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DETERMINACIN

CUALITATIVA

DE

METABOLITOS

SECUNDARIOS

PRESENTES EN LA HOJA DE LIMA (Citrus aurantium) Domnguez Balan O.; Justiniano Canul D.; Keb Tamayo E.; Martnez Arcos F.; Quevedo Castrejn C.; Trujillo Lpez A.; Wicab Che G. Caracterizacin biolgica: Bilogo Ricardo Efran Gngora Chin TCNICO DOCENTE DEL CENTRO DE ESTUDIOS DE DESARROLLO SUSTENTABLE Y APROVECHAMIENTO DE LA VIDA SILVESTRE (CEDESU)

RESUMEN El trabajo siguiente tuvo como objetivo la determinacin cualitativa de los metabolitos secundario de los extractos de la hoja de Citrus aurantium (lima dulce), se realizaron diferentes extracciones con alcohol y agua a distintas temperaturas, para determinar de forma cualitativa los metabolitos secundarios presentes en la C.aurantium (lima dulce), por diferentes mtodos o tcnicas, como la prueba de sudan y mtodo se shinoda, entre otras. Obteniendo como resultado del macerado acuoso, la presencia de azucares reductores, de mucilagos, antocianidinas, flavonoides, fenoles y taninos. En los de procedencia alcohlica se encontr la presencia de: aminas, terpenos y esteroides, saponinas, fenoles y taninos. Al trmino de las tcnicas de determinacin cualitativa de los metabolitos presentes en las distintas maceraciones de la hoja C.aurantium, los cuales, dieron como resultado una mayor presencia de metabolitos secundarios en los extractos. Palabras clave: Citrus aurantium; extracto; metabolitos secundarios; anlisis cualitativo;

INTRODUCCION La medicina tradicional desde hace muchos aos ha sido de gran importancia para el ser humano, este es un conjunto de sistemas mdicos que cambia y perdura a pesar del avancetecnolgico, teniendo un fin teraputico a partir de la herbolaria, el uso de productos animales y minerales; diferentes tipos de masajes y

punciones. Suponen un amplio conocimiento que constituye la base de la materia mdica. Los ctricos existen desde hace 20 millones de aos y su origen est en el sudeste asitico, Persia (Irn), Malasia. De ah durante la edad media y con las cruzadas llegaron a Espaa y al norte de frica. Desde entonces se han extendido por todo el mundo y dependiendo de las regiones han evolucionado de diferentes maneras y por lo tanto obteniendo diferentes variedades.La lima es una fruta extravagante y de un agradable aroma perteneciente a la familia de los ctricos. Existen muchas variedades de lima pero generalmente son de pequeo tamao de color verde o amarillo. Su sabor es entre cido y dulce, segn la variedad, a veces es amargo. Los rbolesde tamao variable y de diferente forma, segn la especie en determinada regin. Este es un rbol pequeo con unas espinas muy puntiagudas. Las hojas son ligeramente onduladas y el soporte que une a la hoja con el tallo es alado. Esta bsqueda puede ser extendida a estudios farmacolgicos y tambin podra verse la oportunidad de produccin industrial en los casos que los principios activos hallados sean debidamente aceptados. Debido al inters actual se identificara preliminarmente los metabolitos secundarios que se hallan en los extractos acuosos y etanlicos de la hoja de Citrus aurantium(lima) recolectado del pueblo de Pocboc perteneciente al municipio de Hecelchakn,Campeche.

MARCO TEORICO Los citricos son el principal cultivo frutal del mundo. Se estima que en la actualidad el cultivo de los citricos ocupa una superficie de 7,4 millones de hectareas en las regiones tropicales y subtropicales del planeta, aproximadamente entre los 40o de latitud Norte y los 40o de latitud Sur, aunque las principales areas de produccion se situan entre los 20o Norte y los 20o Sur. La produccion de citricosesta en continuo crecimiento y se estima que en el ano 2007 se superaron los 110 millones de toneladas de frutos producidos (FAO,2007).

