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MTODO CROMOGNICO PARA LA IDENTIFICACIN DE Salmonella spp.

CON
EL EMPLEO DEL MEDIO CROMOCEN SC EN MUESTRAS CLNICAS

1. INTRODUCCIN

CromoCen SC es un medio cromognico para la deteccin, aislamiento,
diferenciacin y/o recuento de Salmonella (excepto S. Typhi) y coliformes totales de
otras bacterias Gram-negativas.

El medio basa su funcionamiento en la combinacin de una reaccin cromognica
para detectar la actividad -galactosidasa de los coliformes y una reaccin
bioqumica de degradacin de fuentes de carbono por las Salmonella no
pertenecientes al grupo typhi que produce una disminucin del pH, con el
consiguiente cambio de color del indicador incluido en la formulacin. La
combinacin de bases nutritivas utilizadas permite el crecimiento adecuado de los
microorganismos de inters, en presencia de inhibidores para los microorganismos
Gram-positivos.

La utilizacin de un agente que proporciona opacidad, posibilita un mejor contraste
de colores y mejor observacin de las respuestas.

El mtodo que se describe en este documento prev el empleo del medio
CromoCen SC para la identificacin de Salmonella no Typhi, ni Paratyphi, en paralelo
con otro medio selectivo complementario para la identificacin de S. Typhi y
S. Paratyphi (Agar S.S.).


2. INDICADORES DE DESEMPEO DEL MEDIO CROMOCEN SC

Sensibilidad para Salmonella no Typhi: 100%
Especificidad para Salmonella no Typhi: 96,9%
Exactitud para Salmonella no Typhi: 97,6%

Con el medio CromoCen SC, se logra una sensibilidad analtica de 10
-6
UFC/mL a
partir de un inculo estandarizado a 0,5 de la escala MacFarland.

*El nmero de tubo utilizado de la escala Mac Farland, ser el equivalente a 3x10
8
UFC/mL,
equivalente adems al 50 % de transmitancia determinada mediante el espectrofotmetro.


3. CONDICIONES DE SEGURIDAD

Manipule los microorganismos con extremo cuidado segn los requisitos de
Seguridad Biolgica. Estos microorganismos se encuentran en el grupo de
riesgo 2.
En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados,
bloquee la zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente aada
solucin desinfectante (alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y mantngala sobre la
superficie aproximadamente 15 min. Recoja el material derramado, limpie la
zona.
En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes,
lave rpidamente la zona con agua fresca y acuda al mdico si es necesario.
Use bata de laboratorio.


4. PROCEDIMIENTO PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD

1. Determinacin de pH.
2. Evaluacin microbiolgica.
Ver anexo A

5. TRMINOS Y DEFINICIONES

Salmonella: Es un gnero de la familia Enterobacteriaceae (Brenner, 1984). Los
miembros de esta familia son caracterizados como bacilos Gram-negativos,
anaerobios facultativos, no formadores de esporas. Presentan flagelos pertricos.
Producen cido y algunas veces gas a partir de glucosa, son usualmente catalasa
positivos, oxidasa negativos y reducen nitratos a nitritos.

En este mtodo Salmonella no perteneciente a las especies de S. Typhi y
S. Paratyphi se definen como colonias de color rosado con diferentes intensidaes a
rojo.

Deteccin de Salmonella: Determinacin de la presencia o ausencia de Salmonella,
en un volumen o masa determinado de producto.


6. ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO SELECTIVO

Inocule en el Caldo Selenito (CS), u en otro caldo apropiado para enriquecimiento de
Salmonella (Caldo Rappaport-Vassiliadis, o el medio modificado con la
incorporacin de peptona de soja, a partir de la muestra de coprocultivo o de otro
origen.

Incube el Caldo Selenito a 35 2 C durante 18 - 24h. (El Caldo Rappapot Vasiliadis
a 41,5 1 C durante 18-24 horas).


7. SIEMBRA EN PLACAS E IDENTIFICACIN

A partir de los cultivos anteriores, inocule los medios selectivos:

- CromoCen SC
- Agar S.S.

Incube el medio CromoCen SC a 35 2 C durante 18-24 horas.

Incube el Agar S.S. a 35 2 C durante 11-18 horas.


2


Identificacin en el medio CromoCen SC.

El crecimiento tpico de Salmonella (S. Typhimurium, S. cholerae-suis, S. Enteritidis,
excepto S. Typhi) en el medio CromoCen SC son colonias de rosadas con diferentes
intensidades a rojo.

Identificacin en el medio Agar S.S.

El crecimiento tpico de Salmonella en Agar S.S. modificado son colonias incoloras
con o sin centro negro, mientras que Shigella se observa como colonias incoloras.


8. MICROORGANISMOS INTERFERENTES, OTROS MICROORGANISMOS Y
REACCIONES ATPICAS

CromoCen SC
Algunas cepas de Citrobacter sp. pueden dar colonias con coloracin violeta
rosceo, de diferentes intensidades y una persona no entrenada o poco familiarizada
con el desempeo del medio puede confundirlas con Salmonella.

Los coliformes, a excepcin de Klebsiella y Citrobacter, se identifican como colonias
verde azules de diferentes intensidades.

Klebsiella y Citrobacter se observan como colonias de color violeta de diferentes
tonalidades.

Otros microorganismos Gram-negativos crecen como colonias incoloras o con
coloracin propia. Tal es el caso de algunas cepas de Shigella, que aparecen con
coloracin azul con bordes regulares o de color verde azul y bordes irregulares;
algunas cepas de Pseudomonas y de Proteus crecen como colonias de color
naranja, entre otros.

Agar SS

Las bacterias fermentadoras tardas desarrollarn colonias con centro rosa despus
de 48 h.

Cepas de Proteus y Citrobacter muestran tambin colonias transparentes con
centros de color negro grisceo


9. CONFIRMACIN DE IDENTIDAD

Confirme las colonias sospechosas de Salmonella, identificndolas con las pruebas
bioqumicas y serolgicas adecuadas.



3
10. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Ver Anexo B

Base de Caldo Selenito (BCS)
Selenito de sodio
Caldo Rappaport-Vassiliadis con soya (CRVS) (Opcional)
Base de Medio CromoCen SC
Suplemento PLG
Agar S.S.
Caldo triptona soya
Agar nutriente
Agar tres azcares y hierro (TSI)
Agar urea (Christensen)
Medio de descarboxilacin de la L-lisina
Medio SIM
Reactivo para la deteccin de - galactosidasa
Reactivos para la reaccin Voges-Proskauer
Reactivo para la reaccin de indol
Agar nutriente semislido
Solucin salina


11. SUEROS

Realice la identificacin serolgica con los antisueros disponibles a escala comercial.
Estos sueros aglutinantes contienen anticuerpos mono o polivalentes anti-O, anti Vi,
y otros contienen anticuerpos para uno o ms factores H (sueros anti-H mono o
polivalentes).


