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NORMA TCNICA NTC

COLOMBIANA 1232


1996-10-23




MTODO DE ANLISIS DE AFLATOXINAS DE
OCURRENCIA NATURAL (B1, B2, G1 Y G2)











E: ANALYSIS METHOD FOR AFLATOXINS OF NATURAL
OCURRENCE


CORRESPONDENCIA:


DESCRIPTORES: cereal en grano; granos; producto
vegetal.
















I.C.S.: 67.060.00; 65.120.00

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435
Prohibida su reproduccin Primera actualizacin
Editada 2001-09-11









PRLOGO



El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional
de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.

El ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector
gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los
mercados interno y externo.

La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica
est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo
caracterizado por la participacin del pblico en general.

La NTC 1232 (Primera actualizacin) fue ratificada por el Consejo Directivo el 96-10-23.

Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs
de su participacin en el Comit Tcnico.

AGREVO - SEMILLAS TROPICALES
BASF DE COLOMBIA
BOLSA NACIONAL AGROPECUARIA
CONCENTRADOS RAZA
CONTEGRAL
FINCA
INSTITUTO DE MERCADEO
AGROPECUARIO

INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO
MEJA Y CA
NESTL
NULAB
NUTRIANLISIS
SOLLA S.A.
UNIVERSIDAD NACIONAL
Adems de las anteriores, en consulta pblica el proyecto se puso a consideracin de las
siguientes empresas:

ANDI
BAYER
FEDERACIN NACIONAL DE
CULTIVADORES DE PALMA
GRASAS S.A.
LUCTA GRAN COLOMBIANA
ASOHUEVO
FEDERACIN NACIONAL DE MOLINEROS
DE TRIGO
INDUSTRIAS DEL MAZ
MINISTERIO DE AGRICULTURA
BAVARIA S.A.
FEDERACIN NACIONAL DE
CULTIVADORES DE CEREALES
LLOREDA GRASAS

El ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN



NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC 1232 (Primera actualizacin)

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MTODO DE ANLISIS DE AFLATOXINAS DE OCURRENCIA
NATURAL (B1, B2 G1 Y G2)









1. OBJETO

La presente norma establece un mtodo de anlisis de aflatoxinas de ocurrencia natural (B1,
B2, G1 y G2) en granos, cereales y alimentos balanceados de consumo animal utilizando la
tcnica analtica conocida como cromatografa lquida de alta eficiencia o HPLC (High-
performance liquid chromatography). Alternativamente se ofrece un mtodo por cromatografa
en capa delgada o TLC (Thin-layer chromatography).


2. PRINCIPIO

Las aflatoxinas (AF) se extraen con una mezcla de acetonitrilo: agua (84 + 16) y se purifican
con una columna multifuncional de limpieza. Luego de evaporar el extracto bajo una corriente
de nitrgeno, las AFB1 y AFG1 se derivatizan a sus correspondientes hemiacetales (AFB2a y
AFBG2a) con cido trifluoroactico. La separacin de las cuatro Aflatoxinas [B1 (B2a), B2, G1
(B2a) y G2] se hace en una columna cromatogrfica de fase reversa (RP - 18). Las Aflatoxinas
se detectan finalmente y se cuantifican mediante un espectrofotmetro de fluorescencia
acoplado a un integrador-graficador, utilizando un mtodo de cuantificacin por estndar
externo.


3. APLICACIONES DEL MTODO

El mtodo se ha utilizado en los siguientes substratos: maz, sorgo, arroz, torta de algodn,
torta de soya, harina de yuca, subproductos de trigo, alimentos concentrados, gluten de maz,
man, almendras, pistachos y pasta de breva. Si se requiere analizar un substrato diferente a
los anteriores se sugiere hacer una revalidacin del mtodo, con el fin de determinar si se
precisa hacer modificaciones al mtodo.


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4. MTODO POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

4.1 APARATOS Y MATERIALES

4.1.1 Columna de limpieza

El material de empaque de la columna debe tener sitios activos lipoflicos y un intercambiador
inico. El material se coloca en un tubo plstico de 6 ml (1,0 cm x 10 cm) con un reborde de
caucho en su extremo inferior y un filtro poroso en el centro del reborde. Sobre el filtro poroso
debe ir una vlvula que permite el flujo de lquido en una sola direccin (Columna Mycosep 224
MFC o equivalente).

