120130578ES Propuesta Método Oficial Determinación Aminoácidos en Quesos (Comisión Europea)

.
,

DEPARTAMENTO DE LA INSPECCIN CENTRAL DE PROTECCIN DE LA CALIDAD Y
REPRESIN CONTRA EL FRAUDE DE LOS PRODUCTOS AGROALIMENTARIOS
DIRECCIN GENERAL DE PREVENCIN Y LUCHA CONTRA
EL FRAUDE DE LOS PRODUCTOS AGROALIMENTARIOS

1. ------IND- 2013 0578 I-- ES- ------ 20131105 --- --- PROJET
Decreto n_______
Aprobacin del mtodo oficial de anlisis para la determinacin del contenido de aminocidos
libres en los quesos
EL DIRECTOR GENERAL
EN CONJUNTO CON
EL DIRECTOR GENERAL
DE SANIDAD ANIMAL Y MEDICAMENTOS VETERINARIOS
DEL MINISTERIO DE SANIDAD
EL DIRECTOR
DE LA AGENCIA DE ADUANAS Y MONOPOLIOS
Y
EL DIRECTOR GENERAL
PARA LA POLTICA INDUSTRIAL Y LA COMPETITIVIDAD
DEL MINISTERIO DE DESARROLLO ECONMICO
VISTOS el artculo 43 del Real Decreto-ley n 2033, de 15 de octubre de 1925,
transformado en la Ley n 562, de 18 de marzo de 1926, relativo a las disposiciones sobre
Represin del fraude en la preparacin y la comercializacin de sustancias de uso agrario y
productos agrcolas, y el artculo 108 del Real Decreto n 1361, de 1 de julio de 1926, relativo al
reglamento de aplicacin del citado Real Decreto-ley n 2033/1925, los cuales establecen que los
anlisis de los productos y sustancias establecidas en el Decreto-Ley se realizarn en los
laboratorios designados con los mtodos oficiales prescritos y adoptados por este Ministerio junto
con el Ministerio de Hacienda, Sanidad, Industria, Comercio y Artesanado,
VISTO el Decreto-ley n 282, de 18 de junio de 1986, transformado, con modificaciones, en
la Ley n 462, de 7 de agosto de 1986, cuyo artculo 10 prev la creacin de la Inspeccin central de
represin del fraude en el Ministerio de Agricultura y Recursos Forestales para el ejercicio, entre
otras, de las funciones inherentes a la prevencin y la represin de las infracciones en la preparacin
y la comercializacin de productos agroalimentarios y sustancias de uso agrario y forestal,
VISTO el Decreto del Presidente de la Repblica n 41, de 14 de febrero de 2012, relativo a
la Reorganizacin del Ministerio de Polticas Agrcolas, Alimentarias y Forestales, [...], cuyo
artculo 4 prev para la Inspeccin central la actual denominacin de Departamento de la
Inspeccin central para la proteccin de la calidad y represin del fraude de los productos
agroalimentarios con el acrnimo ICQRF, reiterando, entre las competencias atribuidas al mismo,

.
,


las funciones en materia de actualizacin de los mtodos oficiales de anlisis de los productos
agroalimentarios y de las sustancias de uso agrario y forestal,
VISTO el artculo 2, apartado 1, del Decreto legislativo n 300, de 30 de julio de 1999,
modificado por el Decreto-ley n 85, de 16 de mayo de 2008, transformado con modificaciones en la
Ley n 121, de 14 de julio de 2008, relativo a las Medidas urgentes para la adecuacin de las
estructuras gubernamentales en aplicacin del artculo 1, apartados 376 y 377, de la Ley n 244, de
24 de diciembre de 2007, que establece el nmero y la denominacin de los ministerios,
VISTOS los artculos 57, 63 y 68, apartado 1, del mencionado Decreto-ley n 300/1999, en
materia de creacin de las agencias fiscales, entre las cuales se encuentra la Agencia de Aduanas y
Monopolios y para esta ltima, la atribucin de las competencias, as como la identificacin de las
funciones de Director responsable de la representacin y la direccin de la propia Agencia de
Aduanas y Monopolios,
VISTA la Ley n 172, de 13 de noviembre de 2009, relativa, entre otros, a la creacin del
Ministerio de Sanidad, en vigor desde el 13 de diciembre de 2009,
VISTO el Decreto legislativo n 165, de 30 de marzo de 2001, y sus modificaciones
sucesivas;
VISTO el Decreto ministerial, de 5 de mayo de 2006, del Ministro de Polticas Agrcolas y
Forestales pro-tempore, relativo a la creacin, de conformidad con el artculo 44 de la Ley n 82, de
20 de febrero de 2006, de la Comisin consultiva para la actualizacin de los mtodos oficiales de
anlisis de los productos agroalimentarios y las sustancias de uso agrario y forestal, formada por
diez subcomisiones con competencias sectoriales, entre ellas la Subcomisin de leche y derivados,
creada y nombrada mediante el Decreto ministerial n 1795, de 19 de diciembre de 2008, y
modificada posteriormente en su composicin mediante el Decreto ministerial, de 16 de diciembre
de 2011,
VISTA la Directiva de la Presidencia del Consejo de Ministros, de 4 de agosto de 2010,
relativa a las pautas de interpretacin en materia de reorganizacin de los rganos colegiados y
reduccin de los costes de las entidades administrativas, que ha establecido el funcionamiento, en
rgimen de prrroga, de la mencionada Comisin consultiva y de las correspondientes
subcomisiones, hasta el 28 de junio de 2012,
VISTO el Reglamento de ejecucin (UE) n 584/2011 de la Comisin, de 17 de junio de
2011, por el que se aprueban modificaciones que no son de menor importancia del pliego de
condiciones de una denominacin inscrita en el Registro de Denominaciones de Origen Protegidas y
de Indicaciones Geogrficas Protegidas [Grana Padano (DOP)], en el que se hace referencia a la

