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Universidad Autnoma de San Luis Potos Facultad de Ciencias

USO DE LA ESPECTROSCOPA RAMAN COMO MTODO NO-INVASIVO EN EL DIAGNSTICO MDICO: TEJIDO DE PIEL E HGADO

Tesis que presenta: Miguel Ghebr Ramrez Elas Para obtener el grado de: Doctor en Ciencias Aplicadas

Bajo la direccin de: Dr. Francisco Javier Gonzlez Contreras

San Luis Potos, S.L.P. Julio de 2011

TABLA DE CONTENIDO CAPITULO 1: INTRODUCCIN 1.1 INTRODUCCIN 1.2 ESPECTROSCOPA RAMAN 1.2.1 TEORA 1.2.2 INSTRUMENTACIN 1.2.3 VENTAJAS Y DESVENTAJAS 1.3 ESPECTROS RAMAN DE PIEL CAPITULO 2: ANLISIS DE ESPECTROS RAMAN 2.1 ANLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES 2.1.1 METAS DEL ANLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES 2.1.2 COMO FUNCIONA ACP 2.1.3 PASOS NECESARIOS PARA LLEVAR A CABO ACP 2.1.4 PRINCIPALES RESULTADOS DEL ACP 2.1.5 INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS DEL ACP 2.1.6 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL USO DE ACP EN ESPECTROSCOPA RAMAN. 6 6 10 10 13 16 18 22 22 22 23 24 27 29 30

CAPTULO 3: CARACTERIZACIN DEL RUIDO EN LAS MEDICIONES RAMAN IN VIVO DE PIEL HUMANA 32 3.1 INTRODUCCIN 3.2. MTODOS Y MATERIALES. 3.3 RESULTADOS 3.4 CONCLUSIONES 32 34 36 49

CAPTULO 4: USO DE ESPECTROSCOPA RAMAN PARA LA DETECCIN DE FILAGRINA EN PACIENTES CON DERMATITIS ATPICA 51 4.1 INTRODUCCIN 4.2 MTODOS Y MATERIALES 4.3 RESULTADOS 4.4 CONCLUSIONES CAPTULO 5: ESTIMACIN NO INVASIVA DE DAO CRONOLGICO Y FOTOINDUCIDO EN PIEL UTILIZANDO ESPECTROSCOPA RAMAN Y ANLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES 5. 1 INTRODUCCIN 51 52 55 62

64 64

5. 2 MTODOS Y MATERIALES 5. 3 RESULTADOS 5.4 CONCLUSIONES

65 67 70

CAPTULO 6: LA ESPECTROSCOPA RAMAN EN EL DIAGNSTICO EX VIVO DE FIBROSIS HEPTICA 71 6. 1 INTRODUCCIN 6.2 MTODOS Y MATERIALES 6.3 RESULTADOS 6.4 CONCLUSIONES CAPTULO 7: CONCLUSIONES CAPTULO 8: TRABAJO A FUTURO REFERENCIAS APNDICE: CDIGO DE MATLAB PARA OBTENER ACP 71 75 76 80 81 84 86 90

A mi familia: mis padres Miguel y Alma Rosa y a mi esposa Lupita

Agradecimientos
Agradezco de manera especial a mi asesor el Dr. Javier Gonzlez por haberme guiado durante este proceso de doctorado, su respaldo constante y su disponibilidad para ayudarme en todo momento. Agradezco tambin al Dr. Javier Alda, director de la E.U. de ptica de la Universidad Complutense de Madrid por haberme permitido una estancia en su laboratorio y por sus valiosas enseanzas que contribuyeron para mi formacin a nivel acadmico y personal. Al Departamento de Dermatologa del Hospital central Ignacio Morones Prieto. En especial al Dr. Benjamn Moncada, la Dra. Bertha Torres y el Dr. Claudio Castillo por su estrecha colaboracin para la realizacin de esta tesis. As mismo a los investigadores del Laboratorio de la Unidad de Medicina Experimental del Hospital General de Mxico. Tambin deseo agradecer a los Doctores Navarro, Vidal y ngel G. Rodrguez del CIACYT, al Dr. Facundo Ruiz de la Facultad de Ciencias de la UASLP y al Dr. Femat del IPICYT por sus valiosas sugerencias y comentarios sobre mi tesis. Finalmente agradezco al Consejo Nacional de Ciencia Y Tecnologa (CONACYT) por el otorgamiento de una beca Mixta para Estancia Acadmica en el Extranjero periodo Octubre-Noviembre de 2010 y la beca para estudios de Doctorado durante el periodo de 2008 a 2011.

CAPITULO 1: INTRODUCCIN
1.1 Introduccin Una parte fundamental en el estudio y diagnstico de enfermedades se realiza a travs del examen de rganos, tejidos, clulas y fluidos (1). En tejidos, el diagnstico histolgico de una enfermedad generalmente envuelve exmenes visuales con tinciones especiales empleadas para visualizar protenas electrnica, inmunohistoquimica y biologa molecular han especficas, clulas y microorganismos. Adems, tcnicas nuevas como microscopa permitido un enorme avance en el conocimiento histolgico. Sin embargo, para poder dar un diagnstico final frecuentemente se requiere de la biopsia y el anlisis histolgico. Este mtodo de evaluacin tiene la desventaja de que genera un retraso significativo en el diagnstico (la biopsia puede tardar horas o das), introduce la posibilidad de error en el muestreo, adems del riesgo del procedimiento (2). Adems, la interpretacin de los resultados depende fuertemente de la experiencia del que realiza el estudio. Identificar una enfermedad histolgicamente en sus primeras etapas no siempre es una tarea fcil para los patlogos, y nos es inusual que dos patlogos examinando el mismo tejido lleguen a diferentes conclusiones, lo que puede llevar a falsos positivo y falsos negativos. Un falso negativo significara que la enfermedad no recibira tratamiento y un falso positivo resultara en una intervencin innecesaria invasiva y posible trauma emocional para el paciente. Entonces, cualquier tcnica que pueda mejorar los resultados del proceso de diagnstico ser una herramienta valiosa para el mdico (3). Los avances tecnolgicos recientes en fibra ptica, fuentes de luz, detectores y biologa molecular han permitido el desarrollo de numerosos mtodos pticos que prometen una mejora significativa en la evaluacin de tejido in vivo. Estos mtodos, colectivamente se conocen como biopsia ptica (4). El trmino biopsia ptica se refiere a mtodos que usan las propiedades de la luz para 6

permitir al operador hacer un diagnstico al instante, sin necesidad del anlisis histolgico. Entre estos mtodos se encuentran mtodos como la endoscopia de fluorescencia, tomografa de coherencia ptica, microscopia confocal y la espectroscopa Raman (5). Idealmente un mtodo de diagnstico debera ser rpido, sin necesidad de reactivos o preparacin previa de la muestra, no destructivo, relativamente econmico y que requiera una mnima cantidad de entrenamiento previo para su utilizacin (6). En este sentido, la espectroscopa Raman cuenta con ciertas caractersticas que permiten considerarla como un posible mtodo de diagnstico: es una tcnica relativamente rpida considerando que una biopsia puede tomar horas o das, mientras que Raman puede dar una respuesta en segundos (1), tampoco requiere de preparacin previa de la muestra, es no destructiva siempre y cuando se utilicen los parmetros adecuados (como potencia de laser y tiempo de exposicin), el agua no interfiere, las mediciones Raman se pueden realizar en partes de difcil acceso con la ayuda de sondas de fibra ptica, adems de que proporciona informacin a nivel bioqumico que puede utilizarse para detectar las primeras etapas de enfermedad (1), si asumimos que los cambios bioqumicos ocurren antes de que se vean reflejados en la histologa como cambios estructurales (7), estos cambios bioqumicos se ven reflejados en los espectros Raman. Para propsitos de diagnstico de tejido, el reto es identificar caractersticas espectrales que estn asociadas con enfermedad, pero esta identificacin solo es posible mediante el uso de mtodos de anlisis multivariante debido a la complejidad del espectro Raman de tejido. El espectro Raman proporciona informacin sobre los modos vibracionales de una molcula en la que el nmero de modos vibracionales es igual a 3n-6 (donde n es el nmero de tomos). Si consideramos que una protena puede tener cientos de tomos, y el tejido est formado en parte por diferentes protenas, el espectro de tejido tiende a ser complejo. Entonces, un conjunto de datos espectrales puede ser sujeto a diferentes mtodos de anlisis multivariante y los resultados pueden ser 7

correlacionados con condiciones patolgicas (8)(9), en el caso de la presente tesis se ha utilizado Anlisis de Componentes Principales. Si los cambios espectrales son lo suficiente especficos para una enfermedad en particular, estos cambios podran, en principio, ser usados como indicativos de enfermedad (6), al respecto existen estudios que ilustran las diferencias observadas entre espectros Raman de tejido sano y tejido enfermo (10)(11)(12)(13). Otra ventaja que ofrece esta tcnica y que ha generado gran inters en el rea biomdica es el potencial para aplicaciones in vivo ya que las herramientas de diagnstico in vivo son necesarias para evitar diagnsticos tardos y para reemplazar los actuales mtodos invasivos por tcnicas no invasivas (14). El xito de la implementacin clnica de la espectroscopa Raman depender de la sensibilidad, especificidad y costo del instrumento (7). Adems de que esta tcnica deber ser verificada por mtodos histolgicos estndares. Tambin, se debern realizar ensayos clnicos a gran escala para validar y estandarizar esta tecnologa y de esa manera garantizar su utlizacin dentro de la comunidad mdica. Otro aspecto para ganar aceptacin clnica es que la informacin obtenida sea fcil de interpretar para personal no especializado en espectroscopa, porque los mdicos no quieren ver un espectro e interpretarlo, solo quieren una respuesta (1). No se sabe con certeza si la espectroscopa Raman pueda llegar a reemplazar completamente a la biopsia convencional y el anlisis histolgico de tejido a corto plazo, es ms probable que esta tcnica en conjunto con otros mtodos de biopsia ptica ofrezcan un enfoque ms preciso y eficiente para una biopsia guiada de tejido enfermo, reduciendo as el nmero de biopsias convencionales (4). El trabajo presentado en esta tesis incluye aplicaciones de espectroscopa Raman para el diagnstico clnico en tejido de piel e hgado. Como hiptesis se ha planteado que: la espectroscopa Raman proporciona informacin molecular del tejido que puede ser correlacionada con el

diagnstico clnico, por lo que podra ser utilizada como un mtodo no invasivo de diagnstico. El objetivo de esta Tesis es encontrar un mtodo ptico de diagnstico mdico que sirva como una opcin alternativa no invasiva a la biopsia. Para lograr este objetivo se obtuvieron espectros Raman de hgado y de piel in vivo. De la misma manera, se obtuvieron espectros in vitro de sustancias de inters biomdico para establecer una base de datos de espectros que sirvieran como referencia. Una vez hecho esto los resultados obtenidos se validaron mediante mtodos clnicos. La Tesis est organizada de la siguiente manera: El Captulo 1 contiene las bases tericas de la espectroscopa Raman: La interaccin de la radiacin electromagntica con la materia, el efecto Raman. As mismo, contiene la metodologa y las caractersticas del equipo Raman utilizado. Finalmente, se mencionan algunos ejemplos de aplicaciones mdicas de Raman realizadas a la fecha. En el Captulo 2, se explica la tcnica de anlisis utilizada en la presente Tesis: Anlisis de Componentes Principales (ACP). Esta tcnica de datos, as como para reconocer relaciones entre muestras y variables. El Captulo 3 analiza la contribucin de ruido del aparato experimental y de dos mtodos bien establecidos para la eliminacin de fluorescencia usados en las mediciones espectroscopia Raman biomdicas. El Captulo 4 trata sobre el uso de Raman para la deteccin temprana de Dermatitis Atpica (DA) relacionada a la Filagrina (FLG). En este trabajo, se ha detectado la presencia de la protena FLG en la piel usando espectroscopia Raman y ACP como un procedimiento de deteccin temprana de DA relacionada a la FLG y como un posible marcador de mutaciones en el gen de la FLG. anlisis multivariante ha sido de gran utilidad tanto para reducir la dimensin de los

