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PROCEDIMIENTO PARA LA OBSERVACIN EN MICROSCOPA DE CAMPO CLARO

PROF. JORGE SANS PUROJA BIO-JSP, Sans e Hijo Ltda. Cuevas 1447 Santiago- Chile. jsans@biojsp. l.

Las no!"as pa!a el utili#a i$n de un "i !os opio on la "etodolog%a de a"po la!o &ue se des !iben a ontinua i$n son de uso gene!al pa!a ual&uie! "a! a ' "odelo de "i !os opio sea este onven ional o inve!tido

(lgunas gene!alidades a tene! en uenta antes de usa! el "i !os opio. .-)bi&ue ' *a"ilia!% ese on los distintos o"andos del "i !os opio+ Bot$n de en endido, pe!illa &ue !egula la intensidad o b!illo de la lu#, pe!illas pa!a los en*o&ues "a !o ' "i !o"-t!i os, pe!illas pa!a el despla#a"iento . e / del a!!o po!ta "uest!a, pe!illas &ue ont!olan el despla#a"iento del ondensado! en el eje 0 1a!!iba ' abajo2, palan a o !ueda &ue ont!ola la abe!tu!a del dia*!ag"a, et . .-3enga p!esente &ue e4isten "i !os opios &ue pa!a en*o a! el esp- i"en "ediante las pe!%lllas "a !o-"i !o"et!i as despla#an la platina a e! 5ndose o alej5ndose del objetivo, ' ot!os en &ue el objetivo, on todo el tubo, se a e! a o aleja del esp- i"en. .-La "a'o!%a de los "i !os opios tienen una !ueda ubi ada al ostado inte!io! de la pe!illa "a !o"-t!i a, del lado de!e ho o i#&uie!da, seg6n sea la "a! a o "odelo del "i !os opio. 7sta !ueda pe!"ite g!adua! la tensi$n del to!nillo "a !o"-t!i o a *in de evita! &ue la platina o el tubo se despla en solos, on el desag!adable e*e to de pe!dida del plano *o al. Compruebe el sentido de giro de esta rueda. Ajuste la tensin lo suficiente como para evitar este desplazamiento involuntario de estos estativos. Una tensin mayor de lo necesario har dificultoso el enfoque macromtrico . .-8e!i*i&ue &ue los objetivos est-n puestos en el !evolve! en o!den o!!e to 14., 19., 49. ' 199.2, de i#&uie!da a de!e ha, de "ane!a &ue al gi!a! el !evolve! en el sentido de las "ane illas del !eloj se in !e"enta el pode! de au"ento del objetivo &ue va &uedando en el eje $pti o.
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1.- 7n ienda el :i !os opio olo ando el inte!!upto! en la posi i$n O;. (juste el b!illo o intensidad de la lu#, gi!ando la pe!illa del !e$stato o d%"e!, seg6n sea el aso. stos dispositivos controlan la intensidad de la luz variando el voltaje de la fuente de poder que alimenta la lmpara! hace que el filamento de la ampolleta "de tungsteno o halgena#! se ponga ms o menos incandescente en forma proporcional a la corriente que pase a travs de el.

<.- Colo&ue en el eje $pti o el objetivo de "eno! au"ento 14. o 19.2, gi!ando el !evolve! en el sentido de las "ane illas del !eloj hasta senti! un l% = "et5li o "solo ah$ el objetivo estar en su posicin correcta! es decir. perfectamente en el eje ptico#

>.- Baje la platina o ub%&uela en una posi i$n lo "5s alejada del objetivo.

4.- Colo&ue el po!ta objeto sob!e la platina on el ub!eobjeto o el esp- i"en ha ia a!!iba. ?%jelo on la pin#a del a!!o po!ta "uest!a ' despl5 elo hasta &ue &uede puesto sob!e la #ona "5s ilu"inada.