.
,


composicin especfica en aminocidos, que debe determinarse mediante el empleo de
cromatografa de intercambio inico con deteccin fotomtrica poscolumna con ninhidrina,
VISTO el Reglamento de ejecucin (UE) n 794/2011 de la Comisin, de 8 de agosto de
2011, por el que se aprueban modificaciones del pliego de condiciones de una denominacin
inscrita en el Registro de Denominaciones de Origen Protegidas y de Indicaciones Geogrficas
Protegidas [Parmigiano Reggiano (DOP)], en el que se dispone que la tipologa rallado presente,
entre otros requisitos, una composicin especfica en aminocidos del Parmiggiano Reggiano,
VISTOS los Decretos del Presidente del Consejo de Ministros, de 4 de noviembre de 1991,
mediante los cuales se extiende la denominacin de origen del queso Parmiggiano Reggiano y
Grana Padano a la correspondiente categora rallado, a condicin expresa de que se indique su
composicin especfica en aminocidos,
VISTO el Reglamento (CE) n 882/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo sobre los
controles oficiales efectuados para garantizar la verificacin del cumplimiento de la legislacin en
materia de piensos y alimentos que establece en el captulo III, artculo 11: Muestreo y anlisis
que los mtodos de anlisis utilizados en los controles oficiales sern conformes con la normativa
comunitaria pertinente o a falta de esta normativa, con las normas o los protocolos
internacionalmente reconocidos [...] o con los aceptados por la legislacin nacional; y que
siempre que sea posible, los mtodos de anlisis se caracterizarn mediante los criterios de
precisin pertinentes,
CONSIDERANDO que es necesario establecer un mtodo de anlisis para el control del
contenido en aminocidos libres de los quesos con denominacin de origen protegida anteriormente
mencionados, con el fin de reforzar los instrumentos de proteccin y vigilancia de los productos
registrados con denominacin de origen protegida e indicacin geogrfica protegida,
CONSIDERANDO el dictamen relativo, emitido en la reunin de 15 de julio de 2011, de la
Comisin consultiva para la actualizacin de los mtodos oficiales de anlisis de los productos
agroalimentarios y las sustancias de uso agrario y forestal - Subcomisin leche y derivados,
anteriormente mencionada,
VISTOS los resultados, documentados con nota prot. DGPREF n 4953, de 4 de abril de
2013, del ICQRF, del circuito interlaboratorio creado con nota prot. EX DG PREF n 9553, de 5 de
julio de 2012, del ICQRF, para la validacin de un mtodo de anlisis para la determinacin del
contenido en aminocidos libres en los quesos, mediante el empleo de cromatografa de intercambio
inico con deteccin fotomtrica poscolumna con ninhidrina, de conformidad con el dictamen de la
Comisin a que se refiere el punto anterior, que han demostrado la idoneidad del mtodo que debe
utilizarse para la aplicacin del control oficial,

.
,


VISTA la Directiva 98/34/CE y sus modificaciones sucesivas, por la que se establece un
procedimiento de informacin en materia de las normas y reglamentaciones tcnicas,
DECRETA
Artculo 1

1. Se aprueba el mtodo oficial de anlisis para la determinacin del contenido en aminocidos
libres en los quesos, descrito en el anexo del presente Decreto.
2. El mbito de aplicacin del mtodo a que se refiere el apartado 1 se define en el mtodo
mismo.