En el Captulo 5 se encontr una relacin entre las caractersticas histolgicas de la piel foto-envejecida y mediciones no invasivas usando Raman y el anlisis de componentes principales (ACP). Estas relaciones se pueden utilizar para evaluar de forma no invasiva el dao fotoinducido y caractersticas cronolgicas de la piel. En el Captulo 6 se utiliz la espectroscopa Raman en conjunto con Anlisis de Componentes Principales (ACP) y autofluorescencia del infrarrojo cercano (autofluorescencia NIR) para diferenciar entre espectros de tejido hgado de rata normal y tejido afectado por fibrosis. Mediante estos dos enfoques para el anlisis, se ha podido identificar espectros de tejido fibrtico y cirrtico. Finalmente los captulos 7 y 8 se refieren a las conclusiones y el trabajo futuro, respectivamente. 1.2 Espectroscopa Raman 1.2.1 Teora La espectroscopa ptica consiste en la interaccin de un haz de radiacin electromagntica con un sistema cuyas caractersticas se quieren determinar. En trminos generales, el haz saliente difiere del entrante por efecto de esta interaccin. Las modificaciones sufridas por el haz entrante nos permiten obtener informacin sobre la estructura del sistema que queremos estudiar. Para comenzar, se describir el mecanismo de interaccin de la radiacin electromagntica con la materia. El Scattering o esparcimiento, es la desviacin de luz de su direccin original de incidencia. La interaccin del vector de campo elctrico de una onda electromagntica con los electrones del sistema con el que interacta da lugar a la dispersin de la luz incidente. Tales interacciones inducen oscilaciones peridicas en los electrones del compuesto; por lo tanto, produce momentos elctricos oscilantes. Esto lleva a tener nuevas fuentes emisoras 10

de radiacin, es decir, fuentes que re-emiten radiacin en todas las direcciones. Existen dos tipos bsicos de esparcimiento: Elstico e Inelstico. El elstico es tambin llamado esparcimiento Rayleigh. En este la luz esparcida tiene la misma frecuencia (longitud de onda) que la luz incidente. Por otro lado, al esparcimiento inelstico se le llama esparcimiento Raman (15) y existen dos tipos: en uno la luz dispersada tiene menor energa que la luz incidente (la que tiene menor frecuencia) y se llama esparcimiento Raman Stokes. En el otro, la luz esparcida tiene mayor energa que la luz incidente, es decir tiene mayor frecuencia que la luz incidente, y se le llama esparcimiento Raman Anti-Stokes. (Figura 1.1).

Figura 1.1. Representacin esquemtica de los tres tipos de luz dispersada

Comparado con el esparcimiento Rayleigh, la probabilidad de obtener esparcimiento Raman es menor; sin embargo es importante para el estudio de los estados vibracionales de las molculas. En el proceso Raman intervienen fotones de diferentes energas, esta diferencia de energa es debida a un cambio de estado, rotacional o vibracional de la molcula, causado por la interaccin con los fotones. En consecuencia, el anlisis de los

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espectros Raman provee informacin acerca de propiedades moleculares tales como los modos y tipos de vibraciones. Para que una molcula exhiba el efecto Raman, la luz incidente debe inducir un cambio en el momento dipolar o un cambio en la polarizabilidad molecular. El cambio en la polarizabilidad se puede visualizar cualitativamente como un cambio en la forma de la nube electrnica. La luz esparcida contiene una pequea porcin de la luz debida al esparcimiento Raman, adems de la debida al esparcimiento Rayleigh. El esparcimiento Raman contiene lneas Stokes y anti-Stokes; sus frecuencias corresponden a la suma y diferencia de las frecuencias de la luz incidente y las frecuencias vibracionales moleculares permitidas. Cuando los fotones interactan con una molcula, una parte de su energa se puede convertir en varios modos de vibracin de la molcula. Si la molcula se encontraba inicialmente en un estado rotacional o vibracional excitado, es posible que la luz dispersada tenga mayor energa que la incidente (efecto Raman anti-Stokes), siempre y cuando el sistema decaiga a un estado de menor energa que la del estado inicial. Como normalmente la poblacin de los estados excitados es mucho menor que la del estado bsico, la dispersin Raman Stokes es mucho ms intensa que la dispersin antiStokes. Es importante mencionar que slo una pequea fraccin de los fotones es esparcida inelsticamente, solamente 10-6 de la luz incidente (16). La mayor parte de la luz esparcida tiene la misma frecuencia (energa) que la de la luz incidente original, lo cual hace que la observacin del efecto sea relativamente difcil. Para monitorear los cambios en longitud de onda entre la luz incidente y esparcida, se utiliza luz monocromtica de laser para obtener seal de una muestra. En un espectro, las unidades del eje de las x corresponden a 12

nmeros de onda o unidades de corrimiento Raman. Los corrimientos Raman son calculados mediante la frmula:
1 1 102 0

cm-1 =

Donde est en metros (m), corresponde a la longitud excitacin, y s corresponde a la longitud de onda esparcida.

de onda de

1.2.2 Instrumentacin Las innovaciones tecnolgicas recientes han permitido el desarrollo de espectrmetros Raman porttiles, estos sistemas requieren de un espectrmetro y una fuente laser miniatura. Los detectores CCD

comercializados para cmaras digitales han servido como fuentes para obtener detectores CCD de bajo costo en espectroscopa, estos detectores se han combinado con espectrmetros miniatura para producir dispositivos porttiles. Los espectrmetros han sido diseados con interfaces de fibra ptica, de esa forma la fuente de luz y la muestra pueden estar localizadas lejos del espectrmetro sin problema. El espectrmetro, la interface a la PC, los controladores del software y el software de adquisicin y procesamiento de datos, est contenido en un solo paquete. Otra pieza requerida para un espectrmetro Raman porttil es un laser miniatura, estos lseres se han convertido en una pieza bsica para dispositivos CD/DVD y para las comunicaciones pticas, y por consiguiente estn disponibles para la espectroscopa Raman. En cuanto a la resolucin espectral, los sistemas Raman porttiles modernos han alcanzado una resolucin de 8 a 12 cm-1, estos valores son adecuados para discriminar entre substancias diferentes, 13

basndonos en el hecho de que en los espectros Raman de gran cantidad de slidos y lquidos el ancho de lnea natural es de 10 cm-1 (17). En el caso de tejido biolgico, los espectros Raman se componen por bandas cuyo ancho es 10-20 cm-1 (18), el tejido exhibe una fuerte fluorescencia si se excita con una fuente de luz visible, y una alternativa para reducir esta fluorescencia es el uso de fuentes de luz del cercano infrarrojo. Esto ha convertido a la espectroscopa Raman del cercano infrarrojo en una herramienta muy poderosa para determinar la composicin bioqumica de tejido biolgico. Las caractersticas mencionadas anteriormente, han permitido a los investigadores utilizar diferentes configuraciones para adquirir espectro Raman in vivo. Usando un diodo laser de 785 nm junto con fibras pticas para excitacin y coleccin de la luz, es posible detectar cncer crvico-uterino con buena sensibilidad y especificidad (19) , tambin se ha reportado un sistema Raman similar para obtener espectro de piel humana, uas y dientes in vivo. (20). El sistema utilizado en esta tesis es el R3000 de Raman Systems, es un sistema porttil y esta optimizado para trabajar con muestras onda de 785nm que minimiza los efectos de la fluorescencia. biolgicas (Figura 1.2) y cuenta con una fuente de excitacin laser con una longitud de

Fig. 1.2 Sistema Raman utilizado (R3000, Raman Systems)

14

El rango de medicin en trminos de corrimientos Raman es de

200 a

1800 cm-1 con una resolucin de 8 cm-1. La potencia es variable de 90 a 290mW, el detector es un CCD con un total de 1044 X 64 pixeles y la sonda Raman incluye una fibra ptica (figura 1.3) de 100 micras de dimetro para la excitacin laser y una fibra de 200 micras para la coleccin de la luz.

Fig. 1.3 Diagrama ptico de la sonda de fibra ptica utilizada con el espectrmetro utilizado (R3000 Raman Systems).

Para la calibracin del instrumento se utiliza tefln cada vez que se comienza la medicin o serie de mediciones, para las mediciones in vitro el sistema cuenta con un compartimiento pequeo donde se pueden colocar lquidos contenidos en una cubeta de cuarzo, por otra parte las mediciones in vivo se realizan haciendo contacto de la sonda con el tejido a medir. En la siguiente figura, se muestra el espectro Raman in vivo de piel humana de la yema del dedo, obtenido utilizando el espectrmetro Raman R3000 de nuestro laboratorio (figura 1.4a) y el obtenido con el espectrmetro Raman modelo LabRam (figura 1.4 b) utilizando una potencia de 10mW y una longitud de onda de excitacin de 785nm, como ha sido reportado previamente en la literatura (21).

15

150

1442

Intensity (a.u)

849.4

100

920.3

-50 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700

998.7

a)

Wavenumber (cm-1)

Intensity (a.u)

b)

Wavenumber (cm-1)
1.4 Espectro Raman in vivo de piel a) utilizando el espectrmetro Raman R3000 y b) reportado en la literatura.

1.2.3 Ventajas y desventajas La principal ventaja de la espectroscopa Raman es la informacin a nivel molecular que puede ser obtenida a partir de las molculas debido a los picos relativamente fuertes que conforman a un espectro tpico. Y el hecho que cada molcula presente un espectro caracterstico o huella digital(18), otra ventaja es que, a diferencia de la espectroscopa del Infrarrojo, el agua no produce 16

1034

50

934.7

1266 1292

1655

interferencia, esto es particularmente importante para el estudio de tejido biolgico. Adems, no es necesaria una preparacin previa de la muestra para obtener informacin cualitativa o cuantitativa. Una ventaja adicional es que los espectros pueden ser obtenidos va fibra ptica, particularmente til para sitios de difcil acceso. En el campo de las aplicaciones mdicas, la espectroscopa Raman adems tiene otras potenciales ventajas como: - Es mnimamente invasiva, evitando biopsias innecesarias. - Es no destructiva. Siempre y cuando la potencia y longitud de onda de excitacin sean escogidas cuidadosamente para evitar dao en el tejido. - Es una tcnica relativamente rpida en comparacin con mtodos de laboratorio estndares. Los espectros son obtenidos en tiempo real, reduciendo el tiempo en el diagnstico mdico. Entre las desventajas de esta tcnica est la debilidad inherente del efecto Raman. Adicionalmente la dbil seal Raman puede estar sujeta a la veces ms intensa (15). Otra fluorescencia de fondo que puede ser 104

desventaja es cuando existe una alta absorcin en las muestras, porque la luz incidente es absorbida en lugar de ser esparcida. Un ejemplo es que la intensidad Raman en la piel oscura es menor que en la piel clara, esto se debe al hecho de que la piel oscura tiene ms melanina que puede absorber ms fotones y transferirlos en calor, mientras que el laser penetra ms profundo en la piel clara y produce ms esparcimiento Raman (22). Y Por ltimo, para la espectroscopia Raman in situ se utilizan fibras pticas de silicio que tambin producen seal Raman y de fluorescencia que interfiere con la seal Raman de los tejidos (23).

