TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4.

Muestras de origen animal

Es un examen de laboratorio para analizar si hay bacterias u otros grmenes en una muestra de orina. La muestra puede ser tomada de forma casera en un recipiente limpio y bien puede extraerse directamente de la vejiga por medio de una sonda y con la ayuda de un profesional de la salud, cabe menciona que los resultados en el segundo caso suelen ser ms exactos ya que se reducen las probabilidades de contaminacin por agentes externos.

OBJETIVO
Identificar la presencia de bacterias y su tipo dependiendo de su forma y caractersticas qumicas. Instrucciones para recoger una muestra parcial de orina para EMO a. El frasco tiene que ser suministrado por el Laboratorio, o adquirir en la farmacia uno estril apropiado para la recoleccin de orina. b. Es preferible que la orina sea la primera orina de la maana.

c. Practicar previo aseo genital, con agua y jabn, sin dejar residuos. Esto es especialmente importante en la mujer que debe lavarse el rea entre los labios de la vagina y evitar la contaminacin de la muestra con crema, antispticos y secreciones vaginales. Los hombres y nios deben limpiarse la cabeza del pene d. Deje escapar la porcin inicial de la miccin al inodoro, a continuacin recolecte en el frasco la porcin media (10 ml) y descarte la porcin final de la miccin nuevamente en el inodoro. e. Tape bien el frasco y entrguelo rpidamente al Laboratorio (mximo dos horas luego de tomar la muestra). f. NO recoger la muestra durante el Periodo Menstrual

Mtodo para el anlisis microscpico de orina

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4. 1. Se centrifuga la muestra por 5-10 minutos a 1500-2000 rpm con la orina previamente homogenizada. 2. Se elimina el sobrenadante. 3. Colocar una gota del sedimento en el portaobjetos y dejar por 30 a 60 segundos. 4. Se observa al microscopio. Para realizar el urocultivo se siguen los siguientes pasos. a) Se siembra una muestra de la orina en estra con la ayuda de una asa previamente esterilizada con la ayuda de un Mechero de Bunsen, en AgarMc conkey o agar sangre a temperatura ambiente. b) La siembra debe realizarse estriando en cuatro direcciones alrededor de la caja c) Tapamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 35- 37C y dejamos por 24 horas en la misma.

Sembrado de la muestra de orina

Tincin de Gram. Clasifica a los microorganismos en Gram + y Gram -. Las Gram positivas son las que resisten la accin del colorante del disolvente alcohol-acetona, tras el tratamiento con un colorante bsico y lugol. Las gram negativas son decoloradas siendo posteriormente teidas con un colorante de contraste como la fuscina diluida o la safranina, en ambas esto se debe a la composicin de su pared celular. Procedimiento: 1) Se toma la muestra del urocultivo 2) Se aplica el primer colorante: cristal violeta por 1 minuto 3) Lavar con agua

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4. 4) Aadir lugol mordiente por 1 minuto 5) Lavar con agua 6) Decolorar con alcohol de 96 por 20 segundos 7) Lavar con agua 8) Cubrir con safranina por 1 minuto 9) Lavar con agua y dejar secar 10) Observar al microscopio con aceite de inmersion MATERIALES 1. Frasco para la muestra 2. Asa de platino 3. Caja de petri 4. Incubadora 5. Mechero de Bunsen 6. Pipeta o gotero 7. Microscopio 8. Porta y cubre objetos 9. Lavabo y mesa de trabajo 10. Centrfuga 11. Tubo de ensayo REACTIVOS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Muestra de orina Agar sangre o Agar Mc Conkey Lugol Safranina Cristal violeta Alcohol de 96 Agua Aceite de inmersin

Esta tcnica permitir realizar un diagnstico cuantitativo y cualitativo de las bacterias presentes en la muestra cultivada.

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4.

FUNDAMENTO
El cultivo del exudado farngeo o frotis farngeo se realiza utilizando un hisopo especial para detectar la presencia de estreptococo grupo A, que es la causa ms comn de la faringitis estreptoccicca. La faringitis estreptocccica es una infeccin bacteriana que afecta la parte posterior de la garganta y las amgdalas, que se inflaman e irritan, lo cual provoca dolor de garganta particularmente molesto al tragar. Los estreptococos son grmenes Gram positivos y se clasifican en Grupos (A, B, C, etc.) en base a carbohidratos especficos de su pared celular. Presentan forma esfrica, se agrupan en cadenas, anaerbicos facultativos. Son clulas esfricas de 0.6 a 1.0 um de dimetro, se agrupan en forma de cocos en cadenas de longitud variable; pared celular Gram positiva, inmviles; no formadores de esporas; catalasa negativos y anaerobios facultativos.