Artculo 2

El mtodo de anlisis en virtud del presente Decreto se aplica al control de los productos
nacionales.
El presente Decreto, que ser remitido al rgano de control competente, entrar en vigor al da
siguiente de su publicacin en el Boletn Oficial de la Repblica Italiana.

por EL MINISTERIO DE POLTICAS AGRCOLAS, ALIMENTARIAS Y FORESTALES
El Director General de la Direccin General de prevencin y lucha contra el fraude
agroalimentario
por EL MINISTERIO DE SANIDAD
por LA AGENCIA DE ADUANAS Y MONOPOLIOS
El Director
por EL MINISTERIO DE DESARROLLO ECONMICO

Roma,

.
,


.
,


Decreto _______

ANEXO: MTODO DE ANLISIS

QUESO - DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE AMINOCIDOS LIBRES

1. OBJETIVO Y MBITO DE APLICACIN
La presente norma describe la determinacin del contenido de aminocidos libres en el queso,
mediante el uso de analizadores de aminocidos de intercambio inico, en referencia a los
aminocidos que figuran en el siguiente cuadro 1:

Cuadro 1. Aminocidos y acrnimo correspondiente

Aminocido Acrnimo
cido asprtico ASP
cido -aminobutrico GABA
cido glutmico GLU
Alanina ALA
Arginina ARG
Asparagina ASP
Citrulina CIT
Fenilalanina PHE
Glicina GLY
Glutamina GLN
Isoleucina ILE
Histidina HIS
Leucina LEU
Lisina LYS
Metionina MET
Ornitina ORN
Prolina PRO
Serina SER
Tirosina TYR
Treonina THR
Valina VAL

.
,


ADVERTENCI A: para la utilizacin del presente mtodo puede ser necesario el uso de
sustancias peligrosas o la puesta en marcha de operaciones que conllevan un cierto riesgo.
El presente mtodo no tiene el objetivo de afrontar todos los problemas de seguridad
relacionados con su empleo, la persona que lo lleve a cabo ser responsable de la
definicin del procedimiento de seguridad apropiado y del respeto de la legislacin vigente.

2. NORMATIVA DE REFERENCIA
UNI EN ISO 3696:1996 Agua para uso en anlisis de laboratorio. Especificacin y mtodos
de ensayo.
ISO 707:2008 (IDF 50:2008) Leche y productos lcteos. Directrices para la toma de muestras
UNI ISO 5725-2:2004 Exactitud (veracidad y precisin) de resultados y mtodos de
medicin. Parte 2: Mtodo bsico para la determinacin de la repetibilidad y la
reproducibilidad de un mtodo de medicin normalizado

3. TRMINOS Y DEFINICIONES
3.1. Contenido de aminocido XXX (acrnimo): cantidad de aminocido XXX en la
muestra, expresada en mg/kg;
3.2. Aminocidos libres totales: suma del contenido de los aminocidos establecidos en el
cuadro 1, expresados en mg/kg.

4. PRINCIPIO
El queso se disolver con tampn de citrato de sodio; las macromolculas en disolucin se
precipitarn con cido sulfosaliclico y se retirarn por filtracin.
La solucin filtrada que contiene los aminocidos libres se diluir y los aminocidos se
separarn por cromatografa de intercambio inico y se determinarn mediante reaccin
poscolumna con ninhidrina utilizando deteccin fotomtrica a 570 y 440 mm.

