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Instrucciones de Uso

Interleukin-2 (IL-2) ELISA


Inmunoensayo enzimtico para la determinacin cuantitativa de Interleucina-2 (IL-2) en sobrenadantes de cultivos celulares humanos, suero y plasma.

BE53021
96
2-8 C

I B L

I N T E R N A T I O N A L
Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 Fax: +49 (0)40-53 28 91-11

G M B H

Flughafenstrasse 52a D-22335 Hamburg, Germany

IBL@IBL-International.com www.IBL-International.com

INFORMACIN Y MANUAL DEL PRODUCTO

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

USO PROPUESTO RESUMEN PRINCIPIO DEL ENSAYO REACTIVOS SUMINISTRADOS INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO TOMA DE LAS MUESTRAS Y INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO PRECAUCIONES DE USO PREPARACIN DE REACTIVOS

2 2 3 4 5 5 5 6 7 10 13 14 15 17 18 19

10. PROTOCOLO DE ENSAYO 11. CALCULO DE RESULTADOS 12. LIMITES 13. PRUEBAS FUNCIONALES 14. INFORMACIN DE PEDIDOS 15. RESUMEN PREPARACIN DE REACTIVOS 16. RESUMEN DEL PROTOCOLO

Interleukin-2 (IL-2) ELISA (BE53021)

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1.

Uso Propuesto

El ELISA IL-2 humana es un inmunoensayo enzimtico para la deteccin cuantitativa de la IL-2 humana. El ELISA IL-2 humana es para el diagnstico in vitro. No debe utilizarse en los procedimientos teraputicos.

2.

Resumen

La Interleucina-2 (IL-2) juega un papel central en la activacin y proliferacin de los linfocitos que han sido preparados por los antgenos. La IL-2 juega un papel fundamental en la expansin de la mayora de las clulas T, clulas natural killer (NK) y clulas B durante ciertas fases de su respuesta. La IL-2 es una glicoprotena de 15 kDa codificada por un solo gen situado en la regin q26-28 del cromosoma humano 4. El polipptido deducido de cDNA consta de 153 aminocidos. La expresin gnica de IL-2 est regulada a nivel transcripcional por varias vas de activacin. La proliferacin antgeno especfico de los linfocitos T de ayuda y citotxicos despus de la estimulacin es crticamente, dependiente de la expresin, secrecin y de IL-2, y unin a los receptores de IL-2, inducida en una forma autocrina sobre la superficie de las clulasT. Adems de su papel ms importante para mediar el antgeno especfico de proliferacin de linfocitos T, la IL-2 modula la expresin de los antgenos interfern y de histocompatibilidad, estimula la proliferacin y la diferenciacin de las clulas B activadas, aumenta la actividad de las clulas NK y inhibe la formacin de colonias de granulocitos y macrfagos. Se han observado alteraciones en la capacidad de las clulas T de sintetizar IL-2 en los estados fisiolgicos y patolgicos. Debido al papel central de la IL-2 en la respuesta inmunitaria, la IL-2 result ser una molcula muy importante por las implicaciones diagnsticas y teraputicas. La IL-2 muestra efectos antitumorales, por lo tanto se utiliza en el tratamiento del cncer. El seguimiento de los niveles de IL-2 en suero proporciona una visin ms detallada en varias situaciones patolgicas como el cncer, enfermedades infecciosas, el rechazo de trasplantes, esclerosis mltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistmico y la diabetes tipo I.

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3.

Principio de Ensayo
Figura 1

Los pocillos de la microplaca son recubiertos con anticuerpos anti-IL-2 humana.

Micropocillos Recubiertos

Anticuerpo

Figura 2

La IL-2 presente en la muestra o el estndar se une a los anticuerpos adsorbidos en las micropocillos. Se agrega un anticuerpo anti-IL-2 humana conjugado a biotina que se une a la IL-2 capturado por el primer anticuerpo.

Primer Incubacin

Estndar o Muestra Conjugado de Biotina

Figura 3

Despus de la incubacin los anticuerpos no unidos conjugados a biotina anti-IL-2 humana son eliminados durante una etapa de lavado. Se agrega Estreptavidina-HRP y este se une a los anticuerpos conjugados a biotina anti-IL-2 humana.

Segunda Incubacin

Estreptavidina-HRP
Figura 4

Despus de la incubacin se elimina la Estreptavidina-HRP no unida mediante una etapa de lavado, y se aade la solucin de substrato reactiva con HRP a los pocillos.