OBJETIVO
Determinar el tipo de microorganismo presente en la muestra (estreptococo o un virus) que pueden causar infeccin en la garganta y aportar datos para la valoracin profesional y tratamiento adecuado.

RECOLECCIN DE LA MUESTRA
Con la cabeza ligeramente inclinada hacia atrs el paciente debe abrir su boca a toda su capacidad (sin haber usado enjuague bucal) y se introduce un hisopo hasta la zona de las amgdalas; se frota en la parte posterior de la garganta en una sola direccin, sobre las amgdalas y sobre las reas enrojecidas.

CULTIVO
1. Se siembra la muestra en estra en un medio nutritivo como Agar-sangre, Agar-chocolate o Agar-Mc Conkey con la ayuda del hisopo con el cual se recolect la muestra. 2. Se tapa la caja y se deja en la incubadora por 24 horas a una temperatura media de 35C.

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4.

TINCIN DE GRAM
Transcurrido el tiempo de observa al microscopio utilizando la Tincin de Gram. Procedimiento: 1) Se toma la muestra en espiral sobre el portaobjetos 2) Se deja secar a temperatura ambiente o se fija con la ayuda de un Mechero de Bunsen y metanol durante un minuto 3) Se aplica el primer colorante: cristal violeta por 1 minuto 4) Lavar con agua 5) Aadir lugol mordiente por 1 minuto 6) Lavar con agua 7) Decolorar con alcohol de 96 por 20 segundos 8) Lavar con agua 9) Cubrir con safranina por 1 minuto 10) Lavar con agua y dejar secar 11) Observar al microscopio con aceite de inmersion MATERIALES 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Hisopo estril Caja de petri Incubadora Mechero de Bunsen Pipeta o gotero Microscopio Porta y cubre objetos Lavabo y mesa de trabajo

REACTIVOS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Muestra extrada de la zona infectada Medio de cultivo (Agar sangre, Agar Mc Conkey o Agar-chocolate) Lugol Safranina Cristal violeta Alcohol de 96 Agua Aceite de inmersin Metanol

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4. Si al observar al microscopio existiera alguna duda sobre el tipo de microorganismo se pueden hacer otras pruebas como la de la catalasa para descartar la presencia de Staphylococcus. Otros factores a considerar es la forma de la agrupacin el Streptococcus forma cadenas sin ramificaciones.

FUNDAMENTO
Es un examen de laboratorio para verificar si hay sustancias causantes de infeccin en una muestra de lquido, pus, cera o sangre del odo. La causa ms comn de otitis externa aguda son las Pseudomonas y los Streptococcus aureus. Otros comensales como Estafilococos coagulasa negativa y Corinebacterias tambin pueden ser aislados del canal del odo externo, pero no son considerados de importancia clnica. La inflamacin puede ser secundaria a la dermatitis (eccema) solamente, sin la infeccin microbiana, o puede ser causada por una infeccin bacteriana o fngica activa

OBJETIVO
Determinar por medio de cultivo en un medio nutritivo, el tipo de microorganismo (bacteria, hongo o virus) presente en el odo externo con potencial de causar infeccin.

RECOLECCIN DE LA MUESTRA
Se hace una ligera traccin hacia arriba y atrs del pabelln de la oreja y se introduce un hisopo de algodn estril rotndolo suavemente. Es recomendable

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4. tomar dos muestras una para cultivo y posterior observacin por Tincin de Gram y la otra para observacin inmediata en el microscopio.