Los principales paises productores de citricos en el mundo, de mayor a menor, son: Brasil, EE.UU., China, Mexico y Espana. En Brasil y Florida (primera zona productora de EE.UU.) la citricultura esta orientada a la produccion de naranjas para laobtencion de zumo concentrado, al contrario que en Espana donde la mayoria de la produccion es destinada al mercado de fruta fresca. Espana es lider mundial en exportaciones de citricos frescos, sobre todo para el mercado de las mandarinas y clementinas donde supera la cantidad de 1,5 millones de toneladas de producto exportado anualmente (casi el 75% de la produccion total de mandarinas en Espana). En total Espana exporta mas del 50% de su produccion de citricos, lo que nos da una idea de la importancia economica que representa este cultivo para el pas.

METABOLITOS PRIMARIOS: Son los productos qumicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo vital de todo ser vivo, son: los carbohidratos, los lpidos, las protenas y los cidos nucleicos.

METABOLITOS SECUNDARIOS: Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas metablicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro de un grupo taxonmico, estado de vida o tejido presentando una distribucin restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonoma. Su ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patgenos, predadores, cambios trmicos o lumnicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos intra o interespecficos. El metabolismo secundario es una caracterstica fundamental de la especializacin, es decir que el compuesto resultante, puede no ser importante para la clula pero s para el organismo como un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel esencial en los procesos fisiolgicos del organismo. Algunos metabolitos

secundarios son residuos bioqumicos, es decir, productos de actividad enzimtica de substratos no apropiados o productos de destoxificacin o desecho de importancia para la supervivencia y la buena condicin de los organismos. Con pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de cinco grupos, de acuerdo con su base biosinttica: fenilpropanos, acetogeninas, terpenoides, esteroides y alcaloides.

RECONOCIMIENTOS DE METABOLITOS: El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas fitoqumicas preliminares, las cuales son una prueba qumica de caracterizacin consistente en una reaccin qumica que produce alteracin rpida en la estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificacin de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, la formacin de un aducto o un complejo, lo cual da por resultado una manifestacin sensible como el cambio de un color, la formacin de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dndonos indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular. A continuacin se presenta el fundamento de algunas pruebas que se utilizaron en la metodologa. El reactivo de Fehling se utiliza para la deteccin de sustancias reductoras, particularmente azcares reductores. Se basa en el poder reductor del grupo carbonilo de un aldehdo que pasa a cido reduciendo la sal cprica de cobre (II), en medio alcalino, a xido de cobre (I). ste forma un precipitado de color rojo. Un aspecto importante de esta reaccin es que la forma aldehdo puede detectarse fcilmente aunque exista en muy pequea cantidad. Si un azcar reduce el licor de Fehling a xido de cobre (I) rojo, se dice que es un azcar reductor. La prueba de nihidrina se utiliza para la deteccin de aminocidos, actualmente acoplada a sistemas de valoracin automtica. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energtico que por una desaminacin oxidativa de los aminocidos conduce a la formacin del aldehdo correspondiente, con liberacin de amoniaco y gas carbnico y formacin de la ninhidrina reducida o hidrindrantina. La molcula de hidridantina, en presencia de otra de ninhidrina,

condensa a travs del amoniaco produciendo una estructura denominada indanona o prpura de Ruhemann, manifestando un color rojizo, excepto para la prolina, hidroxiprolina y en menor medida para la histidina. Presenta su mximo de absorbancia a los 570 nm, exceptuando los tres aminocidos reseados anteriormente. La presencia de mucilagos permite reconocer en los extractos de vegetales la presencia de esta estructura tipo polisacrido, que forma un colide hidrfilo de alto ndice de masa que aumenta la densidad del agua donde se extrae. Las saponinas son una clase de compuestos qumicos, uno de muchos metabolitos secundarios que se encuentran en fuentes naturales, con saponinas que se encuentran en abundancia en particular, varias especies de plantas. Ms especficamente, son glucsidos anfipticas agrupados, en trminos de la fenomenologa, por el jabn-como la formacin de espuma que producen cuando se agitan en soluciones acuosas, y, en trminos de estructura, por su composicin de uno o ms restos hidrfilos glucsido combinado con un triterpeno lipfilo derivado. El comercio mundial de citricos experimento un fuerte incremento a partir de mediados del siglo XIX, concretandose en las zonas donde el cultivo podia desarrollarse con facilidad gracias a la climatologia. A finales de este mismo siglo el comercio de Espana, sobre todo con Francia, comienza a ser relevante y la citricultura se trasforma en una actividad lucrativa