12. EQUIPAMIENTO, UTENSILIOS Y SUSTANCIAS ADICIONALES

Equipamiento y materiales

Autoclave
Incubadora (capaz de operar a las temperaturas 35 2 C )
Bao termostatado (capaz de operar a la temperatura de 41,5 1 C o
incubadora capaz de operar a la temperatura de 41,5 1 C)
Bao termostatado (capaz de operar a la temperatura de 44 a 47 C )
Agitador magntico
Agitador de tubos
Asa calibrada de 10 L
pHmetro con una exactitud en la calibracin de 0,1 unidades de pH a 20 C
25 C
Pipetas graduadas o automticas, de capacidades de 1 y 10 mL, graduadas
en divisiones de 0,5 y 0,1 mL
Placas Petri (90 x 10 mm
Balanza tcnica con presicin de 0,1 g
Refrigerador capaz de operar a 4 1 C
4
Portaobjetos de cristal estriles
Lmpara para observar las reacciones serolgicas
Mechero de gas.
Papel de pH (rango 6-8 pH) con graduaciones mximas de 0,4 unidades por
cambio de color


13. MUESTRAS
Ver Anexo C.

La toma de muestras es uno de los pasos ms importantes en el Laboratorio de
Microbiologa pues de ello depende el xito de la identificacin. Es responsabilidad
del especialista asegurar la adecuada toma de muestras aunque en general se
delega esta tarea al personal tcnico. Las muestras recogidas incorrectamente
pueden producir resultados dudosos y conllevan al empleo de agentes
antimicrobianos innecesarios o errneos.

El tamao de la muestra debe ser el adecuado para realizar el examen microscpico
y el cultivo. De ser posible, debe tomarse antes de iniciar la terapia antimicrobiana. Si
no va a ser procesada de inmediato debe almacenarse en refrigeracin a 4 C y
trasladarse al laboratorio en un medio de transporte adecuado (Medio Transporte de
Stuart) que proporcione condiciones de pH y humedad.

Es importante que el laboratorio reciba muestras que no hayan sufrido daos o
cambios en su composicin y estado.

Tipos de muestras que se pueden analizar por este mtodo: Coprocultivos,
hemocultivos, o cualquier otro tipo donde se sospeche la presencia de Salmonella..

Recoger heces por defecacin espontnea o isopado rectal.


14. SIEMBRA EN PLACAS E IDENTIFICACIN.
Ver el esquema del mtodo en el Anexo D.

Siembre directamente con un asa la muestra sobre la superficie del medio
CromoCen SC y en el medio Agar S.S. para obtener una respuesta ms rpida.

Utilizando los cultivos procedentes del Caldo Selenito, inocule con la ayuda del asa
la superficie de la placa de medio CromoCen SC y del Agar S.S., sembrando por
estriado (agotamiento del inculo) en las placas.

Realice tantas rplicas como sean necesarias a partir de cada uno de los medios de
enriquecimiento selectivo.

Incube las placas en posicin invertida a 35 2 C (CromoCen SC y Agar S.S.),
agrpelas en no ms de 4 placas por columnas.

5
Con posterioridad a la incubacin, examine las placas para determinar la presencia
de colonias tpicas de Salmonella y las atpicas (sospechosas) que pudieran
considerarse Salmonella. (Ver Anexo E)

Identificacin en el medio CROMOCEN SC

El crecimiento tpico de Salmonella (typhimurium, cholerae-suis, enteritidis, excepto
S. typhi), se expresa en colonias de rosadas con diferentes intensidades a rojas. En
el caso de los coliformes, excepto Klebsiella y Citrobacter, son colonias de
coloracin azul-verdosa. Las colonias de Klebsiella y Citrobacter se observan de
color violeta. Las colonias incoloras o con pigmentacin propia corresponden a otras
bacterias Gram-negativas. Los microorganismos Gram-positivos resultan inhibidos
en el medio.

NOTA: Algunas cepas de Salmonella pueden mostrar una respuesta ms tarda si provienen de la
siembra directa, para lo cual las placas provenientes de la misma, que contengan colonias de color
rosa claro, pueden ser incubadas hasta la confirmacin de la aparicin de la coloracin caracterstica
de Salmonella que puede ser un perodo de hasta 48 horas.

Identificacin en el medio Agar S.S.

El crecimiento tpico de Salmonella en el medio Agar S.S. son colonias transparentes
con centro de color negro.

Cepas de Proteus y Citrobacter muestran tambin colonias transparentes con
centros de color negro grisceo


15 CONFIRMACIN

Para la confirmacin, tome una colonia considerada como tpica o sospechosa de
cada placa de cada medio selectivo. De resultar el aislamiento negativo, seleccione
otras 4 colonias sospechosas.

Si una placa muestra menos de 5 colonias sospechosas, seleccione todas las tpicas
para la confirmacin.

Estre las colonias seleccionadas en la superficie del medio agar nutriente con la
superficie previamente secada, de forma tal que permita el desarrollo de colonias
bien aisladas.

Incube las placas por espacio de 24 3 h a 37 1 C .

Utilice cultivos puros tanto para las pruebas bioqumicas como para la serologa.

15.1 Confirmacin bioqumica
Agar TSI (o agar hierro de Kligler)
Agar urea
Medio para descarboxilacin de la lisina
Voges-Proskauer
Indol
6
15.1.1 Agar TSI

Estre la superficie del agar inclinado y puncione el fondo. Incube durante 24 3 h a
37 1 C.

Interprete los cambios en el medio como sigue:
a) Fondo del tubo.
- amarillo glucosa positiva (utilizacin de glucosa)
- rojo sin cambio glucosa negativa ( no utilizacin de glucosa)
- negro formacin de sulfuro de hidrgeno (H
2
S)
- burbujas o ruptura formacin de gas de glucosa

b) Superficie de la pendiente del tubo.
- amarillo lactosa y/o sacarosa positiva (utilizacin de lactosa y/o
sacarosa)
- rojo sin cambio lactosa y/o sacarosa negativa (no utilizacin de lactosa
ni sacarosa)

Los cultivos puros de Salmonella muestran pendientes alcalinas (rojas) y fondos
cidos (amarillos), con formacin de gas (burbujas) y (en cerca del 90 % de los
casos) formacin de sulfuro de hidrgeno (Ennegrecimiento del agar).

Cuando una Salmonella lactosa positiva es aislada, la pendiente del agar TSI es
amarilla. La confirmacin preliminar de los cultivos de Salmonella no se debe basar
solo en los resultados del ensayo en el agar TSI.

15.1.2 Agar urea

Estre la superficie del agar inclinado. Incube durante 24 3 h a 37 1 C y examine
a intervalos.

Si la reaccin es positiva, la escisin de la urea, libera amonio que provoca un
cambio de color del indicador rojo fenol hacia rosado rosa y despus a cereza. La
reaccin es frecuentemente apreciada despus de 2 a 4 h.

15.1.3 Medio para descarboxilacin de la lisina

Inocule justamente debajo de la superficie del medio lquido. Incube durante 24 3 h
a 37 1 C.

La turbiedad y el color prpura despus de la incubacin indica una reaccin
positiva. El color amarillo indica una reaccin negativa.

15.1.5 Voges-Proskauer

Suspenda una azada de la colonia sospechosa en un tubo estril que contiene 3 mL
del medio VP. Incube durante 24 3 h a 37 1 C.

7
Despus de la incubacin, adicione 2 gotas de solucin de creatina, 3 gotas de
solucin etanlica de 1 naftol y con posterioridad dos gotas de solucin de hidrxido
de potasio, agite despus de adicionar cada reactivo.

La formacin de un color rosa brillante en un intervalo de hasta 15 minutos indica
una reaccin positiva.

15.1.6 Indol

Inocule un tubo que contenga 5 mL de medio con triptona/ triptfano con la colonia
sospechosa. Incube durante 24 3 h a 37 1 C.

Despus de la incubacin adicione 1 mL del reactivo Kovac.

La formacin de un anillo rojo indica una reaccin positiva. Un anillo
amarillo - marrn indica una reaccin negativa.