CULTIVO
1. Sembrar la muestra en estra en un medio nutritivo como Agar-sangre o Agar-Mc Conkey 2. Si en la observacin en fresco se presentan algunas levaduras con seudohifas, cultivar en Agar Sabouraud con cloranfenicol. 3. Se tapa la caja y se deja en la incubadora por 24 horas a una temperatura media de 35C. La observacin al microscopio suele hacerse por Tincin de Gram siguiendo los pasos descritos anteriormente. MATERIALES 9) Hisopo estril 10) Caja de petri 11) Incubadora 12) Mechero de Bunsen 13) Pipeta o gotero 14) Microscopio 15) Porta y cubre objetos 16) Lavabo y mesa de trabajo REACTIVOS 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Muestra extrada de la zona infectada Medio de cultivo (Agar sangre, Agar Mc Conkey) Lugol Safranina Cristal violeta Alcohol de 96 Agua Aceite de inmersin

Las observaciones de las muestras teidas en el microscopio proporcionarn informacin sobre el tipo y cantidad de microorganismos presentes en la muestra. Hay que tomar en cuenta la forma de las colonias observadas y en caso de ser necesario pueden hacerse otras pruebas como la catalasa, entre otras.

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4.

MICROORGANISMOS DE AGUA ESTANCADA.

FUNDAMENTO
Numerosas especies bacterianas y algunas veces incluso algas microscpicas o protozoos, proliferan en las superficies expuestas a la humedad formando una biopelcula de microorganismos contenidos en una matriz de polisacridos, cuyo espesor puede oscilar entre algunos micrmetros y pocos milmetros, que se adhiere fuertemente a la base. Las biopelculas se forman en todas las superficies sumergidas, tanto en agua dulce como de mar, o bien sobre soportes constantemente hmedos tales como paredes de la caera de agua, pisos o dientes. El 99% de toda la actividad microbiana en un ecosistema abierto ocurre sobre las superficies.

OBJETIVO
Identificar microorganismos presentes en agua estancada no clorada.

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4.

PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo seleccionados fueron Barker-Taha (MB) Methanobacterium y StadtmanBarker (MC) para Methanococcus composicin es la siguiente: para cuya

Barker-Taha
Reactivo Etanol Fosfato dipotsico Sulfato de magnesio 7 (H2O) Sulfato de amonio Sulfato ferroso Autolisado de levadura Carbonato de calcio Agua destilada Cantidad 10 mL 5 mg 0.1 mg 0.3 mg 0.02 mg 5 mL 100 g 1000 mL

StadtmanBarker
Reactivo Formiato de sodio Sulfato de amonio Cloruro de calcio Cloruro de magnesio Cloruro frrico Sulfato de magnesio Molibdato de sodio Fosfato dipotsico Rojo de Fenol Azul de metileno Tioglicolato de sodio Cantidad 15 g 1g 0.01 g 0.01 g 0.02 g 0.01 g 0.001 g 2g 0.003 g 0.002 g 0.5 g

Una vez esterilizado se aade carbonato de sodio 0.50 g en 10 mL de agua destilada y sulfuro de sodio 0.1 g en 10 mL de agua destilada.

Recoleccin de la muestra
Las muestras deben ser recolectadas en envases limpios y estriles proporcionados por el laboratorio, estos envases pueden contener preservantes o

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4. no dependiendo del tipo de parmetro a analizar. En caso que el frasco contenga preservante se debe tener la precaucin de evitar cualquier derrame de este (ejemplo: Aguas Cloradas para anlisis Microbiolgicos llevan Tiosulfato como preservante para inhibir la accin del cloro).

1. De sebe provocar una pequea turbulencia con la base del recipiente en que se tomar la muestra 2. Si el agua es de un pozo profundo se debe sacar con un balde previamente lavado con agua del mismo lugar por dentro y fuera eliminando el agua del lavado antes de sacar la muestra. 3. Abra el frasco manteniendo la tapa en una mano y el frasco en la otra. 4. Llene el frasco ponindolo en sentido al flujo de la corriente. Debe dejar un espacio libre entre el nivel del agua y la tapa de aproximadamente 2 centmetros. 5. Cierre el frasco y marque con etiqueta anotando en l el punto de muestreo. 6. El tiempo que transcurre desde la recoleccin hasta la recepcin de la muestra en el laboratorio debe ser inferior a 6 horas, para muestras destinadas a ensayos microbiolgicos. 7. Registrar los datos de muestreo en la Orden de Servicio indicando: - N o descripcin breve de la muestra. - Fecha y hora de recoleccin. - Tipo de muestra. - Detalle de la muestra (lugar de recoleccin). - Responsable del muestreo. - Cdigo de los anlisis que se realizarn.

