PRCTICA N 03

MTODOS DE COLORACIN-COLORACIN SIMPLE-MORFOLOGA MICROBIANA Fundamentos tericos

Un colorante biolgico es una molcula que es capaz de unirse a una estructura se la clula y darle color. Los colorantes se emplean tambin en la constitucin de los medios de cultivo, como indicadores o como inhibidores. En microbiologa, las coloraciones tienen diferentes ob etivos! demostrar los microorganismos y algunas otras clulas en diferentes especmenes! poner de manifiesto algunas caractersticas morfolgicas y estructuras microbianas tales como" esporas, flagelos, gr#nulos, capsulas, etc., y diferenciar los microorganismos seg$n su comportamiento tintorial. 1. Clasificacin: a) tincin simple La tincin simple es una tincin sencilla en la cual la bacteria es te%ida con un solo reactivo. Es preferible utilizar tintes b#sicos que contengan un cromgeno &compuesto que da color al tinte' con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan al cromgeno. La tincin simple se utiliza para observar la morfologa y el crecimiento de las bacterias. Un microorganismo se puede sembrar en un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde az$cares simples hasta sustancias comple as como la sangre o el e(tracto de caldo de carne. )ara aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin" tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. *i esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer# como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. La principal diferencia entre un medio de cultivo slido y uno lquido es que el medio de cultivo slido contiene un +,,-./ de agar-agar, mientras que el medio lquido no contiene agar-agar. b) tincin compuesta *e utilizan para mostrar las diferencias entre bacterias" se denominan compuestas porque se emplea m#s de un colorante. Las m#s utilizadas en microbiologa son la tincin de 0ram y la tincin de 1iehl-2ieelseen 3incin de 0ram La tincin de 0ram. 4ue desarrollada empricamente por 5hristian 0ram en +667, a pesar del tiempo transcurrido la tincin apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificacin bacteriana.

La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias! 0ram positivas y 0ram negativas. 4undamento de la 3cnica La diferenciacin entre las bacterias 0ram positivas y 0ram negativas se establece en la naturaleza y caractersticas de la pared celular bacteriana. Las bacterias 0ram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener al comple o colorante-mordiente &cristal violeta-yodo'. 8urante la decoloracin con alcohol acetona se provoca una deshidratacin de esta gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al comple o en el interior de la clula. Las bacterias 0ram negativas, poseen una delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la salida del comple o colorante-mordiente &cristal violeta-yodo' y es entonces f#cilmente te%ida por el colorante secundario o de contraste.

9eactivos y 5olorantes La tincin de 0ram requiere cuatro soluciones! +. )rimer colorante. Un colorante b#sico &:' que en contacto con las clulas cargadas negativamente, reacciona con ellas colore#ndolas. El mas utilizado es el cristal violeta. .. *olucin mordiente. 4i a las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. ;. Los mordientes usados suelen ser sales met#licas, #cidos o bases, como por e emplo, una solucin diluida de yodo. 7. <gente decolorante. Es un disolvente org#nico" por e emplo alcohol acetona &+!+'.

,. 5olorante de contraste. Es un colorante b#sico de distinto color que el primer colorante, como por e emplo, la *afranina. Tincin de Ziehl-Neelsen La tincin de 1iehl=2eelsen desarrollada inicalmente por )aul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de tuberculosois en muestras clnicas de pacientes es otra muy importante tincin diferencial. La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias! ><<9 positivas y ><<9 negativas. ><<9! bacilos #cido alcohol resistentes 4undamento de la 3cnica Las paredes celulares de ciertos par#sitos y bacterias contienen #cidos grasos &#cidos miclicos' de cadena larga &,? a @? #tomos de carbono' que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-#cido, despus de la tincin con colorantes b#sicos. )or esto se denominan #cido-alcohol resistente. Las micobacterias como A. tuberculosis y A. marinum y los par#sitos coccdeos como 5ryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de #cido-alcohol resistencia. La coloracin cl#sica de 1iehl-2eelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. <l suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de los #cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. )or otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color ro o y la que no se ven de color azul.

P !C"#$%$"NT!:
El profesor proporcionar# a los alumnos cultivos lquidos y slidos de! Escherichia coli Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Baculus subtilis, Klebsiella sp. y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparar# frotis de cada cepa obtenida de cultivo slido y otros de cultivo lquido, los cuales fi ar# y tenir# con azul de metileno. El profesor e(plicar# los principios de mane o del microscopio y la forma de a ustar la iluminacin.

Preparacin de frotis:
+. Lavar perfectamente los portaob etos, secarlos con papel y etiquetarlos. .. )render el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al ro o vivo.

;. 8e ar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. 8espus acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapn y flamear r#pidamente la boca del mismo. Bntroducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.

7. )ara el caso de cultivos lquidos, colocar la muestra en el centro del portaob etos, e(tenderla suavemente en un #rea circular de . cm. 8e di#metro apro(imadamente y esterilizar nuevamente el asa. 8e ar secar el frotis al aire y repetir los procedimientos ; y 7 por .-; veces m#s.

,. *i el cultivo es de medio slido, previamente se colocar# en el centro del portaob etos una gota de agua destilada en la que se mezcla una peque%a muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso ;. E(tenderla suavemente y de ar secar al aire.

Fi&acin del frotis

+. 4i ar los frotis de cultivos lquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y de ar secar al aire &hacer esto en zonas ale adas al mechero'.

.. Los frotis de cultivos slidos, completamente secos se fi ar#n con calor. )ara esto se pasar# el frotis r#pida-mente .-; veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.