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1.3 Espectros Raman de Piel La piel es un tejido de varias capas, semi-permeable que protege los rganos internos y tambin regula el calor y la prdida de humedad. La capa ms profunda es la dermis, tiene 1-4 mm de espesor y est compuesta en su mayora de colgeno. Por encima de esta capa, esta otra de 40-1000 micras de espesor llamada epidermis, que se compone de varias subcapas y que es rica en queratina. La capa ms externa es el estrato crneo, tiene un espesor de entre 10 y 40 micras y est compuesto de clulas de la epidermis (queratinocitos) incrustadas en una matriz de lpidos (24). La primera aplicacin de espectroscopa Raman en piel fue realizada por Williams y colaboradores (25). En el trabajo mencionado, se asignaron de forma detallada los picos de los espectros obtenidos de piel humana ex vivo usando un sistema Raman. Gniadecka y colaboradores obtuvieron espectros Raman de piel, pelo y uas ex vivo y sirvi para mostrar la factibilidad de la espectroscopa Raman para investigar la estructura de las protenas, lpidos y agua en muestras de piel, pelo y uas (26). Hace alrededor de 10 aos, se desarrollaron los primeros sistema Raman in vivo para aplicaciones de diagnstico mdico. Shim y colaboradores obtuvieron espectros de piel, uas y dientes de manera no invasiva (20). Schrader y colaboradores obtuvieron espectros de piel normal y de piel con lesiones (benignas y malignas), utilizando anlisis multivariante pudieron clasificar tejido sano y enfermo(27). A lo largo de los aos se han realizado mejoras en la instrumentacin de los sistemas Raman in vivo., estas mejoras han permitido obtener espectros de buena calidad, libres de fluorescencia y seal Raman debida a las fibras pticas y que permiten tiempos de adquisicin menores (28). Caspers y colaboradores (29) introdujeron un sistema de microespectroscopa Raman Confocal in vivo para obtener informacin molecular detallada de las diferentes capas de la piel. Utilizando espectroscopa Raman in vivo en piel 18

humana, se ha obtenido exitosamente el espectro de la melanina, un pigmento natural que es en gran parte responsable del color de la piel, cabello y ojos (30). Un sistema Raman desarrollado por Huang y colaboradores se utiliz para adquirir espectros de piel humana in vivo y asignar los picos Raman de la piel (Tabla I) (22) Raman Shift (cm-1) 1745 1654 1444 1304 1270 1080 1030 1005 937 853 820 Protein (C=O) Amide I (CH2), (CH3) (CN), (NH), Amide III (CC), Phenyl ring (CC), Proline, Valine (CCH), Aromatic, Olefine (CCH), Aliphatics Fat (C=O) (CH2) (CH2) (CC) (CC) (CC) Nucleic Acids Polisaccaride Other Contributions

Tabla I Asignacin de picos del espectro Raman de piel humana in vivo

Este mismo sistema se utiliz para adquirir

espectros

Raman y de

autofluorescencia NIR, de piel normal y tejido tumoral en ratones in vivo (14). Utilizaron Anlisis de componentes principales (PCA) y anlisis lineal discriminante para probar y comparar el desempeo de Raman en la clasificacin de tejido in vivo. Los resultados (figura 1.5) mostraron a la espectroscopa Raman como una tcnica clnico. En las primeras aplicaciones in vivo, fue importante estudiar la variabilidad de los espectros Raman de diferentes partes del cuerpo, en este sentido Zhao y obtuvieron espectros Raman de diferentes personas en la misma parte del cuerpo y encontraron diferencia de intensidad en los espectros Raman. Sin embargo, encontraron que si los espectros Raman son normalizados los 19 prometedora para el diagnstico

espectros son idnticos, sin importar que sean obtenidos de diferentes personas (31).

Fig. 1.5 Grficos de puntaciones de los componentes principales extrados de los espectros de piel normal y de tumor derivados de (a) Raman, (b) autofluorescencia NIR y (c) espectros compuestos (Raman y autofluorescencia NIR), respectivamente.

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De forma similar, Egawa y Tagami encontraron diferencias en la concentracin de aminocidos y lpidos as como en el contenido de agua segn la edad del paciente y entre las diferentes partes del cuerpo (32). En los ltimos aos nuevas aplicaciones de Raman in vivo de piel han surgido. Por ejemplo, se ha utilizado espectroscopa Raman y nano-partculas para obtener imgenes de partes del cuerpo de animales pequeos para deteccin de tumores (33) y estudiar tejido daado por radiacin UVB (34). Los resultados reportados muestran el gran potencial de Raman para imgenes biomdicas de sujetos vivos. Otras aplicaciones recientes incluyen el estudio de protenas de la piel como colgeno (35) y queratina (36). Debido al inters por parte de especialistas mdicos en aplicacin de Raman para diagnostico no invasivo, diversas enfermedades dermatolgicas han sido estudiadas usando espectroscopa Raman in vivo, estas incluyen Vitiligo (37) Psoriasis (38), Dermatitis atpica (39), Psoroasis (40) (41) y Cncer (42) (43) (44). Como demostramos en esta seccin la espectroscopia Raman ofrece una serie de caractersticas que son tiles en el diagnstico no invasivo. Son numerosos los ejemplos en los que la espectroscopia Raman se utiliza en el campo del diagnstico mdico. El desarrollo de nuevas tecnologas aplicadas a la espectroscopia ha permitido obtener espectros Raman varios milmetros por debajo de la superficie de las muestras opacas y translcidas, como la piel, adems de la posibilidad de que algunos de estos anlisis se pueden utilizar in

vivo.

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CAPITULO 2: ANLISIS DE ESPECTROS RAMAN 2.1 Anlisis de Componentes Principales El anlisis de componentes principales (ACP) es un algoritmo matemtico que reduce la dimensionalidad de los datos mientras retiene la mayor parte de la variacin de los datos (45), se le conoce tambin como un mtodo de proyeccin debido a que toma las variables originales y las proyecta sobre un plano constituido por un nmero ms pequeo de variables llamadas componentes principales (CP). Cada CP explica una cierta cantidad de la informacin total contenida en los datos originales, donde el primer CP explica la mayor parte de la informacin. Cada CP subsecuente contiene menor informacin que el que le precede. Graficando los CPs pueden ser reveladas relaciones importantes entre muestras y variables, permitiendo la interpretacin de grupos de muestras, similitudes y diferencias (46). 2.1.1 Metas del Anlisis de componentes principales Las tablas con un gran nmero de datos generalmente contienen gran

cantidad de informacin. Esta informacin puede estar parcialmente escondida debido a que los datos son muy complejos para ser fcilmente interpretados, un ejemplo de tablas con un gran nmero de datos son los datos espectrales obtenidos por diferentes mtodos pticos. Las metas principales del ACP son: a) extraer la informacin ms relevante de una tabla de datos. b) reducir la dimensin del conjunto de datos conservando nicamente esta informacin relevante c) simplificar la descripcin del conjunto de datos; y 22

d) analizar la estructura de las observaciones y las variables. 2.1.2 Como funciona ACP Para alcanzar las metas mencionadas en la seccin anterior, ACP encuentra nuevas variables llamadas componentes principales (CP) las cuales son combinaciones lineales de las variables originales (figura 2.1)

Fig. 2.1 Anlisis de componentes principales

Los componentes principales se calculan de un modo iterativo de tal forma que el primer CP contiene la mayor parte de la informacin (en trminos estadsticos, la mayor varianza explicada). El segundo CP contendr la segunda mayor parte de la informacin y as sucesivamente. Estos CPs formaran un nuevo conjunto de ejes coordenados que tendrn ventajas sobre el conjunto de ejes originales (variables originales). La primera ventaja es que los CPs son ortogonales unos de otros, la segunda es que estn ordenados de tal manera que cada uno contiene ms informacin que cualquiera de los subsecuentes. Esto hace posible priorizar, enfocndonos en los primeros componentes, dado que estos contienen la mayor parte de la informacin. Los valores de estas nuevas variables se llaman puntuaciones.

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Los componentes son obtenidos de la siguiente forma: Sea X una matriz de datos de dimensiones m x n. La matriz de puntuaciones F dimensiones m x p se obtiene de: F = XQ La matriz Q dimensiones n x p nos da los coeficientes de las combinaciones lineales usadas para calcular las puntuaciones. Los componentes tambin pueden ser representados geomtricamente por la rotacin de los ejes originales. Geomtricamente las puntuaciones dan la longitud (distancia al origen) de una muestra a lo largo de un determinado componente y en este contexto la matriz Q se puede interpretar como una matriz de cosenos directores. La matriz Q tambin se llama matriz de eigenvectores. puntuaciones F por la matriz de eigenvectores Q: X=FQT Y de esa manera obtener de regreso los datos originales. A continuacin se explican el procedimiento paso a paso realizar Anlisis de componentes principales (ACP). 2.1.3 Pasos necesarios para llevar a cabo ACP Paso 1: Obtener los datos Lo primero es tener nuestra matriz datos X m x n. El nmero de componentes principales mximo que puede ser obtenido depender de la dimensin de esta matriz. El nmero mximo de componentes es m-1, donde m es el nmero de objetos. 24 As, la matriz X puede ser interpretada como el producto de la matriz de

Paso 2: Restar la media Para que ACP funcione correctamente, es necesario restar la media a cada dimensin de los datos. La media restada es el promedio a lo largo de cada dimensin. Si tenemos una matriz de datos de dos dimensiones (x, y) entonces a todos los valores de x se les restara la media de los valores de x para todos los objetos. Y este procedimiento se har para los valores de y. Esto produce un conjunto de datos con media cero. Paso 3: Calcular la matriz de covarianza La mayora de conjuntos de datos tiene ms de una dimensin y uno de los propsitos del anlisis estadstico de estos conjuntos de datos es ver si hay alguna relacin entre las dimensiones. La covarianza nos proporciona una medida de que tanto varan las dimensiones, una respecto a otra, de la media. La covarianza siempre se mide entre dos dimensiones. Si calculamos la covarianza entre una dimensin y ella misma, obtenemos la varianza. La frmula de la covarianza est dada por:
=1

, =

( ) 1

Por ejemplo, para un conjunto de datos de 2 dimensiones, la matriz de covarianza quedara:


( , ) (, ) (, ) (, )

Paso 4: Calcular los eigenvectores y los eigenvalores de la matriz de covarianza. De la matriz de covarianza podemos calcular los eigenvectores y eigenvalores. Estos son muy importantes porque nos proporcionan informacin acerca de nuestros datos. Los eigenvectores tienen la propiedad de ser ortogonales. Esto 25

es importante porque de esta forma nos permite expresar los datos en trminos de estos vectores perpendiculares en lugar de en trminos de los ejes originales. Paso 5: Ordenar Eigenvectores y seleccionarlos. Una vez que se han encontrado los eigenvectores de la matriz de covarianza, el siguiente paso es ordenarlos por su eigenvalor, de mayor a menor. De esta manera, el eigenvector con el eigenvalor ms grande es el primer componente principal. Esta forma de ordenar, nos da los componentes en orden de significancia. A continuacin, con los eigenvectores ordenados por significancia, se construye una matriz de vectores. Podemos seleccionar los componentes ms significativos (con un eigenvalor alto) e ignorar el resto. Si ignoramos algunos de estos compontes con eigenvalores pequeos, el conjunto de datos final tendr menos dimensiones que el conjunto original. Tendremos una matriz de eigenvectores Q de dimensiones n x p que contiene los primeros p

(p<<m) eigenvectores ms significativos.