Tercer Incubacin

Substrato

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Figura 5

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Se forma un producto de color proporcional a la cantidad de la IL2 presente en la muestra o el estndar. La reaccin es terminada por la adicin de cido y la absorbancia se mide a 450 nm. Se prepara una curva estndar a partir de 7 diluciones estndar de IL-2 humana y se determina la concentracin de IL-2 humana en la muestra.
Substrato reaccionado

4.
1

Reactivos Suministrados
bolsa de aluminio con una Placa de Micropocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales anti- IL-2 humana vial (100 L) con Conjugado de Biotina (anticuerpos policlonales anti-IL-2 humana) vial (150 L) con Estreptavidina-HRP viales con Estndar IL-2 humana liofilizado, 2.4 ng/mL tras la reconstitucin vial Control alto, liofilizado vial Control bajo, liofilizado frasco (50 mL) Diluyente de Muestras frasco (50 mL) de Solucin Buffer de Lavado Concentrada 20x (PBS con Tween 20 al 1%) vial (15 mL) de Solucin de Substrato (tetrametil-bencidina) vial (12 mL) de Solucin de Parada (Acido fosfrico 1 M) vial (0.4 mL) Colorante Azul vial (0.4 mL) Colorante Verde vial (0.4 mL) Colorante Rojo Tapas para placas, Adhesivas

1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4

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5.

Instrucciones de Almacenamiento ELISA Kit

Conservar los reactivos del juego de reactivos a una temperatura comprendida entre 2C y 8C escepto los controles. Almacenar los controles liofilizados a -20C. Inmediatamente despus de utilizarlos deber volver a conservar los reactivos a dicha temperatura (2C y 8C), controles a -20C, respectivamente. En las etiquetas figuran las fechas de caducidad del juego de reactivos y de los reactivos. Slo se podr garantizar la fecha de caducidad de los componentes del juego de reactivos si se le conservan adecuadamente y si, en caso de uso reiterado de un mismo componente, el reactivo no queda contaminado en la primera manipulacin.

6.

Toma de Muestras e Instrucciones de Almacenamiento

Sobrenadante de cultivo celular, suero y plasma (EDTA, citrato, heparina), lquido amnitico, orina, sangre, han sido examinado con este ensayo. Otras muestras biolgicas pueden ser adecuados para su uso en el ensayo. Eliminar el suero o plasma del cogulo o de las clulas tan pronto como sea posible despus de la coagulacin y separacin. Prestar atencin a un "Efecto Gancho" posible debido a la alta concentracin de las muestras (ver captulo 11). Las muestras que contienen un precipitado visible deben aclararse antes de su uso en el ensayo. No utilizar muestras altamente hemolizadas o lipmicas. Las muestras deben ser alcuotadas y se debe congeladar a -20C para evitar la prdida de IL-2 humana bioactiva. Si se van a usar las muestras dentro de las 24 horas, se pueden almacenar ente 2C y 8C (para la estabilidad de la muestra consulte el cpitulo 13.5). Evite ciclos repetidos de congelacin-descongelacin. Antes del ensayo, la muestra congelada debe alcanzar lentamente la temperatura ambiente y ser mezclada suavemente

7.

Material Requirido Pero No Suministrado

- Pipetas graduadas de 5 mL y 10 mL - Micropipetas ajustables de un solo canal de 5 L a 1000 L con puntas desechables - Micropipetas multicanales ajustables de 50 L a 300 L con puntas desechables - Depsito para micropipetas multicanales - Vasos de precipitados, matraz, probeta, necesarios para la preparacin de reactivos - Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitulacin - Fotmetro para placas de microtitulacin capaz de leer absorbancias a 450 nm (opcional: 620 nm longitud de onda de referencia) - Agua bidestilada o deionizada en un recipiente de vidrio - Programa estadstico informtico para llevar a cabo un anlisis de regresin

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8.

Precauciones de Uso

- Todos los productos qumicos deben considerarse potencialmente peligrosos. Por tanto, recomendamos que este producto sea manipulado nicamente por aquellas personas que hayan sido entrenadas en tcnicas de laboratorio y que sea usado de acuerdo con los principios de buenas prcticas de laboratorio. Se debe llevar ropa de proteccin apropiada como puedan ser las batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Se debe trabajar con cuidado para evitar cualquier contacto con piel y ojos. En el caso de que tenga lugar un contacto con piel u ojos, proceder de forma inmediata a lavar la parte afectada con abundante agua. Vase la(s) hoja(s) de seguridad y/o declaraciones de seguridad para recomendaciones especficas. - Los reactivos estn destinados para un uso en diagnstico in vitro y no se deben usar en procedimientos teraputicos. - No mezclar o sustituir los reactivos por los equivalentes de otros lotes u otras fuentes. - No usar reactivos caducados. - No exponer los reactivos del kit a una luz intensa durante su almacenamiento o incubacin. - No pipetear con la boca. - No se recomienda comer o fumar en las zonas donde se manipulen muestras o reactivos. - Evitar el contacto de los reactivos del kit o de las muestras con piel o mucosas. - Se recomienda el uso de guantes desechables de goma o ltex durante la manipulacin de las muestras y reactivos. - Evitar el contacto de la solucin de substrato con agentes oxidantes y metales. - Evitar salpicaduras y la generacin de aerosoles. - Con el propsito de evitar una contaminacin microbiolgica o contaminaciones cruzadas de reactivos y muestras que puedan invalidar el test se recomienda el uso de pipetas y/o puntas de pipetas de un solo uso. - Usar recipientes limpios y especficos de reactivos para la dispensacin de reactivos de sustrato. - La exposicin a los cidos inactiva el conjugado. - Se debe usar agua destilada o desionizada en la preparacin de los reactivos. - La solucin de substrato debe de estar a temperatura ambiente antes de su uso. - Descontaminar y disponer las muestras y todos los materiales potencialmente contaminados como si pudieran contener agentes infecciosos. El mtodo preferente de descontaminacin es un autoclavado durante un mnimo de 1 hora a 121.5C. - Los residuos lquidos que no contengan cido y los residuos neutralizados pueden ser mezclados con hipoclorito sdico en volmenes tales que la mezcla final contenga 1.0% de hipoclorito sdico. Dejar actuar durante 30 minutos para una efectiva descontaminacin. Los residuos lquidos que contengan cido deben ser neutralizados previamente a la adicin de hipoclorito sdico.