5. REACTIVOS
5.1. Agua, ultrapura de tipo I, segn la norma UNI ISO 3696.
5.2. cido clorhdrico, fumante 37 %.

.
,


5.3. 2,2-tio-dietanol (tiodiglicol), solucin acuosa 25 % para la preparacin de tampones de
elucin.
5.4. 2-propanol, para la preparacin de tampones de elucin.
5.5. Aminocidos estndar, enumerados en el apartado 1.
5.6. Solucin de hidrxido sdico, 12 mol/l.
Disulvanse 480 g de NaOH en agua hasta completar 1 l.
5.7. Tampn de citrato de sodio, 0,2 mol/l, pH 2,20, para la extraccin de los aminocidos
libres.
Disulvanse 19,61 g de citrato de sodio dihidratado, 400 mg de EDTA sal disdica,
100 ml de pentaclorofenol (50 mg de pentaclorofenol disueltos en 10 ml de alcohol
etlico) y 16 ml de cido clorhdrico en aproximadamente 800 ml de agua. Djese
en agitacin durante veinticuatro horas, ajstese el pH a 2,20 con cido clorhdrico,
controlando con pH-metro (6.2), hasta completar 1 l con agua, posteriormente
fltrese al vaco sobre membrana de acetato de celulosa, con poros de 0,2 m.
5.8. cido 5-sulfosaliclico, = 7,5 %, desproteinizante. Disulvanse 75 g de cido 5-
sulfosaliclico dihidratado en aproximadamente 800 ml de tampn citrato (5.7).
Ajstese el pH a 1,7-1,8 con solucin de hidrxido sdico (5.6) hasta completar 1 l
con tampn citrato (5.7), posteriormente fltrese al vaco sobre membrana de
acetato de celulosa, con poros de 0,45 m (6.6).
5.9. Tampn de citrato de litio, para la dilucin de las muestras y de los estndares de
referencia. Disulvanse 8,4 g de hidrxido de litio monohidratado, 9,6 g de cido
ctrico, 100 ml de pentaclorofenol (50 mg de pentaclorofenol disueltos en 10 ml de
alcohol etlico) y 8 ml de 2,2-tio-dietanol, solucin acuosa 25 %, en
aproximadamente 800 ml de agua.
Djese en agitacin durante veinticuatro horas, ajstese el pH a 2,20 con cido
clorhdrico (5.2), controlando con pH-metro (6.2), hasta completar 1 l con agua,
posteriormente fltrese al vaco sobre membrana de acetato de celulosa, con poros
de 0,2 m (6.6).
5.10. Solucin de norleucina de aproximadamente 600 mg/l, como estndar interno.
En un matraz aforado de 100 ml, psense, con una balanza analtica (6.1),
aproximadamente 60 mg de norleucina y rellnese hasta el enrase con tampn de
citrato de litio (5.9). La disolucin se conservar en el frigorfico y tiene una
duracin de seis meses.
5.11. Ninhidrina, preparada segn las indicaciones del productor.
5.12. Tampn de elucin, comprados ya listos o preparados en laboratorio, segn las
indicaciones del cuadro 1.

.
,


Los tampones se prepararn con sales de litio necesarias para la separacin de la
asparagina y la glutamina. El mtodo necesita cinco tampones de elucin y una
solucin regenerante.
Su composicin se proporciona en el cuadro 2 (pesados para 1 l de disolucin):

Cuadro 2. Composicin de los tampones de elucin

TAMPN
N 1
TAMPN
N 2
TAMPN
N 3
TAMPN
N 4
TAMPN
N 5
TAMPN
N 6
TAMPN
DILUYENTE
pH 2.84 3.00 3.15 3.50 3.58 ---- 2.20

MOLARIDAD
(LI
+
)
0,2 0,3 0,5 0,9 1,62 0,3 0,2
HIDRXIDO DE
LITIO
MONOHIDRAT
ADO
8,4 g 8,4 g 8,4 g 4,2 g 7,0 g 12,59 g 8,4 g
CIDO
CTRICO
9,6 g 9,6 g 9,6 g 9,6 g 21,0 g ---- 9,6 g
CLORURO DE
LITIO
---- 4,25 g 12,72 g 34,0 g 61,5 g ---- ----
PENTACLOROFE
NOL
0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
TIODIGLICOL
(25 %)
8 ml 8 ml 8 ml ---- ---- ---- 8 ml
2-PROPANOL 15 ml 15 ml ---- ---- ---- ---- ----
CIDO
CLORHDRICO
37 %
14 ml 13 ml 12 ml 3 ml ---- ---- 14 ml

6. EQUIPOS
Equipos comunes de laboratorio y, en concreto:
6.1. Balanza analtica, con una sensibilidad de 0,1 mg.
6.2. pH-metro, con sensibilidad de 0.01 unidad pH.
6.3. Agitador magntico.
6.4. Homogeneizador tipo Ultra-Turrax.
6.5. Bureta electrnica, o pipetas aforadas de cristal.
6.6. Filtros de membrana inertes de jeringa, poros de 0,2 m y de 0,45 m.

.
,


6.7. Filtros de papel, rpidos (tipo S&S 589/1, Whatman Grade 41 o equivalente).
6.8. Filtros de papel, lentos (tipo S&S 589/3, Whatman Grade 42 o equivalente).
6.9. Cromatgrafo de intercambio inico, equipado con columna de intercambio inico,
bao de reaccin termostatizado para la derivatizacin poscolumna con ninhidrina
utilizando detector fotomtrico capaz de leer la longitud de onda de 570 y 440 nm.

7. MUESTREO
El muestreo no forma parte del mtodo especificado en la presente norma. Se recomienda el
mtodo de muestreo establecido en la norma ISO707/IDF50.
Deber enviarse una muestra representativa al laboratorio. Esta no deber sufrir daos o
modificaciones durante su transporte o conservacin.
El laboratorio conservar la muestra para evitar el deterioro o la modificacin de su
composicin.

