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12 Horiz Med 2013; 13 (2)

Efecto irritante in vitro de formulaciones cosmticas con extracto de camu


camu, mediante el mtodo Het Cam.
Miguel ngel Inocente Camones
1
, Emily Marisol Toscano Guerra
2
, Benjamn Castaeda Castaeda
3
RESUMEN
0bjetivo: Evaluar el efecto irritante de formulaciones cosmticas con extractos de camu camu.
Material y Mtodos: El presente estudio se realiz con formulaciones cosmticas de extractos de camu camu, proporcionadas
por el Laboratorio de AYPU C0SVETC; utilizamos la tcnica alternativa in vitro, en membrana corioalantoidea en huevos
frtiles de gallina (HET CAM, hens egg test chorioallantoic membrane). La implementacin de la tcnica se realiz en el
Centro de nvestigacion de Vedicina Tradicional y Farmacologia del nstituto de nvestigacion de la Facultad de Vedicina
Humana de la USMP.
Resultados: Ninguno de los cosmticos con extracto de camu camu, produjo ruptura de la membrana corioalantoidea,
evidenciado por ausencia del colorante absorbido, azul de tripn, detectable a 595 nm.
Conclusiones: Los indices de irritacion (.) obtenidos en todas las formulaciones cosmticas permiten clasicarlas como N0
PPTANTES, y constituyen el soporte de la inocuidad, de las mismas, para continuar con pruebas de ecacia clinica. (Horiz
Ved 201J; 1J(2): 1218)
Palabras clave: Efecto irritante, formulaciones cosmticas, extracto de camu camu, HET CAV test. (Fuente: 0eCS 8PEVE)
rritant effect in vitro of cosmetic formulations with camu camu extract by Het Cam method
ABSTRACT
0bjective: To evaluate the irritant effect of cosmetic formulations elaborated with camu camu extracts.
Material and Methods: This study was performed with cosmetic formulations containing camu camu extracts supplied by the
AYPU C0SVETC Laboratory. We used the alternative in vitro technic on chorioallantoic membrane in fertile hen's eggs (HET
CAV, hen's egg chorioallantoic membrane test). The technique was implemented at "Centro de nvestigacion de Vedicina
Tradicional y Farmacologia" of the Pesearch nstitute of the school of Vedicine of San Vartin de Porres University.
Results: None of the cosmetic with Camu Camu extracts showed chorioallantoic membrane rupture, which was veried by
the absence of absorbed trypan blue dye, detectable at 595 nm.
Conclusions: The rates of irritation () obtained in all cosmetic formulations allow us to classify them as N0T PPTATNC and
support the safety of such products to continue clinical efcacy trials. (Horiz Ved 201J; 1J(2): 1218)
Key words: rritant effect, cosmetic formulations, Camu Camu extract, HET CAV test. (Source: VeSH NLV)
1
Quimico Farmacutico. nvestigador del Centro de Vedicina Tradicional y Farmacologia. FVHUSVP.
2
8achiller de 8iologia. Asistente del Centro de Vedicina Tradicional y Farmacologia. FVHUSVP
3
0irector del nstituto de nvestigacion de la FVHUSVP
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Abril - Junio 2013 13
INTRODUCCIN
La tendencia europea para obtener productos cosmticos
seguros, se ha convertido en una inuencia mundial;
por lo cual, se busca que los ingredientes dentro de la
frmula sean de origen natural y no irritantes para el ser
humano. Debido a esta tendencia, la industria cosmtica
se encuentra en la bsqueda de ingredientes de origen
vegetal para incorporarlos en sus formulaciones. Sin
embargo, en nuestro pas son escasos los estudios
realizados con productos cosmticos a base de extractos
vegetales, a nivel de seguridad y ecacia (1).
En el caso de la evaluacin del riesgo de los productos
qumicos, se plantea la ejecucin de nuevos mtodos de
evaluacin toxicolgica. Los ensayos toxicolgicos, in
vivo, se han empleado histricamente en la evaluacin
de la inocuidad y seguridad de los ingredientes de
cosmticos. Sin embargo, en aos recientes se ha
criticado el empleo de tales ensayos, debido a los altos
costos de ejecucin, adems del cuestionamiento, cada
vez mayor, de los grupos de defensa de conductas ticas
y ambientalistas en la industria cosmtica.
