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Biotecnologa

Introduccin. La biotecnologa comprende una amplia variedad de tcnicas que utilizan sistemas biolgicos, organismos vivos o sus componentes, para la obtencin de productos y servicios para usos especficos. (ArgenBio, 2007) . La biotecnologa es aplicada por el hombre desde hace ya miles de aos, por ejemplo en la obtencin de alimentos atravs de un proceso llamado fermentacin, el cual es realizado por la accin de diferentes microorganismos como levaduras, bacterias y hongos. El producto final de la fermentacin vara segn el sustrato. La fermentacin es la base de las algunas aplicaciones en la alimentacin humana, pan, quesos, cerveza, vino y otras bebidas fermentadas son algunos ejemplos, por ello tiene mucha importancia econmica. La fermentacin es un proceso catablico, y consiste en el rompimiento de compuestos complejos a compuesto sencillos, donde el aceptor final es una molcula orgnica y en donde no existe la intervencin de la cadena respiratoria, esto a su vez hace que sea un proceso anaerbico puesto que no utiliza el oxgeno del aire como aceptor final (Rosales, 2006). En este tipo de reacciones se produce menos energa (ATP) que en la respiracin y supone una oxidacin parcial de la glucosa y el producto final es una sustancia orgnica que no est totalmente oxidada. La fermentacin tpica o ms conocida es producida por las levaduras, este tipo de fermentacin es llamada fermentacin alcohlica, fue descubierta por Pasteur, que la describi como la vie sans lair (la vida sin el aire). La fermentacin alcohlica es la base de las siguientes aplicaciones en la alimentacin humana, pan, cerveza, vino y otras bebidas fermentadas. Las levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las principales caractersticas de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente carentes de oxigeno (O2), por esta razn se dice que es un proceso anaerbico. El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar
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tambin etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible (Biotecnologiaferraris, 2007)

Fig. 1: El vino es una de los productos que se obtienen gracias a la fermentacin alcohlica. Fuente (Rodriguez, 2003).

La fermentacin alcohlica se puede considerar (desde una perspectiva humana) como un proceso bioqumico para la obtencin de etanol, que por otras vas se ha obtenido gracias a procedimientos qumicos industriales, como por ejemplo mediante la hidratacin de etileno. Es importante recalcar que no solo las levaduras son aquellas que pueden producir fermentacin, tambin producen fermentacin algunos metozoos y protistas (Vela., 2006). Desarrollo. La fermentacin alcohlica es un proceso biolgico en total ausencia de aire (oxgeno - O2), causada por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono (general y principalmente azcares: como pueden ser por ejemplo la glucosa, la fructosa, la sacarosa, el almidn, etc.) para obtener como productos finales: un alcohol en forma de etanol cuya frmula qumica es: CH3-CH2-OH, unas molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energtico anaerbico y dixido de carbono (CO2) en forma de gas, lo que provoca el burbujeo y el aroma caracterstico de la fermentacin. (Vanegas, 2011). Dentro de los principales microorganismos que se utilizan para llevar a cabo la fermentacin alcohlica se encuentran las levaduras, la ms representativa de

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ellas es Saccharomyces cerevisiae: Se conoce como levadura silvestre, por lo que corresponde a una especie no cultivada, produce fermentacin superficial. Otros microorganismos son: Saccharomyces carisbergenis: Especie cultivada, seleccionada, realiza su actividad fermentativa en el fondo de los recipientes. Se considera como la levadura autentica cervecera. Saccharomyces pastorianus: Son clulas ovalas en forma de salchicha, su actividad fermentativa es de fondo. No conveniente en la industria cervecera. Es resistente a altas concentraciones de alcohol y anhdrido sulfuroso. Zymomonas Mobilis: Esta bacteria ofrece ventajas en los procesos continuos de fermentacin), permitiendo la convivencia de una mayor densidad de las mismas durante la produccin (Valcarcel, 2012).

Fig. 2: Levadura Saccharomyces cerevisiae. Fuente (Valcarcel, 2012).

