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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS & MATEMTICAS MATEMTICAS

Bioqumica
PROTEINAS Y AMINOCIDOS
Aislar Casena a Partir de la Leche

INTRODUCCION: El proposito de este experimento es asilar una protena (casena) de una fuente natural (leche) y demostrar que el producto obtenido es en s una protena llevando a cabo una serie de pruebas a su producto Favor de repasar la estructura y la qumica de protenas en su libro de texto. TEORIA Solubilidad de las protenas: Las protenas son macromolculas que son solubles (suspendidas?) en agua. Las protenas son menos soluble en agua cuando estn en su punto isoelctrico y son ms solubles a valores de pH ms altos o bajos. La solubilidad a valores de pHs diferentes al punto isoelctrico aparenta deberse a un exceso de grupos catinicos o aninicos expuestos en la superficie de la protena. Si la protena est negativamente cargada a pH mayores de su punto isoelctrico, cuando dos protenas chocan una con la otra las cargas negativas se repelen y no se aglomeran como se esperara de molculas grandes. Sin embargo, en el punto isoelctrico de la protena no existe carga neta. Cuando un extremo negativo de una protena se encuentra de frente con el extremo positivo de otra protena, la atraccin electroesttica causa que las dos protenas se peguen. Otras protenas tropiezan con el dmero y se unen al grupo. Eventualmente, un nmero grande de protenas formaran un agregado tal, que la protena precipita. En este experimento, casena (pI = 4.6) se precipitar a partir de la leche (pH 7) por adicin de cido actico glacial.

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Pgina 2 PRUEBA PARA PROTENAS

Prueba Biuret: La prueba Biuret es una prueba general para protenas, no especifica. Cuando una protena reacciona con sulfato de cobre (II) (color azul) se forma como respuesta positiva un complejo color violeta.

AZUL

VIOLETA

La prueba Biuret trabaja para cualquier tipo de compuesto que posea uno o ms de los grupos siguientes:

Prueba de Ninhidrina: La prueba de ninhidrina es positiva para aminocidos y protenas que tengan un grupo -NH2 libre. Cuando el grupo -NH2 reacciona con ninhidrina, se forma un complejo azul-violeta.

AZUL-VIOLETA

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Prueba Xanthproteica: Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden ser nitrados produciendo un compuesto Amarillo:

Compuesto amarillo La produccin de un producto coloreado Amarillo al aadir cido ntrico es una prueba para la presencia de tirosina o triptfano en una protena. La adicin de base fuerte hace que el color se torne ms oscuro hacia anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por cido ntrico son el resultado de la reaccin xanthoproteca. Prueba para metales pesados: Los metales pesados tienen el efecto de precipitar protenas de sus soluciones creando enlaces (cross-linkings) entre los grupos amino libres y los grupos carboxilo libres.

PRECIPITADO

Los iones ms comnmente usados para detector la presencia de protenas incluyen Zn2+, Fe3+, Cu2+, Sb3+, Ag1+, Cd2+, and Pb2+. Entre los metales, Hg2+, Cd2+, and Pb2+ tienen una alta toxicidad. Estos pueden causar serios daos a las protenas (especialmente enzimas) denaturndolas. Victimas que han ingerido iones de mercurio o plomo (Hg2+ o Pb2+ ) se tratan con un antdoto de algn alimento rico en protenas. La protena se combina con los iones de mercurio y plomo minimizando la absorcin de tales iones. Los alimentos ms usados son leche y clara cruda de huevo. La protena que se precipita es removida inmediatamente del estmago mediante un lavado estomacal.