DESARROLLO Materiales y mtodos. Se recolectaron 900 gr de la hoja de C. aurantium aleatoriamente a una altura de 3m aproximadamente, se sec el material orgnico como se muestra en la figura 1, teniendo un peso inicial de 184gr y posterior al secado un peso de 106.35 gr, dando as un porcentaje de humedad de 55.69 %. Posterior al secado se trituro el material orgnico y se someti a maceracin esttica por una semana aadiendo 10 gr de la

muestra y 100 ml de diferentes solventes: Agua fra, agua caliente, alcohol fro y alcohol caliente (figuras 2 y 3) Se realizaron una serie de pruebas para determinar las propiedades que tiene el extracto de la hoja de Citrus aurantium (lima dulce), como son la determinacin de azcares reductores, la determinacin de aminas, los muclagos, principios amargos o astringentes, antocianidinas, determinacin de terpernos o esteroides, saponinas, glucsidos cardiotnicos, determinacin de alcaloides, quinonas y agrupamientos lactnicos. Para la determinacin de azucares reductores se utiliz la prueba de Fehling. Se realiz tomando una gota del extracto de la maceracin de la hoja de Citrus aurantium, se trat con una gota de Fehling A y una gota de deFehling B y se someti a bao mara por tres minutos. La prueba de aminas se determin mediante la tcnica de la Ninhidrina, se tomaron dos gotas del extracto y se le aadieron 2 gotas de ninhidrina al 5 % en etanol, se someti a bao mara por cinco minutos. La determinacin de los muclagos se vio mediante la viscosidad que present el extracto. Para el ensayo de los principios amargos o astringentes se coloc una gota de extracto en placas ELISA y

se diluy con 5 gotas de agua, se prob el resultado. La identificacin de antocianidinas se realiz depositando dos gotas del extracto en un tubo de ensayo y se llev a sequedad; el residuo se diluy en 10 gotas de HCL 2N. Posteriormente se coloc el tubo a bao mara durante 15 minutos y para terminar se le agregaron dos gotas de alcohol amlico. La prueba de la triterpenos y esteroides se realiz agregando en un pozo de la placa de ELISA 2 gotas del extracto con 2 gotas de cloroformo, posteriormente se le aadi 2 gotas de anhdrido actico. Se le adicion 2 gotas de cido sulfrico concentrado. En el ensayo de saponinas, en un tubo de ensayo se adicion 1 ml del extracto con 1 ml de agua destilada y se agit la mezcla durante dos minutos. Para los glucsidos cardiotnicos se agreg 2 gotas del extracto las placas de ELISA se mezcl con 2 gotas de cido 3,5 dinitrobenzoico al 2% en metanol y 2 gotas de Hidrxido de potasio en agua. La prueba de Sudan se us para determinar lpidos y aceites esenciales, se realiz extrayendo 0.5 ml del extracto y adicionndolo en un tubo de ensaye. Se le aadi 0.5 ml de Sudan III al 0.6% en glicerinaagua 1:1.