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9.

Preparacin de los Reactivos

La Solucin de Buffer Concentrada debe de alcanzar la temperatura ambiente y ser diluidas antes de iniciar el procedimiento del test. Si en el concentrado de la Solucin de Buffer se han formado cristales, caliente suavemente hasta su completa disolucin.

9.1. Solucin Buffer de Lavado (1x)


Vierta todo el contenido (50 mL) de la Solucin Buffer de Lavado Concentrada (20x) en un matraz aforado de 1000 mL limpio. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para evitar la formacin de espuma. Transfiera la solucin a un frasco de lavado limpio y consrvela a una temperatura entre 2C y 25C. La Solucin Buffer de Lavado permanece estable durante 30 das. En funcin de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solucin Buffer de Lavado de acuerdo a la siguiente tabla: Nmero de Tiras 1-6 1 - 12 Solucin Buffer de Lavado Concentrado (20x) (mL) 25 50 Agua Destilada (mL) 475 950

9.2. Preparacin de Conjugado de Biotina


Utilice el Conjugado de Biotiona antes de transcurridos 30 minutos desde su dilucin. Justo antes de utilizar el Conjugado de Biotina, se debe diluir en una proporcin de 1:100 con Diluyente de Muestras en un tubo de ensayo de plstico limpio. En funcin de la cantidad que vaya a necesitar, prepare el Conjugado de Biotina de acuerdo a la siguiente tabla: Nmero de Tiras 1-6 1 - 12 Conjugado de Biotiona (mL) 0.03 0.06 Dilyente de Muestras (mL) 2.97 5.94

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9.3. Estreptavidina-HRP
Utilice la estreptavidina-HRP antes de transcurridos 30 minutos desde su dilucin. Se debe diluir la Estreptavidina-HRP concentrada en una proporcin de 1:100.con Diluyente de Muestras en un tubo de ensayo de plstico limpio. En funcin de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la estreptavidina-HRP de acuerdo a la siguiente tabla: Nmero de Tiras 1-6 1 - 12 Estreptavidina -HRP (mL) 0.06 0.12 Dilyente de Muestras (mL) 5.94 11.88

9.4. Estndar IL-2 Humana


Reconstituir el Estndar IL-2 humana aadiendo agua destilada. El volumen de reconstitucin est indicado en la etiqueta del vial del estndar. Girar o mezclar cuidadosamente para garantizar una completa y homognea solubilizacin (concentracin del estndar reconstituido = 2.4 ng/mL). El estndar tiene que ser usado inmediatamente despus de la reconstitucin y no se puede almacenar. Las diluciones estndar pueden ser preparadas directamente en la placa multipocillo (vase 10.d) o alternativamente en tubos (vase 9.4.1).

9.4.1. Dilucin Estndar Externa


Rotular 7 tubos, uno para cada curva estndar. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Acto seguido, preparar diluciones seriadas 1:2 para la curva estndar como se indica a continuacin: Pipetear 225 L de diluyente de muestra a todos los tubos. Pipetear 225 L de estndar reconstituido (concentracin del estndar = 2.4 ng/mL) en el primer tubo, etiquetado como S1, y mezclar (concentracin del estndar 1 = 1.2 ng/mL). Pipetear 225 L de esta dilucin en el segundo tubo, etiquetado como y mezclar completamente antes de la siguiente transferencia. Repetir la serie de diluciones 5 veces ms de manera que se obtengan los diferentes puntos de la curva estndar (vase figura 6). El Diluyente de Muestra sirve como blanco.
Figura 6

Transferir 225 L

S1 IL-2 Humana Estndar Reconstituido

S2

S3

S4

S7 Descartar 225 L

Diluyente de Muestra 225 L

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9.5. Controles
Reconstituya aadiendo 800 L de agua destilada a los controles liofilizados (10-30 minutos). Girar o mezclar cuidadosamente para garantizar una completa y homognea solubilizacin. Adems tratar los controles como sus muestras de ensayo. Para el rango referencial consulte la certificacin de anlisis la etiqueta del frasco. Almacenar el reconstituyente de los controles en aliquotas a -20C. Evite congelar y descongelar repetidamente.

