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LA DESECACIN EN PAPEL FILTRO COMO MTODO DE CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS EN UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA CLNICA

LA DESECACIN EN PAPEL FILTRO COMO MTODO DE CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS EN UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA CLNICA
Gerardo Arratia Ramrez.
Universidad Politcnica de Puebla. Ingeniera en Biotecnologa. 72640. San Mateo Cuanal. Juan C. Bonilla. Estado de Puebla.

INTRODUCCIN La preservacin de cepas microbianas no es un procedimiento fcil ni simple, y debe garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad gentica de los cultivos, caractersticas que coinciden con los objetivos de un buen mtodo de conservacin. Para ello se han establecido varios procedimientos, con los cuales se trata de mantener el cultivo lo ms cercano posible al aislamiento original. Todos los mtodos de preservacin tienen ventajas y desventajas; por tanto, es necesario hacer una seleccin del mtodo con respecto a las caractersticas de cada tcnica, factibilidad de su uso y las necesidades del usuario. Generalmente la eleccin depende de la disponibilidad del equipamiento. En cualquier laboratorio de microbiologa clnica es fundamental el mantenimiento y conservacin de cepas de microorganismos con las que se trabaja ya que son el material biolgico primordial.3 Existen una gran variedad de mtodos de mantenimiento y conservacin de los microorganismos cuya utilizacin va a depender del tiempo que se desee conservar la cepa y de las caractersticas de las diferentes bacterias que deseamos conservar.

OBJETIVOS Objetivo general: Establecer un procedimiento para la conservacin de bacterias que nos permita tener acceso a ellas durante un periodo aproximado de dos aos. Objetivos especficos: 1. Reactivar cepas bacterianas conservadas en medios especficos. 2. Estandarizar la metodologa de conservacin por el mtodo de papel filtro. 3. Realizar pruebas de viabilidad a las cepas conservadas. 4. Establecer un esquema de uso de las cepas conservadas.

PROCEDIMIENTIO PARACONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS EN UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA CLNICA

MARCO DE REFERENCIA La eleccin del mtodo de conservacin utilizado debe permitir mantener las caractersticas del microorganismo por las cuales fue seleccionado. Un cultivo de uso cotidiano en un laboratorio de microbiologa clnica tiene que reunir determinadas caractersticas como estar libre de contaminantes o contener el mximo nmero de clulas viables, entre otras. Por sta razn el mantenimiento de cultivos es extremadamente importante. No existe un mtodo universal para mantener los cultivos de microorganismos, ya que no todos los microorganismos son iguales en cuanto a su crecimiento o actividad metablica. La seleccin del mtodo tiene que basarse en las ventajas e inconvenientes del mtodo escogido. Los cultivos de microorganismos se siembran en medios estriles y en condiciones de asepsia y se mantienen activos aplicando alguno de los siguientes mtodos: 1. Subcultivo seriado Consiste en resembrar el microorganismo cada cierto tiempo en un medio adecuado; generalmente se utiliza agar inclinado ya que en medio slido se detectan mejor los contaminantes que en medio lquido y el hacerlo inclinado tiene por objeto el evitar la desecacin rpida del medio. Este mtodo es vlido para cortos perodos de tiempo (1 semana a 15 das) por lo que deben ser resembrados con frecuencia lo que incrementa el riesgo de contaminacin o muerte celular. Adems, al mantenerlos a temperatura ambiente, pueden crecer y espontneamente cambiar sus caractersticas genticas (Presentando mutacin, prdida de plsmidos, cambio morfolgico, etc.) que pueden afectar al carcter por el que fueron seleccionados. Estos inconvenientes pueden evitarse frenando o alentando el metabolismo de los microorganismos mantenindolos a 4C con lo que su crecimiento es inferior y la necesidad de hacer subcultivos se prolonga de 1 a 3 meses.8