El desarrollo de estos ensayos, y la actual demanda
social y legislativa, propician la implantacin de las tres
"erres" (PPP) de Pusell y 8urch: reduccion, renamiento
y reemplazo.
En respuesta a este escenario, se ha dedicado esfuerzos
y recursos a la bsqueda de ensayos toxicolgicos
alternativos, basados en anlisis in vitro, todo lo cual
ha motivado que exista una corriente de fomento para
el desarrollo cientico de mtodos que contribuyan
a disminuir la utilizacin de animales en las pruebas
toxicologicas y de control de sustancias (15).
Los ensayos de irritacin ocular y drmica en conejo
(test de Draize), muy utilizados, son, actualmente, muy
criticados, por lo que en el Centro de nvestigacion de
Medicina Tradicional y Farmacologa de la FMH-USMP,
estamos abocados en la implementacin de otros
mtodos, seguros, ecaces y sencillos, que puedan
reemplazarlos.
El ojo del conejo, aunque similar en tamao al ojo
humano, diere de ste en numerosos aspectos. Estas
diferencias en la siologia, unida a la subjetividad que
tiene el ensayo para valorar las lesiones y a la variabilidad
de resultados, encontrados al ensayar un mismo producto
entre distintos laboratorios, hacen lgicas las objeciones
a este ensayo.
Sin embargo, el ensayo de Draize, cuando es realizado
por personal experto, es muy preciso para evaluar
sustancias irritantes del ojo humano, especialmente
cuando se trata de sustancias ligeramente irritantes.
La evaluacin de la irritabilidad ocular in vivo segn el
mtodo de Draize requiere la aplicacin de la sustancia
de ensayo en la conjuntiva del animal de experimentacin
(conejo), sometindolo, en muchos casos al dolor,
ulceracin y hasta necrosis de las estructuras oculares.
Aunque, ltimamente se ha aceptado la disminucin del
nmero de animales en esta prueba, an constituye un
ensayo cruento y rechazado por muchos investigadores
y personal relacionado, que ven en los mtodos in vitro
una alternativa til no slo para evitar la exposicin
innecesaria de los animales a productos potencialmente
txicos sino que, adems, logran una mayor correlacin
de los resultados obtenidos con el humano que con los
ensayos en animales (6-11).
Actualmente, numerosos laboratorios en el mundo han
incorporado el ensayo de la membrana corioalantoidea
del huevo de gallina (hens egg test chorioallantoic
membrane, HET-CAM) para la evaluacin de la irritacin
ocular producida por cosmticos; por su rapidez,
simplicidad, sensibilidad, fcil ejecucin y su relativo
bajo costo (12-20).
En el Per, la utilizacin de mtodos alternativos para
evaluar toxicidad es escasa; sin embargo, la normatividad
mundial exige que la investigacion cientica incluya
toxicidad o funcionalidad de los productos cosmticos,
evaluada con mtodos alternativos al uso de animales de
experimentacin.
El mtodo HET CAM para evaluar irritabilidad, an no
ha sido implementado en los laboratorios peruanos de
investigacin, por lo cual consideramos que el presente
trabajo es pionero en nuestro medio, y la implementacin
de la tcnica para productos cosmticos en el Centro de
nvestigacion de Vedicina Tradicional y Farmacologia de
la Facultad de Medicina Humana de la Universidad San
Martn de Porres sirva como referencia de control de
seguridad para productos cosmticos y anes.
MATERIAL Y MTODOS
La crema, gel y locin evaluados, fueron elaborados
en el Area de nvestigacion y 0esarrollo de la empresa
peruana AYPU C0SVETC SAC.
La composicin de estas se expone a continuacin,
Tabla 1.
Efecto irritante in vitro de formulaciones cosmticas con extracto de camu camu, mediante el mtodo Het Cam.
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Tabla 1. Composicin y usos de los cosmticos de origen natural
evaluados
Se utilizo huevos frtiles de Callus gallus domesticus
(especie resistente a enfermedades) suministrados por
la criandera 0rfelinda, mediante convenio con el autor
del trabajo de investigacin para exclusividad de la
produccin.