@.- (p!o4i"e el esp- i"en al objetivo, subiendo la platina o bajando el objetivo, seg6n sea el aso, gi!ando el to!nillo "a !o"-t!i o, "i!ando po! el lado del "i !os opio, hasta &ueda! lo "5s e! a de la "uest!a 1 tope superior2.
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A.- 7n*o&ue el esp- i"en "i!ando a t!av-s de los o ula!es, alejando lenta"ente el esp- i"en del objetivo 1bajando la platina2 on el to!nillo "a !o"-t!i o, hasta &ue apa!e# a en el a"po visual el esp- i"en. Boste!io!"ente, o!!ija el en*o&ue *ino, pa!a ello gi!e leve"ente ha ia adelante ' at!5s el to!nillo "i !o"-t!i o hasta &ue la "uest!a &uede pe!*e ta"ente en*o ada. %erifique que a medida que se van colocando en el eje ptico objetivos de mayor aumento! su lente frontal va quedando ms cerca del espcimen. &a distancia que queda entre el lente frontal del objetivo y el espcimen enfocado! se denomina distancia 'til de trabajo y es inversamente proporcional al poder de aumento del objetivoe . n la tabla se se(alan las distancias 'tiles de trabajo apro)imadas a distintos objetivos *oder de Aumento del objetivo .istancia 'til de trabajo "mm# +) ,-) +-) ,/.0 ,-.1 -.1 ,--) -.,2

7.- (juste el siste"a bino ula! del "i !os opio al ejes $pti os de sus ojos (distancia interpupilar2, despla#ando los o ula!es hasta ve! si"ult5nea"ente el "is"o a"po on los dos ojos. Boste!io!"ente, o"pense la di*e!en ia de d%opt!ias &ue puede e4isti! ent!e sus ojos, gi!ando la !ueda "oleateada p!esente en uno o en a"bos tubos o ula!es, seg6n sea el aso. Ba!a ello, p!o eda de la siguiente "ane!a+ en*o&ue el espe %"en on el to!nillo "i !o"-t!i o pe!o "i!ando solo a t!av-s del o ula! *ijo 1sin rueda moleteada2. )na ve# en*o ado on di ho o ula!, ve!i*i&ue on el ot!o ojo, es de i! el &ue esta puesto sob!e el a ula! u'o tubo tiene la !ueda "oleteada. Si la i"agen no se ve n%tida, en*$&uela gi!ando aho!a solo la !ueda "oleteada p!esente en di ho tubo, hasta &ue el esp- i"en se vea pe!*e ta"ente n%tido 1po! ning6n "otivo "ueva el *o o on la pe!illa del ont!ol "i !o"et!i o2. Ce esta "ane!a, ud. ve!5 el esp- i"en pe!*e ta"ente n%tido on a"bos ojos si"ult5nea"ente, solo as%, su obse!va i$n se!5 g!ata ' !elajada.

D.- (juste la intensidad de la lu# pa!a el au"ento &ue este usando en la obse!va i$n. 7s i"po!tante *ija!se si el a"po esta ho"og-nea"ente ilu"inado, de no se! as%, ve!i*i a! si el ondensado! estas pe!*e ta"ente ent!ado. O bien, si ud. ve en el a"po de obse!va i$n, el *ila"ento de la a"polleta, !egule la distan ia de la a"polleta a la lente ole to!a del po!ta l5"pa!a solo si su "i !os opio posee un dispositivo pa!a !egula! di ha distan ia. 7n aso ont!a!io, olo&ue un *ilt!o despulido 1opal2 o sob!e la *uente de lu#. s recomendable usar! en lo posible! un filtro azul "luz d$a# colocado en el trayecto de la luz que incidir sobre el espcimen! a fin de igualar los colores a la temperatura de color de la luz del medio d$a. .e esta manera! se reproducirn mejor los colores con que se han te(ido los especimenes. *or otro lado! se mejora la resolucin de lo observado! puesto que esta es inversamente proporcional a la longitud de onda de la luz usada "Azul ms corta y rojo ms larga en el espectro visible#.