9.6. Adicin de Reactivos Colorantes: Colorante Azul, Colorante Verde, Colorante Rojo
Para ayudar a nuestros clientes a evitar errores durante el pipeteado de los ELISA de IBL, ofrecemos ahora una nueva herramienta para supervisar la adicin de volmenes incluso muy pequeos al pocillo de reaccin al dotar de un color diferente a cada etapa del procedimiento ELISA. Esta herramienta es opcional y no interfiere de ningn modo con los resultados del ensayo. Est diseada para ayudar al cliente a realizar dicho ensayo aunque es un mtodo omisible y cabe la posibilidad de seguir simplemente las instrucciones expuestas en el manual. Como alternativa, se puede aadir a los reactivos las soluciones colorantes obtenidas de los materiales iniciales suministrados (Colorante Azul, Colorante Verde, Colorante Rojo), conforme a las siguientes pautas: 1. Diluyente: Antes de diluir el estndar y la muestra, aada el Colorante Azul diluido en proporcin 1:250 (vase la tabla siguiente) al diluyente consiguiente (1x) de acuerdo con el protocolo Despus de aadir el Colorante Azul, siga las instrucciones del manual. 5 mL Diluyente de Muestras 12 mL de Diluyente de Muestras 50 mL de Diluyente de Muestras 2. 20 L Colorante Azul 48 L Colorant Azul 200 L Colorant Azul

Conjugado de Biotina: Antes de diluir el conjugado concentrado, aada el Colorante Verde diluido en una proporcin de 1:100 (vase la tabla siguiente) al diluyente de muestra utilizado para la dilucin final del conjugado. Despus de aadir el Colorante Verde, siga las instrucciones del manual (Conjugado de Biotiona). 3 mL de Diluyente de Muestras 6 mL de Diluyente de Muestras 12 mL de Diluyente de Muestras 30 L Colorante Verde 60 L Colorante Verde 120 L Colorante Verde

3.

Estreptavidina-HRP: Antes de diluir el Estreptavidina-HRP concentrado, aada el Colorante Rojo diluido en una proporcin de 1:250 (vase la tabla siguiente) al Diluyente de Muestra utilizado para la dilucin final del Estreptavidina-HRP. Despus de aadir el Colorante Rojo, siga las instrucciones del manual (Estreptavidina-HRP). 6 mL de Diluyente de Muestras 12 mL de Diluyente de Muestras 24 L de Colorante Rojo 48 L de Colorante Rojo

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10.
a.

Protocolo de Ensayo
2 x 100 L de muestra son necesarias para duplicar la medicin. Las muestras de suero o plasma, as como los controles reconstituidos, se utilizan sin diluir. Los niveles de sobrenadante de cultivo celular IL-2 humana, puede variar considerablemente. Debe realizarse una dilucin ptima para cada muestra individual. Las muestras desconocidas de cultivo celular es conveniente analizar sin diluir, as como muestras prediluidas en paralelo (por ejemplo, 1:20 - 1:50), cubriendo as una gama ms amplia en un mismo ensayo. Sobrenadantes de cultivo celular con muy altas concentraciones de IL-2 humana, requieren altas diluciones (por ejemplo, hasta 1:2000) con el fin de medir correctamente. Estas muestras deben ser prediludas en el respectivo medio de cultivo celular. La dilucin final de la muestra debe realizarse de acuerdo con el siguiente esquema: Dilucin 1:5 1:10 1:50 1:100 1:1000 1:2000 Volumen de Muestra 50 L Muestra 25 L Muestra 10 L Muestra A: 10 L Muestra B:25 L predilucin A A: 10 L Muestra B:25 L predilucin A A: 10 L Muestra B:10 L predilucin A Diluyente de Muestra 200 L Diluyente de Muestra 225 L Diluyente de Muestra 490 L Diluyente de Muestra 90 L Diluyente de Muestra 225 L Diluyente de Muestra 990 L Medio de Cultivo 225 L Diluyente de Muestra 390 L Medio de Cultivo 490 L Diluyente de Muestra Factor de Dilucin: 5 10 50 100 1000 2000

b.

Determine el nmero de tiras necesarias para analizar el nmero deseado de muestras y adems aada las tiras para blancos y estndares. Cada muestra, estndar, blancos y la muestra de control opcional deben ser analizadas por duplicado. Retire del soporte las tiras sobrantes y consrvelas, junto con el desecante suministrado en una bolsa metalizada y cerrada hermticamente, a una temperatura de 2-8C. Lave 2 veces las tiras con aproximadamente 400 L de Solucin Buffer de Lavado por cada pocillo, aspirando completamente el contenido de los pocillos entre cada lavado. Permitir que la Solucin Buffer de Lavado permanezca en los pocillos durante 10-15 segundos antes de su aspiracin. Evite rayar la superficie de los pocillos. Tras el ltimo lavado, golpee suavemente las tiras contra un papel absorbente o una toallita de papel para eliminar el exceso de tampn de lavado. Utilice las tiras inmediatamente despus de lavadas o bien colquelas boca abajo sobre un papel absorbente hmedo durante como mximo 15 minutos. No deje secar los pocillos. Dilucin de los Estndares en la placa de microtitracin (Alternativamente, la dilucin de los estndars puede ser preparada en tubos vase 9.4.1) Aadir 100 L de Diluyente de Muestra en duplicado a todos los pocillos estndar. Pipetear 100 L de estndar preparado (vase Preparacin del Estndar 9.4, concentracin = 2400.0 pg/mL) por duplicado en los pocillos A1 y A2 (vase Table 1). Mezclar el contenido de los pocillos A1 y A2 por repetidas aspiraciones y expulsiones del contenido con la pipeta (concentracin del estndar 1, S1 = 1200.0 pg/mL), y transferir 100 L a los pocillos B1 y B2, respectivamente. (vase Figure 7). Llevar cuidado de no rascar la superficie interior de los micropocillos con la punta de la pipeta. Continuar este procedimiento 5 veces, formando dos filas de diluciones estndar del human IL-2 ordenadas des de 1200.0 a 18.8 pg/mL. Descartar 100 L de los contenidos de los ltimos micropocillos (G1, G2) usados.