Prueba HET CAM, mediante el mtodo observacional
o cualitativo:
El proceso de incubacin de los huevos comenz, mximo,
dos das despues de ovado, los que se mantuvieron bajo
condiciones normales de incubacion articial hasta el
dcimo da en que se determin el potencial irritante.
(Laignier, 2009) (16).
El dcimo da se evalu la viabilidad de los huevos
frtiles, mediante luz articial, escogiendo los huevos
en los que se distingue la disposicin de venas de tamao
regular.
Con ayuda de tijera y pinza, se realizo un oricio por
la zona de la cmara de aire, dejando expuesta la
membrana corioalantoidea (los huevos con la membrana
corioalantoidea lesionada no fueron aceptados, ni
aquellos que presentaban un desarrollo embrionario
anormal). Se adiciono 2 mL de suero siologico
para humedecer la capa que cubre la membrana
corioalantoidea, durante 5 minutos.
Luego se procedi a retirar la capa con una pinza
metlica. Despus se aplic 0,3 mL de la crema, gel o
locin, sobre la membrana corioalantoidea expuesta,
de tres huevos por cada muestra problema. Como
controles positivos se utilizaron soluciones de Na0H 0,1N
y laurilsulfato de sodio (LSS) 1, en estos casos solo son
necesarios 2 huevos por patrn.
El tiempo (segundos) de la aparicin de hemorragia, lisis
y coagulacin se anotaba dentro de los 300 segundos y se
ingresaba los datos a la siguiente formulacin:
I.I. = ((301TH)/300) x 5) + ((301TL)/300) x 7) + ((301 TC)/300) x9)
Donde:
I.I. = Indice de irritacin
TH = Tiempo de aparicin de hemorragia
TL = Tiempo de aparicin de lisis
TC = Tiempo de aparicin de coagulacin
Una vez obtenido los ndices de irritacin de las muestras
y controles, se compara con la tabla 2 para determinar si
el producto era irritante:
Prueba HET CAM, mediante el mtodo de colorante
Azul de Tripn
Para la prueba con el colorante azul de tripn (HET-CAM
T8S) se efectuo, previamente, un escaneado (500700
nm) para conocer el punto de mxima absorbancia del
colorante (N7T0X, protocolo N 108, 1996) (21).
Una vez concluida la observacin de la membrana
corioalantoidea y registrado los signos descritos
anteriormente, se procedi de la siguiente manera:
La membrana se lav con agua destilada y se deposit
0,5 mL de la solucion de azul de tripn al 0,1 en buffer
fosfato, dejndola actuar durante 1 minuto. Luego, se
retir el colorante con agua destilada y la membrana
se cortaba y pesaba en balanza analtica. La membrana
lavada, se pes para eliminar el sesgo de la diferencia en
el tamao de cada muestra.
RANGO CATEGORA IRRITANTE
HET CAM
0,0 0,9 NO IRRITANTE
1,0 4,9 IRRITANTE LEVE
5,0 8,9 IRRITANTE MODERADO
9,0 21,0 IRRITANTE SEVERO
Tabla 2. Clasicacion para determinar que el producto es irritante
Crema de camu
camu con ltros
solares
Extracto de
camu camu 15%
Benzofenoma 3,
Benzofenoma 4
Preservante:
cido srbico
Excipiente csp.
Humectante
Regenerativa
para la piel
Antioxidante
Filtro solar
Humectante
Regenerativa
para la piel
Antioxidante
Filtro solar
Humectante
Regenerativa
para la piel
Antioxidante
Filtro solar
Extracto de
camu camu 25%
Benzofenoma 3
Preservante:
cido srbico
Excipiente csp.
Extracto de
camu camu 40%
Benzofenoma 3
Preservante:
cido srbico
Excipiente
PRODUCTO COMPOSICIN PROPIEDADES
Gel de camu
camu con ltro
solar
Locin de camu
camu con ltro
solar
Miguel ngel Inocente Camones , Emily Marisol Toscano Guerra, Benjamn Castaeda Castaeda
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CA = b X 5/1000 x 10
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nmoles
Tabla 4. Control de caracterstica del producto.