8. PREPARACIN DE LA MUESTRA
8.1. Preparacin de la muestra
Antes de la extraccin de los aminocidos libres, la muestra de queso deber estar molida
finamente.

8.2. Extraccin de los aminocidos libres
El procedimiento de extraccin de los aminocidos libres se llevar a cabo a temperatura
ambiente, aproximadamente no superior a 25 C.
En un vaso de precipitados de 100 ml, psese, con balanza analtica (6.1), 1,5 g de queso
molido finamente, posteriormente adanse, con bureta electrnica o con pipeta de cristal
aforada, 40 ml de tampn de citrato de sodio 0,2 N pH 2.20 (5.7). Colquese el vaso de
precipitados sobre un agitador magntico con barra magntica y djese en agitacin durante
quince minutos. Psese la disolucin bajo homogeneizador (6.4), a la velocidad mnima,
durante cinco minutos, posteriormente fltrese a travs de un filtro de papel rpido (6.7) en un
matraz de 100 ml.
Retrense, con pipeta de cristal aforada, 10 ml del filtrado y transfiranse a un matraz aforado
de 25 ml. Posteriormente, en presencia de barra magntica, agtese en un agitador (6.3) y
adanse, gota a gota, 10 ml de solucin de cido sulfosaliclico 7,5 % pH 1,7-1,8 (5.8).
Djese agitar durante cinco minutos y rellnese hasta el enrase con tampn de citrato 0,2 N
con pH 2,2 (5.7); agtese, despus fltrese a travs de un filtro de papel lento (6.8) en probeta.
Retrense, con pipeta de cristal aforada, 10 ml del filtrado y transfiranse a un matraz aforado
de 100 ml, adanse 2 ml de solucin de norleucina de aproximadamente 600 mg/l (5.10) y

.
,


rellnese hasta el enrase con tampn de citrato de litio (5.9). Fltrese la disolucin obtenida
con un filtro de jeringa sobre membrana de celulosa regenerada (RC) con poros de 0,2 m
antes de proceder al anlisis instrumental.

8.3. Preparacin de las disoluciones estndar de referencia
8.3.1. Mezcla de referencia concentrada de aminocidos, de aproximadamente:
300 mg/l para: cido -aminobutrico, citrulina, glicina, glutamina;
400 mg/l para: alanina, arginina, asparagina, metionina, ornitina, tirosina,
treonina;
600 mg/l para: cido asprtico, fenilalanina, isoleucina, histidina, serina;
800 mg/l para: leucina, prolina, valina;
900 mg/l para: cido Glutmico, lisina.

En un matraz aforado de 100 ml, psense, con balanza analtica, aproximadamente 30 mg de
cido -amino-butrico, citrulina, glicina y glutamina; aproximadamente 40 mg de alanina,
arginina, asparagina, metionina, ornitina, tirosina y treonina; aproximadamente 60 mg de
cido asprtico, fenilalanina, isoleucina, histidina y serina; aproximadamente 80 mg de
leucina, prolina y valina; y aproximadamente 90 mg de cido glutmico y lisina. Rellnese
hasta el enrase con tampn de citrato de litio (3.9). En el clculo de las concentraciones, se
tendr en cuenta la pureza de cada uno de los aminocidos pesados.
La disolucin se conservar en el congelador y tiene una duracin de seis meses.

8.3.2. Mezcla de referencia intermedia de aminocidos:
En un matraz aforado de 100 ml, transfiranse, con pipeta de cristal aforada, 50 ml de la
mezcla concentrada y rellnese hasta el enrase con tampn de citrato de litio (3.9).
La disolucin se conservar en el congelador y tiene una duracin de seis meses.

8.3.3. Mezcla de referencia diluida A de aminocidos de aproximadamente:
0,75 mg/l para: cido -aminobutrico, citrulina, glicina, glutamina;
1,0 mg/l para: alanina, arginina, asparagina, metionina, ornitina, tirosina, treonina;
1,5 mg/l para: cido asprtico, fenilalanina, isoleucina, histidina, serina;
2,0 mg/l para: leucina, prolina, valina;
2,25 mg/l para: cido Glutmico, lisina.

En un matraz aforado de 100 ml, transfiranse, con pipetas de cristal aforadas, 0,5 ml de la
mezcla de referencia intermedia de aminocidos y 2 ml de la disolucin de norleucina de
aproximadamente 600 mg/l (3.10). Rellnese hasta el enrase con tampn de citrato de litio
(3.9).

.
,


La disolucin se conservar en el congelador y tiene una duracin de dos meses.