c.

d.

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Figura 7 Transferir 100 L

S1 IL-2 Humana Estndar Reconstituido

S2

S3

S4

S7 Descartar 100 L

Diluyente de Muestra 100 L

En caso de una dilucin estndar externa (vase 9.4.1), pipetear 100 L de estas diluciones estndar (S1-S7) en los pocillos correspondientes al estndar de acuerdo con la Tabla 1.

Tabla 1 Tabla que describe un ejemplo de la disposicin de los blancos, estndares y muestras en los micropocillos de las tiras: 1 A B C D E F G H Estndar 1 (1200.0 pg/mL) Estndar 2 (600.0 pg/mL) Estndar 3 (300.0 pg/mL) Estndar 4 (150.0 pg/mL) Estndar 5 (75.0 pg/mL) Estndar 6 (37.5 pg/mL) Estndar 7 (18.8 pg/mL) Blanco 2 Estndar 1 (1200.0 pg/mL) Estndar 2 (600.0 pg/mL) Estndar 3 (300.0 pg/mL) Estndar 4 (150.0 pg/mL) Estndar 5 (75.0 pg/mL) Estndar 6 (37.5 pg/mL) Estndar 7 (18.8 pg/mL) Blanco 3 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 4 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8

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e. f. g. h. Aadir 100 L de Diluyente de Muestra en duplicado en los pocillos en blanco. Aadir 100 L de cada muestra en duplicado a los pocillos con la muestra.

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Prepare el Conjugado de Biotiona (vase la preparacin del Conjugado de Biotiona 9.2) Aada 50 L el Conjugado de Biotiona a todos los pocillos. Cubra la placa con una tapa e incbela a temperatura ambiente (18-25C) durante 2 horas en un agitador mecnico a 200 rpm, si es posible. Prepare la Estreptavidina-HRP (vase la Preparacin de Estreptavidina-HRP 9.3). Retire la tapa y vace los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 4 veces de acuerdo al punto c del protocolo del test. Proseguir inmediatamente despus al prximo paso. Aada 100 L de Estreptavidina-HRP a todos los pocillos, inclusive el pozo en blanco Cubra la placa con una tapa e incbela a temperatura ambiente (18-25C) durante 1 hora en un agitador mecnico a 200 rpm, si es posible. Retire la tapa y vace los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 4 veces de acuerdo al punto c del protocolo del test. Proseguir inmediatamente despus al prximo paso. Pipetee 100 L de la Solucin de Substrato TMB y virtalos en todos los pocillos. Incube las tiras a temperatura ambiente (18-25C) durante aproximadamente 10 minutos. Evite la exposicin directa a la luz intensa. Deben monitorizarse los valores DO de la placa para detener la reaccin del substrato (vase el siguiente punto de este protocolo) antes de que deje de ser posible registrar correctamente los pocillos positivos. La determinacin del tiempo adecuado para el desarrollo del color, debe realizarse de forma individual para cada ensayo. Se recomienda aadir la solucin de parada cuando el estndar ms alto presente un color azul oscuro. Alternativamente el desarrollo de color puede ser monitorizado con un lector de placas de ELISA a 620 nm. La reaccin del substrato debera ser parada cuando el Estndar 1 alcanze una DO entre 0.9 y 0.95.

i.
j. k. l. m. n. o. p.

q.

Detenga la reaccin enzimtica pipeteando rpidamente 100 L de la Solucin de Parada en cada pocillo, incluidos los del blanco. Es importante dispensar la Solucin de Paro de forma rpida y uniforme en todos los pocillos para inactivar totalmente la enzima. Los resultados deben leerse inmediatamente despus de aadir la solucin de parada o, como mximo, en el plazo de 1 hora si las tiras se conservan a una temperatura entre 2-8C en un lugar oscuro. Lea la absorbancia de cada pocillo en un espectrofotmetro utilizando 450 nm como longitud de onda principal (opcionalmente 620 nm como longitud de onda de referencia; los valores comprendidos entre 610 nm y 650 nm son aceptables). Utilizando los pocillos de blanco, haga el blanco del lector de placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine la absorbancia de las muestras y de los estndares.

r.

Nota: En caso de incubar sin agitar, los valores de D.O. pueden ser inferiores a los indicados ms abajo. De todas formas los resultados siguen siendo vlidos.