2. Liofilizacin ste mtodo inhibe el crecimiento de las clulas conservadas, puesto que se les ha quitado el agua mediante una liofilizacin. Con este mtodo la estabilidad gentica es alta, pero en ocasiones suele convenir ms una congelacin, ya que la liofilizacin se consigue por sublimacin del hielo de las clulas. Por lo tanto, primero se tiene que congelar el agua libre de las clulas y despus eliminarla mediante el vaco, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabara afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los que hay muchos modelos en el mercado. Este es un mtodo muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envo de las cepas, pues una vez conseguidos los microorganismos lifilizados pueden almacenarse a temperatura ambiente.6 La congelacin se puede generar rpidamente sumergiendo los tubos en nitrgeno lquido. Para ste mtodo usamos agentes crioprotectores que facilitan el flujo de agua a travs de la membrana celular y protegen las estructuras
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moleculares. Se pueden utilizar varios tipos de crioprotectores dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de evaporacin y a su higroscopicidad, que provoca que los lifilos queden muy viscosos. Por lo tanto, para la liofilizacin se recomienda usar como crioprotector el inositol ya que es conveniente para la mayora de las bacterias, pero para algunos microorganismos pueden ser ms convenientes otros crioprotectores.10 Los factores que influyen especficamente en la eficacia de la liofilizacin como medio de conservacin son: 1. Tipo de microorganismo: Hay algunas bacterias que no resisten la liofilizacin y lgicamente sern aquellas que contengan ms agua en su interior. Algunas bacterias no se pueden guardar liofilizadas y hay que recurrir a otros mtodos. 2. Concentracin celular: Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una alta concentracin de clulas por mL. 3. Temperatura durante la sublimacin: Se deben alcanzar temperaturas lo ms baja posibles, sin subir por encima de los 50C. 4. Grado de deshidratacin alcanzado: Se deben lograr niveles lo ms alto posibles de deshidratacin, aunque la concentracin de solutos puede conllevar una pequea cantidad de agua remanente que no llega a ser perjudicial. 5. Atmsfera de oxgeno en el tubo: Las clulas liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vaco para evitar, tanto la rehidratacin como la presencia de algn gas dentro del tubo, como el oxgeno que puede daar a las clulas. En cuanto a condiciones de almacenamiento, la temperatura debe ser constante, preferentemente a 18C y sin bajar de los 0C. Los microorganismos liofilizados se deben almacenar en la oscuridad y en un ambiente seco.10 2. Congelacin Debido a que la actividad metablica de una clula se reduce estando en condiciones de baja temperatura, la congelacin es una tcnica recomendable, ya sea para cortos o largos perodos de tiempo. La tcnica involucra el crecimiento del cultivo hasta la fase estacionaria, ya que en general en esta etapa las clulas son ms resistentes a los daos por congelacin y descongelacin, que las de fase exponencial. Tambin es aconsejable utilizar una densidad celular elevada en la congelacin, debido a que, cuando parte de las clulas se lisan se liberaran sustancias crioprotectoras que aumentaran el porcentaje de clulas sobrevivientes. Las clulas a congelar pueden ser resuspendidas directamente en un agente crioprotector o se puede agregar el mismo como aditivo al medio de cultivo. El ms empleado es glicerol al 10%, aunque otros agentes como dimetilsulfxido, glucosa, dextranos, sacarosa, suero de conejo, lactosa y extracto de malta, han sido tambin empleados. Es recomendable el enfriamiento a 1 C min hasta 0 C. En cuanto a la temperatura de conservacin, la ms baja recomendada es -70C, ya que a temperaturas ms altas ocurren algunas recristalizaciones, las cuales si son intracelulares son letales para las clulas. Puede hacerse uso de nitrgeno lquido para una supercongelacin, as la conservacin podra prolongarse por aos, asegurando una buena provisin del mismo.
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4.- Desecacin en papel filtro La eliminacin del agua deshidratacin es un mtodo de conservacin que disminuye drsticamente la actividad metablica. Una vez secos los microorganismos es importante mantener el producto sellado ya sea con tapn de rosca ampolla para poder evitar el contacto con el aire y la humedad ya que las bacterias cuentan con propiedades higroscpicas y si evitamos el contacto con el aire evadimos una contaminacin. La conservacin en discos de papel de filtro es basada en la paralizacin del crecimiento celular por la eliminacin del agua disponible para cada. El empleo de un soporte de papel para el mantenimiento de clulas en condiciones de ausencia de agua es un procedimiento adecuado y sencillo, para conservar cepas. La tcnica consiste en embeber tiras de papel de filtro con una suspensin densa de organismos en suero, glutamato de sodio u otro agente, las mismas son posteriormente colocadas en tubos para su posterior secado bajo vaco. De esta forma se han logrado conservar por perodos de hasta 2 aos a temperatura ambiente. Los soportes que tambin se suelen utilizar son arena, suelo, slica gel previamente secados y esterilizados por calentamiento con aire caliente. Sobre estos soportes se aade la suspensin de los microorganismos y se deja secar a temperatura ambiente. Tambin se pueden utilizar como soportes discos de gelatina donde se aade la suspensin de microorganismos y posteriormente se seca al vaco evitando la congelacin.7 A continuacin se presenta un cuadro comparativo que reduce los parmetros importantes de la conservacin de microorganismos: Mtodo Conserva en papel filtro Subcultivo seriado Liofilizacin Congelacin Tiempo de conserva 2 aos 2 a 3 meses 25 aos 15 aos Temperatura de almacenamiento Refrigeracin o temperatura ambiente Recomendable a 4C Constante de 0C a 32C Desde 1C a -70C