Paso 6: Obteniendo el nuevo conjunto de datos Una vez seleccionados los componentes (eigenvectores) que queremos

guardar para nuestro anlisis y construida la matriz de vectores, simplemente tomamos la t matriz de eigenvectores Q y la multiplicamos por la matriz de datos originales X.

Donde Q es la matriz con los eigenvectores, y X son los datos originales ajustados (con media cero).

26

Esto nos dar los datos originales en trminos de los vectores que hemos escogido. Bsicamente, lo que se hace es transformar nuestros datos para que puedan ser expresados en trminos de un nuevo conjunto de ejes que describen las relaciones entre los datos. Si queremos obtener lo datos originales, hacemos

Donde QT es la transpuesta de Q. Es importante mencionar que para obtener el conjunto de datos originales, es necesario sumar la media que ha sido removida al comenzar el procedimiento. As quedara,

Y de esa forma hacemos la reconstruccin de los datos originales a partir de los componentes principales. 2.1.4 Principales resultados del ACP Cada componente de un modelo de ACP se caracteriza por tener los siguientes atributos: A) Puntuaciones Cada muestra tiene una puntuacin para cada CP. Este revela la localizacin de la muestra a lo largo del CP y es la coordenada de la muestra en el CP (figura 2.2).

27

Fig. 2.2 Las puntuaciones de los CP

Las graficas de puntuaciones son una herramienta muy til que ofrece ACP, estas resultan de graficar las puntuaciones de un CP contra otro y permiten conocer como las muestras estn relacionadas unas con otros, basndose en el hecho de que muestras con puntuaciones cercanas en el mismo CP son similares. B) Eigenvectores: Describen la estructura de los datos en trminos de las contribuciones de las variables, estos eigenvectores reflejan cuanto contribuye una variable individual a cierto CP y que tan bien el CP toma en cuenta la variacin contenida en una variable. En trminos geomtricos, es el coseno del ngulo entre la variable y el CP correspondiente. Pueden ser graficados como una lnea y son comnmente usados para la interpretacin de datos espectrales. Tambin son llamados componentes principales. C) Varianza Explicada: La varianza total explicada mide cuanto de la variacin original en los datos es descrita por el modelo y expresa la proporcin de estructura en los datos encontrada por el modelo. Son las mediciones del error que dicen cuanta informacin es tomada en cuenta por cada CP. 28

2.1.5 Interpretacin de los resultados del ACP Antes de pasar a la interpretacin de los resultados debemos comenzar con dos pasos principales: Checar las varianzas, para determinar cuntos componentes principales debemos tomar y saber cunta informacin contienen los CPs seleccionados. Buscar outliers. Es decir, aquellas muestras general (atpicas). 2.1.5.1 Interpretacin de las grficas de puntuaciones En la interpretacin de las graficas de puntuaciones, es necesario tomar cuenta los siguientes puntos: -Las muestras cercanas al origen de los ejes de los PC son las ms tpicas o muestras promedio. Las ms alejadas del origen pueden ser casos extremos o atpicos. -Los objetos cercanos entre si son similares y aquellos que se alejan entre si son diferentes. -Objetos aislados pueden ser muestras atpicas, es decir, muestras que no se ajustan al resto. Estas pueden ser eliminadas, segn requiera un problema especifico. -Se recomienda que los resultados de la grficas de puntuaciones sean interpretados usando las grficas de eigenvectores. 2.1.5.2 Interpretacin de los eigenvectores Para la interpretacin de las graficas de los eigenvectores, primero es necesario considerar la proporcin de varianza total explicada por cada CP o eigenvector. Por ejemplo si CP1 explica el 95% y PC2 solo el 5% entonces las 29 que no se ajustan al patrn

variables con valores altos del CP1 son ms importantes que aquellas con valores altos de CP2. Otro punto a considerar es que si una variable tiene un CP pequeo, sin importar el signo, no debe ser usado para interpretacin porque esa variable no est contando de manera significativa por el CP. Se debe enfocar en las variables con altos CP. Si la puntuacin de una muestra y el CP de una variable tienen el mismo signo, significa que la muestra tiene un valor ms alto que el valor promedio para esa variable y viceversa.

2.1.6 Ventajas y desventajas del uso de ACP Raman.

en espectroscopa

La ventaja principal de ACP es que datos complejos (ej. espectros) pueden ser analizados. Para el caso de la espectroscopa Raman biomdica, el ACP contribuye a mejorar el algoritmo de diagnstico debido que en lugar de tomar solo las intensidades o posiciones de un nmero limitado de picos, esta tcnica trabaja con amplias regiones espectrales (o incluso todo el espectro) y as incluir la mayor parte de informacin contenida en el espectro. Esto es importante si tomamos en cuenta que, por ejemplo, diferentes molculas en el tejido biolgico proporcionan seal Raman en mltiples regiones espectrales a lo largo de prcticamente todo el rango del espectro Raman (47). ACP tambin es til para encontrar conglomerados de espectros similares, esto es posible debido al hecho de que espectros con caractersticas similares requerirn cantidades similares de los mismos CP. Para poder descartar la presencia de conglomerados se utilizan grficas de la puntuaciones de los CP en las cuales se grafican las puntuaciones de un CP contra las puntaciones de otro CP. Por otra parte, las desventajas de ACP provienen de errores sistemticos que hacen que algn espectro aparezca diferente de los otros espectros aunque qumicamente no presente diferencias. Estas diferencias artificiales aparecern en los resultados del ACP como un componente adicional, que reducir la 30

habilidad para distinguir entre componentes con informacin Raman de aquello que contiene ruido. De esta manera, se pueden formar conglomerados artificiales o incluso desaparecer. Estos problemas pueden provenir de corrimiento en el nmero de onda o cambios en la intensidad durante la coleccin de los espectros o de inconsistencias en el preprocesado de los datos.

31

CAPTULO

3:

CARACTERIZACIN

DEL

RUIDO

EN

LAS

MEDICIONES RAMAN IN VIVO DE PIEL HUMANA


3.1 Introduccin
Como se ha comentado en el captulo introductorio, una desventaja de la

espectroscopia Raman en tejido biolgico es que la emisin de fluorescencia intrnseca puede ser 104 veces ms intensa que la dispersin Raman. En los espectros, la fluorescencia aparece como una banda slida que opaca las seales de Raman y con el fin de simplificar el anlisis de los datos espectrales esta amplia banda de la fluorescencia debe ser eliminada. Sin embargo, el proceso para remover la fluorescencia no es sencillo debido a las complejas caractersticas asociadas a los espectros Raman de muestras biolgicas (15), este proceso de eliminacin de la fluorescencia puede hacerse por dos vas: por instrumentacin o por mtodos computacionales. Ejemplos de mtodos va instrumentacin son el cambio de la excitacin (48) y de time-gating (49). El mtodo de cambio de excitacin requiere cambios en la instrumentacin durante la espectroscopa, por esta razn no ha sido utilizado para aplicaciones in vivo. Time-Gating no es prctica para aplicaciones clnicas debito al tamao, costo y complejidad de estos sistemas, adems el potencial de dao biolgico debido a la luz de excitacin (50). Por otro lado, estn los mtodos computacionales estos incluyen el ajuste polinomial (14)(51), transformada de Fourier (52)(53), transformada Ondeleta (54)(55) y derivadas de primer y segundo orden (56). El uso de derivadas es un mtodo muy efectivo para restar la fluorescencia pero distorsiona severamente la informacin Raman (57). La transformada de Fourier puede causar que se generen artefactos en el espectro procesado si la seal Raman y la de ruido no estn bien separadas (52)(53)(58). La transformada ondeleta se 32

ha utilizado recientemente (54), pero es altamente dependiente del mtodo de descomposicin usado y de la forma de la fluorescencia de fondo (55) (59). Por otro lado, el ajuste polinomial tiene la ventaja frente a los otros mtodos debido a su efectividad, rapidez y simplicidad. Estas caractersticas han permitido su uso en aplicaciones biomdicas de espectroscopa Raman in

vivo.(51). La debilidad del ajuste polinomial es que depende del rango


espectral en el que se haga el ajuste y el orden del polinomio. De ah que variaciones de este mtodo han sido propuestas como las modificaciones hechas por Mahadevan-Jansen y colaboradores, quienes reportaron un mtodo de ajuste multipolinomial que mejoro sustancialmente la eliminacin de la fluorescencia en los espectros Raman(60), sin embargo este mtodo tiene ciertas limitaciones especialmente para el procesado en tiempo real y bajo circunstancias de niveles altos de ruido. Otra variacin del mtodo polinomial es el llamado Algoritmo de Vancouver (51), que tiene la ventaja de que toma en cuenta los efectos del ruido en la seal y la influencia de los picos Raman en el ajuste de la fluorescencia, suprimiendo la creacin de picos artificiales indeseables que pueden generarse en los ajustes polinomiales. A la vez, el algoritmo toma poco tiempo para ser ejecutado favoreciendo la aplicaciones en tiempo real. En general, los mtodos de ajuste polinomial son los que dan la mejores aproximaciones de la fluorescencia para las aplicaciones biomdicas de espectroscopa Raman in vivo.(47)(19) Adems de la fluorescencia, el ruido en las mediciones Raman incluye la contribucin del ruido generado por el equipo utilizado, el ruido shot es la fuente dominante de ruido y es en un orden de magnitud mayor que las contribuciones del ruido de la lectura, el ruido de oscuridad y el ruido generado por fuentes externas. En este trabajo se explora el ruido generado por la instrumentacin y el ruido introducido por dos mtodos de ajuste polinomial para la eliminacin de la fluorescencia. 33

El ruido generado por el equipo de medicin se obtuvo utilizando una muestra de tefln debido al hecho de que no produce fluorescencia, dejando nicamente la contribucin del ruido debido al equipo. Dos mtodos de ajuste polinomial para eliminar la fluorescencia de las mediciones Raman de piel fueron evaluados en trminos de generacin de ruido. En el primer mtodo la fluorescencia se ha removido al restar un polinomio de quinto grado a los espectros adquiridos. En el segundo mtodo se ha utilizado de igual manera un polinomio de quinto grado pero aplicando el algoritmo de Vancouver, propuesto por Zhao et al.(51)

