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Conceptos y Tcnicas de Biotecnologa I

PRODUCCION DE AMILASAS UN!ICAS


OBJETIVO El trabajo prctico consiste en el aislamiento de hongos productores de enzimas hidrolticas del almidn, produccin de estas enzimas, medicin de su actividad enzimtica en forma soluble e inmovilizada y su utilizacin para la produccin de etanol. INTRODUCCION Las enzimas que hidrolizan el almidn son un conjunto de enzimas !amilasa, ! amilasa, glucoamilasa y enzimas desramificadoras" hidrolticas que catalizan la degradacin del almidn. #ada enzima tiene una actividad caracterstica generando distintos productos como se observa en la siguiente figura. E$isten amilasas de uso industrial tanto de origen bacteriano como f%ngico.

Las amilasas son producidas a gran escala para su uso en la industria de la alimentacin y de la produccin de combustibles. Los usos ms importantes son& '. (idrlisis parcial del almidn para generar de$trinas que son utilizadas como espesantes. ). *btencin de jarabe de alta maltosa +lu!+lu" utilizados en la fabricacin de la cerveza y confituras dulces, helados, tortas". ,. *btencin de jarabes de alta glucosa utilizados en la fabricacin de cerveza, panes y repostera, confituras y bebidas no alcohlicas. -. .emocin del almidn utilizado como apresto en la industria te$til. /. (idrlisis parcial del almidn en la industria panadera para la liberacin de glucosa que es sustrato de fermentacin de las levaduras para producir el leudamiento de la masa. 0. (idrlisis del almidn para ser utilizado como fuente de carbono en diversas fermentaciones, entre ellas la produccin de etanol para uso alimenticio y combustible.

DISEO EXPERIMENTAL Parte I" AISLAMIENTO # SCREENIN! Da 1: Aislamie t! "1# $arte% 1e colocan semillas de lenteja sobre un medio 1lido de agar 234 conteniendo / 5 6a#l para evitar el desarrollo de especies 7ucorales" y 8.8' 5 tetraciclina antibitico que inhibe el crecimiento bacteriano". 1e colocan - semillas por caja de 3etri. 1e incuba a )9:# durante ; das. Da &: Aislamie t! "&# $arte% Las colonias de hongos preferentemente las verdes sobre las negras o blancas" se repican con un escarbadiente en cajas de 3etri con agar 234. 1e incuba a )9:# durante ; das. Da ': S(ree i ) *e (e$as $r!*+(t!ras *e amilasas "1# $arte% Las colonias aisladas se pican en cajas de 3etri con medio slido de almidn ' 5 y agar './ 5. 1e incuba a )9:# durante - das.

Da ,: S(ree i ) *e (e$as $r!*+(t!ras *e amilasas "&# $arte% Las cepas productoras de enzimas hidrolticas del almidn se detectan observando el halo de degradacin del almidn crculo claro alrededor de la colonia". 3ara facilitar la deteccin, se revela la presencia de almidn en el medio por el agregado de solucin de < )=>< 8.8)0 5 <) ? 8.)0 5 ><" que se acompleja con el polisacrido dando una coloracin azul. Parte II: PRODUCCION DE AMILASAS Da ,: Pr!*+((i- *e es$!ras Las colonias con actividad amilsica se repican en tubos en pico de flauta conteniendo medio de / 5 salvado triturado y agar ) 5. 1e estra con ansa cada colonia en un pico de flauta. 1e incuba a )9:# durante / das. Da .: Pr!*+((i- *e e /imas $!r 0erme ta(i- e s+strat! s-li*! Las esporas de cada pico de flauta se resuspenden en / ml de solucin acuosa de 1ar@osyl 8.8/ 5. 1e inocula ' ml de la suspensin de esporas en erlenmeyers de )/8 ml conteniendo / g de salvado y / ml de agua destilada. 1e incuba a )9:# durante / das. Da 1: E2tra((i- *e las e /imas La enzimas e$tracelulares producidas en la fermentacin del salvado por el hongo se e$traen con /8 ml de 6a#l '.8 5. Agitar durante ,8 min a temperatura ambiente. Biltrar por papel de filtro y conservar el eluido. Parte III: MEDICION DE LA ACTI$IDAD EN%IMATICA Da 1: Me*i(i- *e la a(ti3i*a* e /im4ti(a La actividad amilsica se determinar utilizando almidn como sustrato. 1e cuantificar la desaparicin del sustrato por espectrofotometra. La solucin de sustrato consiste en una solucin de almidn tamponada 8.8/ 5 almidn, 8.'/ 7 6a#l, 8,' 7 acetato de sodio p(& /.8". La reaccin enzimtica se detiene por el agregado de un revelador 8.880 5 < ) ? 8.80 5 >< en (#l 8.8) 7" del almidn remanente en la solucin de incubacin. El iodo de la solucin de