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MARCO TERICO En el rea de microbiologa clnica hay que pensar en mantener las colecciones de microorganismos durante perodos de aos y no de meses, tomando en cuenta los equipos y el material disponibles para la metodologa. El mtodo elegido y el utilizado es el mtodo de conservacin por papel filtro. Ya que cuenta con las siguientes ventajas: 1. La temperatura ambiente permite que las caractersticas morfolgicas del microorganismo no se alteren. 2. Evita una mutacin gentica o un cambio estructural. 3. No hay agua libre, por lo tanto no hay peligro de hidrlisis ni de crecimiento microbiano.9 4. Al evaporarse el agua, quedan poros de celulosa que permiten la rehidratacin o reconstitucin rpida. 5. La humedad residual es baja casi nula. 6. La duracin de la conservacin es larga. 7. Son productos de peso ligero que no necesitan cadenas de refrigeracin para su transporte. ste mtodo es bastante eficiente debido a su conservacin a temperatura ambiente y nos genera un tiempo de viabilidad de mnimo 2 aos.2

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METODOLOGA Diagrama de metodologa:

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Proceso metodolgico: 1. A partir de las 11 cepas disponibles que se desean conservar, se resiembran en medio gelosa sangre poder obtener la colonia aislada. 2. Se incuban las cepas a 24 horas y se observa su morfologa colonial. 3. Se realizan respectivas pruebas bioqumicas de identificacin para corroborar que se cuenta con la bacteria que se desea conservar. 4. Una vez identificada la cepa, se inoculan individualmente (de 2 a 3 colonias) en 1mL. de solucin salina y se agitan de 20 a 30 segundos para obtener un suero saturado homogneo del microorganismo. 5. Se toma el papel filtro Watman No 4 y se recortan en crculo con ayuda de una perforadora (De 8 a 10 discos por microorganismo) 6. Se toman los crculos de papel y se esterilizan en la autoclave por 15 min. a 15lb. y 121C dentro de una bolsa para esterilizacin o cubiertos de papel filtro que los envuelva para evitar que se humedezcan. 7. Una vez estriles los crculos de papel, se sumergen directamente en la suspensin de microorganismo para que los discos queden impregnados del microorganismo. 8. Una vez hmedos los crculos se colocan en tubos de plstico para microcentrfuga (comnmente apodados eppendorf) previamente esterilizados. 9. Se llevan al desecador con tapa abierta y en condiciones estriles a temperatura ambiente por 17 das para que pierdan humedad. El desecador deber contener una sustancia desecadora llamada cloruro de calcio, previamente esterilizado para evitar la contaminacin de las cepas. Y generando condiciones de vaco dentro del desecador para obtener una aceleracin en el proceso de secado.5 10. Transcurrido el tiempo del secado de los discos, se cierran las tapas de los tubos y se conservan a temperatura ambiente.