16.1.7 Interpretacin de los resultados de las pruebas bioqumicas
La interpretacin de los resultados de las pruebas bioqumicas aparece en la tabla 1.
Tabla 1 Interpretacin de las pruebas bioqumicas

Cepas de Salmonella
Ensayo
a
S. Typhi S. Paratyphi A S. Paratyphi B S. Paratyphi C Otras cepas

Reaccin %
b
Reaccin %
b
Reaccin %
c
Reaccin %
c
Reaccin %
b
TSI cido de glucosa
+
100
+
100
+ + +
100
TSI gas de glucosa
d
0
+
100
+ + +
92
TSI cido de lactosa
-
2
-
100
- - -
1
TSI cido de sacarosa
-
0
-
0
- - -
1
TSI produccin de H
2
S
+
97
-
10
+ + +
92
Hidrlisis de urea
-
0
-
0
- - -
1
Descarboxilacin de lisina
+
98
-
0
+ + +
95
Reaccin de -Galactosidasa
-
0
-
0
- - -
2
e
Reaccin de Voges-Proskauer
-
0
-
0
- - -
0
Producin de indol
-
0
-
0
- - -
1
3
From reference [4].

b
Estos porcentajes indican que no todos los aislamientos de los serotipos de Salmonella muestran reacciones marcadamente
+ o -. Estos porcentajes pueden variar dentro de los serotipos de los serotipos que contaminan los alimentos de diferentes
orgenes.
c
Estos porcentajes se desconocen en la bibliografa disponible.
d
Salmonella Typhi es anaerognica.
e
La subespecie arizon de Salmonella enterica muestra reacciones positiva o negativa a la lactosa pero es siempre
galactosidasa positiva. Para el estudio de estas cepas puede ser de utilidad ejecutar pruebas complementarias.



8

15.2 Confirmacin serolgica y serotipaje

Realice la deteccin de la presencia de antgenos O, Vi y H en Salmonella con los
sueros apropiados, a partir de cultivos puros y despus de haber eliminado las cepas
autoaglutinantes. Utilice el antisuero de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

15.2.1 Eliminacin de las cepas autoaglutinantes

Coloque una gota de solucin salina en un portaobjetos limpio. Disperse en la gota,
con la ayuda del asa, parte de la colonia a analizar, hasta que obtenga una
suspensin homognea y turbia. Balancee el portaobjetos suavemente por un
perodo de 30 a 60 segundos. Observe el resultado tomando un fondo oscuro y
preferiblemente con la ayuda de una lupa. Si las bacterias se han agrupado en una o
ms unidades, entonces considere la cepa autoaglutinante, y no la someta a las
pruebas de deteccin de antgenos.

15.2.2 Prueba para antgenos O

Utilice una colonia pura, no aglutinante, y proceda de igual manera que en el acpite
anterior, utilizando una gota del antisuero O en lugar de solucin salina.
Si ocurre aglutinacin, considere la reaccin como positiva.

15.2.3 Prueba para antgenos Vi

Utilice una colonia pura, no aglutinante, y proceda de igual manera que en el acpite
15.2.1, utilizando una gota del antisuero Vi en lugar de solucin salina.
Si ocurre aglutinacin, considere la reaccin como positiva.

15.2.4 Prueba para antgenos H

Inocule el agar nutriente semislido con una colonia pura no autoaglutinante. Incube
el medio a 351 C durante 18-24 horas. Utilice este cultivo para realizar la prueba
para antgenos H. Proceda de igual manera que en el acpite 16.2.1, utilizando una
gota del antisuero H en lugar de solucin salina.
Si ocurre aglutinacin, considere la reaccin como positiva.


16. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS

De acuerdo con la interpretacin de los resultados, indique la presencia o ausencia
de Salmonella en la muestra.
9
18. BIBLIOGRAFA

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agente causal de sndrome diarrico agudo en nios menores de 6 aos de
edad. 2005. ISSN 0075-5222 versin impresa.
2. Anuario estadstico de Salud, 2007. MINISTERIO DE SALUD PBLICA
DIRECCIN NACIONAL DE REGISTROS MDICOS Y ESTADSTICAS DE
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the Republic of Cuba, 1991. Rev Cub Med Trop 45: 139145.
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D.R., Rodrguez Martnez, C. (2002). Utilidad de los medios cromognicos y/o
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7. Dr. Jorge Lpez Hernndez, Dr. Juan Manuel Snchez Daz, Dra. Marcia
Lpez Prez, Dra. Magaly Marrero Garca, Dra. Clara Santamara Trujillo, Dra.
Tania Rosa Gonzlez Rodrguez y Dra. Ana Tamara Blanco Daz, 2005.
Caractersticas clnicas de pacientes ingresados en UCIP con Enfermedad
diarreica aguda por Salmonella "no tifodica" (1990-1999). Instituto Superior de
Medicina Militar: Dr. Luis Daz Soto. Unidad de Cuidados Intensivos
Peditricos. Ciudad de La Habana. Revista Cubana de Medicina Intensiva y
Emergencias 2005;4(4)
8. Dr. Pablo Aguiar Prieto, Dr. Arnaldo Castro Domnguez, Dr. Enrique Prez,
Dra. Gisele Coutin Marie, Dra. Telma Triana rodrguez, Dr. Rubn Hernndez
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de la shigellosis en tres sitios centinelas de Cuba. Reporte Tcnico de
Vigilancia. Vol. 10, No 4 Julio-Agosto, 2005 ISSN 1028-4338.
9. Dra. Erenia Gmez Frmeta, Dra Alexis Sanchn Casas, Dr. Ubaldo del Risco
Barrios, Lic. Raquel Idania Hernndez Cisneros. Aislamiento de Plesiomonas
shigelloide en pacientes con enfermedad diarrica aguda. Centro provincial de
Higiene y Epidemiologa Camagey. Archivo Mdico de Camagey 2005; 9 (3)
ISSN 1025-0255.
10. Dra. Margarita Ramrez, Dra. Neysi Vaalds, Lic. Laura Bravo, Tc. Anabel
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antimicrobiana en cepas de Shigella aisladas en Cuba. Rev. Cubana de
Medicina Tropical v.56 n.3 Ciudad de La Habana sep.-dic. 2004.
11. Dra. Nilda E. Herrera Valds, Tc. Mara Elena Fuerte Calvo, My. Mara Elena
Daz Garca, Tc. Day Larrinaga, Tc Martha Sandoval Acosta y Dr. Mario
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12. G. Prats Pastor, B. Mirelis Otero, C. Muoz Batet y N. Rabella Garca. 1998.
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15. Informe anual. Unidad Nacional de Salud ambiental. Ministerio de Salud
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16. Kosek M, Bern C, Guerrant RL. The magnitude of the global problem of
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17. My. Rigoberto Bravo Prez, Dr. Mario Santiago Puga Torres, Cap. Dionys
Barreiro Viera y Dr. Rafael Nodarse Hernndez. Presentacin de un caso
atpico de fiebre tifoidea. 2002. Revista Cubana de Medicina Militar ISSN
0138-6557 v.7 n.1 Ciudad de La Habana ene.-mar. 2002.
18. Quesada Muiz, V. de J., Rodrguez Martnez, C. (2001). Composition and
method for detecting and early and differentiated counting of Gram-negative
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19. Quesada Muiz, V. de J., Rodrguez Martnez, C. (2002). Composicin y
mtodo para la deteccin y recuento diferenciado y temprano de organismos
microscpicos Gram-negativos. Certificado de Autor No. 22808. Cuba.
20. Quesada Muiz, V. de J., Rodrguez Martnez, C. (2002). Composicin y
mtodo para la deteccin y el recuento temprano y diferenciado de
organismos microscpicos Gram-negativos. Patente. No. Expediente PI-
20010060, No. Registro 4816, Guatemala.
21. Quesada Muiz, V., Rodrguez Martnez, C., Tsoraeva, A. (2000). Medios de
cultivo cromognicos y fluorognicos para el anlisis de muestras de agua y
alimentos. Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol. 31, No. 1:25-28.
22. Roberto Cabrera, Joaquim Ruiz, Margarita Ramrez, Laura Bravo, Anabel
Fernndez, Ana Aladuea, Aurora Echeta, Joaquim Gascn, Pedro L. Alonso,
And Jordi Vila. Dissemination Of Salmonella Enterica Serotype Agona And
Multidrug-Resistant Salmonella Enterica Serotype Typhimurium In Cuba. Am.
J. Trop. Med. Hyg., 74(6), 2006, Pp. 1049-1053
23. Rodrguez Martnez, C., Quesada Muiz, V. de J., Tsoraeva, A., Zhurbenko,
R., Rodrguez Iglesias, I. (2002). Empleo de nuevos medios cromognicos y
fluorognicos para el recuento y la identificacin de microorganismos
indicadores y deteccin de patgenos en alimentos. Revista Latinoamericana
de microbiologa, Vol. 44, No. 4, Oct-Dic, p. 471. Suplemento.
24. Rodrguez Martnez, C., Zhurbenko, R., Quesada Muiz, V. de J. (2002).
Resultados y perspectivas del desarrollo de medios de cultivo para el
diagnstico microbiolgico. Revista Latinoamericana de microbiologa, Vol. 44,
No. 4, Oct-Dic, p. 470. Suplemento.
11
ANEXO A: Control de la calidad. Medio CromoCen SC.