4.1.2 Cromatgrafo de lquidos


a) Inyector con capacidad de introducir 50 l al sistema

b) Bomba cromatogrfica con capacidad de bombear la fase mvil a razn de 1 ml/min

c) Columna cromatogrfica de fase reversa (C
18
) (Supelcosil RP-18 de 25 cm x 4,6 mm
o equivalente)

d) Detector de fluorescencia de longitudes de onda variables. Condiciones de
operacin: excitacin 360 nm, emisin 440 nm. (Perkin Elmer 650-15 o
equivalente)

e) Horno cromatogrfico con capacidad para regular una temperatura constante de la
columna en 50 C

f) Integrador-graficador.


4.1.3 Agitador de vaivn

4.1.4 Bao termostatado con capacidad de regular una temperatura de 65 C.

4.1.5 Evaporador de nitrgeno (ReactiVap Pierce o equivalente).

4.1.6 Papel de filtro cualitativo de 25 cm de dimetro (Whatman No. 4 o equivalente).

4.1.7 Pipetas de 5 ml de capacidad.

4.1.8 Tubos de ensayo de vidrio borosilicato de 15 mm x 85 mm.

4.1.9 Micropipeta de volumen variable con capacidad de medir volmenes de 10 l a 100 l.

4.1.10 Viales para derivatizacin de 2 ml de capacidad con tapa rosca recubierta de tefln.

4.2 REACTIVOS

4.2.1 Solvente de extraccin

Se mezclan 840 ml de acetonitrilo grado reactivo analtico con 160 ml de agua destilada.

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4.2.2 Solucin de derivatizacin

Se mezclan 10 ml de cido trifluoroactico (grado reactivo analtico) con 5 ml de cido actico
glacial (grado reactivo analtico) y 35 ml de agua destilada. Este volumen es suficiente para
realizar 70 derivatizaciones.

4.1.3 Fase mvil

Se mezclan 600 ml de agua grado HPLC con 400 ml de metanol grado HPLC. Se filtran a travs
de membrana de 0,45 m de dimetro de poro y se desgasifica antes de usar.

4.1.4 Soluciones estndar de aflatoxinas

Sigma A-1022, la cual contiene las siguientes cantidades de aflatoxinas en forma de pelcula
desecada: AFB1:25 g; AFG1:25 g; AFB2: 7,5 g de AFB2; AFG2: 7,5 g.

Preparacin de la solucin madre: se disuelve el contenido del vial con 5,0 ml de benceno:
CH
3
CN (98 + 2) para obtener las siguientes concentraciones de aflatoxinas: 5 g/ml de AFB1;
1,5 g/ml de AFB2; 5 g/ml de AFG1; 1,5 g/ml de AFG2.

Preparacin de la solucin de trabajo: se toman 400 l de la solucin madre y se llevan a un vial
mbar silanizado de 40 ml. Se evaporan a sequedad el solvente en corriente de nitrgeno y
redisolver con 40 ml de acetonitrilo grado HPLC. La concentracin final de aflatoxinas: 50 ng/ml
de AFB1; 50 ng/ml de AFG1; 15 ng/ml de AFG2 y 15 ng/ml de AFB2.

Preparacin del estndar de calibracin (estndar externo de cuantificacin):


a) Se colocan 200 l de solucin estndar de trabajo en un vial mbar de
automuestrador (preferiblemente silanizado)

b) Se aaden 700 l de reactivo de derivatizacin.

c) Se calienta a 65 C durante 10 min en bao termostatado. Se deja enfriar a
temperatura ambiente y se inyectan 50 l en el cromatgrafo de lquidos.


4.3 PROCEDIMIENTO GENERAL

4.3.1 Extraccin


1) En un erlenmeyer de 250 ml con tapn esmerilado o tapa rosca, se mezclan 50 g
de muestra adecuadamente molida (Molino Romer Serie II o equivalente) con
100 ml de solvente de extraccin (CH
3
CN: agua 84 + 16) durante 1 h en agitador
de vaivn (alternativamente, se homogeneiza la muestra y el solvente durante
3 min en una licuadora empleando un vaso de vidrio de 250 ml de capacidad).


Nota. Se recomienda pesar la mitad de la muestra (25 g) cuando se realicen anlisis de harina de
arroz, harina de yuca, torta de algodn, torta de soya y subproductos de trigo.

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2) Se filtra a travs de papel cualitativo y se recogen cerca de 5 ml de filtrado en un
tubo de ensayo de 10 ml.


4.3.2 Purificacin del extracto


3) Se inserta lentamente el extremo con el reborde de caucho de la columna de
limpieza (Columna Mycosep 224 MFC o equivalente) en el tubo de ensayo y se
presiona hasta obtener cerca de 0,5 ml de extracto purificado en el interior de la
columna.