E.- (juste la altu!a del ondensado!. Lleve el ondensado! a la posi i$n "5s supe!io! (tope superior2. 7nseguida, b5jelo lige!a"ente 1un poquito2. Fene!al"ente esa suele se! la posi i$n o!!e ta del ondensado! pa!a la obse!va i$n en a"po la!o. 7n algunos "i !os opios esta altu!a viene indi ada en el estativo. Ce no se! as%, se puede dete!"ina! di ha altu!a p!o ediendo de la siguiente "ane!a+ 7n*o&ue un p!epa!ado hasta el au"ento 19.. )na ve# en*o ado, !eti!e el p!epa!ado sin va!ia! el plano *o al. Colo&ue un t!o#o papel alu"inio, o!tado en punta, sob!e la *uente de lu#. (l "i!a! a t!av-s de los o ula!es, ve!a en el a"po una so"b!a &ue delinea la *o!"a en punta del papel puesto sob!e la *uente de lu#. Boste!io!"ente gi!e el tonillo &ue !egula la altu!a del ondensado! hasta &ue los bo!des de di ha so"b!a se vean pe!*e ta"ente n%tida. 7n ese punto el ondensado! esta!5 en posi ion o!!e ta ' $pti"a pa!a la ilu"ina i$n GHlle!. :antenga sie"p!e di ha altu!a.
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19.- (juste de la ape!tu!a del dia*!ag"a pa!a ada objetivo, on el *in de iguala! las ape!tu!as del dia*!ag"a on la ape!tu!a del !espe tivo objetivo. 7n algunos "i !os opios la ape!tu!a ideal del dia*!ag"a viene seIalada pa!a ada objetivo en el estativo del ondensado! 119., 49. ' 199.2. Ce no se! as%, esta se puede dete!"ina! de la siguiente "ane!a+ Sa&ue uno de los o ula!es del siste"a bino ula!, ve!a usted. al *ondo del tubo un a"po ilu"inado &ue es de "eno! ta"aIo del di5"et!o del tubo, di ho a"po o!!esponde a la ape!tu!a del objetivo &ue se en uent!a puesto en ese "o"ento en el eje $pti o del "i !os opio. (b!a ' ie!!e el dia*!ag"a hasta &ue se igualen los di5"et!os del a"po ilu"inado on el di5"et!o de la so"b!a del dia*!ag"a p!o'e tada en di ho a"po. Ce esta "ane!a, se igualan las ape!tu!as del dia*!ag"a on la del objetivo. 7sto se ha e on ada objetivo. Se !e o"ienda ha e una "a! a en el estat%vo del ondensado! &ue seIale la posi i$n de la palan a &ue o!!esponda a la abe!tu!a ade uada del dia*!ag"a pa!a ada uno de los objetivos. &a altura correcta del condensador y la abertura adecuada del diafragma para cada objetivo! permite la visualizacin del espcimen con la m)ima resolucin del objetivo! y se conoce como iluminacin 34ler. sta es la recomendada para hacer macrofotograf$as de ptima calidad.

11.- )na ve# alib!ado el "i !os opio ini ie la obse!va i$n del de la "uest!a. 7n este p!o eso, sie"p!e !e o!!a el esp- i"en en toda su e4tensi$n gi!ando las pe!illas &ue o"andan los "ovi"ientos . e / del a!!o po!ta "uest!a, a *in de en ont!a! las #onas "as !ep!esentativas o "ejo! onse!vadas de la "uest!a. .urante toda la observacin mantenga siempre una mano en la perilla del enfoque micromtrico! a fin de ir corrigiendo constantemente la nitidez.

1<.- Ba!a ontinua! la obse!va i$n on objetivos de "a'o! au"ento, basta on gi!a! el !evolve! en el sentido de las "ane illas del !eloj hasta &ue &uede en el eje $pti o.