Determinacin del pH
Condiciones de Seguridad:
Use la bata de laboratorio.

Equipos, Materiales y Materias Primas:
Equipos:
Balanza de precisin de 0,01 g
pH-metro
Licuadora elctrica

Materiales:
Frasco cnico de 250 mL
Embudo de cristal de 120 mm de dimetro
Esptula de acero inoxidable
Papel de filtro neutro
Cilindro graduado de 100 mL
Pinzas con punta amiantada para vasos
Termmetro de 0-100C (valor de divisin 1)

Materias Primas:
Agua destilada o desionizada

Procedimiento:
a) Corte con una esptula el medio contenido de una o ms placas y adicinelo en el
vaso de la licuadora elctrica.
b) Aada un volumen de agua destilada o desionizada, medidos con el cilindro
graduado, igual al volumen de medio contenido en la placa o en las placas tomadas
para el ensayo, en varias porciones para arrastrar en cada una de ellas los restos de
medio que queden adheridos a las paredes de la placa.
c) Adicione todas estas porciones en la licuadora.
d) Homogeneice totalmente la mezcla en la licuadora durante 1 minuto, operando el
equipo segn la instructiva del mismo, y filtre todo el contenido a travs de un papel
de filtro neutro para filtracin rpida colocado en un embudo.
e) Recoja el filtrado en un frasco cnico.
f) Enfre el filtrado a una temperatura de 25 2 C y proceda a medir el pH en el
pHmetro. Opere el pHmetro segn la instructiva del mismo.
g) Realice el procedimiento por triplicado para cada muestra.
h) Anote los resultados.

Clculo e Interpretacin de los Resultados:
Calcule la media entre los tres valores obtenidos.
Aproxime los resultados hasta la dcima.

Criterios de aceptacin
El valor del pH debe ser 7,0 0,2.


12

Anexo A (cont.). Control de la calidad del Medio CromoCen SC
Evaluacin microbiolgica del Medio CromoCen SC

Condiciones de Seguridad:
Manipule los microorganismos con extremo cuidado segn los requisitos de Seguridad
Biolgica.
En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados, bloquee
la zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente aada solucin desinfectante
(alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y mantngala sobre la superficie aproximadamente 15
min. Recoja el material derramado, limpie la zona.
En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes, lave
rpidamente la zona con agua fresca y acuda al mdico si es necesario.

Equipos, Materiales y Materias Primas:
Equipos:
Balanza tcnica (precisin 0,01 g)
Incubadora de laboratorio
Microscopio ptico
Bao termostatado de laboratorio
Espectrofotmetro (opcional)

Materiales:
Tubos de cultivo (125 x 15) mm o tubo con tapa de rosca (150 x 20) mm
Asa y aguja de nicrom
Gradillas para tubos
Frascos cnicos de vidrio sin tapa de 250, 500 y 1 000 mL
Quemador de gas
Pipetas de 1 y 2 mL estriles
Portapipetas
Placas de Petri de (100 x 13) mm
Cilindros graduados de cristal de 100 mL
Lmina portaobjetos
Lmina cubreobjetos
Lpiz cristalogrfico
Tubo 0,5 de la escala MacFarland (opcional)
Pinza de acero inoxidable

Materias Primas:
Alcohol al 70 % o fenol al 3 %
Medio de cultivo agar triptona soya en tubos, con agar en plano inclinado
Medio de cultivo, de referencia o control, semejante al que se evaluar
Cepas ATCC de referencia o control Salmonella Typhimurium ATCC 14028,
Escherichia coli ATCC 25922, Citrobacter freundii ATCC 8090 y Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Algodn
Tubos con medio agarizado de uso general en plano inclinado, preparado
Tubo con caldo triptona soya
13
Bata sanitaria
Botas cubrecalzado
Gorro
Agua destilada o desionizada
Reactivos para la tincin de Gram

Operaciones Preliminares:
a) Compruebe que se ha realizado la limpieza de la meseta y el cuarto segn lo
establecido, observando el registro correspondiente.
b) Prepare el inculo segn los siguientes pasos.
c) Partiendo de cuas de los cultivos microbianos en conservacin (refrigeracin de 4 8
C), siembre por estras cada uno de los microorganismos de referencia en dos tubos de
agar triptona soya con agar inclinado o en caldo triptona soya, de las bacterias a
ensayar.
d) Incube a 35 2C de 18 a 24 h para las bacterias.
e) Realice la Tincin de Gram, para comprobar la pureza del cultivo a sembrar.
f) La evaluacin del medio se realizar a partir de inculos estandarizados, ya sea a
partir del cultivo con 50 % de transmitancia en el espectrofotmetro, o del tubo
correspondiente a la escala 0,5 de MacFarland, para lo cual, estandarice el inculo y
prepare diluciones seriadas del mismo.
g) Rotule las placas que contienen el medio a evaluar.

Procedimiento:
Agrupe las placas rotuladas por microorganismo dentro del cuarto de siembra.

Inoculacin del medio de cultivo
Mtodo de siembra por estriado en la superficie hasta obtener colonias aisladas.

Inoculacin del medio de cultivo.
a) Utilice un asa de nicrom previamente esterilizada a la llama. Con el dedo meique y la
palma de la mano, quite el tapn o desenrosque la tapa del tubo que contiene el
microorganismo a sembrar y mantngala sujeta con el dedo meique, enfre en las
paredes del tubo el asa que tiene en esa misma mano y que contiene un cultivo puro o
una suspensin madre del microorganismo de prueba. Arrastre con el asa parte de la
biomasa o una gota de la suspensin prueba, flamee la boca del tubo y enrosque la tapa
que mantuvo sujeta con el dedo meique. Deposite el tubo en una gradilla, manteniendo
el asa cargada en la mano y en la zona cercana al mechero. Este procedimiento puede
hacerse partiendo de una placa con un cultivo del microorganismo de prueba y tocando el
centro de una colonia aislada.
b) Tome la placa a ser inoculada al lado del mechero y comience a trazar lneas rectas en
zig-zag bien apretado a partir de un borde a otro de la placa, avanzando hacia el centro.
Gire la placa en un ngulo de aproximadamente 70 a 90 grados y realice estriado
entrecruzando los cuadrantes. En el ltimo cuadrante realice un zig-zag menos frecuente,
o sea, con lneas ms separadas para garantizar el aislamiento de las colonias. Este
mtodo puede hacerse flameando el asa al pasar de un cuadrante a otro, sobre todo si el
inculo de partida est muy concentrado (colonia aislada o suspensin madre del
microorganismo de prueba).
c) Realice la misma operacin con el medio control utilizado.