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11.
-

CALCULO DE RESULTADOS
Calcular los valores de absorbancia media para cada conjunto de duplicados de los estndares y muestras. Los duplicados deben estar dentro del 20 por ciento del valor medio Construir una curva estndar mediante la representacin de la absorbancia media obtenido para cada estndar frente a la concentracin de IL-2 humana con el valor de absorbancia en el eje y y la concentracin en el eje-x. Se logra un buen ajuste con 5 Parameter Logistics. Para determinar la concentracin de la IL-2 humana circulante para cada muestra, primero encontrar el valor de absorbancia media en la ordenada y extender una lnea horizontal a la curva estndar. En el punto de interseccin, extender una lnea vertical al eje de abscisas y leer la concentracin la IL-2 humana. Si se han seguido las instrucciones de este protocolo, se han diluido las muestras de cultivo celular. La concentracin leda a partir de la curva estndar se debe multiplicar por el factor de dilucin. Clculo de las muestras con una concentracin superior al estndar 1, puede dar lugar a concentraciones incorrectas, bajas en IL-2 humana (Efecto Gancho). Estas muestras requieren ms predilucin externa segn los valores esperados de IL-2 humana con el Diluyente de Muestras para cuantificar con precisin la concentracin real de IL-2 humana. Se recomienda que cada centro de pruebas establece una muestra de control con concentraciones conocidas de IL-2 humana y se ejecuta este control adicional con cada ensayo. Si los valores obtenidos no estn dentro del intervalo esperado del control, los resultados del anlisis pueden ser no vlidos. En la figura 8 se muestra una representativa curva estndar. Esta curva no se puede utilizar para obtener resultados de las pruebas. Cada laboratorio debe preparar una curva estndar por cada grupo de tiras ensayadas.

Figura 8

Representativa curva estndar para el ELISA IL-2 humana. Se diluy IL-2 humana en serie de 2 etapas en el Diluyente de Muestras. No use esta curva estndar para obtener resultados de las pruebas. Se debe ejecutar una curva estndar para cada grupo de tiras ensayadas.

Interleucina-2 ELISA
10

DO (450 nm)

0.1

0.01 10 100 1000 10000 pg/m L

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Tabla 2

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Datos tpicos utilisando el ELISA IL-2 humana Longitud de onda: 450 nm Longitud de onda de referencia: 620 nm Concentracin Human IL-2 (pg/mL) 1200.0 600.0 300.0 150.0 75.0 37.5 18.8 0 D.O. (450 nm) 2.294 2.450 1.166 1.168 0.592 0.562 0.313 0.307 0.171 0.173 0.105 0.100 0.066 0.060 0.029 0.026 D.O. Moyenne (450 nm) 2.372 1.167 0.577 0.310 0.172 0.102 0.063 0.028 C.V. (%) 3.3 0.2 2.6 1.0 0.4 2.0 4.8 5.5

Estndar 1 2 3 4 5 6 7 Blanco

Los valores de DO de la curva estndar pueden variar segn las condiciones de la realizacin del ensayo (por ejemplo empleados del laboratorio, tcnica de pipeteo, tcnica de lavado o efectos de la temperatura). Por otra parte el almacenamiento del equipo puede afectar la actividad enzimtica y por tanto la intensidad de color. Los valores medidos siguen siendo vlidas.

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LIMITES
Dado que las condiciones exactas pueden variar de un ensayo a otro ensayo, se debe crear una curva estndar para cada prueba. La contaminacin de las muestras o los reactivos por bacterias o hongos, o una contaminacin cruzada entre los reactivos puede dar resultados errneos. Se debe utilizar preferiblemente puntas de pipeta desechables, matraz de vidrio o frascos de vidrio. Los frascos de vidrio reutilizables deben ser lavados antes de su uso y todos los productos de limpieza ser eliminados por un enjuague minucioso. Un lavado incorrecto o inadecuado durante cada paso del procedimiento de ensayo puede conducir a resultados errneos ya sea falsos positivos o falsos negativos. Vaciar los pocillos completamente antes de pipetear la Solucin de Lavado fresca. Pipetear la Solucin Buffer de Lavado en los pocillos como se especifica para cada ciclo de lavado y no deje que los pocillos estn no cubiertos durante mucho tiempo o que se secan. Por la aplicacin de radioinmunoterapia, el nmero de pacientes con los anticuerpos humanos IgG antiratn (HAMA) ha aumentado significativamente. HAMA puede interferir en ensayos que utilicen anticuerpos monoclonales murinos, y dar lugar a resultados tantos falsos positivos como falsos negativos. Muestras de suero que contienen anticuerpos contra inmunoglobulinas murinas pueden todava ser ensayadas en ensayos de este tipo si se aaden inmunoglobulinas murinas (suero, lquido asctico o anticuerpos monoclonales no especficos) a la muestra.

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Pruebas Funcionales

13.1. Sensibilidad
El lmite de deteccin de IL-2 humana definido como la concentracin del analito resultando en una absorcin significativamente ms alta que la del medio de dilucin (media ms dos desviaciones estndar), se determin de ser 9.9 pg/mL (media de 6 ensayos independientes).