Materia prima para la produccin de etanol. Para la obtencin de etanol, se utilizan productos que contengan azucares, que pueden ser fermentados y transformados a etanol, por ejemplo: Materias sacaroideas como azcar de caa, remolacha, melazas y jugos de frutas. Materias que contienen almidn: cereales (maz, cebada, avena, trigo, arroz, sorgo, papa, boniato, girasol, yuca, etc.
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Materiales celulsicos como madera y residuos de fabricacin de pulpa de papel (Laverde, 2007). Requerimientos necesarios para que se lleve a cabo la fermentacin alcohlica y factores de inhibicin en esta. La actividad de las levaduras, bacterias y hongos, as como de sus enzimas que realizan la fermentacin, se pueden ver influenciadas por agentes externos, esto se refleja en el rendimiento de la operacin, por ello es importante tomarlos en cuanta, pues al conocerlos y controlarlos podremos mejorar la produccin (Rosales, 2006). Los principales requerimientos para que se lleve a cabo una correcta fermentacin alcohlica, as como los factores que pueden influir en la inhibicin de esta, encontramos: pH: La fermentacin se realiza entre un rango de pH entre 3.0 a 5.0. Con este rango no se desarrollan agentes patgenos. El pH es un factor limitante en el proceso de la fermentacin ya que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el ambiente alcalino o cido. Por regla general el funcionamiento de las levaduras est en un rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos industriales procuran mantener los niveles ptimos de acidez durante la fermentacin usualmente mediante el empleo de disoluciones tampn. Los cidos de algunas frutas (cido tartrico, mlico) limitan a veces este proceso (Rodriguez, 2003). Presin: En la actividad fermentativa se forma etanol y se desprende gas carbnico, en la medida que su concentracin aumenta en el recipiente de fermentacin, la presin aumenta y trae como consecuencia una disminucin de la actividad celular, por ello es necesario controlarla (Valcarcel, 2012). Temperatura: la temperatura de fermentacin, 15 27C, esta es la temperatura optima para que las levaduras realicen la fermentacin, mxima puede ser 30C. Nunca se debe permitir que un mosto fermente por encima de los 40 C. Concentracin de azcares: Es la materia prima para las levaduras, la concentracin debe estar entre 14 a 20 grados brix. La concentracin excesiva de

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hidratos de carbono en forma de monosacridos y disacridos puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma la baja concentracin puede frenar el proceso. Las concentraciones lmite dependen del tipo de azcar as como de la levadura responsable de la fermentacin. Las concentraciones de azcares afectan a los procesos de osmosis dentro de la membrana celular (Valcarcel, 2012). Otros factores pueden ser: Concentracin de etanol resultante: Una limitacin del proceso de fermentacin, es la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol que se llegan a producir durante la fermentacin, algunos microorganismos como el

Saccharomyces cerevisiae pueden llegar a soportar hasta el 20% de concentracin en volumen estos crecimientos se modelan con las ecuaciones de crecimiento celular dadas por las ecuaciones de Tessier, Moser y de la ecuacin de Monod (Valcarcel, 2012). Contacto con el aire: Una intervencin de oxgeno (por mnima que sea) en el proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razn por la que los recipientes fermentadores se cierren hermticamente. Ritmo de crecimiento de las cepas: Durante la fermentacin las cepas crecen en nmero debido a las condiciones favorables que se presentan en el medio, esto hace que se incremente la concentracin de levaduras. Proceso Bioqumico de la Fermentacin alcohlica y la estequiometria de la reaccin. La fermentacin alcohlica es la transformacin cuantitativa de la glucosa en etanol y CO2, y tiene como finalidad biolgica proporcionar energa a los

microorganismos que la realizan en ausencia de oxigeno, para ello disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa necesaria para sobrevivir. Para que se realice la fermentacin se requiere de tres etapas estas son: ETAPA I: Reacciones preparatorias (formacin del gliceraldehido 3-P). ETAPA II: Oxidacin (obtencin de ATP y acido pirvico.

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ETAPA III: Reduccin (formacin de productos de la fermentacin). En la fermentacin alcohlica a partir de la glucosa y con la participacin de diferentes enzimas, se origina el cido pirvico, el cual posteriormente es descarboxilado hasta CO2 y acetaldehdo y este ltimo reducido por la accin de la deshidrogenada hasta alcohol etlico. El proceso de fermentacin alcohlica es anaerbico ya que se produce en ausencia de oxigeno es decir que el aceptor final de electrones del NADH producido en la glucolisis (UNC, 2008).

Fig3. Diagrama que muestra el proceso general de la fermentacin alcohlica (Prez, 2012).

Proceso bioqumico de la fermentacin.