* Resultados expresados en Promedio Desviacin estndar
Figura 1. Evaluacin del efecto del Hidrxido de sodio 0,1 N en la
membrana corioalantoidea.
1A. Adicin de NaOH 0,1 N, se observa cogulos y hemorragia;
1B. Sin adicin de sustancia.
Tabla 3. Resultados de la prueba HET CAM, mtodo observacional
Posteriormente se introdujo en un tubo con 5 mL de
formamida para arrastrar el colorante jado y luego se
retiraba la membrana
Se midi la absorbancia de la formamida teida frente
a una recta patrn con concentraciones conocidas del
colorante (5x 105 V, 105 V, 106 V), a una longitud de
onda de 595 nm. La deteccion de colorante absorbido
indica prdida de la integridad de la membrana
corioalantoidea.
La determinacin del potencial irritante de la sustancia
de ensayo se realiz segn la frmula:
La comparacin se realiz entre los embriones tratados
con las sustancias de ensayo y los controles positivo
y negativo. Con el dato obtenido se determin la
clasicacion de irritacion.
En el caso del ensayo HET CAM con el colorante azul
de tripn, trabajamos con una longitud de onda (A)
de 595 nm, donde detectamos la mxima absorbancia
del colorante. Se realiz la curva de calibracin del
colorante azul de tripn para determinar la ecuacin de
la recta, Figura 4, para la obtencin de la concentracin
de colorante absorbido detallado en las Tablas 3 y 4.
PESULTA00S
Segn la tabla 2, el ndice de irritacin obtenido para
la crema, gel y locin elaborados con extracto de camu
camu, clasica como N0 PPTANTE, pero el control de
hidrxido de sodio y lauril sulfato de sodio, resultan ser
clasicados como PPTANTES SE7EP0S, segun la tabla 2,
y como podemos observar en las guras 1, 2 y J. .
Donde:
CA = Cantidad de colorante absorbido
b = Concentracin de colorante (obtenido por
ploteo de la curva patrn) /mg de membrana.
PRODUCTO H * L * C * I.I
CREMA >300 >300 >300 0
GEL >300 >300 >300 0
LOCIN >300 >300 >300 0
NaOH (control) 125 12 14 18,29
LSS (control) >300 19 94 12,79
PRODUCTO ABS. PESO membrana Concentracin Colorante
(mg) colorante absorbido *
Moles/mg
CREMA 0,0205 82,05 6,266 x 10 -9 0,031 0,002
GEL 0,0220 66,95 8,350 x 10 -9 0,042 0,007
LOCIN 0,0240 83,03 7,464 x 10 -9 0,037 0,015
Suero siolgico 0,0230 133,6 4,427 x 10 -9 0,022 0,000
NaOH 0,1 N 0,1240 85,05 4,273 x 10 -8 0,214 0,080
Lauril sulfato 0,0475 51,35 2,727 x 10 -8 0,136 0,0141
de sodio 1%
Efecto irritante in vitro de formulaciones cosmticas con extracto de camu camu, mediante el mtodo Het Cam.
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En la gura 4, se muestra la cantidad de colorante
absorbido por la formamida, luego de ocurrido el dao
celular en la membrana corioalantoidea; la crema, gel y
locion, clasicaron como N0 PPTANTES en comparacion
con los controles positivos laurilsulfato de sodio 1
Hidroxido de sodio 0,1 N que clasicaron como PPTANTE
V00EPA00 e PPTANTE SE7EP0 respectivamente, segun
la tabla 2.
Figura 2. Evaluacion del efecto del Laurilsulfato de sodio 1, en la
membrana corioalantoidea.
2C. Adicion de Laurilsulfato de sodio 1, se observa lisis y cogulos;
2D. Sin adicin de sustancia.
Figura 4. Curva de calibracin del colorante Azul de Tripn en
formamida
Figura 3. Evaluacin del efecto de la crema, gel y locin con camu
camu, en la membrana corioalantoidea.
JA. Sin adicion de sustancia; 48. Adicion de crema; 4C. Sin adicion
de sustancia;
3D. Adicin de gel; 4E. Sin adicin de sustancia; 4F. Adicin de
locin.