13.2. Recuperacin
13.2.1. Intra-ensayo
La recuperacin del intra-ensayo se evalu en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llev a cabo con 6 repeticiones de 4 muestras de suero y 4 muestras de sobrenadantes de cultivos clulares que contienen diferentes concentraciones de IL-2 humana. Se llevaron a cabo dos curvas de estndar en cada placa. Los datos a continuacin muestran la concentracin media de IL-2 humana y el coeficiente de variacin para cada muestra (ver Tabla 3). El calculado coeficiente de variacin intra-ensayo total fue del 5.2%. Tabla 3 La concentracin media de IL-2 humana y el coeficiente de variacin para cada muestra. Muestra 1 Exprience 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Concentracin media de human IL-2 (pg/mL) 251 283 238 150 170 128 336 396 332 127 146 123 202 236 202 78 87 68 241 273 264 168 193 169 Coeficiente de Variacin (%) 7.9 2.2 8.8 5.6 4.6 6.9 7.4 2.8 5.6 4.5 6.5 4.6 3.4 4.3 4.8 5.9 4.5 6.5 2.8 3.1 4.4 6.2 7.5 4.8

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La recuperacin del intra-ensayo se evalu en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llev a cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de sobrenadantes de cultivos celulares que contienen diferentes concentraciones de IL-2 humana. Se llevaron a cabo dos curvas de estndar en cada placa. Los datos a continuacin muestran la concentracin media de la IL-2 humana y el coeficiente de variacin para cada muestra (ver Tabla 4). El calculado coeficiente de variacin intra-ensayo total fue del 8.0%. Tabla 4 La concentracin media de IL-2 humana y el coeficiente de variacin para cada muestra: Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 Concentracin media de IL-2 humana (pg/mL) 257 149 355 132 213 78 259 177 Coeficiente de Variacin (%) 7.5 11.4 8.3 7.6 7.5 9.9 5.3 6.6

13.3. Recuperacin despus del enriquecimiento


La recuperacin del enriquecimiento fue evaluada enriqueciendo tres niveles de IL-2 humana en muestras combinadas de suero humano normal y muestras de plasma citrato. Las recuperaciones se determinaron en dos experimentos independientes con 4 repeticiones cada uno. La recuperacin vari entre 72% a 93% en las muestras de suero y de 71% a 81% en las muestras de plasma con una recuperacin media total del 78%.

13.4. Dilucin en paralelo


Muestras de suero (1), plasma citrato (2) y sobrenadantes de cultura celular (3, 4) con diferentes concentraciones de IL-2 humana fueron analizadas mediante 2 diluciones en serie con 4 repeticiones cada uno. La recuperacin vari entre 100% a 115% con una recuperacin total de 107% (vease Table 5).
Tabla 5

Muestra

Dilucin -1:2 1:4 1:8 -1:2 1:4 1:8 -1:2 1:4 1:8 -1:2 1:4 1:8

Concentracin Expectada de IL-2 Humana (pg/mL) -327 179 90 -260 130 67 -4680 2340 1170 -3034 1517 759

Concentracin Observada de IL-2 Humana (pg/mL) 654 358 180 100 520 260 135 71 9360 4993 2527 1326 6068 3238 1745 805

Recuperacin de Concentracin Expectada de IL-2 Humana (%) -110 101 112 -100 104 106 -107 108 113 -107 115 106
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13.5. Estabilidad de Muestras


13.5.1. Estabilidad Congelacin - Descongelacin
Alcuotas de las muestras de suero y de sobrenadantes de cultivos celulares (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20C y posteriormente 5 veces descongeladas, y se determin las concentraciones de la IL-2 humana. No hubo prdidas significativas de la inmunoreactividad de IL-2 humana detectada por hasta 3 ciclos de congelacin y descongelacin. Una prdida significativa de la inmunoreactividad de la IL-2 (20%) fue detectado a ms ciclos de congelacin y descongelacin.

13.5.2. Estabilidad de Almacenamiento


Alcuotas de las muestras de suero y de sobrenadantes de cultivos celulares (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20C, 2-8C, temperatura ambiente (TA) y a 37C, y la concentracin de la IL-2 humana determinada despus de 24 h. No se detect una prdida significativa de la inmunoreactividad de la IL-2 humana durante el almacenamiento a -20C, 2-8C y TA. Se detect una prdida significativa de la inmunoreactividad de IL-2 humana (20%) durante el almacenamiento a 37C despus de 24 h.

13.6. Comparacin de Suero y Plasma


Se obtuvieron muestras de suero as como plasma EDTA, citrato y heparina al mismo tiempo de tres donantes y se ensay la concentracin de IL-2 humana. Las concentraciones no fueron significativamente diferentes y por tanto todas estas lquidos corporales son adecuadas para uso en este ensayo. Sin embargo, es muy recomendable asegurar la uniformidad de las preparaciones de sangre.

13.7. Especificidad
La reactividad cruzada y la interferencia de factores circulantes del sistema inmune fue evaluada por enriquecer estas protenas a concentraciones fisiolgicamente relevantes en un suero positivo de IL-2 humana. No se detect reactividad cruzada o interferencias.