14
Criterios de aceptacin (tabla 1)

Tabla 1. Criterios de aceptacin para el mtodo de siembra por estriado en la
superficie hasta obtener colonias aisladas

Microorganismo Color y morfologa de las
colonias aisladas
Crecimiento a partir
de la suspensin al
50 % de
transmitancia
Salmonella Typhimurium ATCC
14028
De rosada a roja, centro ms
oscuro y bordes ms claros

Bueno


Preparacin de patrones de la escala MacFarland
Condiciones de Seguridad:
Use bata de laboratorio.
Manipule con cuidado el cido sulfrico concentrado ya que puede causar
quemaduras severas en los ojos y la piel.

Equipos, Materiales y Materias primas:
Equipos:
Estufa con circulacin forzada de aire de 50 a 200 C
Agitador magntico
Balanza de 0,01 g de precisin

Materiales:
Bulbos de vidrio 2R
Tapones de clorobutilo 13 mm
Sellos de aluminio de 13 mm
Matraz de un solo trazo de 100 mL
Frasco cnico de 250 mL
Esptula
Vaso para precipitado de 25 mL
Pipeta automtica de 1 a 5 mL
Puntas para pipeta automtica de 1 a 5 mL
Bandeja de acero inoxidable (160 x 270) mm
Barra magntica (40 x 8) mm
Selladora manual para bulbos 2R
Pipetas de vidrio graduadas de 1 mL y 10 mL

Materias primas:
Agua potable
Detergente industrial
Agua desionizada
Acido sulfrico 98 % (p.a) (=1,84 g/cm
3
)
Cloruro de bario dihidratado (p.a.)

Operaciones Preliminares:
Fregado de los bulbos y tapones.
15
a) Sumerja los bulbos y tapones en una solucin de detergente.
b) Mantngalos en esta solucin durante 15 min.
c) Saque los bulbos y tapones del detergente y enjuguelos con suficiente agua
potable, hasta eliminar todo el detergente.
d) Enjuague los bulbos y tapones dos veces con agua desionizada.
e) Escrralos y colquelos en una bandeja de acero inoxidable.
f) Coloque la bandeja en una estufa con circulacin forzada de aire y seque los
bulbos y tapones a 70 C durante 2 h.
g) Una vez transcurrido el tiempo de secado, saque la bandeja de la estufa y deje
enfriar los bulbos y tapones hasta temperatura ambiente.

Preparacin de la solucin de cido sulfrico al 1 %.
a) Tome con una pipeta graduada 0,55 mL de cido sulfrico (p.a.) al 98 %, (=1,84
g/cm
3
) y depostelo en un matraz de un solo trazo de 100 mL.
b) Complete el volumen con agua desionizada.
c) Homogeneice bien la solucin, agitndola manualmente.

Preparacin de la solucin de cloruro de bario al 1 %.
a) Pese en una balanza de 0,01 g de precisin, con una esptula en un frasco cnico
de 250 mL, 1,17 g de cloruro de bario dihidratado. Opere el equipo segn instructiva
del mismo.
b) Aada agua desionizada hasta completar 100 g.
c) Homogeneice bien la solucin, agitndola manualmente.

Procedimiento:
Preparacin de la suspensin.
a) Endulce una pipeta graduada de 10 mL con la solucin preparada en el apartado
3.2.
b) Endulce una pipeta graduada de 1 mL con la solucin preparada en el apartado
3.3.
c) Mezcle en un frasco cnico de 250 mL los volmenes deseados de soluciones
segn las proporciones indicadas en la tabla 5. Segn el patrn que se desea
preparar.
d) Agite durante 5 min.
Tabla 2. Proporciones de los reactivos para la preparacin de la escala MacFarland

Escala de MacFarland
Tubo H
2
SO
4
1 % (mL) BaCl
2
1 % (mL)
0,5 9,95 0,05
1 9,9 0,1
2 9,8 0,2
3 9,7 0,3
4 9,6 0,4
5 9,5 0,5
6 9,4 0,6
7 9,3 0,7
8 9,2 0,8
9 9,1 0,9
10 9,0 1,0
16
Llenado de los bulbos.
a) Coloque el frasco cnico con la suspensin en el agitador magntico e introduzca
una barra magntica.
b) Comience a agitar a 500 r/min.
c) Grade la pipeta automtica para 3 mL.
d) Coloque la punta en la pipeta automtica.
e) Manteniendo en agitacin la suspensin dispense en cada bulbo 3 mL de la
misma con ayuda de la pipeta automtica.

Tapado y sellado de los bulbos.
a) Coloque los tapones y los sellos de aluminio sobre los bulbos.
b) Tome los bulbos uno a uno, colquelos fuera de la bandeja y vaya sellndolos con
la selladora manual para bulbos 2R.

Revisin.
a) Observe los bulbos individualmente a travs de la luz y elimine los que tengan
partculas extraas.

Rotulado.
a) Rotule los frascos con la etiqueta correspondiente.

Almacenamiento.
a) Almacnese en la oscuridad.

Preparacin de las cepas de trabajo
Condiciones de Seguridad:
Manipule los microorganismos con extremo cuidado segn los requisitos de Seguridad
Biolgica.
En caso de derrame de diluciones de microorganismos o medios inoculados, bloquee
la zona al acceso de cualquier persona. Inmediatamente aada solucin desinfectante
(alcohol al 70 % o fenol al 3 %) y mantngala sobre la superficie aproximadamente 15
min. Recoja el material derramado, limpie la zona.
En caso de quemadura en la piel por derrame de medios de cultivo calientes, lave
rpidamente la zona con agua fresca y acuda al mdico si es necesario.

Equipos, Materiales y Materias Primas:
Equipos:
Incubadora de laboratorio
Microscopio ptico
Espectrofotmetro
Agitador de tubos

Materiales:
Tubos de cultivo (125 x 15) mm o tubo con tapa de rosca (150 x 20) mm
Asa y aguja de nicrom
Gradillas para tubos
Quemador de gas
Pipetas de 1 y 2 mL estriles
Portapipetas
17
Lmina portaobjetos
Lpiz cristalogrfico
Pinza de acero inoxidable

Materias Primas:
Alcohol al 70 % o fenol al 3 %
Algodn
Tubos con medio agarizado de uso general en plano inclinado, preparado
Tubo con caldo triptona soya
Bata sanitaria
Botas cubrecalzado
Gorro
Agua destilada o desionizada
Reactivos para la tincin de Gram
Formaldehdo al 37 %
Solucin salina estril
Agar para conteo en placas

Operaciones preliminares.
Preparacin de la solucin de formaldehdo al 12 %
a) Vierta en un matraz de un solo trazo de 100 mL, 32,4 mL de formol al 37 %.
b) Complete el volumen con agua destilada o desionizada.
c) Homogeneice la preparacin invirtiendo el frasco de 4 a 5 veces el matraz.
d) Trasvase el contenido a un frasco mbar.
e) Rotule el frasco para identificar la solucin.