8.3.4. Mezcla de referencia diluida B de aminocidos de aproximadamente:

En un matraz aforado de 100 ml, transfirase, con pipetas de cristal aforadas, 1 ml de la
(3.9).

8.3.5. Mezcla de referencia diluida C de aminocidos de aproximadamente:

En un matraz aforado de 100 ml, transfiranse, con pipetas de cristal aforadas, 2 ml de la
(3.9).

8.3.6. Mezcla de referencia diluida D de aminocidos de aproximadamente:
10,0 mg/l para: alanina, arginina, asparagina, metionina, ornitina, tirosina,
treonina;

En un matraz aforado de 100 ml, transfiranse, con pipetas de cristal aforadas, 5 ml de la

.
,


(3.9).

9. PROCEDIMIENTO
9.1. Separacin de los aminocidos libres
9.1.1. Principio del mtodo
El principio analtico se basa en la elucin de la muestra en una columna cromatogrfica de
intercambio inico, seguida de derivatizacin poscolumna con ninhidrina, deteccin con
colormetro, obtencin y posterior tratamiento de los datos mediante ordenador dotado del
software adecuado.
La comparacin de los diferentes tiempos de retencin con los de una disolucin de
aminocidos estndar (6.1-6.6) permite identificar los aminocidos presentes en la muestra.
El laboratorio verifica la capacidad de aplicar el mtodo, con referencia particular a la
capacidad de separacin (sobre todo en relacin con el triplete ASN/GLU/GLN) y la
linealidad de la respuesta.

9.1.2. Condiciones cromatogrficas
Ajstese el instrumento de acuerdo con las siguientes condiciones:
volumen de inyeccin: 100 l de muestra anteriormente filtrada sobre acetato de
celulosa 0,2 m
velocidad de flujo de los tampones: 20 ml/h
velocidad de flujo de la ninhidrina: 20 ml/h
duracin de la adquisicin de datos: aproximadamente 160 min.
tiempo de regeneracin: 47 min.
temperatura del bao de reaccin: 135 C
gradiente de elucin: vase cuadro 3

Cuadro 3. Gradiente de elucin
N Tiempo Temperatura
Tampn
(vase
cuadro 1)
Flujo Ninhidrina Comandos
1 01:00 31
o
C 1 20 ml/h ON
2 00:00 31
o
C 1 20 ml/h ON Reset
3 01:00 31
o
C 1 20 ml/h ON Load
4 05:30 31
o
C 1 20 ml/h ON
5 38:00 31
o
C 2 20 ml/h ON

.
,


6 17:00 40
o
C 3 20 ml/h ON
7 10:00 64
o
C 3 20 ml/h ON
8 34:00 64
o
C 4 20 ml/h ON
9 50:00 76
o
C 5 20 ml/h ON
10 06:00 76
o
C 6 20 ml/h ON
11 10:00 31
o
C 1 20 ml/h ON
12 01:00 31
o
C 1 OFF OFF
13 30:00 31
o
C 1 25 ml/h OFF
14 06:00 31
o
C 1 20 ml/h ON
Fin

.
,


En la figura 1 se muestra un ejemplo de separacin cromatogrfica de los aminocidos. Las
condiciones de separacin mencionadas con anterioridad podrn modificarse, pero
garantizando una capacidad de separacin de los aminocidos como mnimo igual a la que se
muestra en la figura 1.

Fig. 1. Separacin de los aminocidos libres de una disolucin estndar (con referencia
particular a los tripletes crticos ASN-GLU-GLN y GLY-ALA-CIT)

10. CLCULOS Y EXPRESIN DE LOS RESULTADOS
10.1. Clculos
A partir de los valores obtenidos para las cuatro disoluciones estndar de aminocidos (8.3.3-
8.3.6) se construirn las curvas de calibracin de los aminocidos. Para la determinacin de
las correspondientes ecuaciones, las curvas de calibracin se vern obligadas a atravesar el
origen de los ejes.
Por interpolacin lineal sobre las correspondientes curvas de calibracin se derivarn las
concentraciones de los aminocidos, presentes en las disoluciones (8.2) de extraccin de las
muestras.
El resultado se indicar en la cantidad inicial de la muestra.

10.2. Expresin de los resultados
Minutes
Name

.
,


El resultado se expresar, para cada aminocido, en mg de aminocido por kg de muestra de
queso, sin cifras decimales.

11. PRECISIN
Los valores de repetibilidad y reproducibilidad, para cada aminocido, se han obtenido en un
circuito interlaboratorio, realizado en 2012 (vase anexo A). Las pruebas se realizaron en
muestras con un contenido de aminocidos libres totales variables entre aproximadamente
57 000 mg/kg y 80 000 mg/kg y con un contenido de aminocido variable individual de
aproximadamente 100 mg/kg (GABA) a unos 13 000 mg/kg (GLU).

