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Informe Practica Especial Fsica II (ByG) - Ctedra Sigman FCEN !

B"

SIMULACION DE TECNICAS PARA LA DETERMINACION DE COEFICIENTES DE DIFUSION: FRAP Y FCS


Carlos Federico, Rita Berg !o, " a# Salgado Salter

INTRODUCCION
F#"P (Fl$orescence #eco%ery "fter P&oto'leac&ing) es $na t(cnica de microscopia m$y empleada en 'iologa cel$lar para el est$dio de la dinmica de protenas) *esde la d(cada de +,-. esta t(cnica se empleo para el est$dio de la dinmica de protenas de mem'rana y la determinaci/n de s$s coeficientes de dif$si/n) " partir de la d(cada de +,,. c$ando f$e posi'le la e0presi/n de protenas de f$si/n a GFP (green fl$orescent protein) F#"P co'ro n$e%o imp$lso) En F#"P las mol(c$las fl$orescentes locali1adas en $na pe2$e3a regi/n de inter(s son irre%ersi'lemente foto'lan2$eadas empleando $n laser de alta intensidad) " contin$aci/n la rec$peraci/n de la fl$orescencia en la regi/n de inter(s como res$ltado del mo%imiento de las mol(c$las fl$orescentes &acia la misma es medida en el tiempo empleando $n microscopio confocal) 4a espectroscopia de correlaci/n de fl$orescencia (FCS) es otra t(cnica 2$e permite determinar coeficientes de dif$si/n de protenas fl$orescentes y otros fl$oroforos) Para ello empleando $n microscopio confocal se miden las fl$ct$aciones en la intensidad de fl$orescencia dentro de $n pe2$e3o %ol$men de o'ser%acion (5. 6 f4) conteniendo $nas pocas molec$las) 4$ego el anlisis de la correlaci/n temporal de dic&as fl$ct$aciones permite o'tener informaci/n como el coeficiente de dif$si/n y la concentraci/n)

DESARROLLO
Se sim$laron e0perimentos de F#"P en protenas de mem'rana as$miendo 2$e estas reali1an $n random 7al8 en dos dimensiones so're $na s$perficie esf(rica) 4a c(l$la f$e representada como $na esfera de radio ig$al a +. 9m) Se sim$lo el mo%imiento de :.... partc$las con posiciones iniciales aleatorias so're la esfera) Cada $na $nidad de tiempo las protenas dieron $n paso de direcci/n y longit$d aleatoria restringido a $n circ$lo) " todas las partc$las se les asigno inicialmente $na fl$orescencia ar'itraria ig$al a +) ;ransc$rrido $n cierto tiempo ;o la fl$orescencia de a2$ellas partc$las 2$e se encontra'an en la regi/n de inter(s ($n circ$lo de radio 6 9m) paso a ser ig$al a cero) Posteriormente se registro la fl$orescencia (2$e es ig$al al n$mero de mol(c$las fl$orescentes) en la regi/n de inter(s en f$nci/n del tiempo mientras las protenas dif$ndan li'remente) Para el est$dio de FCS se sim$lo $n random 7al8 en < dimensiones con :.. partc$las (=+. n>) dentro de $na esfera de +. 9m (representando el citosol de

$na c(l$la)) Se registro el n$mero de partc$las en el %ol$men focal (considerado como $n esferoide de semie?e menor @.A. 6: 9m y semie?e mayor @1A+ 6: 9m) en f$nci/n del tiempo) 4$ego se o't$%o la f$nci/n de a$tocorrelaci/nB

*ondeB y F(t) es la fl$orescencia a tiempo t)

RESULTADOS Y DISCUCION
>ediante la sim$laci/n de F#"P se o't$%ieron los res$ltados esperados para $na protena 2$e dif$nde li'remente en la mem'rana plasmtica o'ser%ndose $na rec$peraci/n casi total (es inalcan1a'le $na rec$peraci/n del +..C de'ido a la perdida de fl$orescencia 2$e implica el P&oto'leac&ing)) En la fig$ra + se m$estra como e?emplo $na de las c$r%as o'tenidas) En ella se o'ser%a como l$ego del P&oto'leac&ing la fl$orescencia se rec$pera de'ido al ingreso de protenas fl$orescentes al rea medida)

Fig ra $% Sim$laci/n de F#"P de protenas de mem'rana

" contin$aci/n se reali1aron n$e%as sim$laciones de :.... partc$las %ariando el tama3o del paso dado por las partc$las) En las sim$laciones el despla1amiento a 2

cada tiempo esta dado por $n DEA6FGPGrand y $n DHAFGPGrand siendo P $n n$mero menor a +) En la fig$ra 6 se m$estran las c$r%as de fl$orescencia (relati%i1ada a la fl$orescencia final) en f$nci/n del tiempo para distintos %alores de P)

Fig ra &% Efecto del tamao del paso sobre la recuperacin de la fluorescencia.

;al como se espera'a c$anto mas rpido se m$e%en las partc$las (mayor %alor de P) la rec$peraci/n es mas %elo1) Se denomina tiempo de dif$si/n o tiempo caracterstico (d) al tiempo en el c$al la fl$orescencia es la mitad de la fl$orescencia final) Este se relaciona con el coeficiente de dif$si/n porB dA@6IJ* *onde @ es el radio de la regi/n so're la c$al se &i1o el p&oto'leac&ing) Se grfico el tiempo caracterstico en f$nci/n de la in%ersa de PK (fig$ra <)) Se o't$%o $na relaci/n lineal lo c$al era espera'le ya 2$e P es proporcional al tama3o del paso y el coeficiente de dif$si/n es proporcional al c$adrado del paso) >ediante la sim$laci/n del mo%imiento de partc$las en < dimensiones se o't$%ieron datos de fl$orescencia en f$nci/n del tiempo con los c$ales se constr$yeron las c$r%as de G() 2$e se m$estran en la fig$ra J) El res$ltado o'tenido es el esperado o'ser%ndose como la a$tocorrelaci/n (normali1ada) decae con el tiempo &asta llegar a cero) "demas se compr$e'a 2$e el tiempo caracterstico es in%ersamente proporcional al tama3o del paso (y en $ltima instancia al coeficiente de dif$si/n) ya 2$e dA@.6IJ* (donde d es el tiempo al c$al la correlaci/n decae a la mitad y @. es el radio en el plano 0-y del %ol$men focal)

Fig ra '% #elaci/n entre el tiempo caracterstico y el tama3o del paso)

Fig ra (% "$tocorrelaci/n temporal para distintos coeficientes de dif$si/n o'tenida mediante sim$laci/n de FCS

BIBLIO)RAFIA
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