Preparacin del cultivo para su posterior estandarizacin
Preparacin del cultivo puro (18-24 horas)
a) Tome con un asa de nicrom previamente esterilizada a la llama del quemador
parte de la biomasa del microorganismo procedente de una cua de conservacin
(Cepa certificada) e inocule en un tubo de vidrio que contenga un medio slido de
uso general en plano inclinado (Ej: agar triptona soya). Rotule el tubo con el nombre
del microorganismo en cuestin. En caso de contar con una cepa salvaje proveniente
de una muestra, tomar una colonia aislada y proceder de igual forma.
b) Incube el tubo inoculado en condiciones de tiempo y temperatura segn los
requisitos del microorganismo. (Bacterias generalmente a 35 2 C).
c) Si desea comprobar la pureza del cultivo despus de pasado el tiempo de
incubacin realice una tincin de Gram.

Preparacin de la suspensin
a) Tome el tubo de cultivo fresco y aada 5 mL de solucin salina estril.
b) Arrastre el cultivo del agar rotando el tubo con movimientos manuales,
manteniendo el tubo en posicin horizontal.
c) Vierta la suspensin final a un tubo de (150 x 20) mm con tapa de rosca, estril.
Rotule el nombre de la cepa y la fecha. (Tubo A).
d) Si desea compruebe la pureza del cultivo del tubo A realizando una Tincin de
Gram.


18
Preparacin de la solucin salina
Pese 8,5 g de NaCl y adicione a 1 litro de agua destilada o desionizada.

Estandarizacin de la cepa al 50 2 % de transmitancia utilizando un
espectrofotmetro a una longitud de onda de 580 nm
a) Encienda el espectrofotmetro 30 min. antes de ser utilizado.
b) Ajuste el equipo a 0 y 100 de transmitancia.

c) Extraiga con una pipeta estril de 1mL en condiciones aspticas 1mL del
contenido del tubo A y transfiralo a un tubo de (150x20) mL con tapa de rosca, no
necesariamente estril en este caso, indicando el nombre de la cepa y rotulndolo
como tubo B.
d) Aada 1 mL de formaldehdo al 12 % al tubo B.
e) Mantenga en contacto la suspensin de la cepa y el formaldehdo de 15-30 min.
f) Agite el tubo B, aada de su contenido aproximadamente 8 mL al tubo de lectura
del equipo, colquelo en el espectrofotmetro y observe el porcentaje de
transmitancia que mide el equipo.
g) Si el porcentaje de transmitancia est por debajo del 50 %, adale con cuidado
aproximadamente 1 mL menos de solucin salina al 0,85 %. Anote en su libreta de
trabajo los volmenes de solucin salina que va aadiendo.
h) Repita la operacin descrita en el apartado f.
i) Repita las operaciones descritas en los apartados g y h hasta alcanzar el 50 2 %
de transmitancia.
j) En caso de que el valor de la transmitancia exceda el 50 %, extraiga con una
pipeta estril de 1 mL en condiciones aspticas 1 mL del contenido del tubo A y
transfiralo al tubo B, aada 1 mL de formaldehdo al 12 % y contine la lectura
despus de haber transcurrido los 15 minutos.
k) Sume los volmenes de solucin salina al 0,85 % y de formaldehdo incorporados
al mL de suspensin microbiana.
Ejemplo:
1 mL de formaldehdo + mL de solucin salina = X mL de solvente
Entonces:
1 mL de suspensin microbiana + X mL de solvente (Formaldehdo y solucin
salina) ~ 50%

Estandarizacin por turbiedad similar al tubo # 5 de MacFarland
a) Tome un tubo de cultivo de vidrio (150 x 20) mm con tapa de rosca que contenga
en su interior 9 mL solucin salina, colquelo en una gradilla para tubos y rotlelo
con el nombre del microorganismo, la fecha y las iniciales M.F# 5 que significa
MacFarland # 5 lo que corresponde aproximadamente a 3,0 10
8
clulas/mL.
b) Coloque el tubo A en la gradilla referida en el apartado anterior.
c) Tome el tubo # 5 de la escala de MacFarland y colquelo en la gradilla.
d) Extraiga con una pipeta de 1 mL estril en condiciones aspticas 0,5 mL del
contenido del tubo A y transfiralo al tubo de (150x20) mm con tapa de rosca
rotulado con M.F. # 5 hasta alcanzar una turbiedad al tubo # 5 de la escala de
MacFarland.

Cuenta de viables de la suspensin estandarizada (Para determinar las Unidades
Formadoras de Colonias (UFC)).
a) Prepare la suspensin microbiana estandarizada (Tubo A).
19
b) Coloque en una gradilla 10 tubos de cultivo de vidrio (150 x 20) mm con tapa de
rosca, estril. Rotule los tubos indicando el nombre del microorganismo y diluciones
desde 10
-1
hasta 10
10
.
c) Adicione aspticamente 9 mL de solucin salina estril a cada tubo con una pipeta
de 10 mL estril y portapipetas automticos si posee.
d) Agite el tubo A con un agitador vortex de tubos, si lo posee, o con la mano durante
5 segundos.
e) Tome 1 mL aspticamente con una pipeta de 1 mL estril y portapipetas
automtico, del tubo A y adalo al tubo 10
-1
. Agite durante 2 3 segundos.
f) Transfiera de igual forma, 1 mL del tubo 10
-1
al tubo 10
-2
. Agite. Repita esta
operacin hasta el tubo marcado con 10
-10
.
g) Rotule 2 placas de Petri con el medio agar para conteo en placas segn
corresponda por microorganismo y por dilucin e identifquelas con el nombre de la
cepa, dilucin y fecha de inoculacin.

Inoculacin
a) Agite la dilucin 10
-5
durante 2 3 segundos y tome 0,2 mL de la misma con una
pipeta de 1 mL estril e inocule esta cantidad en cada una de las 2 placas que
contienen el medio de cultivo.
b) Aplique rotacin manual en forma de 8 a las placas.
c) Repita las operaciones a y b para todas las diluciones restantes hasta 10
-10
.
d) Deje reposar las placas con las tapas hacia arriba durante 15 minutos.
e) Incube las placas a la temperatura y el tiempo que se describe para el
microorganismo del ensayo.
f) Si desea comprobar la pureza del inculo a las placas incubadas realice Tincin de
Gram despus del tiempo de incubacin.

Lectura de las placas
Cuente las Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en cada una de las 2
placas sembradas. Haga un promedio y tome el valor promedio (de no
obtenerse crecimiento en una de ellas, desechar el resultado de esa placa y
solo tomar en cuenta el de la placa restante) y antelo en el registro de
cuentas de viables. Nota: Si en lugar de partir de la cepa estandarizada con el
espectrofotmetro parte de la cepa estandarizada por MacFarland, realice los
mismos pasos para hacer las diluciones pero partiendo del tubo que contiene
la suspensin estandarizada al 0,5 de MacFarland. El resto de los pasos se
realiza de la misma forma.

Se considerar vlido el ensayo si:
a- En las diluciones de trabajo se encuentran las Unidades Formadoras de Colonias
necesarias para realizar nuestro ensayo en al menos 1 placa (de 10 a 100 UFC).
b- No existe contaminacin en las inoculaciones realizadas.
20
ANEXO B. Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos.

1. Caldo Selenito
Medio de enriquecimiento para el aislamiento de Salmonella spp. a partir de
materiales clnicos, especialmente heces.

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el selenito de
sodio inhibe la flora Gram positiva y la mayora de la flora entrica excepto
Salmonella spp. durante las primeras 8-12 horas de incubacin.