11.1. Repetibilidad
Hace referencia a los datos que figuran en el cuadro 4.

11.2. Reproducibilidad
Hace referencia a los datos que figuran en el cuadro 4.

Cuadro 4. Valores de desviacin estndar de repetibilidad y desviacin estndar de
reproducibilidad para cada aminocido obtenidos

Repetibilidad (
r
) Reproducibilidad (
r
)

Media y = mx + b
1
Media y = mx + b
1

r m b r m b
ASP 23 0,017 13,437 165 0,055 47,353
GABA 10 0,08 8,605 42 0,123 23,704
GLU 129 0,006 56,718 389 0,026 85,965
ALA 27 0,043 49,995 132 0,042 57,752
ARG 28 0,011 13,396 96 0,033 49,429
ASP 42 0,002 35,914 136 0,122 237,218
CIT 37 0,022 4,933 113 0,040 35,943
PHE 46 0,002 40,108 167 0,088 137,105
GLY 21 0,008 7,391 108 0,041 39,611
GLN 45 0,025 27,105 89 0,070 39,611
ILE 97 0,082 261,360 201 0,102 244,161
HIS 37 0,016 3,253 154 0,034 81,302
LEU 139 0,091 430,871 370 0,017 474,065
LYS 76 0,004 43,866 377 0,007 433,832
MET 42 0,084 91,746 110 0,143 119,131
ORN 7 0,013 3,911 28 0,045 19,295
PRO 134 0,051 187,572 349 0,117 1094,494
SER 52 0,013 2,414 234 0,043 65,764
TYR 111 0,484 766,276 195 0,282 316,060
THR 25 0,010 1,490 106 0,003 99,774
VAL 54 0,017 29,961 216 0,040 20,369
AA TOT 596 0,022 925,668 2907 0,051 610,841

.
,


1
En la ecuacin indicada (y = mx + b), y corresponde a r/R y x corresponde a la concentracin en
mg/kg de cada aminocido

.
,


12. BIBLIOGRAFA
D.H. Spackman, W.H. Stein, y S. Moore, Anal. Chem., 30, 1190 (1958);
J.V. Benson, Jr, M.J. Gordon, y J.A. Patterson, Anal. Biochem., 18, 228 (1967);
Informe final del circuito interlaboratorio CI, de 2 de enero de 2012,
proporcionado por el Departamento de la Inspeccin central de proteccin de la
calidad y represin del fraude de los productos agroalimentarios (ICQRF), con
nota DG PREF - Laboratorio Central de Roma - prot. n 0004953, de 4 de abril
de 2013.

13. ANEXO A (INFORMATIVO) - RESULTADOS DEL CIRCUITO
INTERLABORATORIO
El circuito interlaboratorio organizado para la validacin del presente mtodo se realiz
durante el ao 2012. Los resultados obtenidos en las dos pruebas fueron objeto de anlisis
estadstico de acuerdo con la norma ISO 5725-2:2004, para proporcionar los datos de
precisin indicados en el siguiente cuadro A.1.
El circuito se realiz sobre cuatro muestras con contenido variable de aminocidos
individuales (de aproximadamente 100 mg/kg a unos 13 000 mg/kg) y de aminocidos libres
totales (de aproximadamente 57 000 mg/kg a 80 000 mg/kg).
En el circuito participaron siete laboratorios expertos. Ningn laboratorio se excluy de la
prueba. Algunos resultados se excluyeron de la elaboracin estadstica tras la aplicacin de
las pruebas de Cochran y de Grubbs. Para mayor informacin, consltese el informe del
circuito (vase bibliografa).
A continuacin se incluye un cuadro sinptico con los datos de mayor inters procedentes del
circuito.