3.2. Mtodos y materiales.


3.2.1 Instrumentacin y condiciones de medicin Las mediciones Raman se realizaron utilizando un espectrmetro Raman R3000 descrito anteriormente en la seccin 1.2.2 Para obtener el ruido generado por el instrumento, se obtuvieron cuarenta espectros Raman del tefln el cual est contenido en la tapa de verificacin que incluye el sistema Raman. Todas las mediciones fueron obtenidas el mismo da, usando siempre la misma muestra de tefln. Las mediciones se llevaron a cabo de diez en diez, esperando cincuenta minutos entre cada conjunto de mediciones, hasta completar un total de cuarenta espectros. La potencia usada fue 90mW con un tiempo de integracin de 10s. Tambin se realizaron mediciones de piel del antebrazo de un individuo sano con el fin de evaluar el ruido introducido por la fluorescencia y los mtodos para eliminar fluorescencia. El procedimiento para realizar las mediciones fue similar al usado para el tefln descrito anteriormente: se realizaron en conjuntos de diez, esperando cincuenta minutos entre cada conjunto de mediciones, hasta completar cuarenta. Todas las mediciones fueron realizadas 34

bajo las mismas condiciones, durante el mismo da y sobre la misma rea de la piel. La potencia de laser utilizada fue de 90mW con un tiempo de integracin de 10s para asegurar una buena calidad de los espectros Raman sin provocar dao sobre el paciente. Las mediciones se realizaron en el rango espectral de 800 a 1800 cm-1. 3.2.2. Anlisis de componentes principales En este trabajo, los datos obtenidos mediante espectroscopia Raman se analizan utilizando ACP para revelar artefactos ocultos y la presencia de ruido. El mtodo para identificar componentes principales independientes se basa en una estrategia de agrupamiento que identifica conexiones internas estadsticamente significativas entre los componentes principales basada en las incertidumbres estadsticas intrnsecas de los datos (61). Luego, los componentes principales independientes se toman como los relevantes y de algunos de ellos de obtiene su significado fsico. Los componentes principales conectados son asociados comnmente con el ruido o la presencia de artefactos en el anlisis del conjunto de datos. 3.2.3. Mtodos para eliminar la fluorescencia en la espectroscopa Raman biomdica. Para eliminar la fluorescencia dos mtodos comnmente utilizados en la espectroscopa Raman biomdica han sido utilizados, el primero ha sido el mtodo de Ajuste de curva polinomial y el segundo el Algoritmo de Vancouver. 3.2.3.1 Ajuste de curva polinomial Para aplicaciones de espectroscopa Raman biomdicas, un mtodo simple y eficaz para la reduccin de fluorescencia es el ajuste de curva polinomial. Este 35

mtodo tiene la ventaja de retener las bandas espectrales e intensidades de los espectros Raman originales. Empricamente, los polinomios de quinto grado proporcionan las mejores aproximaciones de la fluorescencia in vivo para aplicaciones biomdicas(23)(62)(63). Este mtodo consiste en ajustar un polinomio de quinto grado al espectro Raman adquirido y posteriormente se hace la substraccin de la funcin polinomial al espectro original dando como resultado un espectro Raman sin fluorescencia. 3.2.3.2 Algoritmo de Vancouver para la eliminacin de la fluorescencia El Algoritmo de Vancouver es un algoritmo iterativo para la eliminacin de fluorescencia basada en el ajuste polinomial (51). La ventaja de este mtodo es que incluye un mtodo estadstico que toma en cuenta los efectos del ruido y la contribucin de la seal Raman. El ajuste polinomial final es considerado como la fluorescencia de fondo, luego se hace la resta de la funcin polinomial final a los espectros originales dando como resultado espectros Raman sin fluorescencia.

3.3 Resultados
3.3.1 El ruido y los artefactos del instrumento de medida El espectrmetro Raman utiliza una muestra de tefln como estndar de referencia para la calibracin. Esta muestra se midi 40 veces. La correlacin obtenida fue mayor que 0.996, lo cual muestra que los espectros son bastante similares. El ACP se utiliz para este conjunto de datos, mostrando que slo 6 componentes principales pueden ser considerados como independientes. Estos 6 componentes explican el 99.98% de la varianza total del conjunto de datos. La figura 3.1 muestra la importancia relativa de cada componente principal y la figura 3.2 muestra estos componentes principales independientes.

36

Figura 3.2. Grfica Semilogartmica del peso relativo de los eigenvalores de los componentes principales. La lnea vertical separa a los principales componentes independientes.

TEFLON
200 2 0 x 10
4

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

PC1
400 400 600 600 800 800 1000 1000 1200 1200 1400 1400 1600 1600 1800 1800

-2 200 200 500 0 -500 200 200 200 0 -200 200 200 50 0 -50 200 200 200 0 -200 200 200

PC2
400 400 600 600 800 800 1000 1000 1200 1200 1400 1400 1600 1600 1800 1800

PC3
400 400 600 600 800 800 1000 1000 1200 1200 1400 1400 1600 1600 1800 1800

PC4
400 400 600 600 800 800 1000 1000 1200 1200 1400 1400 1600 1600 1800 1800

PC5
400 400 600 600 800 800 1000 1000 1200 1200 1400 1400 1600 1600 1800 1800

PC6
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Wavenumber/cm-1
Figura 3.3 Componentes principales independientes extrados de los espectros Raman de tefln. PC#1 (99.92%), PC#2 (0.02%), PC#3 (0.01%), PC#4 (0.01%), PC#5 (0.01%), PC#6 (0.01%).

37

Al analizar CP # 1 se puede observar picos en 285, 380, 728, 1213, 1297 y 1377 cm-1 los cuales corresponden a los asociados al tefln. De hecho, el CP#1 est fuertemente relacionado con el espectro del tefln (coeficiente de correlacin r=0.9999). Si analizamos ahora las puntuaciones de los CP (Fig. 3.4) podemos ver que el CP # 1 es casi constante y tiene un valor de 0.1581 0.0009, muy cercano al valor de 0.1581 = el cual correspondera a un

eigenvector cuyas componentes tienen la misma importancia para cada uno de los 40 espectros, tomando en cuenta que los eigenvectores son por definicin ortogonales y unitarios.
0.6 0.4

0.2

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

-1

Spectrum #

Figura 3.4. Anlisis de las puntaciones de los CP del conjunto de espectros Raman de tefln.

El CP # 2 tiene una forma que se relaciona con la variacin espectral del CP#1, y describe el error en la determinacin del nmero de onda del equipo experimental. Esto se puede explicar de la siguiente manera: el CP#1 explica la mayor parte de la varianza de los datos y representa el espectro promedio que en este caso es el espectro del tefln y los CPs que le siguen representaran cambios a este espectro. Los corrimientos de bandas se representan en los CPs como formas tipo derivada (64), las cuales pueden ser consideradas como las diferencias espectrales entre las posiciones de las bandas observadas. Este caso se aplica a la forma espectral del CP#2 por lo 38

que correspondera a corrimientos en la longitud de onda en los datos originales que pueden relacionarse al error en la determinacin espectral de la longitud de onda. Analizando ms profundamente esta relacin, se obtuvo el ancho espectral definido como la distancia entre el mximo y el mnimo del CP # 2 alrededor de donde se localizan los picos espectrales del tefln. La Tabla 1 contiene los resultados de este clculo y muestra que la diferencia es de alrededor de 10 cm-1, que est cerca del valor nominal de la resolucin espectral de nuestro sistema experimental, de 8 cm-1. Lo que indica que el ACP nos da el error en la determinacin del nmero de onda del sistema sin conocimiento previo del mismo. Por otra parte, los resultados obtenidos para el eigenvalor del CP # 2 muestran que la cantidad de varianza descrita es de 0.02% de la varianza total. Pico# Pico (cm-1) Max (cm-1) Min (cm-1) Diferencia (cm-1) 1 285 280 290 10 2 380 375 385 10 3 728 724 733 9 4 1213 1207 1217 10 5 1297 1292 1303 11 6 1377 1372 1382 10
Tabla 1. Diferencia entre el mximo (Max) y mnimo (Min) de PC#2 alrededor de los picos asignados al tefln (columna Pico)

El anlisis de la evolucin del Eigenvector # 2 muestra un incremento continuo que se puede representar como funcin del tiempo para cada medicin (vase el grfico 3.5), esta dependencia puede ser ajustada a una funcin exponencial de la forma y = A1 * exp (-x/t) + y0 que da una constante temporal t=48.5 minutos. Esta constante se puede interpretar como el tiempo de calentamiento de nuestro equipo experimental. Los componentes principales # 3 y # 5 han aislado las contribuciones a la varianza de los datos de dos picos que aparecen de forma espuria en las

39

mediciones. Estos

dos componentes principales explican un 0.01% de la

varianza de los datos.

Figura 3.5. Evolucin del vector propio # 2.

Al utilizar ACP para aplicaciones espectroscpicas es interesante graficar la localizacin de los espectros en trminos de las puntuaciones de algunos CP dados. Despus de analizar los resultados de este procedimiento se encontr que graficando de las puntuaciones de los CP# 5 Vs. CP# 3 se observa que para los espectros # 9 y # 30 su localizacin es diferente a la del resto basndonos ene le principio de que espectro similares tendrn puntuaciones similares para determinados CP, podemos concluir que estos dos espectros (9 y 30) son diferentes del resto (vase la figura 3.6). Esto se debe a como mencionamos anteriormente a que estos espectros presentan picos espurios.

40

0.4 0.2
40 5 16 2 4 8 18 13 3 11 17 6 15 29 10 20 12 7 14 38 26 28 25 24 27 32 37 19 39 33 23 22 35 36 31 34 21 1

Coefficient PC #5

30

0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1 -1


9

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.2

0.4

Coefficient PC #3
Figura 3.6. Grafica de puntuaciones de los componetes principales CP#3 Vs CP#5

Dado que estos dos produjeron picos espurios en los datos originales, se opt por eliminar estos dos espectros y repetir el anlisis. El valor mnimo de la correlacin cruzada (0.997) fue mayor que para el conjunto de datos original. 3.3.2 Caracterizacin de las mediciones de la piel En las mediciones de la piel, un espectro con una intensidad inusual fue considerado como caso atpico y por su alta influencia en el anlisis fue removido. Se calcul la matriz de correlacin cruzada entre los espectros restantes y se obtuvo un valor mayor a 0.9997 para todas las mediciones. El ACP encontr 5 componentes principales que pueden ser considerados como independientes. Estos cinco componentes explican el 99.59% de la varianza total del conjunto de datos. La figura 3.7 muestra el peso relativo de cada componente principal, los principales componentes considerados como independientes estn separados por una lnea continua vertical.

41

Figura 3.8. Grfica semilogartmica de la importancia relativa de los eigenvalores de los principales componentes obtenidos a partir de la piel espectros Raman. La lnea vertical separa los principales componentes independientes

El anlisis de los vectores propios de la descomposicin PCA (figura 3.9) muestra que el vector propio # 1 es casi constante y tiene un valor de 0.160 0.014, que est cerca del valor de 0.1581 = de tefln.
0.6

obtenidos en las mediciones

0.4

0.2

-0.2

-0.4 1 2 3 4 5

-0.6

-0.8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839

Spectrum #

Figura 3.8 Anlisis de autovectores del conjunto de espectros Raman de piel.

La figura 3.9 muestra los componentes principales independientes extrados del ACP de la piel. 42

Skin

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

PC1

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

PC2

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

PC3

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

PC4

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

PC5

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

1500

1600

1700

1800

Wavenumber (cm-1) Figura 3.9 Espectro de la piel (arriba) y CP#1 extrado de los espectros Raman de piel (abajo).

43

El PC # 1 explica el 99.37% de la varianza de los datos, y est fuertemente relacionado con el espectro Raman promedio de la piel (25) (24) con un coeficiente de correlacin r = 0.998 (figura 3.9) 3.3.3 Caracterizacin de los algoritmos para la eliminacin de fluorescencia Comenzamos la comparacin entre los dos mtodos para extraer la fluorescencia de los espectros de la piel, obteniendo la matriz de correlacin de todos los espectros procesados por el mtodo 1 y por el mtodo 2 (Fig. 3.10). Para el mtodo 1, los valores de correlacin son superiores a 0.8 y en el caso del mtodo 2 superiores a 0.84. Este resultado sugiere que los espectros obtenidos por el mtodo 2 son ms uniformes. Esto se puede deber al hecho de que este mtodo introduce menos variaciones en el conjunto de espectros en comparacin con el mtodo 1. Las variaciones incluyen picos artificiales creados por el mismo mtodo de sustraccin de la fluorescencia.

Figura 3.10 Matriz de correlaciones de a) todos los espectros obtenidos por el mtodo 1 y b) los obtenidos por el mtodo 2.