<)=<> se acompleja con la amilosa nativa con su estructura tridimensional intacta. El complejo iodo!amilosa se cuantifica midiendo la absorbancia a 0-8 nm con un espectrofotmetro. La reaccin consiste en incubar '8 Cl de e$tracto enzimtico con 8./ ml de solucin de sustrato. La incubacin se realiza a ,;:# durante ;./ min. La reaccin se detiene por el agregado de -./ ml de solucin revelador y se mide la absorbancia a 0-8 nm. El protocolo se detalla a continuacin&

Me*i(i- *e a(ti3i*a* amil4si(a Tubo N '!) ,!Extracto enzimtico ! '8 Cl Solucin de sustrato 8./ ml Incubacin a 37C ;./ min Solucin reveladora -./ ml Absorbanci a a !" nm ! !

La Dnidad Amiloltica DA" es la cantidad de enzima contenida en '88 ml de muestra, que puede hidrolizar '8 mg de almidn en ,8 minutos, en las condiciones de la reaccin. En esta tEcnica se incuban '8 Cl de muestra con 8.)/ mg de almidn contenidos en 8./ ml de solucin de sustrato durante ; minutos y medio, lo que equivale a incubar '88 ml de muestra con '8.888 mg de almidn durante ,8 minutos. 1i todo el almidn fuera hidrolizado, la actividad amilsica de la muestra sera de '888 DA=dl. 3ara obtener las unidades de actividad amilsica, la fraccin de almidn digerido se multiplica por '888. #lculo de los resultados&
Absorbancia Tubos' )"Absorbancia Tubos, -" '888 Absorbancia Tubos' )"

Amilasa#A = dl =

Ejemplo& Absorbancia Fubo '!)"& 8.-/8 Absorbancia Fubo ,!-"& 8.)88


8.-/8 8.)88 '888 = /// #A = dl 8.-/8

#alcular las Dnidades Amilolticasa por decilitro DA=dl". Parte IV: INMO$ILI%ACION EN%IMATICA Da 1: I m!3ili/a(i- e /im4ti(a El e$tracto enzimtico se inmoviliza con alginato de sodio. El alginato es un polisacrido producido por algas soluble en agua, en una solucin con iones divalentes como el #a)? polimeriza ya que los iones producen entrecruzamiento de los polisacridos. Al polimerizar una solucin de alginato conteniendo enzimas estas quedan atrapadas dentro de las esferas que se generan. 3ara la inmovilizacin se colocan '8 ml del e$tracto enzimtico en un vaso de precipitado y se agregan '88 mg de alginato de sodio '.8 5 final". 1e homogeiniza y se toma con una jeringa de '8 ml. 1e hace gotear la solucin en un vaso de precipitado conteniendo solucin de #a#l) )88 m7. 1e producen esferas de ,!/ mm de dimetro que polimerizan al entrar en contacto con la solucin de #a#l). Las esferas se estabilizan durante ' h en la solucin de #a#l) a temperatura ambiente. Las esferas se lavan con buffer acetato 8.' 7, p(& /. La actividad de la enzima inmovilizada se determina agregando / ml de solucin de sustrato e incubando / min a ,;:. Luego se e$trae una alcuota de 8./ ml y se agrega a cada tubo -./ ml de solucin reveladora. 1e mide la absorbancia en espectrofotmetro a 0-8 nm.

