UNIVERSIDAD CATLICA ANDRS BELLO EXTENSIN GUAYANA FACULTAD DE INGENIERA ESCUELA DE INGENIERA CIVIL CTEDRA: LABORATORIO DE INGENIERA SANITARIA I

PRCTICA N1 USO DEL MICROSCOPIO Y TINCION DE BACTERIAS

PROFESOR: SEIJAS, ANTONIO AUTORES: CCERES, ALEJANDRA - C.I. 19.095.662 VALERO, RAFAEL C.I. 20.804.687 VIDAL, DAGNY C.I. 20.250.832

CIUDAD GUAYANA, OCTUBRE DEL 2013

TABLA DE CONTENIDOS
RESUMEN .. . 3 4-5 6 7-8 9 9 9 10-13

INTRODUCCIN OBJETIVOS

.. . ..

PARTE EXPERIMENTAL ANLISIS DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS

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RESUMEN

En la prctica que se presenta a continuacin fue tomada aproximadamente a las 11:30 de la maana una muestra de agua de la laguna del Cisne de Anauco (identificada como: 201421002), precisamente cerca de la columna del lado derecho ubicada en la zona de la entrada de la biblioteca de la UCAB Guayana, cuyo croquis puede observarse en los anexos, con el fin de hacer un estudio para identificar las diferencias morfolgicas de los grupos de bacterias, utilizando el mtodo de tincin de Gram, mediante el uso del microscopio ptico determinar la diferencia entre las bacterias de tipo Gram + y Gram -. Finalmente gracias a las bases tericas se pudo comprobar que las bacterias observadas en el microscopio ptico se tieron de color rosa, constatando que se trataban de un tipo Gram -, y de morfologa entre bacilos y cocos.

INTRODUCCIN

Una de las caractersticas ms importante de las bacterias es su morfologa, definida por el tamao, la forma, el arreglo y la estructura. Estas caractersticas son difciles de ver con el microscopio ptico, debido a la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea. Se utilizan colorantes como una forma fcil de aumentar el contraste de las clulas para la microscopia, el mtodo de tincin simple se utiliza si solo se desea aumentar el contraste de las clulas utilizando un solo colorante, y a menudo se utilizan mtodos que no tien de igual modo todas las clulas, denominado tincin diferencial. Uno muy usado en microbiologa es la tincin Gram.

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas, basndose en si retienen o no el colorante primario (cristal violeta) luego del proceso de decoloracin, siendo sta clasificacin un indicador de diferencias fundamentales de la pared celular de las mismas, recordando que en este caso los trminos positivo y negativo no tienen relacin con carga elctrica, simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias.

Los organismos que retienen el cristal violeta luego de la adicin del agente decolorante, el alcohol, aparecen como azul oscuro o violeta, esto se debe a que poseen una pared celular gruesa y muy densa que consiste en un poco de cido teicoico y varias capas interconectadas de peptidoglicano, siendo as este compuesto un 80% 90% de la misma. Los organismos con clulas que responden a estas caractersticas se designan como gram positivos. Aquellos que pierden el cristal violeta y se tien con el colorante secundario, la safranina, aparecen como

rosados y por lo contrario se debe a que poseen una pared celular muy delgada, se designan como gram negativos, dicha pared celular est constituida nicamente de peptidoglicano (un 10% 20%), rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos y lipoprotenas.

La tincin de Gram es una herramienta muy til en el laboratorio de microbiologa, siendo necesario conocer su fundamento y procedimiento, para poder tener una correcta interpretacin de los datos que nos otorga la diferenciacin de Gram positiva y negativa. Un examen detallado de un extendido bacteriano teido diferencialmente, provee una informacin muy importante sobre la caracterizacin morfolgica e identificacin de la muestra.

OBJETIVOS

Iniciacin en las tcnicas del estudio de microorganismos: cultivo, tincin y morfologa. Diferenciar morfolgicamente los grupos de bacterias, Gramnegativos de los Gram positivos, mediante la tincin de Gram Uso del microscopio como herramienta para la diferenciacin de bacterias Gram positivas de las Gramnegativas.