;. )alpar la parte inferior del portaob etos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento.

Tincin simple
+. 5ubrir el frotis con . gotas de azul de metileno durante ;? segundos a l minuto. .. Eliminar el e(ceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la pisceta con agua destilada.

;. 8e ar secar al aire.

"'()T*#!'
9eportar las observaciones de forma, agrupacin y tama%o relativo de cada uno de los microorganismos en el cuadro de resultados Culti+o: Lquido *umento total: 1,---1-. /,---1--.

Forma:

)*EU8CDB4<*! alargadas y filamentosas LEE<8U9<*! redondas u ovaladas

)*EU8CDB4<*! alargadas y filamentosas LEE<8U9<*! redondas u ovaladas )seudohifas y levaduras

*grupamiento Culti+o: *lido *umento total: 1,------1-0 /,------1--0 Forma: *grupamiento

)seudohifas y levaduras

9E8C28C* U CE<L<8<* LEE<8U9<*

9E8C28C* U CE<L<8<* LEE<8U9<*

Culti+o: slido *umento total: 1,---1-. /,---1--.

Forma ! *grupacin:

cocos staphylococos

cocos staphylococos

>. 5omparar sus observaciones con las reportadas en la literatura. 0racias al azul de metileno se logra la coloracin azul, esta coloracin de azul de metileno es la m#s simple.

C!NC)('$!N"'
La coloracin simple solo usa un colorante. 2o permite ver muchos detalles solo es superficial. 2o siempre se pueden observar bacillos o cocos tambin se pudo observar levaduras y )seudohifas.

C("'T$!N* $!
1. $n+estigue cu1les son las estructuras celulares o mol2culas responsables de la tincin simple reali3ada. #e e&emplos de otros colorantes 4ue podr5an utili3arse. La mayora de los colorantes son compuestos org#nicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Auchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente &cationes' y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los #cidos nucleicos y los polisac#ridos #cidos. E emplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Ctros colorantes son molculas cargadas negativamente &aniones' y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina #cida y el ro o 5ongo. Ctro grupo de colorantes son sustancias liposolubles" los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, us#ndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depstos de grasa. Un e emplo de colorante liposoluble es el negro *ud#n .

/. 6Por 4u2 se recomienda fi&ar los frotis de culti+os l54uidos con alcohol 7 no con calor8 6Por 4u2 se deben poner +arias +eces muestras del culti+o l54uido 7 slo una muestra de culti+os slidos al preparar los frotis8 Los frotis lquidos se deber#n fi ar con alcohol para evitar residuos de medio, que al quemarse dar#n interferencias en la observacin. *e ponen varias veces muestras de cultivo liquido por la densidad del medio ya que a matoor densidad mayor es la probabilidad de obtener una buena muestra.

9.

6Cu1les son las principales precauciones de mane&o del microscopio 7 por 4u2 se debe utili3ar el aceite de inmersin al hacer el estudio microscpico de bacterias8

3raslado. *e toma con la mano derecha el brazo del microscopio y con la mano izquierda la base. El microscopio se encender# hasta que comience la observacin. Fa encendido, no se apagar# constantemente, sino hasta finalizar la observacin de todas las muestras que se indiquen en la pr#ctica, mientras no se observe, se disminuir# la intensidad luminosa. Aientras permanezca encendido se evitar# realizar cualquier movimiento brusco, *e evitar# mane arlo con las manos h$medas o mo adas El sistema ptico y de iluminacin nunca deber# ser tocado con los dedos. 2o se deber#n colocar los portaob etos mo ados sobre la platina. En las preparaciones en fresco siempre deber# cubrirse con cubreob etos. 8espus de usar el lente de inmersin se deber# limpiar con un pa%o suave o con un papel higinico. El fundamento el uso de un aceite especial &aceite de cedro' interpuesto entre dicho ob etivo y el cubreob eto. 8e esta manera, se altera el ndice de difraccin del medio interpuesto entre el preparado y el ob etivo, y por simple frmula de lmite de resolucin, se consigue un mayor aumento. :. 6Cu1les son las des+enta&as o limitaciones de la tincin simple8 2o es +??/ fiable ya que solo permite observar la morfologa e(terna y agrupacin de los microorganismos sin detalles, formaciones de te idos como col#geno, fibras, etc. 6Cu1les son las fuentes de error m1s frecuentes en la preparacin de frotis8 <ntes de hacer cualquier tincin debe obtenerse un frotis adecuado del material en estudio. 8e sus cualidades depende en gran parte el (ito de la tincin.

;.

<. =ibliograf5a consultada

+. <nnimo &n.d' 5oloracin de las bacterias. http!GGHHH.danival.orgGnotasmicroGtincionG=madre=tincion.html .. <nnimo &n.d' 3incin de las bacterias. http!GGHHH.microinmuno.qb.fcen.uba.arG*eminario3inciones.html Cbtenido el .; de febrero del .?++ en!

Cbtenido

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febrero

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en!

;. Iose magari%o &n.d'.3inciones 8iferenciales <spectos tcnicos. Cbtenido el .; de febrero del .?++ en! http!GGHHH.slideshare.netG osemagarinosGtinciones-diferenciales-aspectos-tecnicos

7. U2BEE9*B8<8 AE39C)CLB3<2< ><F<AJ2 E*5UEL< 8E 5BE25B<* 8E L< *<LU8 &n.d.' Atodos de coloracin Cbtenido el .; de febrero del .?++.