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Aislamiento de la Casena 1. 2. 3. A un matraz Erlenmeyer de 250-mL aada 50.0 g de leche y caliente en una hornilla dentro de un beaker de 600 mL conteniendo 200 mL de agua. Agita la solucin constantemente con una varilla de cristal. Cuando la temperatura del bao llegue a 40o C, remueva el matraz del bao de agua y aada cerca de 10 gotas de cido actico glacial mientras agita para precipitar la casena. Filtre la mezcla a un beaker de 100-mL derramando la mezcla a travs de cheese cloth sujetado al beaker con una gomita. Luego que ya no salga ms lquido, remueva el agente filtrante y suavemente exprima para eliminar lquido. Descarte el filtrado en el vertedero. Usando una esptula raspe cualquier remanente en el cheese cloth. Aada 25 mL de etanol al 95% al precipitado en el matraz. Agite la mezcla por cinco minutos para disolver grasas y agua en la mezcla. Permita que el precipitado se asiente y entonces cuidadosamente decante el alcohol a otro beaker. Disponga del alcohol en el matraz rotulado DESPERDICIOS. Aada 25 mL de una mezcla 1:1 de ter:etanol (PRECAUCIN: Inflamable) al precipitado para remover grasas y agua. Agite la mezcla por unos 5 minutos rotando el matraz para crear una suspensin y filtre por filtracin al vaco derramando la mezcla rpidamente en un embudo Bchner en el extractor. Aada cerca de 5 mL de la mezcla 1:1 de eter:etanol al matraz, agite en fomra de rotacin el matraz y derrame la suspensin en el embudo Bchner. Pase aire sobre la casena por al menos un minuto para secarla.

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Pese la casena y calcule el porcentaje de casena en la leche por usted usada en este experimento.

Anlisis Qumico de Protenas Para cada uno de los primeros tres conjuntos de pruebas usted tendr cinco muestras diferentes. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Prepare tres sets de cinco tubos de ensayo limpios. Rotlelos del 1 al 5. En los tubos #1 aada 15 gotas de glicina al 2% En los tubos #2 aada 15 gotas de gelatina al 2%. En los tubos #3 aada 15 gotas de albmina al 2%. En los tubos #4 aada 15 gotas de tirosina al 2%. En los tubos #5 aada 15 gotas de agua y cerca de de la punta de una esptula con la casena por usted aislada. Prueba Biuret (Set de tubos #1)

I.

A cada uno de los tubos de ensayo aada 5 gotas de solucin NaOH al 10% y dos gotas de CuSO4 diludo mientras agita. La aparicin de un color prpura o violeta es evidencia de la presencia de protenas. En lugar del NaOH y del CuSO4 puede utilizar reactivo Biuret ya preparado si este est disponible. II. Prueba de Ninhidrina (Set de tubos #2)

A cada uno de los tubos aada 5 gots de ninhidrina y caliente en un bao de agua hirviendo por unos 5 minutos. III. Prueba Xanthoproteica (Set de tubos #3)

A cada uno de los cinco tubos aada diez gotas de cido ntrico (HNO3) concentrado mientras agita. Caliente los tubos con mucho cuidado en un bao de agua tibia. Adicionalmente, aada un par de gotas de cido ntrico concentrado a un pedazo seco de huevo hervido duro. Permita que el cido reaccione con el huevo por unos cinco minutos.

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IV.

Prueba de metales pesados.

A cada uno de tres tubos de ensayo limpios aada 2 mL de leche. Aada unas cuntas gotas de los siguientes iones metlicos segn se indica: En el tubo #1: Pb+2 en forma de Pb(NO3)2; En el tubo #2, Hg2+ en forma de Hg(NO3)2; y en el tubo #3, Na1+ en forma de NaNO3. Disponga del plomo y del mercurio en el matraz de desperdicios correspondiente. INFORME DE LABORATORIO Su informe de laboratorio deber ser preparado segn las instrucciones del profesor y debe responder a las preguntas siguientes: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Como fue precipitada la casena? Como se removi la grasa del precipitado de casena? Como se removi el agua del precipitado de casena? Como difiere un embudo Hirsh de uno Bchner? Cuales son las ventajas respectivas de cada uno? Qu pruebas pueden utilizarse para distinguir entre aminocidos y protenas? Qu pruebas pueden utilizarse para distinguir entre un aminocido y un monosacrido? Muchas manchas en las manos pueden ser removidas por lavado. Por qu no pueden ser las manchas de cido ntrico removidas de este modo?

ENE-MAY, 2009

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