0SCUS0N
La utilizacin de la Membrana Corioalantoidea de
embriones de Callus gallus domesticus como un medio
de evaluar la irritacin producida por un cosmtico sobre
la mucosa ocular y nasal se basa en que la Membrana
Corioalantoidea presenta un epitelio similar a la mucosa
ocular y nasal, con una amplia red vascular que permite
evaluar las lesiones de hemorragia, lisis y coagulacin que
ocurren en dichos vasos, as como la desnaturalizacin
de las protenas extravasculares, lo cual indica diversos
grados de irritacin (7-22).
Adems, estos embriones de 10 das no poseen un sistema
nervioso desarrollado y por lo tanto no estn sometidos
al sufrimiento que pudiera producir una irritacin
severa, cumplindose as con el principio de las 3Rs que
deben tener los mtodos alternativos en toxicologa:
renamiento, que signica reduccion del sufrimiento
animal, reemplazamiento y reduccin en el nmero de
animales de laboratorio a emplear (23).
7arios investigadores, han sealado la alta correlacion
entre los resultados alcanzados por este mtodo
alternativo y las pruebas in vivo, por el mtodo de Draize.
La industria de los cosmticos ha sido una de las ms
beneciadas con esta tcnica, teniendo en cuenta que
estos productos estn diseados para tener poca o
ninguna penetrabilidad y por tanto su aval de seguridad
debe contemplar las pruebas de irritabilidad drmica y
oftlmica (14,20,24-27).
Miguel ngel Inocente Camones , Emily Marisol Toscano Guerra, Benjamn Castaeda Castaeda
3C 3D
4A
4C
4E
4B
4D
4F
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Los resultados de la investigacin realizada son similares
con los resultados del estudio realizado por Conzlez Y, et
al; en el cual se ha evaluado la irritabilidad oftlmica de
tres cremas cosmticas mediante la tcnica alternativa
in vitro en membrana corioalantoidea utilizando la
prueba subjetiva HET CAM y la prueba objetiva HET CAM
T8S (1J).
El ensayo HET CAM, se basa en cambios macroscpicos
producidos en la membrana corioalantoidea del huevo
de gallina, como son la hemorragia, lisis y coagulacin,
identicados con estereomicroscopio. Esta prueba tiene
un sistema de puntuacin subjetivo, por lo tanto se
complementa con la prueba de HET CAVT8S, utilizando
el colorante azul de tripn, como un medio de contraste
para distinguir clulas vivas y muertas. En este ensayo,
se cuantica la cantidad de azul de tripn absorbida
por la membrana corioalantoidea daada. La prueba es
sencilla, cuantitativa y reproducible (28J0).
En conclusion, los indices de irritacion (.) obtenidos, en
todos los casos, permiten clasicar a los productos como
N0 PPTANTES. Ninguno de los cosmticos con extracto
de camu camu, mostr ruptura de la membrana biolgica,
lo cual se verico por la ausencia del colorante absorbido
detectable a 595 nV. Estos resultados permiten avalar la
seguridad de estos productos cosmticos para continuar
con pruebas de ecacia clinica.
Se recomienda conrmar estos datos con investigacion
histopatolgica.
AGRADECIMIENTO
Al Decano de la Facultad de Medicina Humana Dr. Frank
Lizaraso Capar por haber hecho posible la realizacin de
la presente investigacion. A la empresa AYPU C0SVETC
SAC por los productos cosmticos y a la Criandera
0rfelinda por brindar los huevos frtiles exclusivos para
el trabajo de investigacin.
Fuentes de nancamento
El presente trabajo fue nanciado por el Programa del
FNCYT y los equipos de la Universidad de San Vartin de
Porres.
Conctos de nters
Los autores declaran no tener conictos de inters.
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Correspondencia
Viguel Angel nocente Camones
0ireccion: Av. Alameda del Corregidor 15J1 - Las 7ias,
La Volina. Lima - Peru
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Miguel ngel Inocente Camones , Emily Marisol Toscano Guerra, Benjamn Castaeda Castaeda
: 1218
Recibido: 12 de Marzo de 2013
Aprobado: 03 de Junio de 2013
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