Primera etapa. Glucolisis es el primer paso de la respiracin celular y consiste de una serie de reacciones que ocurren en el citoplasma de la clula y por las cuales, a partir de una molcula de glucosa, se producen dos molculas de cido pirvico (piruvato). Todos los organismos llevan a cabo la gluclisis. La gluclisis se divide en dos partes; en la primera la molcula de glucosa se divide en dos molculas de gliceraldehido-3-fosfato y en la segunda estas dos molculas se convierten en dos molculas de cido pirvico (piruvato). Durante la gluclisis se producen dos molculas de ATP (Raisman & Gonzalez, 2007). Glucosa + 2Pi + 2ADP + 2NAD+ 2 Acido pirvico + 2ATP + 2NADH + 2H+.
Fig. 4. Reaccin bioqumica de la glucolisis.

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Segunda etapa La Segunda etapa de la fermentacin alcohlica tiene como objetivo la recuperacin del NAD+ en condiciones anaerbicas, y esto sucede dos reacciones consecutivas: Paso 1. En primer lugar el piruvato se descarboxila (pierde un carbono) mediante la accin de la enzima piruvato descarboxilasa liberando, dixido de carbono (CO2) para dar como producto final acetaldehdo (Raisman & Gonzalez, 2007).

cido pirvico acetaldehdo + CO2.


Fig. 5. Reaccin donde el piruvato se descarboxila para producir acetaldehdo y liberar CO2.

Paso 2. El acetaldehdo es reducido por el NADH a alcohol etlico. En esta operacin el NADH sintetizado en la reaccin bioqumica catalizada por el GADHP se vuelve a oxidar por la alcohol deshidrogenasa, regenerando NAD+ para la continuacin de la gluclisis y sintetizando al mismo tiempo etanol (Raisman & Gonzalez, 2007).

Acetaldehdo + NADH + H+ etanol + NAD+


Fig. 6. Reaccin bioqumica que muestra como el acetaldehdo es reducido por el NADH para la sntesis de alcohol etlico.

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Fig. 7. Imagen que muestra el proceso bioqumico completo de la fermentacin alcohlica. Fuente (Raisman & Gonzalez, 2007).

Balance energtico en la fermentacin alcohlica La fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico exotrmico (libera energa) y molculas de ATP necesarias para el funcionamiento metablico del

microorganismo que la lleva a cabo. Debido a las condiciones de ausencia de oxgeno durante el bioproceso, la respiracin celular de la cadena del ADP en ATP queda completamente bloqueada, siendo la nica fuente de energa para los microorganismos la gliclisis de la glucosa con la formacin de molculas de ATP mediante la fosforilacin a nivel de sustrato. Balance energtico general a nivel molecular mediante la fermentacin alcohlica: La glucosa se transforma en 2 molculas de etanol y 2 de CO 2, produciendo 2 ATP. Por consiguiente, 100 kg de azcar-hexosa = 51,1 kg de etanol + 48,9 kg de CO2. Si se compara este balance con el de la respiracin celular se ver que se generan 38 molculas de ATP. A pesar de ello parece ser suficiente energa para los organismos anaerbicos. La energa libre de Gibbs (entalpa libre) de la reaccin de fermentacin etlica muestra un valor de G de -234.6 kj mol-1 (en un entorno de acidez neutra pH igual a 7) este valor negativo de la energa libre de Gibbs indica que: desde el punto de vista termodinmico la fermentacin etlica es un proceso qumico espontneo (Sansen & Marlon, 2009).

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Tipos de fermentacin alcohlica: Existen 3 principales tipos de fermentacin para producir etanol, a continuacin se describen brevemente. Fermentacin continua: En esta fermentacin se establece un sistema abierto. La solucin nutritiva estril se aade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solucin utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultneamente del sistema. Entre las distintas clases de fermentacin continua pueden distinguir dos tipos de biorreactores con este tipo de fermentacin: Biorreactor mezclado homognicamente: Este es utilizado como un quimiostato o como un turbidostato. Biorreactor de flujo de tapn: En este tipo de fermentacin continua la solucin de cultivo fluye a travs de un reactor tubular sin mezclado. En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la perdida de clulas debida al flujo que sale debe ser balanceada por el crecimiento del microorganismo. Los procesos industriales que utilizan fermentacin continua incluyen el tratamiento de las aguas residuales as como la produccin de la cerveza, glucosa-isomerasa y etanol (Mateos, 2009). Fermentacin alimentada: En el proceso discontinuo los sustratos se aaden al principio de la fermentacin. Una mejora del proceso discontinuo cerrado es la fermentacin alimentada, en este proceso los sustratos se aaden escalonadamente a medida que progresa la fermentacin. Fermentacin discontinua: Una fermentacin discontinua puede ser considerada como un sistema cerrado. A tiempo cero, la solucin esterilizada de nutrientes se inocula con

microorganismos y se permite que se lleve acabo la inoculacin en condiciones ptimas de fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin no se aade nada, excepto oxigeno (en forma de aire), un agente antiespumante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin del medio de cultivo, la concentracin de la

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biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente en forma continua como resultado del metabolismo de las clulas (Lopez, 2006).