44

El anlisis de los pesos relativos de los eigenvalores se muestra en la figura 3.11, en ambos casos, el primer componente explica la mayor parte de varianza: 87.25% (mtodo 1) y 90.94% (mtodo 2). En el mtodo 1 los dos primeros componentes principales son estadsticamente independientes (indicado por una lnea vertical).En el mtodo 2 los cuatro primeros son independientes (lnea vertical punteada). Los los datos. componentes independientes explican el 87.35% (mtodo 1) y el 93.94% (Mtodo 2) de la varianza total de

Figura 3.11 Grfica Semilogartmica del peso relativo de los valores propios de los componentes principales. Mtodo 1 (crculos negros) y el mtodo 2 (cuadrados grises).

Al analizar los eigenvectores (fig. 3.12), el CP # 1 obtenido de los espectros procesados por el mtodo 1 tiene un valor de 0.158 0.011. De forma similar, del anlisis de los vectores propios de los espectros procesados por el mtodo 2 se obtiene que el CP# 1 tiene un valor de 0.158 0.012. Ambos valores estn en torno al valor 0.1581 que correspondera a una contribucin constante, como se ha mencionado anteriormente.

45

Method 1
0.6 0.5 0.4 0.3

Method 2
0.5

1 2

0.4 0.3 0.2

1 2

0.2

0.1
0.1

0
0 -0.1 -0.2 -0.3

-0.1 -0.2 -0.3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Spectrum #

Spectrum #

Fig. 3.12 Anlisis de los autovectores obtenidos mediante el mtodo 1 (izquierda) y del mtodo 2 (derecha)

En la figura 3.13, los componentes independientes obtenidos del anlisis de los dos mtodos se grafican. En ambos casos el PC # 1 muestra las bandas Raman relacionadas al espectro de la piel(25). De la correlacin entre el PC # 1 obtenido del mtodo 1 y el PC#1 obtenido del mtodo 2 se obtiene un valor de coeficiente de correlacin de r = 0.97, mientras que la correlacin para los PC # 2 muestra un coeficiente de correlacin menor (r = 0.54).

Fig. 3.13 Componentes principales independientes extrados de los mtodos de eliminacin de la fluorescencia. Mtodo 1 (lnea negra) y el Mtodo 2 (lnea gris)

46

Luego, se realiz el anlisis de los coeficientes del ajuste polinomial para los dos mtodos. Se calcul el error relativo del ajuste polinomial. El clculo se llevo a cabo mediante la divisin de la desviacin estndar por la media (promedio). El resultado se representa en la M1 figura 3.14
M2
0.24 0.22 0.20 0.18

Relative error

0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 a b1 b2 b3 b4 b5

Polynomial coefficients
Fig. 3.14 El error relativo de los coeficientes del ajuste polinomial por dos mtodos para eliminar la fluorescencia. Mtodo 1 (crculos negros) y Mtodo 2 (cuadrados grises).

Estos resultados indican que el mtodo 1 contiene un error menor en relacin a los coeficientes del ajuste polinomial respecto al mtodo 2. Lo que se ha obtenido con este resultado es que el mtodo 1 ajusta mejor y esto tiene sentido, ya que es el mtodo para ajustar funciones por excelencia. El mtodo 2 es ms rebuscado y posiblemente sea ms sensible a diferencias locales del espectro. Sin embrago estos resultados aun no fueron los definitivos para decidir cual mtodo es mejor, por lo que hemos realizado otras maneras de comparar los dos mtodos. Otra manera ha sido mediante la reconstruccin del espectro original utilizando slo los componentes principales estadsticamente independientes, luego calculando la diferencia entre el espectro original y el reconstruido podemos ver cul de los dos mtodos reconstruyen mejor los espectros originales. La reconstruccin se realiz 47

usando el PC # 1 y PC # 2 para el mtodo 1 y PC#1, PC#2, PC#3, PC#4 para el mtodo 2. La figura 3.15 muestra la desviacin estndar de la diferencia entre el espectro original y el reconstruido para cada uno de los espectros. Los valores de desviacin estndar para el mtodo 2 son ms bajos en comparacin con los del mtodo 1, lo que indica un mejor rendimiento por parte del mtodo 2.

Figura 3.16. Valores de la desviacin estndar de la diferencia entre los espectros originales y reconstruidas. Mtodo 1 (crculos negros) y el mtodo 2 (cuadrados grises).

Finalmente, la tabla 2 compara resume los resultados de los pesos relativos obtenidos mediante el anlisis de componentes principales. De estos resultados podemos comparar tambin el desempeo de los mtodos para quitar fluorescencia, de la tabla podemos ver que el porcentaje asignado al ruido en el mtodo 2 es de 6.06% mientras que para el mtodo 1 el porcentaje asignado es mayor (11.76%). # CP Independientes 1, 2, 3, 4, 5, y 6 1, 2, 3, 4, y 5 1y2 Importancia relativa (%) de los CPs independientes (ordenados por #) 99.92, 0.02, 0.01, 0.01, 0.01, and 0.01 Total: 99.98 95.84, 3.90, 0.03, 0.02, and 0.01 Total: 99.80 87.25, and 1.03 48 % Ruido 0.02

Teflon

Piel Mtodo 1

0.20 11.72

(Ajuste polinomial) Mtodo 2 (Algoritmo de Vancouver)

1, 2, 3, y 4

Total: 88.28 90.94, 1.37, 0.84, and 0.79 Total: 93.94

6.06

Tabla 2 Pesos relativos de los CP

Basndonos en los resultados obtenidos de las comparaciones de los dos mtodos para eliminar fluorescencia, podemos decir el mtodo 2 a pesar de no ser el que hace el mejor ajuste, reconstruye mejor los datos originales y su contribucin al ruido es menor, por lo que en general su desempeo es mejor 3.4 Conclusiones Los espectros obtenidos para la muestra de tefln muestran una correlacin muy alta y el ACP obtuvo 6 componentes principales independientes. El PC # 1 est relacionado con el espectro promedio de tefln, el PC # 2 explica la variabilidad en la determinacin del nmero de onda, que se ajusta bastante bien con la resolucin nominal espectral del sistema. Adems, los componentes del eigenvector # 2 muestran una dependencia temporal que puede ser ajustada a una funcin exponencial produciendo una constante de tiempo. Esta constante de tiempo puede ser interpretada como el tiempo de calentamiento del dispositivo de medicin. Al analizar los componentes de los eigenvectores correspondientes a los componentes principales estadsticamente independientes, hemos identificado un par de espectros que pueden ser retirados de la serie original, ya que presentan picos espurios. En el caso de los espectros Raman de la piel, el ruido total incluye el ruido generado por el sistema, el ruido del procedimiento de medicin, y el efecto de la fluorescencia. En el anlisis de los mtodos para eliminar la fluorescencia, el porcentaje de varianza explicada asignados a los componentes principales que no son independientes es mayor en comparacin con los correspondientes a los espectros originales. Esto se debe a la contribucin de la fluorescencia en el 49

ruido total. Comparando los dos mtodos para eliminar la fluorescencia, el porcentaje de varianza explicada por los componentes independientes obtenidos del Mtodo 2 es mayor (93.94%) que el porcentaje explicado por los componentes independientes obtenidos del Mtodo 1 (87.35%). Esto se debe al porcentaje de varianza de los datos explicado por el primer componente principal, en el caso del Mtodo 2 el primero componente explica el 90.94% de la varianza de los datos, en comparacin con el 87.25% que explica el primer componente obtenido del Mtodo 1. Este primer componente principal puede servir como un parmetro de qu tan efectivo es el mtodo para eliminar la fluorescencia sin perder informacin de la seal Raman y evitando picos artificiales producidos por el mismo ajuste polinomial, los cuales contribuyen al ruido total. Por lo tanto, de los dos mtodos utilizados en este trabajo, el mtodo 2 (Algoritmo de Vancouver) puede ser considerado como la mejor opcin para eliminar fluorescencia en espectros Raman de piel humana.

50

CAPTULO 4: USO DE ESPECTROSCOPA RAMAN PARA LA DETECCIN DE FILAGRINA EN PACIENTES CON DERMATITIS ATPICA
4.1 Introduccin
La espectroscopa Raman puede proporcionar informacin bioqumica detallada que puede utilizarse para detectar las primeras etapas de algunas enfermedades. Como se demostr en la seccin 1.3 del primer captulo, una de las reas en la que la espectroscopa Raman ha mostrado gran potencial como herramienta en el diagnstico no invasivo es en la dermatologa. Esto debido al hecho de poder hacer mediciones de piel in vivo, evitando biopsias innecesarias. En este captulo, se muestra la aplicacin de espectroscopa Raman y anlisis de componentes principales en la deteccin temprana de Dermatitis Atpica (DA) relacionada a la FLG y como un posible marcador cuantitativo para mutaciones genticas de FLG. La filagrina (FLG) es una protena requerida para la formacin de la barrera del estrato corneo (SC) (65). Juega un importante papel en el mantenimiento de la funcin de barrera de la piel (66) y es esencial para la hidratacin del SC (67). La mutaciones en el gen de la FLG han sido reportadas como un factor importante de predisposicin a la dermatitis atpica (DA) y otros fenotipos atpicos secundarios como asma atpico, lo que sugiere que un defecto en la barrera de la piel es un evento primario en el desarrollo de la DA y fenotipos alrgicos relacionados(67). Kezic y colaboradores (65) usaron microespectroscopa Raman confocal para medir el factor de humectacin natural (NMF, por sus siglas en ingles) en funcin de la profundidad del SC, mostrando que individuos portadores de mutaciones FLG-nula tienen niveles bajos de NMF en el SC y perdidas transepidrmica de agua alta en comparacin a los no portadores; esto sugiere que la medicin de estos parmetros podran ser 51

usados como marcadores del estado del gen de la FLG como lo ha reportado Nemoto-Hasabe y colaboradores (66) En este artculo, usando inmunohistoquimica mostraron que mutaciones en el gen de la FLG resultan en prdida total o parcial de los pptidos proFLG/FLG. En nuestro trabajo, se ha detectado la presencia de la protena FLG en la piel usando espectroscopia Raman y Anlisis de Componentes Principales como un procedimiento de deteccin temprana de FLG relacionada a la DA y como un posible marcador de mutaciones en el gen de la FLG. La tcnica propuesta produce parmetros cuantitativos que de manera positiva identifican aquellos pacientes que desarrollaron DA, usando un procedimiento ptico no invasivo, y cuando ningn signo o sntoma de enfermedad era evidente. 4.2 Mtodos y Materiales

4.2.1 Pacientes En este estudio participaron doce pacientes sanos, nacidos sin complicaciones de madre sanas. Con consentimiento informado obtenido de las madres de todos los participantes y el estudio fue aprobado por el comit de tica del Hospital Dr. Ignacio Morones Prieto. Las mediciones Raman fueron realizadas en el muslo derecho de cada infante. Se realizaron a temperatura ambiente usando el espectrmetro modelo R3000 Raman Systems descrito en el captulo 1. Las mediciones se realizaron en el rango espectral de 200 a 1800cm-1 y el instrumento fue calibrado, previamente cada da ante de la ronda de mediciones, usando un estndar de Tefln. Los participantes fueron monitoreados durante un ao para observar si alguno de ellos desarrollara DA. El diagnostico dermatolgico de la DA se realizo de

52

acuerdo al criterio estndar en presencia de dermatitis crnica con la morfologa y distribucin tpica(68)(69). 4.2.2 mediciones Raman de la Filagrina La mediciones Raman incluyeron el espectro Raman in vitro de protena FLG humana recombinante (Genway Biotech Inc, San Diego, CA, USA) con el propsito de obtener un espectro de referencia que nos ayudara a determinar la cantidad de FLG en los espectros medidos. Se utiliz una cubeta de cuarzo y una potencia laser de 300 mW. La filagrina fue caracterizada previamente para conocer su peso molecular usando electroforesis en gel de poliacrilamidasds, esta tcnica es comnmente usada para el anlisis de protenas debido a que provee informacin sobre los pesos y las cargas de las mismas (70). La protena mostr una banda en 53KDa (figura 4.1), lo cual concuerda con lo especificado por el proveedor (71).