PARTE EXPERIMENTAL
EQUIPOS Y MATERIAL Microscopio Portaobjetos Asas de cultivo Mechero Cpsulas de Petri Tubos de ensayo. Cultivo de bacterias. Cristal violeta (1 g de cristal violeta en 100 cc de agua destilada). Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potsico en 100 cc de agua destilada). Alcohol de 95 (decolorante) Safranina Fuscina bsica (1 g de Safranina bsica en 100 cc de agua destilada).

PROCEDIMIENTO Antes de la realizar el proceso de tincin de Gram, fue necesario colocar 2 muestras a girar en sentido contrario en la centrifugadora a 2340 rpm por un lapso de 5 minutos con el fin de concentrarla mejor y tener una porcin de muestra ms significativa. El mecanismo de tincin Gram fue realizado de la siguiente manera:

1. Se fij un frotis, colocando la muestra sobre el portaobjeto hasta secarla pasndola levemente por encima del mechero. 2. Se agreg violeta cristal con un gotero hasta que cubri toda la muestra y se dej actuar aproximadamente 1 minuto. 3. Luego, se enjuago la muestra con un chorro de agua que actu sobre la parte superior de la lmina que no contena la muestra.

4. Una vez enjuagado el portaobjeto se aplic con un gotero el mordiente (Lugol) por un minuto. 5. Luego de transcurrido el minuto se realiz la decoloracin, la cual se hizo aplicando etanol hasta que escurri el lquido azul de modo que el lquido que sali solo fue transparente. 6. Despus de decolorar se realiz un lavado con agua hasta que se quitaron los restos del decolorante y se sec la muestra con la ayuda del mechero. 7. Una vez que el portaobjeto se sec se hizo la tincin de contraste, se tio con safranina y se dej actuar por 1 minuto. 8. Se realiz un nuevo enjuague con agua. 9. Finalmente el portaobjeto se coloc en el microscopio, y con un lente de 1000 aumentos se pudo determinar la distencin de bateras entre Gram + y Gram , en conjunto con su morfologa.

ANLISIS DE RESULTADOS
Luego de realizar el respectivo cultivo y la tincin de la muestra, se pudo apreciar al divisarla en el microscopio unas manchas de color rosado y que mostraban una morfologa variada donde predominaban formas alargadas y algunas circulares, as como tambin se observ una mancha alargada color verde.

CONCLUSIN
Al finalizar el experimento, podemos concluir que el color rosado que presentaban las manchas observadas en el microscopio nos indica que se trata de una colonia de bacterias, ya que contienen el peptidoglicano que permite la absorcin del tinte, obteniendo una Tincin de Gram Negativa, cuyo objetivo s resaltar las cualidades de las bacterias indicadoras de la potabilizacin del agua. La forma alargada observada nos indica que son bacterias del tipo bacilos y cocos. Por otra parte se destaca a su vez el hecho de que estas bacterias son aerobias o anaerobias facultativas y la presencia de las mismas asegurara que aunque muchos de ellos son patgenos para el ser humano, algunos no hacen dao. En cuanto a la mancha alargada color verde que se observ, se descubri que se trataba de un alga la cual no posee peptidoglicano y no fij la safranina por su naturaleza eucarionte.

BIBLIOGRAFA Seijas, Antonio. Tincin Gram y manejo del microscopio ptico. Gua de
Laboratorio Ingeniera Sanitaria, UCAB-Guayana, 2012.

ANEXOS

Imagen 1.1. Foto satelital con el rea demarcada de la laguna del Cisne de Anauco y sealizacin del rea de toma de la muestra.

Imagen 1.2. Edificio de biblioteca y la laguna del Cisne de Anauco.

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Imagen. 1.3. Toma de muestra.

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Imagen 2. Maquina Centrifugadora.

Imagen 3. Visualizacin del microscopio

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Imagen 4. Planilla de toma de muestras utilizada en la prctica.

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