4) Se transfieren cuantitativamente 0,5 ml del extracto purificado a un vial de fondo
cnico de 2 ml de capacidad (preferiblemente silanizado) y se evapora a
sequedad bajo una corriente suave de nitrgeno (ReactiVap Pierce o equivalente).

5) Se redisuelve el residuo seco con 200 l de acetonitrilo.


4.3.3 Derivatizacin


6) Se aaden 700 l de reactivo de derivatizacin.

7) Se calienta a 65 C durante 10 min en bao termostatado. Se deja enfriar a
temperatura ambiente.

4.4 HPLC


8) Se filtra a travs de membrana de 0,45 m (Millipore HVLP 1300 o equivalente) y
se inyectan 50 l en el cromatgrafo de lquidos.

Nota. Las AFB2A y AFBG2a son inestables (especialmente en metanol). Los extractos derivatizados se deben inyectar
rpidamente para evitar la degradacin de las aflatoxinas.


Clculos ng/g de aflatoxina en la muestra = C/W


Donde:


C = ng de aflatoxina inyectada en la columna cromatogrfica (en los 50 l =
0,5555 ng)

W = equivalente en peso de la muestra inyectada (50 l), lo cual se calcula con la
siguiente frmula:


W = 50 g x (0,5 ml/100 ml) x (0,05 ml/0,90 ml) = 0,01385 g

Lmite de deteccin de la tcnica: 1 ng/g de cada aflatoxina

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5. TCNICA POR CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA (TLC)

5.1 APARATOS Y MATERIALES


1) Columna de limpieza: el material de empaque de la columna debe tener sitios
activos lipoflicos y un intercambiador inico. El material se coloca en un tubo
plstico de 6 ml (1,0 cm x 10 cm) con un reborde de caucho en su extremo inferior
y un filtro poroso en el centro del reborde. Sobre el filtro poroso debe ir una vlvula
que permite el flujo de lquido en una sola direccin (columna Mycosep 224 MFC o
equivalente)

2) Bomba de vaco

3) Balanza con sensibilidad 0,1 g

4) Cabina con lmpara de luz ultravioleta (254 y 366 nm)

5) Cabina de extraccin de vapores y gases

6) Cmaras en vidrio para desarrollo de cromatoplacas de 20 x 20 cm

7) Cmaras en vidrio para desarrollo de cromatoplacas de 10 x 10 cm

8) Densitmetro con detector U.V y fluorescencia

9) Estufa de circulacin forzada (graduacin con temperatura hasta 180 EC).

10) Jeringa cromatogrfica graduada de 50 l.

11) Agitador de vaivn

12) Bao termostatado con capacidad para regular una temperatura de 65 C

13) Evaporador de nitrgeno (reactiVap Pierce o equivalente)

14) Papel de filtro cualitativo de 25 cm de dimetro (Whatman No. 4 o equivalente)

15) Pipetas de 5 ml de capacidad

16) Tubos de ensayo de vidrio borosilicato de 15 mm x 85 mm

17) Micropipeta de volumen variable con capacidad para medir de 10 l a 100 l

18) Viales para derivatizacin de 2 ml de capacidad con tapa rosca recubierta de
tefln.

5.2 REACTIVOS


- Solvente de extraccin: se mezclan 840 ml de acetonitrilo grado reactivo analtico
con 160 ml de agua destilada.

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- Fase mvil: se preparan 50 ml por cmara de una mezcla cloroformo y acetona
(9:1).

- Solucin estndar de trabajo:


200 ng/ml AFB1 = AFB2 en benceno acetonitrilo 98:2

60 ng/ml AFB2 = AFG2


5.3 PROCEDIMIENTO

5.3.1 Activacin de las placas cromatogrficas

Se colocan las placas de silica gel 60 (con o sin zona de concentracin) en estufa a 105 C
durante 1 h. Se deja secar y enfriar las placas en un desecador.

5.3.2 Extraccin

En un erlenmeyer de 250 ml con tapn esmerilado o tapa rosca, se mezclan 50 g de muestra
adecuadamente molida (molino Romer serie II o equivalente) con 100 ml de solvente de
extraccin (CH
3
CN: agua 84 + 16) durante 1 h en agitador de vaivn (alternativamente se
homogeneiza la muestra y el solvente durante 3 min en una licuadora empleando un vaso de
vidrio de 250 ml de capacidad).

Se filtra a travs de papel cualitativo y se recogen cerca de 5 ml de filtrado en un tubo de ensayo
de 10 ml.