Cintica de crecimiento.
El crecimiento, se puede considerar como el aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de un organismo En organismos unicelulares el crecimiento conduce a un aumento en el nmero de clulas ms que un aumento en el tamao celular, as entonces para entender acerca de la cintica de crecimiento es importante conocer los siguientes conceptos. Generacin (n): Es el nmero de divisiones celulares que ocurren en un determinado tiempo en un cultivo microbiano. Velocidad de crecimiento: Es el cambio en el nmero de generaciones(n) por unidad de tiempo (t) y se representa por la siguiente formula.

Tiempo de generacin: Es el tiempo para que partir de una clula se formen dos, es el tiempo requerido para duplicar el nmero de clulas. Una vez que hemos conocido estos trminos podremos entender la cintica de crecimiento.Despus de la inoculacin de una solucin nutritiva estril con microorganismos y su cultivo en condiciones fisiolgicas y tomando en cuenta el tipo de fermentacin discontinua y utilizando como ejemplo Saccharomyces

cerevisiae, podemos observar a continuacion cuatro fases tpicas de crecimiento. FASE DE LATENCIA: En esta etapa la poblacin de levaduras es inoculada, y debe adaptarse o aclimatarse al nuevo medio. Se registra una intensa actividad metablica, pero sin crecimiento, ya que las levaduras estn avocadas a la readecuacin de su maquinaria biolgica al nuevo ambiente. Debido a esta transferencia al nuevo medio probablemente sern alterados por las clulas del inculo varios parmetros: Cambios en el valor del pH, aumento en el suministro de nutrientes, descenso en los inhibidores del crecimiento. En las clulas deben
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ser inducidos nuevos sistemas de transporte. Fuera de la clula pueden difundir cofactores esenciales y las enzimas del metabolismo primario deben ajustarse a las nuevas condiciones (Fermentis, 2009). FASE LOGARTMICA: Al final de la fase de latencia las clulas se han adaptado a las nuevas condiciones de crecimiento. El crecimiento de la masa celular puede ahora ser descrito cuantitativamente en funcin de la duplicacin de nmero de clulas por unidad de tiempo o por la duplicacin de la biomasa por unidad de tiempo. El nombre de esta fase viene porque representando el nmero de clulas o biomasa frente al tiempo en una grfica semilogartmica se obtiene una lnea recta. Cuando se utilizan soluciones nutritivas complejas, frecuentemente se producen dos fases de logartmicas separadas por una fase de latencia. Este proceso se denomina diauxia y se produce debido a que uno de los dos substratos se cataboliza preferentemente. Las enzimas para el catabolismo de los otros substratos se inducen slo despus de que el primer substrato haya sido completamente metabolizado (Lopez, 2006). FASE ESTACIONARIA: Cuando el substrato es metabolizado o se han formado sustancias txicas, el crecimiento desciende o se detiene completamente. La biomasa aumenta slo gradualmente o permanece constante en esta fase, aunque la composicin de las clulas puede cambiar. (Lopez, 2006)Debido a la lisis se liberan nuevos sustratos que pueden servir como fuente de energa para el crecimiento lento de los supervivientes (Pantoja, 2002). FASE DE MUERTE: En esta fase las reservas de energa de las clulas se agotan. La longitud de tiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte dependen del organismo y del proceso utilizado (Lopez, 2006)

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Fig. 8: Figura que muestra el crecimiento de una levadura en el proceso de fermentacin alcohlica.

Conclusin La fermentacin alcohlica es un proceso catablico anaerbico, donde se lleva a cabo el rompimiento de compuestos complejos a compuesto sencillos, la funcin de esta es proporcionar energa a los microorganismos que la llevan a cabo. Sin embargo para el hombre es uno de los procesos biotecnolgicos ms importante, pues gracias a este se elaboran bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava y se fabrica biocombustible. El xito del sistema de fomentacin se puede ver afectado por diferentes factores fsicos y qumico tales como la temperatura, el pH, la presin o la concentracin de azucares, por ello es de gran importancia conocer el proceso bioqumico, as como la estequiometria y la cintica de crecimiento en la reaccin, esto nos ayudara a potenciar la produccin de etanol.

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Referencias
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