1>.- Ba!a usa! el objetivo de in"e!si$n, en*o&ue p!i"e!a"ente el esp- i"en hasta el objetivo se o de "a'o! au"ento, o"6n"ente 49., enseguida gi!e el !evolve! a una posi ion inte!"edia ent!e el objetivo de 49. ' el de 199., sin va!ia! el en*o&ue. Colo&ue una gota de li&uido de in"e!si$nJ sob!e el esp- i"en, gi!e el !evolve! de "ane!a &ue el lente *!ontal del objetivo de 199. &uede in"e!so en la gota. 7vite la *o!"a i$n de bu!bujas, en aso ont!a!io gi!e lige!a"ente el !evolve! de de!e ha a i#&uie!da pa!a !e"ove! di has bu!bujas. Co"p!uebe sie"p!e &ue el objetivo &uede pe!*e ta"ente ubi ado en el eje $pti o. Co!!ija el en*o&ue gi!ando lenta"ente la pe!illa "i !o"-t!i a ha ia adelante ' at!5s, hasta obtene! la "54i"a nitide#. . vite el contacto directo del aceite de inmersin con los ojos o la piel! si esto ocurre lvese con agua reiteradas veces los ojos y ocupe agua y jabn para la piel J &os objetivos de inmersin se identifican por una l$nea circunscrita al e)tremo ms distal del lente. sta l$nea puede ser de distintos colores seg'n el l$quido de inmersin para el cual estn calibrados5 negro para el aceite de inmersin! amarillo para el glicerol y blanco para el agua. vite el contacto directo del aceite de inmersin con los ojos o la piel! si esto ocurre lvese con agua reiteradas veces los ojos y ocupe agua y jabn para la piel n la mayor$a de los microscopios modernos! una vez enfocado el espcimen con el objetivo de menor aumento tambin quedan en foco o pr)imos al foco! los objetivos de mayor aumento "objetivos parafocales#.

14.- )na ve# *inali#ada la obse!va i$n on in"e!si$n, gi!e el !evolve! en sentido de las "ane illas del !eloj, dejando en el eje $pti o el lente de "eno! au"ento 1442. Li"pie in"ediata"ente el objetivo !e"oviendo el l%&uido de in"e!si$n pasando un papel suave 1 line42, hasta &ue no &uede !ast!os del li&uido de in"e!si$n. 7nseguida !eti!e el p!epa!ado ' !e"ueva el l%&uido de in"e!si$n del "is"o on un papel suave hasta &ue no &ueden !ast!os de di ho "edio.

Importante: - Nunca devolverse al o !et"vo de #$% estando el l&'u"do de "nmers"(n so re el esp)c"men *a 'ue "nvar"a lemente el lente +rontal 'uedar, "mpre-nado con el med"o de "nmers"(n * de "do a 'ue este o !et"vo no esta cal" rado para este med"o. se ver, orroso. En caso de ocurr"r esto. l&mp"elo "nmed"atamente o s" no este se secar, * no podr, volver a en+ocar
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con el o "ncluso. da/arse en +orma "rrepara le. El 0$1 del deter"oro del o !et"vo de #$% se de e a este percance.

-En caso. 'ue usted olv"do 'u"tar el med"o de "nmers"(n. este se secar, * 'uedar, pe-ado so re el lente de manera 'ue al usarlo nuevamente en esas cond"c"ones la "ma-en se ver, orrosa m"entras no el"m"ne el med"o de "nmers"(n 'ue se seco so re el o !et"vo. Para su remoc"(n. l"mp"e con un pa/o "mpre-nado con enc"na lanca o alco2ol a soluto 2asta 'ue 'uede totalmente l"mp"o.

In+ormac"(n de ut"l"dad:
- 7l au"ento total de la i"agen obse!vada en el "i !os opio se obtiene "ultipli ando el au"ento del o ula! po! el au"ento del objetivo. 7n algunos "i !os opios puede e4isti! un au"ento adi ional po! lentes inte!puestos en el tubo 11,< 4 1,A o <.2, po! lo &ue el au"ento o ula! po! objetivo debe se! "ultipli ado po! este *a to! de au"ento adi ional. - 7s i"po!tante seIala! &ue el au"ento &ue el obse!vado! ve en el "i !os opio no sie"p!e o!!esponde al au"ento &ue di ha est!u tu!a tiene en una *otog!a*%a, puesto &ue en la *otog!a*%a *inal se pudo !edu i! o bien au"enta! el ta"aIo de las est!u tu!as vista en el "i !os opio.