Parte V: PRODUCCION DE ETANOL POR ERMENTACION 1e estudiar la capacidad de fermentacin para producir etanol de Sacc$arom%ces cerevisiae a la vez que se ver su incapacidad para utilizar almidn como fuente de carbono, por

lo que se hace imprescindible la hidrlisis previa del polisacrido para su utilizacin por la levadura usando para ello el e$tracto enzimtico obtenido. Da 1: I !(+la(iLas fermentaciones se realizarn en erlenmeyers de /8 ml conteniendo -8 ml de agua destilada y '.8 g de harina de trigo o maz autoclavadas. A este sustrato se le agrega / ml del e$tracto enzimtico obtenido o / ml de solucin de 6a#l '.8 5 y '88 Cl de tetraciclina '8 mg=ml. 1e e$trae una alcuota de , ml de cada fermentacin para determinar las condiciones iniciales. Luego se inocula con 8./ ml de una suspensin de Sacc$arom%ces cerevisiae de /8 mg=ml y se incuba durante / das a temperatura ambiente. Da 5: Determi a(i- *e eta !l 1e cuantificar el etanol producido en las fermentaciones - muestras& antes y despuEs de incubar s=c e$tracto enzimtico" por el mEtodo de microdifusin. Este mEtodo se basa en que si una sustancia voltil y un solvente puro se mantienen en compartimientos separados pero en contacto con la misma atmsfera, el soluto voltil tender a disolverse en el solvente puro. El soluto voltil pasar de la solucin original hacia la atmsfera para luego disolverse en el solvente originalmente puro. Binalmente, esto implicar una difusin del soluto desde la solucin original al solvente. Este proceso ocurrir hasta alcanzar el equilibrio pero, si en lugar del solvente puro utilizamos una sustancia que convierta al soluto voltil en no voltil, la difusin ocurrir hasta que la presin de vapor en la atmsfera compartida tienda a cero. El ensayo se realizara en dos tubos colocados uno dentro del otro. En el compartimiento e$terior tubo ancho" se colocar 8./ ml de solucin saturada de carbonato de potasio que causar que el alcohol sea menos soluble en la solucin acuosa. 3or otro lado se prepara el compartimiento interior tubo angosto" que contendr '.8 ml de solucin de dicromato de potasio 8.'-/ 5 en cido sulf%rico '8 6 y se coloca dentro del tubo ancho con la ayuda de una pinzaG en presencia de esta solucin el etanol es o$idado a cido acEtico y el #romo pasa a #r ,? cambiando su color de amarillo anaranjado a transparente. Dna vez preparado el dispositivo se agrega al compartimiento e$terior 8.' ml de solucin standard o muestra y se tapa con un tapn de goma. 1e incuba 08 min a -/:#, se saca el tubo angosto y se le agrega 8./ ml de agua destilada y se mide la absorbancia a -/8 nm.

Dis$!siti3! $ara la *etermi a(i- *e Eta !l Fapn de +oma

#ompartimiento e$terior& Solucin saturada de Carbonato de &otasio con Standard o 'uestra

#ompartimiento interior& Solucin de (icromato de &otasio El protocolo se detalla a continuacin&


Determi a(i- *e Eta !l Tubo N '!) ,!/!0 ;!9 H!'8 'uestra )*"" +l, Agua destilada Et*( 8.)/ 5 Et*( 8./ 5 Et*( '.8 5 1in e$tracto = 1in incubar Absorbancia a !-" nm ! ! ! ! !

''!') ',!''/!'0

1in E$tracto = <ncubado #on e$tracto = 1in <ncubar #on e$tracto = <ncubado

! ! !

+raficar la curva de calibracin Absorbancia vs 5 de Etanol" y luego calcular el porcentaje de etanol producido en cada una de las fermentaciones.