.
,


Cuadro A.1. Resultados del circuito interlaboratorio de aminocidos libres
ASP GABA GLU ALA ARG ASN CIT PHE GLY GLN ILE
Muestra
1
media (mg/kg)
2 651 139 13 816 1 994 242 3 387 2 989 3 913 2 386 609 4 957
sr
24 13 110 49 16 49 91 44 26 39 127
sR 214 45 443 140 47 236 203 202 138 95 284
CV%r 0,9 % 9,6 % 0,8 % 2,5 % 6,4 % 1,5 % 3,0 % 1,1 % 1,1 % 6,3 % 2,6 %
CV%R 8,1 % 32,5 % 3,2 % 7,0 % 19, 3 % 7,0 % 6,8 % 5,2 % 5,8 % 15,7 % 5,7 %
Muestra
2
media (mg/kg)
2 523 210 12 261 1 908 2 188 2 891 1 205 3 512 1 557 350 4 807
sr
37 9 168 24 55 38 14 56 24 38 174
sR 173 48 423 158 216 182 94 184 109 57 293
CV %r 1,5 % 4,2 % 1,4 % 1,3 % 2,5 % 1,3 % 1,2 % 1,6 % 1,5 % 10,9 % 3,6 %
CV %R 6,6 % 22,8 % 3,5 % 8,3 % 9,9 % 6,3 % 7,8 % 5,2 % 7,0 % 16,3 % 6,1 %
Muestra
3
media (mg/kg)
2 077 100 11 958 1 776 328 3 213 2 872 3 615 1 550 494 4 236
sr
25 7 144 16 15 36 30 40 18 38 49
sR 139 33 370 105 60 51 99 172 99 72 54
CV %r 1,2 % 7,0 % 1,2 % 0,9 % 4,7 % 1,1 % 1,0 % 1,1 % 1,1 % 7,6 % 1,2 %
CV %R 6,7 % 33,1 % 3,2 % 5,9 % 18,1 % 1,6 % 3,5 % 4,8 % 6,4 % 14,5 % 1,3 %
Muestra
4
media (mg/kg)
1 390 8 920 1 417 2 459 2 752 578 2 877 1 155 1 346 3 493
sr
8 94 16 26 47 15 42 15 62 39
sR 134 321 124 48 74 54 11 87 132 171
CV %r 0,6 % 1,1 % 1,2 % 1,1 % 1,7 % 2,6 % 1,5 % 1,3 % 4,6 % 1,1 %
CV %R 9,7 % 3,6 % 8,7 % 2,0 % 2,7 % 9,4 % 3,9 % 7,5 % 9,8 % 4,9 %

HIS LEU LYS MET ORN PRO SER TYR THR VAL AA TOT
Muestra
1
media (mg/kg) 2 184 6 688 9 346 1 925 382 7 060 4 540 1 858 1 849 5 640 79 059
sr 56 198 67 67 10 200 44 165 22 62 864
sR 153 478 421 152 36 260 287 266 108 321 4 251
CV %r 2,5 % 3,0 % 0,7 % 3,5 % 2,6 % 2,8 % 1,0 % 8,9 % 1,2 % 1,1 % 1,1 %
CV %R 7,0 % 7,2 % 4,5 % 7,9 % 9,4 % 3,7 % 6,3 % 14,3 % 5,8 % 5,7 % 5,4 %
Muestra
2
media (mg/kg) 1 980 6 226 8 180 1 722 102 6 377 4 651 1 682 2 620 4 988 72 008
sr 37 264 100 64 9 139 69 63 23 74 828
sR 168 375 342 167 26 373 250 141 148 84 3 338
CV %r 1,9 % 4,2 % 1,2 % 3,7 % 8,9 % 2,2 % 1,5 % 3,8 % 0,9 % 1,5 % 1,2 %
CV %R 8,5 % 6,0 % 4,2 % 9,7 % 25,8 % 5,8 % 5,4 % 8,4 % 5,7 % 1,7 % 4,6 %
Muestra
3
media (mg/kg) 2 317 6 616 7 803 1 519 253 6 628 3 708 2 000 2 450 4 880 69 364
sr 31 64 77 19 5 102 63 188 36 44 267
sR 166 240 308 45 31 306 212 216 47 235 944
CV%r 1,3 % 1,0 % 1,0 % 1,3 % 1,9 % 1,5 % 1,7 % 9,4 % 1,5 % 0,9 % 0,4 %
CV%R 7,2 % 3,6 % 4,0 % 3,0 % 12,2 % 4,6 % 5,7 % 10,8 % 1,9 % 4,8 % 1,4 %
Muestra
4
media (mg/kg) 2 043 5 650 6 340 1 226 80 5 376 2 722 1 710 2 091 3 928 57 682
sr 23 29 60 16 2 94 31 30 18 36 426
sR 129 388 437 76 20 457 189 156 120 222 3 093
CV %r 1,1 % 0,5 % 0,9 % 1,3 % 3,1 % 1,7 % 1,1 % 1,7 % 0,9 % 0,9 % 0,7 %
CV %R 6,3 % 6,9 % 6,9 % 6,2 % 25,6 % 8,5 % 6,9 % 9,1 % 5,7 % 5,6 % 5,4 %

120130578ES Propuesta Método Oficial Determinación Aminoácidos en Quesos (Comisión Europea)

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

120130578ES Propuesta Método Oficial Determinación Aminoácidos en Quesos (Comisión Europea)

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

.

También podría gustarte