- Cete!"ina i$n del au"ento !eal de las est!u tu!as en una *otog!a*%a *inal. Ba!a ello puede p!o ede! de las siguientes "ane!as+
Si usted ono e el ta"aIo !eal de una est!u tu!a p!esente en la obse!va i$n 1po! eje"plo, el di5"et!o de un n6 leo de una -lula ' este *ue!a de 19u"2 pe!o al "edi! di ha est!u tu!a en la *oto esta "ide po! eje"plo @ " lo &ue e&uivale a @9.999u" 11 " es igual a 19.999u"2 basta on dividi! este valo! po! el ta"aIo !eal de la est!u tu!a, es de i! 1@9.999 K192, el !esultado obtenido e&uivald!5 a las ve es &ue di ha est!u tu!a ha sido au"entada en la *otog!a*%a pa!a el aso @.9994 @9. 999u"K 19u"L @.999 . Si usted &uie!e !ep!esenta! una l%nea en la *oto &ue o!!esponda, po! eje"plo, a @u", basta on "ultipli a! este n6"e!o po! el *a to! de au"ento ante!io!"ente al ulado @u" 4 @999. L <@.999u" L <.@ " de la!go. Bo! lo tanto, debe!5 dibuja! en la *oto una l%nea de <, @ " de la!go, &ue e&uivald!5 a @u" en di ha *oto (ho!a si usted no ono e el ta"aIo !eal de una est!u tu!a elula! o tisula! puede p!o ede! de las siguientes "ane!as+ ?otog!a*%e una est!u tu!a de ta"aIo ono ida, po! eje"plo, el !eti ulado de una 5"a!a de ;eubaue! 1la su"ato!ia de todos los uad!ados ent!ales de este !eti ulado o!!esponde a 1"" 11999 u"2. Si la divisi$n de los uad!ados ent!ales es de 4 4 4 ada uad!ado se!5 <@9 4 <@9 u" ' de @ 4 @ se!5 de <99 4 <99 B!o ese esta *oto de la "is"a "ane!a &ue la *oto de la est!u tu!a &ue usted &uie!e ono e! su ta"aIo !eal ' las ve es &ue *ue au"entada. Si en la *oto del !eti ulado &ue tiene un ta"aIo !eal es de <99u", "ide 19 " o sea ,19.999u", divida este 6lti"o valo! po! <99 19.999 K <99 L @94 ( ontinua i$n siga los p!o edi"ientos seIalados n el punto ante!io!.

3a"bi-n se puede p!o ede! de la siguiente "ane!a+ Cete!"ine p!i"e!a"ente el di5"et!o del a"po &ue usted obse!va en el "i !os opio pa!a ada au"ento. Ba!a ello, "ida uidadosa"ente el di5"et!o lib!e de la lente o ula! ' div%dalo po! el *a to! de au"ento del objetivo, po! eje"plo+ Ci5"et!o lente o ula! (u"ento Objetivo Ci5"et!o del Ca"po 8isual 19"" K 44 4"" L 4.999u" 19"" K 194 1"" L 1.999u" 19"" K 494 9.<@"" L <@9u" 19"" K 1994 9.19"" L 199u" 7n*o&ue la est!u tu!a u'o ta"aIo &uie!e ono e! on el au"ento "a'o! 1in"e!si$n199.2. Boste!io!"ente, despla e la est!u tu!a a un bo!de del a"po ' al ule 1al ojo2, uantas ve es la est!u tu!a ab!ia en el di5"et!o del a"po. Suponga"os &ue la est!u tu!a abe ap!o4i"ada"ente @ ve es en el di5"et!o del a"po obse!vado on el au"ento 199.. (ho!a, o"o usted ono e el di5"et!o de di ho a"po 1199u"2, basta on dividi! di ho valo! po! las ve es &ue usted al ulo 1al ojo2, &ue la est!u tu!a ab%a en el di5"et!o del a"po 1@2. 7n onse uen ia 7l ta"aIo ap!o4i"ado de la est!u tu!a es de <9u" 199u"K@L <9 (un&ue le pa!e# a !a!o, este p!o edi"iento, el e!!o! o"etido es "u ho "eno! al 19M del valo! !eal. Con la p!5 ti a di ho e!!o! se "ini"i#a. 7ste do u"ento ha sido elabo!ado po! el B!o*eso! No!ge Sans Bu!oja pa!a el OCu!so (van#ado de :i !o opio Celula! Integ!alP &ue di ta anual"ente pa!a estudiantes de Bostg!ado en la ?a ultad de :edi ina de la )nive!sidad de Chile

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