5.3.3 Purificacin del extracto

Se inserta lentamente el extremo con el reborde de caucho de la columna de limpieza (columna
Mycosep 224 MFC o equivalente) en el tubo de ensayo y se presiona hasta obtener cerca de
2,0 ml de extracto purificado en el interior de la columna.

Se transfieren cuantitativamente 2,0 ml de extracto purificado a un vial de fondo cnico de 2 ml
de capacidad (preferiblemente silanizado) y se evaporan a sequedad bajo una corriente suave de
nitrgeno (reactiVap Pierce o equivalente). Se redisuelve el residuo seco con 100 l de
benceno/acetonitrilo (98:2)

Aplicacin de muestras: a una distancia de 1,5 cm del borde inferior de la placa se aplican 5 l,
10 l, 15 l de estndar con una separacin de 1,5 cm entre aplicacin igualmente se aplican
10 l de extracto de la muestra.

5.3.4 Desarrollo de la placa

Se satura la cmara con 50 ml de cloroformo acetona (9:1). Se coloca la placa ajustando las
condiciones para que Rf sea (04 - 07).


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5.3.5 Interpretacin de los resultados

Semicuantitativos

Se colocan las placas en la cmara de luz UV. Se compara los valores Rf del estndar y la muestra.

Se busca el estndar aplicado de fluorescencia similar a la fluorescencia de muestra. Se reportan
los resultados como mg/kg.


muestra peso . aplic . ext l
extracto final volumen in concentrac muestra e equivalent estndar de l
g / ng




Cuantitativo

Utilizando un densitmetro se realiza la curva de calibracin aplicando cuatro estndares 2 l, 5 l,
10 l, 15 l de la muestra y se reportan los g/kg de la muestra.

Calibracin de los estndares

Clculo de absortividad molar

y factor de correccin (CF)



En espectrofotmetro se determina la absorbancia de tres soluciones de K
2
Cr
2
O
7
en H
2
SO
4


Solucin 1: 0,25 mM

Solucin 2: 0,125 mM

solucin 3: 0,0625 nM


Se determina la absorbancia (A) a 350 nm utilizando como blanco una solucin de 0,0018 N de
H
2
SO
4
en agua.

Se calcula ? mediante la ecuacin:

= (A X 1 000)/concentracin en mM


Para determinar el factor de correccin CF, se reemplaza en la ecuacin CF = 3160/



Clculo de la concentracin de estndares de aflatoxinas en benceno:acetonitrilo (98:2)
(aplicable a estndares independientes a AFB1, AFB2, AFG1 y AFG2).

Se realiza para el espectro para establecer la mxima absorbancia entre 330 nm - 370 nm se
calcula:


= ) CF x MW A (
mL
aflatoxina g
000 1



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Donde:

A = lectura del espectrofotmetro

MW y

= tomados segn la siguiente tabla



Aflatoxina MW



B1 312 19,800
B2 314 20,900
G1 328 17,100
G2 330 18,200

Tambin se pueden adquirir estndares preparados.



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Anexo A (Informativo)


Bibliografa


DAZ, G.J. 1995. Anlisis de aflatoxinas por cromatografa lquida de alta eficiencia. Mtodos de
anlisis del Laboratorio de Toxicologa de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia.
Universidad Nacional de Colombia.

HOLCOLB, M., WILSON, D.M., TRUCKSESS, M.W. 6 THOMPSON, H.C. 1992 Determination of
Aflatoxins in Food Products by Chromatography. Journal of Chromatography, 624:341-352.

PARK, D.L., S. NESHEIM, S., TRUCKSESS, M.W., STACK & R.F. NEWELL. 1990. Liquid
Chromatographic Method for Determination of Aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in corn and Peanut
Products: Collaborative Study. J Assoc. Off. Anal. Chem., 73:260-266.

TRUCKSESS, M.W., STACK, M.E., M.E., NESHEIM, S., ALBERT, R.H. & ROMER, T.R. 1994.
Multifunctional Column Coupled with Liquid Chromatography for Determination of Aflatoxins B1,
B2, G1, and G2 in corn Almonds, Brazil nuts, Peanuts, and Pistachic Nuts: Collaborative Study J.
of AOAC Int., 77: 1512-1521

WILSON, T.J. & ROMER, T.R. 1991. Use of Mycosep Multifunctional Cleanup Column for Liquid
Chromatographic Determination of Aflatoxins in Agricultural Produts. J. Assoc. Off. Anal. Chem.
74:951-956.