55 kDa 50 kDa

Fig. 4.1 Electroforesis en gel de la filagrina. La flecha indica la banda de la filagrina en 53 KDa.

53

4.2.3 Anlisis estadstico Se realizaron tres procedimientos estadsticos diferentes para el anlisis de los espectros Raman para obtener parmetros cuantitativos al problema. El primer anlisis consiste en calcular la correlacin coseno entre los espectros para determinar similitudes entre espectros y relacionarlos con hallazgos clnicos. Tambin se aplic ACP al conjunto de datos. El segundo anlisis consisti en analizar el contenido de FLG en cada espectro medido, mediante la reconstruccin del espectro medido usando solo los componentes principales relevantes a la FLG. Y el tercer mtodo consisti en construir una grfica bidimensional de los dos primeros componentes principales y comparar la localizacin del espectro de la FLG con la localizacin de los espectros medidos. Usando la matriz de la correlacin coseno, la relacin entre un conjunto de espectros puede ser obtenida (72); el elemento (i,j) de esta matriz cuantifica la similitud entre el espectro i con el espectro j. En este trabajo, es de inters determinar cmo est relacionado el espectro de la FLG con el de los pacientes; como una primera opcin, la matriz de correlacin coseno fue utilizada para encontrar estas similitudes. Sin embargo, existen otras tcnicas estadsticas, como ACP, que proveen un anlisis ms profundo de la estructura de la matriz varianza-covarianza entre espectros. Es importante mencionar que la matriz de correlacin coseno es una versin normalizada de la matriz de varianza-covarianza de los datos (72)(73). Como mencionamos en el captulo 2, los componentes principales estn dados en orden decreciente de importancia, lo que significa que el primer componente explica la mayor cantidad de varianza de los datos originales, el segundo explica ms varianza que el tercero y as sucesivamente. As que evaluando la importancia de los componentes principales consecutivos, es posible reducir la dimensionalidad de los datos usando un conjunto ms pequeo de espectros que explique una cantidad de varianza aceptable. Por otro lado, cuando avanzamos hacia el ltimo componente principal, estos componentes pueden ser agrupados y 54

formar procesos que son explicados por contribuciones del ruido (61)(74). Este agrupamiento es basado en un criterio estadstico que envuelve el nmero de puntos espectrales medidos y el nivel de confianza deseado para el agrupamiento de los componentes principales. Tomando en cuenta las propiedades de ACP, se ha desarrollado un mtodo para analizar espectros Raman; el mtodo consiste en incluir el espectro de la FLG con el conjunto de datos originales que contiene los espectros de los pacientes y analizar los resultados obtenidos utilizando ACP. Solo los primeros componentes principales se tomaron en cuenta y el resto fueron considerados como contribuciones del ruido. Despus, los componentes principales relacionados con la FLG fueron identificados. Un nuevo conjunto de espectros reconstruidos fue generado utilizando nicamente los componentes principales relacionados a la FLG y se compararon con los originales. La desviacin cuadrtica media entre los espectros originales y reconstruidos fue calculada para cada espectro para determinar la contribucin de los componentes principales relacionados a la filagrina a los espectros originales. Una desviacin cuadrtica media grande significa que esos espectros tendrn poca contribucin de la FLG, lo que podra indicar una FLG degradada o ausente. Al mismo tiempo, identificamos aquellos componentes principales que tienen poca contribucin al espectro de la FLG. Los coeficientes de estos componentes en los espectros de los pacientes fueron utilizados para localizar estos espectros con respecto al de la FLG. As podemos identificar aquellos espectros localizados lejos de la posicin de la FLG. Todo el anlisis matemtico se llevo a cabo usando el paquete computacional Matlab (The Mathworks Inc, Natick, Ma, USA). 4.3 Resultados De 12 infantes medidos y monitoreados, 3 desarrollaron DA en el transcurso de un ao. El anlisis estadstico se realiz utilizando los 12 espectros Raman 55

obtenidos de los 12 infantes y el espectro Raman de la FLG. Estos 13 espectros se midieron en el rango espectral de 300.17 a 1783.99 cm-1 con 1484 puntos. Por lo tanto, la matriz de datos usada en este anlisis es de dimensin 1484 x 13. Los espectros obtenidos fueron procesados para remover fluorescencia. La figura 4.2 muestra tres espectros: el correspondiente a la FLG (lnea slida negra), de un paciente que desarrollo DA (lnea de trazos gris) y la de otro que permaneci sano (lnea slida gris).

Fig. 4.2 Grfica de los tres espectros usados en este anlisis. La lnea solida negra corresponde al de la filagrina, la lnea a trazos gris es de un paciente que desarroll dermatitis atpica (paciente #1) y el espectro en gris corresponde a un paciente sano (paciente #4). espectros han sido preprocesados para eliminar fluorescencia. Estos

La figura 4.3(a) muestra el valor absoluto de la matriz de correlacin cruzada entre espectros. La localizacin de la FLG esta etiquetada como FLG. La figura 4.3 (b) muestra la correlacin de los espectros de los pacientes con el espectro de la FLG; los valores ms bajos de correlacin cruzada corresponden a pacientes que luego desarrollaron la enfermedad (pacientes #1, #9, #11 representados por crculos grises). Cabe sealar que otros pacientes (como el #4 y #7) tienen tambin valores bajos de correlacin coseno. De estas 56

grficas, se puede ver que la correlacin coseno puede identificar aquellos espectros que tienen un componente bajo de FLG, lo que indicara una mayor probabilidad de desarrollar DA.

Fig. 4.3 (a) Mapa en escala de grises de la Matriz de Correlacin-Cruzada de los espectros y (b) muestra la correlacin-cruzada del espectro de pacientes. La localizacin la filagrina (FLG) con los espectros de los (los pacientes que de la FLG esta etiquetada por FLG

desarrollaron dermatitis atpica se representan por crculos grises).

Con el fin de obtener un anlisis ms profundo de la influencia del espectro de la FLG sobre los espectros medidos, ACP fue aplicado al conjunto de datos, produciendo 13 eigenvalores, que se graficaron en la figura 4.4. Usando un criterio estadstico para agrupar los componentes principales(61) y encontramos que con un nivel de confianza de 99%, los primeros ocho componentes son estadsticamente independientes unos de otros, y despus del octavo componente hay una dependencia estadstica entre ellos que puede ser asociada al ruido(74). Los primeros ocho componentes explican el 57

99.84% de la varianza total de los datos; este lmite ha sido representado como una lnea vertical solida en la figura 4.4

Fig. 4.4 Grafica Semilogaritmica del peso relativo de los eigenvalores de los componentes principales. Despus del componente principal ocho, los componentes principales siguientes pueden ser combinados en procesos que pueden ser interpretados como ruido. La lnea punteada representa el lmite cuando consideramos la contribucin de la filagrina.

El criterio para seleccionar los componentes principales (est basado en conexiones internas que pueden ser establecidas debido a incertidumbres estadsticas relacionadas a la normalidad de los datos. Por lo tanto, algunos componentes principales (CP) no pueden ser tomados de manera individual debido a esas relaciones internas. Juntos, estos CP vinculados describen un proceso. Tpicamente estos procesos estn asociados al ruido. En nuestro anlisis, preferimos limitar el estudio a aquellos CP que pueden ser verdaderamente considerados como independientes. Debido a que estamos interesados principalmente en la contribucin de la FLG, nos enfocamos en las puntuaciones de los CP del espectro de la FLG (figura 4.5). Cada muestra tiene una puntuacin para cada CP, una puntuacin alta significa una contribucin alta de un determinado CP en una muestra.

58

Fig. 4.5 Puntuaciones de los CP del espectro de la filagrina. La lnea solida representa el lmite en el nmero de CP independientes despus de ser aplicado un criterio estadstico de discriminacin. La lnea punteada indica que hemos despreciado la contribucin los componentes principales #7 y #8.

Se puede observar que los primeros dos componentes principales contribuyen de una manera casi despreciable (baja puntuacin) al espectro de la FLG, y las mayores contribuciones (alta puntuacin) provienen de los componentes #3, #4, #5 y #6. Por lo tanto, con el fin de reducir la dimensin de los datos originales mientras se mantiene la informacin relacionada a la FLG, consideraremos hasta el componente #6. El criterio ha sido utilizado para despreciar aquellas contribuciones menores que provienen de componentes principales del #8 en adelante. Este lmite ha sido representado por una lnea de trazos en las figuras 4.4 y 4.5 La contribucin del espectro de la FLG en los espectros originales puede ser calculada primero mediante la reconstruccin de los datos originales usando solo aquellos componentes principales relevantes a la FLG. Esto significa que la reconstruccin se lleva a cabo seleccionando los componentes principales #3, #4, #5 y #6.

59

Fig. 4.6 Diferencia cuadrtica entre el espectro original y los representan aquellos pacientes que desarrollaron dermatitis atpica.

reconstruidos usando solo

aquellos componentes principales relevantes al espectro de la filagrina. Los crculos grises

Cabe mencionar que estos cuatro componentes principales explican solo el 5.83% de la varianza de los datos; de cualquier forma, su contribucin es relevante para analizar la cantidad de FLG en los espectros de los pacientes. Los espectros reconstruidos son comparados con los originales y la desviacin estndar de la diferencia es evaluada. La figura 4.6 muestra esta evaluacin para los 13 espectros. Observamos que el espectro de la FLG muestra la mnima desviacin estndar, como debera de ser debido a que hemos usado los componentes principales que ms contribuyen a la FLG. Al mismo tiempo, aquellos espectros que muestran una desviacin estndar grande son aquellos que tienen un componente bajo de FLG y que eventualmente desarrollaron DA (pacientes #1, #9, y #11). Esta identificacin se hizo con mejor especificidad que cuando se ha usado solo la correlacin cruzada entre espectros. Como una manera complementaria para checar la utilidad del mtodo de ACP, se evalu el comportamiento de los dos primeros componentes principales; estos dos componentes representan el 93.8% de la varianza total de los datos originales. Como se mencion anteriormente, los coeficientes del espectro de 60

la FLG para estos dos componentes principales son casi despreciables (ver fig. 4.5) Por lo tanto, podemos decir que estos dos componentes principales no estn relacionados al FLG y representan la falta de FLG en los espectros Raman. Los datos originales pueden ser representados como una grafica bidimensional teniendo como coordenadas el valor absoluto de los coeficientes de los espectros para los componentes primero y segundo (fig. 4.7).

Fig. 4.7 Localizacin de los espectros en el espacio de componentes principales usando solo el primero y segundo componentes principales. Los puntos grises representan aquellos pacientes que desarrollaron la enfermedad. El punto negro representa el espectro de la FLG.

Los puntos grises corresponden a aquellos infantes que desarrollaron DA; el resto de los pacientes estn agrupados alrededor de la localizacin del espectro de la FLG (representados por punto negro). Este resultado indica tambin que este tipo de enfoque identifica pacientes que desarrollaron la enfermedad.