CULTIVO
1. Sembrar la muestra en alguno de los medios mencionados anteriormente 2. Tambin se puede cultivar una muestra en un medio diferencial como podra ser el Citrato segn Simmons. Con este medio de cultivo se puede diferenciar entre las coliformes fecales y Citrobacter as como algunas especies de Salmonelas. 3. El sembrado es por estras. 4. Citrato positivo provocar un viraje de color azul 5. Citrato negativo dar un color verde y significa que la bacteria no consume citrato como nica fuente de carbono. 6. Incubar a 35 C por 24 horas

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4.

TINCIN
Transcurrido el tiempo de incubacin utilizar la Tincin de Gram para observar al microscopio. MATERIALES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Frasco estril con tapa Caja de petri Incubadora Mechero de Bunsen Pipeta o gotero Asa de platino Microscopio Porta y cubre objetos Lavabo y mesa de trabajo

REACTIVOS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Muestra extrada de un cuerpo de agua estancada no clorada Medio de cultivo (Citrato de Simmons) Lugol Safranina Cristal violeta Alcohol de 96 Agua Aceite de inmersin

MICROORGANISMOS (BACTERIAS) PRESENTES EN COCINAS

FUNDAMENTO
La cocina de un hogar es un lugar cuyas caractersticas representan un sitio por excelencia de grandes concentraciones de bacterias. Cultivar algunas permitir conocer el tipo de microorganismo implicado en los procesos que ah se realizan y el riesgo que estos representan para la salud.

OBJETIVO
Determinar el tipo de microorganismos presentes en el lavabo de una cocina comn.

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4.

RECOLECCIN DE LA MUESTRA
Con un hisopo restregar suavemente, el rea de desage del lavatrastos cuyo estado debe contener humedad para que pueda adherirse la cantidad suficiente de materia.

CULTIVO Y TINCIN
1. Se siembra la muestra directamente por estria en la caja de Petri en un medio nutritivo como Agar-agar o Agar-nutriente se sella perfectamente la caja para evitar la contaminacin de la muestra. 2. Se en reposo durante 6 das en condiciones de temperatura de 35 a 37C. 3. Utilizar la Tincin de Gram y ubicar el tipo y cantidad de microorganismos presentes.

CONCLUSION
El mundo microscpico es un universo de posibilidades, la vida que ah se desarrolla es impresionantemente abundante. Las diversas tcnicas que se utilizan en un laboratorio con el fin de estudiar a estos seres vivos, son piezas clave en la identificacin y clasificacin de los mismos. Recolectar, sembrar, cultivar, observar y analizar microorganismos es definitivamente una actividad interesante y formativa.

TCNICAS DE LABORATORIO DE BIOLOGA UNIDAD 4. BIBLIOGRAFIA ALORS, ROSARIO (2009) Estudio microbiolgico de la orina. Madrid Espaa. Recuperado el da 11 de enero de 2014 http://www.csicsif.es/andalucia/modules/mod_ense/revista/pdf/Numero_14/ROSARIO_ALORS_2.pdf

VALENCIA, IVAN (2009) Evaluacin en medios de cultivo. Universidad Mayor de San Andrs, Facultad de Ciencias Farmacuticas y Bioqumicas. La Paz, Bolivia. Recuperado el da 12 de enero de 2014
http://bibliotecadigital.umsa.bo:8080/rddu/bitstream/123456789/437/1/TE654.pdf

CARRILLO, LEONOR (2003) Microorganismos. Microbiologa agrcola, captulo 1. Argentina. Recuperado el da 12 de enero de 2014
http://www.unsa.edu.ar/matbib/micragri/micagricap1.pdf

http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.%20Cultivo%20de%20microorganismos.p df

INSTRUCTIVO PARA LA TOMA DE MUESTRAS. LABSER. Recuperado el da 13 de enero de 2014 http://www.labser.cl/pdf/faq/instructivo_muestreo_aguas.pdf HERNANDEZ, FERNANDA ET. AL. (2002) Cultivo de bacterias. Universidad de Valparaso. Chile. Recuperado el da 13 de enero de 2014
http://www.slideshare.net/fer2895/cultivo-de-bacterias-hipotesis