Para la determinacin de flavonoides fue elegido el mtodo de Shinoda. En un tubo de ensaye se aadi 1 ml de agua destilada con 1 ml de extracto, luego se adicion 0.5 ml de cido clorhdrico y un pequeo trozo de magnesio metlico. Despues de haber acabado la reaccin se le adicion 0.5 ml de cido amlico y se agit. Para la deteccin de fenoles y taninos en un tubo de ensaye dispusimos 0.5 ml del extracto, se le aadi 0.25 ml de cloruro frrico al 5% en solucin salina. Al extracto acuoso se le adicion acetato de sodio previo al ensayo. En la determinacin especifica de taninos, de la prueba anterior extraer 0.5 ml del extracto y se adicion 0.5 ml de gelatina al 1% en cloruro de sodio al 0.85%. Para la deteccin de los alcaloides utilizamos el mtodo de Dragendorff,

ocupamos un tubo de ensaye para la determinacin aadiendo 0.5 ml de extracto al igual que 0.5 ml del reactivo de Dragendorff. Posteriormente para la especificacin de quinonas; en un tubo de ensaye se agreg 0.5 ml del extracto y se diluyo en proporcin 1:1 en cloroformo luego se agito esperamos un momento y se agreg 0.5 ml de hidrxido de sodio al 5% y se agito vigorosamente. Para la identificacin de los agrupamientos lactonicos; se agreg a un tubo de ensayo 0.5 ml del extracto obtenido a la cual se le agrego 0.5ml de cido picrico al 1% en etanol y 0.5 ml de hidrxido de sodio al 10% en agua, en esta identificacin solo se observ el cambio de color y la formacin de un precipitado rojo.

Figura 1.-Hojas de Citrus aurantium despus del secado

Figura3.- Maceracin esttica de la hoja de C. arantium en alcohol caliente y fro

Figura 2.- Maceracin esttica de la hoja de C. arantium en agua caliente y fra.

RESULTADOS HOJA DE LIMA (Citrus aurantium) Agua caliente + Alcohol caliente -

Prueba PRUEBA DE FEHLING PRUEBA NINHIDRINA (AMINAS) PRUEBA DE MUCLAGOS PRUEBA DE ANTOCIANIDINAS PRINCIPIOS AMARGOS Y

Agua fra

Alcohol frio

Amargo

Amargo

Astringente Astringente

ASTRINGENTES PRUEBA DE TERPENOS Y ESTEROIDES PRUEBA DE SAPONINAS PRUEBA DE GLCOSIDOS CARDIOTNICOS PRUEBA DE LIPIDOS Y ACEITES ESENCIALES PRUEBA DE FLAVONOIDES PRUEBA DE FENOLES Y TANINOS PRUEBA DE ALCALOIDES PRUEBA DE QUINONAS PRUEBA DE AGRUPAMIENTO LACTNICOS + + + + + + + + + + + + + + + +

DISCUSION Los ctricos son una parte fundamental para la elaboracin de medicamentos,ya que constituyen una principal fuente de metabolitos secundarios, como son las

cumarinas, alcaloides, aceites esenciales y flavonoides, ya que utilizan estos para su proteccin y crecimiento. Los alcaloides son de gran inters porque se les atribuye propiedadesanalgsicas como: anestesia (morfina y tubocuraina), estimulantes (cafena, nicotina). Los flavonoides por tener un mayor inters por la comunidad cientficason una de las pruebas que hicimos para ver si haba presencia de este en los extractos obteniendo positivo en la tcnica tanto para este metabolito tanto para los alcaloides. Estos datos obtenidos son aceptables porque se han encontrado en otras investigaciones como las publicadas en revistas cubanas sobre plantas.

CONCLUSION Las diferentes determinaciones realizadas pueden servir para saber los metabolitos presentes en Citrus aurantium (lima dulce), son muy importantes para posteriores investigaciones como son las cuantificaciones de estos, tambin para efectos farmacolgicos que pueden aliviar en el organismo algn padecimiento o enfermedad. Estos metabolitos pueden ser de utilidad para crear nuevos farmacoforos aislando la molecula activa o principio activo y posteriormente tener medicamentos para el tratamiento.

BIBLIOGRAFIA Avendao,C, (2001). Introduccin a la qumica farmacutica. Madrid: Mc Graw Hill Kuklinskli,c. (2000). Farmacognosia, estudios de las drogas y sustancias medicamentosas de origen natural. Omega http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1028-47962008000400004&script=sci_arttext