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RESULTADOS De 11 cepas obtenidas, se lograron conservar 7 de las cuales se mencionan a continuacin incluyendo las pruebas bioqumicas realizadas para su identificacin y su importancia en la microbiologa clnica:
Citrobacter freundii Gram Catalasa Oxidasa TSI H2S LIA Citrato Movilidad Indol Ornitina Urea +

cido/cido + Alcalino/cido + + +

a)Tincin de gram de Citrobacter freundii expuesta al microscopio. b)Colonias aisladas de Citrobacter freundii en agar MacConkey. c)Prueba de ureasa positiva para Citrobacter freundii. d)Pruebas bioqumicas de TSI, Citrato, LIA y MIO.

Citrobacter freundii es de alta importancia clnica por ser causante de enfermedades tales como Infecciones urinarias, meningitis neonatal y abscesos cerebrales. 1

Enterobacter agglomerans Gram Catalasa Oxidasa TSI H2S LIA Citrato Movilidad Indol Ornitina Urea +

cido/cido Alcalino/cido + -

a)Colonias aisladas de Enterobacter agglomerans en agar MacConkey. b)Tincin de gram de Enterobacter agglomerans expuesta al microscopio. c)Pruebas bioqumicas de TSI, Citrato, LIA y MIO.

Enterobacter agglomerans es de alta importancia clnica por ser causante de enfermedades tales como artritis sptica, sinovitis y ostetis. 1

PROCEDIMIENTIO PARACONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS EN UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA CLNICA Morganella morganii Gram Catalasa Oxidasa TSI H2S LIA Citrato Movilidad Indol Ornitina Urea + Alcalino/cido Alcalino/cido + + + +
a)Colonias aisladas de Morganella morganii en agar gelosa sangre. b)Tincin de gram de Morganella morganii expuesta al microscopio. c) Prueba de ureasa positiva. d)Pruebas bioqumicas de TSI, Citrato, LIA y MIO.

Morganella morganii es de alta importancia clnica por ser causante de enfermedades tales como infecciones urinarias y otras infecciones nosocomiales. 1

Gram Oxidasa Catalasa 42C Gelatina Glucosa Xylosa Maltosa

Pseudomonas pseudoalcaligenes +

+ + V -

a)Tincin de gram de Pseudomonas pseudoalcaligenes expuesta al microscopio. b)Colonias aisladas de Pseudomonas pseudoalcaligenes. c)Pruebas de gelatina, glucosa, xilosa y maltosa.

Pseudomonas pseudoalcaligenes es de alta importancia clnica por ser causante de enfermedades tales como ectima gangrenoso, infecciones del odo y del pulmn, incluyendo infecciones en quemaduras y lesiones. 1

Staphylococcus saprophyticus Gram Catalasa Coagulasa Manitol Resistencia a noboviocina +


+
a)Colonias aisladas de Staphylococcus saprophyticus en agar gelosa sangre. b)Resistencia a noboviocina de Staphylococcus saprophyticus. c)Prueba de coagulasa negativa.

+ +

Staphylococcus saprophyticus es de alta importancia clnica por ser causante de la infeccin comn del tracto urinario. 1

PROCEDIMIENTIO PARACONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS EN UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA CLNICA Streptococcus pneumoniae + Gram
a)Colonias aisladas de Streptococcus pneumoniae en agar gelosa sangre. b)Tincin de gram de Streptococcus pneumoniae expuesta al microscopio. c)Prueba de optoquina positiva.

Catalasa Resistencia a optoquina

Streptococcus pneumoniae es de alta importancia clnica por ser causante de enfermedades como neumona, sinusitis, peritonitis, meningitis y sepsis. 1

Streptococcus pyogenes Gram Catalasa Resistencia a bacitracina CAMP +


-

a)Tincin de gram de Streptococcus pyogenes expuesta al microscopio. b)Colonias aisladas de Streptococcus pyogenes en agar gelosa sangre.