Composicin.

Peptona de carne 5,0 g
Lactosa 4,0 g
Selenito de sodio 4,0 g
Fosfato hirgeno dipotsico 3,5 g
Fosfato dihidrgeno potsico 6,5 g
Agua 1000 mL


pH : 7.0 0.2

Suspender 23 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar
ligeramente hasta su disolucin completa. Evite el calentamiento excesivo.
No esterilizar en autoclave.
Distribuir en tubos estriles un volumen no menor a 5 mL. Se recomienda guardar en
refrigeracin si no se usa de inmediato.
Siembra
-Materia fecal: a un tubo con 10-15 mL de caldo selenito, agregar 1-2 mL de una
suspensin de materia fecal.
-Tejido infectado: macerar 1-2 g de tejido en 10-15 mL de caldo selenito, usando una
varilla estril.
-Orina: a un tubo con unos 5 mL de caldo selenito doble concentracin, agregar igual
volumen de orina.

Incubacin
A 35-37 C, durante 16-24 horas, en aerobiosis.
Resultados
Microorganismos Crecimiento
Salmonella Enteritidis ATCC 13076 Bueno
Salmonella Typhimurium ATCC 14028 Bueno

Otras recomendaciones:
-Se aconseja usar el medio el mismo da de la preparacin.
-No incubar el medio de cultivo sembrado por ms de 24 horas, debido a que el
efecto inhibitorio del selenito disminuye luego de las primeras 6-12 horas de
incubacin, y adems porque no es favorable para la mayora de las cepas de
Salmonella, que pueden no recuperarse.
21

-La nica ventaja de incubar durante 48 horas es el incremento de la recuperacin
de Salmonella Pullorum.


2. Medio Caldo Rappaport-Vassiliadis con soya (CRVS) (Opcional)

Solucin A
Composicin.

Digerido enzimtico de soya 5,0 g
Cloruro de sodio (NaCl) 8,0 g
Dihidrgenofosfato de potasio (KH
2
PO
4
) 1,4 g
Dipotasiohidrgenofosfato (K
2
HPO
4
) 0,2 g
Agua 1000 mL

Preparacin.
Disuelva los componentes calentando cerca de los 70 C de ser necesario. Prepare
esta solucin el da de la elaboracin del medio CRVS completo.

Solucin B
Composicin

Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl
2
. 6H
2
O) 400 g
Agua 1000 mL

Preparacin.

Disuelva el cloruro de magnesio en agua.

Al ser esta sal muy higroscpica, es recomendable que disuelva el contenido
completo de un frasco de MgCl
2
. 6H
2
O de un frasco nuevo, de acuerdo con la
frmula. Por ejemplo, 250 g de MgCl
2
. 6H
2
O, adalos a 625 mL de agua, dando una
solucin de volumen total de 788 mL con concentracin de 31,7 g por 100 mL de
MgCl
2
. 6H
2
O.

Conserve la solucin en frasco mbar bien cerrado a temperatura ambiente y con
tiempo lmite de vencimiento de 2 aos.

Solucin C
Composicin

Oxalato de verde malaquita 0,4 g
Agua 100 mL


Preparacin.

Disuelva el oxalato de verde malaquita en el agua.
Conserve la solucin en frasco mbar a temperatura ambiente hasta 8 meses.
22

Medio completo.

Composicin.

Solucin A 1000 mL
Solucin B 100 mL
Solucin C 10 mL

Preparacin.

Aada a los 1000 mL de solucin A, 100 mL de solucin B y 10 mL de solucin C.

Ajuste pH de ser necesario, el cual debe encontrarse despus de la esterilizacin en
5,2 0,2.
Antes de su uso, dispense en los tubos un volumen de 10 mL.
Esterilice durante 15 min a una temperatura de 115 C.
Almacene el medio preparado a 3 2 C. Use el medio el da de su preparacin.

La composicin final del medio es:

Digerido enzimtico de soya 4,5 g/L
Cloruro de sodio 7,2 g/L
Mezcla de fosfatos (KH
2
PO
4
+ K
2
HPO
4
) 1,44 g/L
Cloruro de magnesio anhidro (MgCl
2
) Cloruro de
magnesio hexahidratado (MgCl
2
. 6 H
2
O)
13,4 g/L
28,6 g/L
Oxalato de verde malaquita 0,036 g/L

3. Medio CromoCen SC

Medio base.

Composicin.

Mezcla cromognica 5,4 g
Bases nutritivas 11, 0 g
Agar 15, 0 g


pH 7,0 0,2


Preparacin.

Adicione el suplemento lquido PLG (cd. 4261) a 1 L de agua destilada o
desionizada. Mezcle bien. Suspenda 31,4 g del medio base y agite suavemente.
Caliente hasta ebullicin repetidas veces, si fuera necesario, hasta la total fusin del
agar. No caliente a temperaturas mayores de 100 C. Enfre hasta 45 C. Dispense
en placas Petri estriles, agite suavemente para homogeneizar.
23
Ajuste pH de ser necesario, para que despus de la esterilizacin este se encuentre
alrededor de 7,0 0,2 a 25 C.
Caliente con agitacin frecuente hasta que el medio hierva y el agar se disuelva. No
sobrecaliente.

4. Suplemento PLG

Reactivo: propilenglicol

Determinacin de las caractersticas organolpticas
Se ejecuta por simple evaluacin visual.

Criterios de aceptacin
El reactivo debe ser incoloro, transparente, sin presencia de partculas.

5. Agar S.S. Modificado

Medio diferencial y selectivo idneo para el aislamiento de Shigella y Salmonella.

El Agar S.S. Modificado. como lo indica su nombre, responde a una variante del
medio original, en el cual se disminuye el contenido de las sales biliares, se vara la
composicin de las bases nutritivas y se aumenta el pH del medio, todo esto para
lograra un crecimiento ms abundante de Shigella.

Composicin.

Proteosa Peptona 5,0 g
Extracto nutritivo 2,0 g
Extracto de levadura 3,5 g
Lactosa 10,0 g
Sales biliares 5,5 g
Citrato de sodio 2,5 g
Tiosulfato de sodio 10,0 g
Citrato frrico amnico 1,5 g
Verde brillante 0,00033 g
Rojo neutro 0,025 g
Agar 12,0 g


pH l: 7,3 0,2

Suspender 52 g en 1 L de agua destilada o desionizada, hervir hasta disolucin
completa, mezclar bien y distribuir. Evitar cualquier sobrecalentamiento. No
esterilizar en autoclave.
Preparacin de las placas de agar S.S. modificado

Transfiera alrededor de 8 mL del medio fundido a placas Petri estriles pequeas.
Inmediatamente antes de su uso, proceda a secar las placas en el horno con
temperatura entre 37-55 C, por aproximadamente 30 minutos, hasta que la
superficie del medio est seca.

24
Almacene las placas por un perodo de 5 das a 3 2 C protegidas de la luz.


Incubacin
A 35-37 C, durante 18-24 horas, en aerobiosis.
Resultados
Microorganismos Crecimiento Produccin de H
2
S
Salmonella Typhimurium ATCC 14028 bueno +
Shigella flexneri ATCC 12022 bueno -
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Inhibidoa escaso -


6. Agar nutriente.

Composicin.

Peptona bacteriolgica 5,0 g
Extracto nutritivo 1,0 g
Extracto de levadura 2.0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Agar 15,0 g

Preparacin.

Suspenda 28 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada o desionizada,
hervir hasta disolucin completa, esterilice a 121 C por 15 min y distribuya. Ajuste
pH para que despus de la esterilizacin este se encuentre entre 7,4 0,2 a 25 C.