13.8. Valores Esperados


No se encontr concentraciones detectables de IL-2 humana en los donantes sanos. Concentraciones elevados de IL-2 humana dependen del tipo de trastorno inmunolgico.

13.9. Calibracin
El inmunoensayo es calibrado con recombinante IL-2 humana altamente purificada, que ha sido evaluado segn el estndar de referencia internacional NIBSC 86/504 y se ha demostrado que son equivalentes. NIBSC 86/504 se cuantifica en unidades internacionales (UI) de una IU que corresponde a 76 pg de la IL-2 humana.

14.

INFORMACIN DE PEDIDOS

Para los pedidos pongse en contacto con:

Vase ltima pgina.

Para preguntas tcnicas comuniquese con: e-mail: IBL@IBL-International.com www.IBL-International.com

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Resumen: Preparacin de Reactivos

15.1. Solucin Buffer de Lavado (1x)


Aadir 50 mL de la Solucin Buffer de Lavado Concentrado (20x) a 950 mL de agua destilada. Nmero de tiras 1-6 1-12 Solucin Buffer der Lavado Concentrado (mL) 25 50 Agua Destilada (mL) 475 950

15.2. Conjugado de Biotina


Hacer una dilucin 1:100 del Conjugado de Biotina en Diluyente de Muestras: Nmero de tiras 1-6 1-12 Conjugado de Biotina (mL) 0.03 0.06 Diluyente de Muestras (mL) 2.97 5.94

15.3. Estreptavidina-HRP
Hacer una 1:100 dilucin de Estreptavidina-HRP en Diluyente de Muestras: Nmero de tiras 1-6 1-12 Estreptavidina-HRP (mL) 0.06 0.12 Diluyente de Muestras (mL) 5.94 11.88

15.4. Estndar IL-2 Humana


Reconstituir el estndar liofilizado de IL-2 humana con agua destilada. (El volumen de reconstitucin es indicado en la etiqueta del frasco de estndar)

15.5. Controles
Aadir 800 L de agua destilada a los controles liofilizados.

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1. 2. 3. 4.

Resumen Protocolo de Ensayo


Prediluir los sobrenadantes de cultivos celulares con Diluyente de Muestras. Determinar el nmero requirido de tiras de la placa de microtitulacin Lavar las tiras de la placa de microtitulacin dos veces con Solucin Buffer de Lavado. Dilucin estndar en la placa de microtitracin: Aadir 100 L de Diluyente de Muestras, por duplicado, a todos los pocillos estndar. Pipetear 100 L de estndar preparado en los primeros pocillos y crear diluciones estndar mediante la transferencia de 100 L de pocillo a pocillo. Deseche 100 L de los ltimos pocillos. Alternativamente dilucin estndar externa en tubos (ver 9.4.1): Pipetear 100 L de estas diluciones estndares en las tiras de los micropocillos. Aadir 100 L de Diluyente de Muestras, por duplicado, a los pocillos blancos. Aadir 100 L de muestra por duplicado a los pocillos respectivos. Preparar el Conjugado de Biotina. Aadir 50 L de Conjugado de Biotina a todos los pocillos. Cubrir las tiras e incubar 2 horas a temperatura ambiente (18-25C). Preparar la Estreptavidina-HRP. Vaciar y lavar los pocillos 4 veces con Solucin Buffer de Lavado. Aadir 100 L de Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos. Cubrir las tiras e incubar 1 hora a temperatura ambiente (18-25C). Vaciar y lavar los pocillos 4 veces con Solucin Buffer de Lavado. Aadir 100 L de Solucin Substrato TMB a todos los pocillos. Incubar las tiras para approximadamente 10 minutos a temperatura ambiante (18-25C). Aadir 100 L de Solucin de Parada a todos los pocillos. Ajustar el fotmetro y medir la absorbancia a 450 nm.

5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.

Nota: Si han seguido las instrucciones en este protocolo las muestras de los sobrenadantes de cultivos celulares han sido diluidas. La concentracin leda de la curva estndar debe ser multiplicada por el factor de dilucin.

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Symbols / Symbole / Symbles / Smbolos / Smbolos /


REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N. Cat.: / N.Cat.: / -.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.: / Lotto n.: / -: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser : / Usado por: / Usar at: / Da utilizzare entro: / : No. of Tests: / Kitgre: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N. de Testes: / Quantit dei tests: / : CONC LYO IVD Concentrate / Konzentrat / Concentr / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilis / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Mdical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Mdico para Diagnstico In Vitro. / Equipamento Mdico de Diagnstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / In-Vitro . Evaluation kit. / Nur fr Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour valuation. / Juego de Reactivos para Evaluaci. / Kit de avaliao. / Kit di evaluazione. / . Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instrues antes de usar. / Leggere le istruzioni prima delluso. / . Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schtzen. / Garder labri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Mantngase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / . Store at: / Lagern bei: / Stocker : / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / : Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / : Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaucin! / Cuidado! / Attenzione! / ! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbles des composants du kit. Smbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para smbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. .

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