Streptococcus pyogenes es de alta importancia clnica por ser causante de enfermedades como faringitis estreptoccica e infecciones de piel como celulitis, erisipelas, imptigos y fascitis necrotizante.1

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Esquema de uso para las cepas conservadas.11


1. Rehidratar nuevo cultivo stock u obtener cepa a partir de un stock congelado.

2. Inocular en medios de cultivo apropiados para cada microorganismo e incubar (cultivo primario).

3. Cultivar, incubar y almacenar apropiadamente segn sea el caso para cada microorganismo. Usar colonias aisladas a partir de los das 1 a 7.

4. Preparar nuevo cultivo cada 7 das (O usar el cultivo del da 1). Almacenar a temperaturas apropiadas segn sea el caso para cada microorganismo.

5. Repetir el mismo procedimiento para semanas 3 y 4. Despus de 4 semanas, descartar el cultivo inicial y volver a tomar la cepa del cultivo stock congelado o rehidratar el nuevo cultivo.
NOTA 1: Para cultivos congelados o liofilizados se recomienda resembrar 2 veces antes de su uso. NOTA 2: Para pruebas de control de calidad, seleccionar colonias aisladas a partir del cultivo puro. NOTA 3: Si llega a haber una contaminacin o un crecimiento inadecuado, preparar nuevos cultivos primarios puros u obtener un nuevo cultivo stock. NOTA 4: Puede llegar a ser necesario preparar nuevos cultivos cada dos semanas para algunos microorganismos (Ej. Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae, entre otros).

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CONCLUSIONES Se estableci un procedimiento para la conservacin de bacterias por medio de papel filtro que resulto ser eficaz para el 75% de las cepas. La eficacia fue determinada gracias a que se realizaron pruebas de viabilidad para las 11 cepas conservadas de las cuales solamente 7 presentaron crecimiento y viabilidad.

Se recomienda volver a realizar el proceso de conservacin de las cepas que no presentaron viabilidad ya que pudo no haberse realizado de manera adecuada el procedimiento o en su defecto se propone realizar algn otro mtodo de conservacin alternativo para esas cepas. Se logr establecer un esquema de uso de las cepas que se encuentran en conserva.

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REFERENCIAS, BIBLIOGRAFA Y LITERATURA CITADA 1. Patrick R. Murray, George S. Kobayashi. Michael A. Pfaller y Ken S. Rosenthal. Microbiologa mdica.2ed. Madrid: Espaa; 1997. 2. Alicia Hernndez, Ileana Alfaro y Ronald Arrieta. Microbiologa Industrial.1ed. Costa Rica: Editorial Universidad Estatal a Distancia; 2003. 3. Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez. Mantenimiento y conservacin de microorganismos industriales. 4. Lansing M. Prescott, John P. Harley y Donald A. Klein. Microbiologa.10ed. Madrid: McGraw Hill; 2002. 5. Castro, G.; J. T. Hernndez; C. Aquino. Manual sobre conservacin de microorganismos. Instituto Politcnico Nacional, Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. Mxico: 2000. 6. Todor Donev. Methods for Conservation of Industrial Microorganisms. National bank for industrial microorganisms and cell cultures. Bulgaria: 2001. 7. Mara Dolores Garca Lpez y Federico Uruburu Fernndez. La conservacin de cepas microbianas. Universidad de Valencia. Valencia: 2001. 8. Uzunova-Doneva, T.; T. Donev. Anabiosis and Conservation of Microorganisms. Journal of Culture Collections 4:17-28. Sofia: 2005. 9. I. Sosa, Victoria Pazos, Giovanni Borges, Marleny Gonzlez y Enrique Ponce. Evaluacin del mtodo de conservacin en papel de filtro en dos cepas de Bacillus subtilis cohn, mediante la actividad antagnica frente a Rhizoctonia solani khn. Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. La Habana: 2011. 10. Lucero Mariene Zamora Rodrguez. Aislamiento, identificacin y conservacin de cultivos de bacterias lctivas antagonistas de Microbiota contaminante de sangre de matadero. Universitat de Girona. Girona: 2003. 11. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard-Eleventh Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Pennsylvania: 2012.

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