Preparacin de las placas de agar nutriente.

Transfiera alrededor de 8 mL del medio fundido a placas Petri estriles pequeas.
Inmediatamente antes de su uso, proceda a secar las placas en el horno con
temperatura entre 37-55 C, por aproximadamente 30 minutos, hasta que la
superficie del medio est seca.

Almacene las placas por un perodo de 5 das a 3 2 C protegidas de la luz.

Prepare el medio en tubos, si lo desea, dispensndolo a una altura de
aproximadamente
4 cm. Inclnelo y deje solidificar.








25
7. Agar tres azcares y hierro (TSI)

Composicin
Extracto de carne 3,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Peptona 20,0 g
Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g
Lactosa 10,0 g
Sucrosa 10,0 g
Glucosa 1,0 g
Citrato de hierro (III) 0,3 g
Tiosulfato de sodio 0,3 g
Rojo fenol 0,024 g
Agar 9 g a 18 g
1
)
Agua 1 000 ml

Preparacin
Disolver los componentes o el medio deshidratado completo en agua, calentando de
ser necesario.
Ajuste pH de ser necesario, de modo que despus de la esterilizacin tenga un valor
de 7,4 0,2 a 25 C.
Dispense el medio en tubos una cantidad de aproximadamente 5 mL.
Esterilice durante 15 min. en autoclave a 121 C.
Deje solidificar inclinados los tubos de manera tal que la base del medio tenga una
profundidad entre 2,5 cm a 5 cm.

8. Base de caldo urea

Composicin.

Peptona bacteriolgica 1,0 g
Dextrosa 1,0 g
Fosfato mopotsico 0,8 g
Fosfato disdico 1,2 g
Cloruro de sodio 15,0 g
Rojo fenol 0,004 g

Preparacin.

Suspender 0,9 g en 95 mL de agua destilada o desionizada, mezclar bien, esterilizar
115 C por 20 min, enfriar a 50 C y adicionar aspticamente 5 mL de una solucin
de urea estril al 40 %. Mezclar bien y distribuir un volumen de 5 mL en tubos
estriles.

26
9. Medi o para descarboxi l aci n de L-l i si na
Composicin
L-Lisina monohidrocloruro 5,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Glucosa 1,0 g
Prpura de bromocresol 0,015 g
Agua 1 000 ml
Preparacin
Disolver los componentes en agua, calentando de ser necesario.
Ajuste pH, de ser necesario, de modo que despus de la esterilizacin se encuentre
en un valor de 6,8 0,2 a 25 C.
Transfiera el medio en cantidades de 2 mL a 5 mL.
Esterilice durante 15 min en autoclave a 121 C.


10. Medio SIM

Composicin.

Hidrolizado enzimtico de casna 20,0 g
Peptona bacteriolgica 6,1 g
Tiosulfato de sodio 0,2 g
Sulfato amnico ferroso 0,2 g
Agar 3,5 g

Preparacin.

Suspender 30 g en 1 L de agua destilada o desionizada, hervir hasta disolucin
completa, distribuir en tubos y esterilizar a 121 C por 15 min.


11. Reactivo de Kovac

Composicin.

Alcohol amlico, isoamlico o butlico 5,0 mL
p - dimetilbenzaldehdo 5 mg
HCL concentrado 25 mL





27
12. Solucin salina fisiolgica

Composicin.

Cloruro de sodio 8,5 g
Agua 1 000 mL

Preparacin.

Disolver el cloruro de sodio en agua. Ajustar pH, de ser necesario, de modo que
despus de la esterilizacin se encuentre en un valor de 7,0 0,2 a 25 C. Dispense
de 90 mL a 100 mL de la solucin en tubos ante de esterilizar. Esterilizar a 121 C
por 15 min.
28
ANEXO C: Procesamiento de muestras clnicas

Los procedimientos que se describen a continuacin son tomados de: Lic. Eric
Caballero J. MANUAL DE CONTROL DE CALIDAD EN MICROBIOLOGIA CLINICA.
Consultado en: www.monografias.com.


1. HEMOCULTIVOS:
Desinfecte el tapn de caucho del frasco de hemocultivos con alcohol
etlico al 70%. No utilice solucin de yodo para limpiar el caucho.
Aspticamente desinfecte el sitio de la venopuncin con alcohol etlico al
70% y luego con una preparacin de yodo en crculos concntricos hacia
fuera del sitio elegido. Espere que el yodo seque y realice la puncin sin
palpar de nuevo.
Coleccione la muestra de sangre a razn de 0.5 2 ml para nios y 5-10
ml para adultos en cada frasco. El volumen de sangre a cultivar es el factor
ms importante en la recuperacin del microorganismo.
Cada frasco debe ser servido con una puncin diferente en diferentes
tiempos, a menos que utilice a la vez frascos para organismos aerbicos y
anaerbicos. Nunca llenar todos los frascos con sangre provenientes de
una sola puncin.
No tomar sangre del catter, a menos que se est realizando un estudio
epidemiolgico.

Siembre la muestra de sangre en caldo triptona soya (u otro medio lquido de
propsito general). En paralelo, inocule una placa de agar chocolate y CromoCen
SC.

Incube el ATS inoculado por 6-18 h a una temperatura de 35 2 C y las placas de
agar chocolate y CromoCen SC a 35 2 C durante 12-24 h y 18-24 h
respectivamente.


2. HECES :
Coloque la muestra dentro de un envase limpio, con cierre hermtico y no
necesariamente estril. No solicite frotis por Gram.
No cultive si la muestra es dura o bien formada.
No se recomienda el uso de Culturette, salvo para infantes y pacientes con
diarrea activa. Si lo utiliza, recolecte ms de 2 g de muestra.




29
ANEXO D. Diagrama del mtodo para la determinacin de Salmonella en
coprocultivos

Muestra de heces fecales

CromoCen SC Agar S.S mod. Caldo Selenito


Kliger, LIA



Incubar (18 - 24 h a 35 2 C)
24 h
Incubar (8 - 12 h a 35 2 C)
C A romoCen SC gar S.S mod.
Urea
Sist. ident.
Serologa
24 48h
3 h



18 24 h






30
Anexo E. Algunos ejemplos de respuestas tpicas y atpicas de los
microorganismos diana y otros microorganismos



Fig. 1. Salmonella
Typhimurium en el
medio CromoCen SC.



Fig. 2. E. coli en el
medio CromoCen SC.



31
Fig. 3. Citrobacter
freundii en el medio
CromoCen SC.



Fig. 4. Klebsiella
pneumoniae en el
medio CromoCen SC.
32

Fig. 5. Shigella
sonnei en el medio
CromoCen SC
(violetas bordes muy
irregulares)



Fig. 6. Shigella
flexneri en el medio
CromoCen SC
(violetas bordes muy
irregulares)
33




Fig. 7. Salmonella
Typhi en el medio
CromoCen SC




Fig. 8. Pseudomonas
aeruginosa en el
medio CromoCen SC

34





Fig. 9. Mezcla de
microorganismos en
el medio CromoCen
SC.
Salmonella
Typhimurium
Citrobacter
Citrobacter
E. coli
Fig. 10. Mezcla de
microorganismos en
el medio CromoCen
SC.
Enterobacter
35




Fig. 11. Mezcla de
microorganismos en
el medio CromoCen
SC.
Salmonella
Typhimurium
Pseudomonas
aeruginosa
Salmonella
Typhimurium
Citrobacter
Fig. 12. Mezcla de
microorganismos en
el medio CromoCen
SC.





36