61

4.4 Conclusiones Se ha reportado que mutaciones de prdida de funcin en el gen de la FLG causan ictiosis vulgaris, y son el mayor factor de predisposicin gentica para la DA (75). Estas mutaciones se han encontrado en porcentajes de un 15% a un 55% en pacientes con DA de origen europeo. Las 6 mutaciones ms prevalentes son la R501X, 2282del4, R2447X, S3247X, 3702delG, y Y2092X (76). Sin embargo, la deteccin de estas mutaciones por genotipado consiste en un procedimiento invasivo que requiere de un equipo costoso y que por lo general no est fcilmente disponible. Por otra parte, la espectroscopa Raman es un procedimiento no invasivo que puede proveer informacin acerca de la composicin molecular de la piel, apoyada con los anlisis de la matriz de la correlacin coseno entre espectros y el ACP es posible extraer informacin relevante y cuantitativa de los espectros Raman de piel de pacientes con AD. Primero, la matriz de correlacin cruzada fue calculada; esta matriz mostr que aquellos espectros que mostraron una correlacin coseno con el espectro de la FLG cercana a cero fueron los que correspondan a infantes que desarrollaron DA; Sin embrago, los espectros de sujetos que permanecieron sanos tambin resultaron en valores bajos de correlacin cruzada. La ventaja de usar el mtodo de correlacin coseno es que no se necesita una base de datos de espectros Raman. La correlacin entre espectros puede ser evaluada usando solo el espectro medido y el espectro Raman de la FLG. Un nuevo enfoque para mejorar la especificidad que involucra ACP se ha propuesto para identificar aquellos componentes principales relacionados al espectro de la FLG. Estos componentes principales seleccionados se usaron para reconstruir los espectros medidos y luego compararlos con los originales. La diferencia entre los reconstruidos y los originales representa la falta de FLG en los espectros. La comparacin de estos resultados con la evaluacin clnica un ao despus de las mediciones mostraron que estos sujetos con menos FLG 62

desarrollaron DA. La ventaja de usar este mtodo es que no depende fuertemente del conjunto de datos y fue til identificando a los sujetos que desarrollaron la enfermedad. Un tercer mtodo usado para analizar el contenido de FLG en los espectros Raman se llevo a cabo construyendo una grafica bidimensional con los dos primeros componentes principales, donde la FLG tena la menor contribucin al conjunto de datos. Usando esta grafica, los sujetos que luego desarrollaron la enfermedad fueron los que se alejaron del espectro de la FLG. De los resultados reportados arriba, se puede concluir que es posible determinar cules infantes son ms susceptibles a desarrollar DA tomando el espectro Raman de la piel, en el momento en el que todava no se ha desarrollado ningn sntoma o signo de enfermedad, y analizando el contenido de la protena FLG por cualquiera de las tres tcnicas de anlisis estadstico presentadas. Este enfoque cuantitativo puede ser usado como un procedimiento de deteccin temprana de DA relacionada a la filagrina y como un posible marcador de mutaciones en el gen de la FLG.

63

CAPTULO 5: ESTIMACIN NO INVASIVA DE DAO CRONOLGICO Y FOTOINDUCIDO EN PIEL UTILIZANDO ESPECTROSCOPA RAMAN Y ANLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES

5. 1 Introduccin
El envejecimiento de la piel puede atribuirse a factores endgenos y exgenos (77). Los factores endgenos incluyen el dao normal debido al paso del tiempo (envejecimiento cronolgico) y los factores exgenos incluyen los daos debido a la exposicin a la radiacin UV (fotoenvejecimiento), el tabaquismo y la exposicin a partculas en el aire(78) entre otros (77). Estos factores endgenos y exgenos que modifican la hidratacin y la estructura de las protenas en la piel dan como resultado alteraciones morfolgicas y mecnicas que se manifiestan en forma de arrugas, flacidez, prdida de elasticidad, o sequedad aparente (79). Los efectos de estos procesos endgenos y exgenos a menudo se superponen e incluyen cambios tanto en epidermis como en dermis. De resultados de estudios en piel humana y de animal, se sabe que existen importantes diferencias estructurales en la piel entre los dos tipos de envejecimiento (80). Histolgicamente, la piel envejecida cronolgicamente se caracteriza por aplanamiento de la unin dermoepidrmica, atrofia de la dermis, disminucin general en una variedad de poblaciones de clulas incluyendo melanocitos y clulas de Langerhans y reduccin en la microvasculatura drmica (81). La caracterstica histolgica ms importante de fotoenvejecimiento es la elastosis drmica la cual consiste en gran parte de estructuras elsticas amorfas espesas, enredadas, y granuladas, acompaadas por la degeneracin del colgeno (82). En este trabajo, el envejecimiento cronolgico y fotoinducido se estima de forma no 64

invasiva mediante la espectroscopia Raman y anlisis de componentes principales (ACP), los resultados fueron relacionados posteriormente con los hallazgos histolgicos.

5. 2 Mtodos y Materiales
5.2.1 Pacientes Este estudio incluy a veintin voluntarios adultos sanos, edades de 32-81 aos (media = 54.5 aos, SD = 13.4 aos), con fototipos de piel evaluados clnicamente que van desde I-V (4 voluntarios con fototipo I, 8 con fototipo II, 7 con fototipo III, 8 con fototipo IV y 2 con fototipo V). El fototipo se evalu clnicamente con la ayuda de un espectrofotmetro de reflectancia difusa(83). 5.2.2 Espectroscopa Raman Los espectros Raman se obtuvieron de la parte superior interna del brazo, a 5 cm por debajo de la axila, que fue considerada como una regin de la piel protegida del sol dado que la exposicin solar en esta parte es similar a la de las nalgas (84), esta regin fue utilizada para representar el envejecimiento cronolgico. Para la piel expuesta al sol, la regin de la mejilla derecha fue elegida, esta regin representa los efectos combinados del fotoenvejecimiento y el envejecimiento cronolgico. Todas las mediciones se hicieron en la misma regin para evitar la variabilidad debida a la ubicacin. Se realizaron mediciones Raman en las regiones expuestas al sol y las protegidas del sol, estas mediciones se realizaron a temperatura ambiente usando el espectrmetro Raman R3000 mencionado en el captulo 1 seccin 1.2 referente a la instrumentacin. Las mediciones se realizaron en el rango espectral de 200 a 1800 cm-1 y los espectros obtenidos fueron procesados con el fin de eliminar la fluorescencia. Para analizar los espectros Raman obtenidos, se utiliz Anlisis de Componentes Principales (ACP) descrito con detalle en el captulo 2. 65

5.2.3 Biopsias Tambin, se recogieron biopsias de tres milmetros de la piel de la mejilla derecha (piel expuesta al sol) de todos los voluntarios. Todos los voluntarios fueron perfectamente informados acerca del propsito del estudio, as como de los mtodos y protocolos utilizados. Se obtuvo consentimiento informado de todos los voluntarios y el estudio fue aprobado por el comit de tica del Hospital "Dr. Ignacio Morones Prieto". Todas las biopsias fueron examinadas al final del estudio para minimizar la variabilidad debido al investigador y al procesamiento. Las muestras de tejido fueron fijadas en formalina neutra al 10%, y fueron procesadas para sus cortes en parafina. Secciones de cuatro micras se tieron con hematoxilina y eosina, Verhoeff-van Gieson (Figura 5.1 (a)) y Masson Trichrome (Figura 5.1 (b)). Se realiz el procesamiento de imgenes de la microfotografa digital de las biopsias teidas con el fin de obtener el porcentaje de fibras elsticas y de colgeno afectadas, este procedimiento consiste en calcular el rea teida sobre la imagen y dividindolo por el rea de todo el tejido, el procesamiento de imgenes se realiz utilizando las capacidades de procesamiento de imgenes de Mathematica (Wolfram Research Inc, Champaign, IL).

Figura 5.1. Micrografas biopsia teidas con (a) Verhoeff-van Gieson para fibras elsticas y (b) Masson Trichrome para las fibras de colgeno.

66

5. 3 Resultados
Se realiz Anlisis de Componentes Principales en los espectros Raman obtenidos de piel expuesta al sol y de protegida del sol. Se obtuvieron 19 valores propios representados en la figura 5.2. Mediante el uso de un criterio estadstico para agrupar los componentes principales (61) encontramos que, con un nivel de confianza del 99%, los primeros 5 componentes son estadsticamente independientes unos de otros y despus del sexto hay una dependencia estadstica entre los componentes que se puede asociar al ruido(61). Los primeros 5 componentes principales explican el 99.62% de la varianza total de los datos, este lmite se ha representado en la figura 5.2 como una lnea vertical continua.

Figura 5.2. Grfica Semilogartmica de los pesos relativos de los valores propios de los componentes principales. Los primeros cinco componentes principales pueden considerarse estadsticamente independientes. El resto estn relacionados entre s y pueden ser interpretados como ruido.

Los cinco componentes principales estadsticamente independientes extrados de las mediciones Raman para la piel expuesta al sol y protegida del sol se correlacionaron con la edad de los voluntarios y el porcentaje de fibras de 67

colgeno y fibras elsticas, obtenidas de las biopsias. La Figura 5.3 muestra la relacin entre el primer componente principal y la edad de los voluntarios de la piel protegida del sol (Fig. 5.3 (a)) y la piel expuesta al sol (Fig. 5.3 (b)). De la figura 5.3 se puede observar que existe una relacin (p= 0.06) entre el primer componente principal de los espectros Raman tomados de la piel protegida del sol y la edad de los voluntarios, mientras que los espectros Raman tomados de la piel expuesta al sol no se relacionan con la edad de los voluntarios (p = 0.23). Esto indica que la informacin sobre el envejecimiento cronolgico se puede obtener del primer componente principal de los espectros Raman de la piel protegida del sol, mientras que en la piel expuesta al sol el efecto del envejecimiento fotoinducido es dominante y opaca la contribucin del envejecimiento cronolgico.

Figura 5.3. Primer componente principal (CP1) en funcin de la edad de los voluntarios para (a) la piel protegida del sol y (b) la piel expuesta al sol

La Figura 5.4 muestra la relacin entre el segundo componente principal y el porcentaje de fibras elsticas, obtenidas de biopsias de los voluntarios para la piel protegida del sol (Fig. 5.4 (a)) y la piel expuesta al sol (Fig. 5.4 (b)). Los resultados de la figura 5.4 muestran una relacin (p=0.03) entre el segundo componente principal de los espectros Raman de la piel expuesta al sol y el porcentaje de fibras elsticas en las biopsias, mientras que no se observa ninguna relacin en la piel protegida de sol (p=0.47). 68

Figura 5.4. El segundo componente principal en funcin del porcentaje de fibras elsticas, obtenidas de biopsias de los voluntarios para (a) de la piel protegida del sol y (b) la piel expuesta al sol.

La figura 5.5 muestra la relacin entre el cuarto componente principal y el porcentaje de fibras de colgeno, obtenidas de biopsias de los voluntarios para la piel protegida del sol (Fig. 5.5 (a)) y la piel expuesta al sol (Fig. 5.5 (b)). Estos resultados tambin muestran una relacin (p=0.05) entre la cantidad de fibras de colgeno en las biopsias y los espectros Raman obtenidos de la piel expuesta al sol. No se encontr relacin con los espectros Raman obtenidos de la piel protegida el sol (p=0.72).

Figura 5.5 Cuarto componente principal en funcin del porcentaje de fibras de colgeno, obtenidas de biopsias de los voluntarios para (a) la piel protegida del sol y (b) la expuesta al sol.

69

Cabe sealar que no se observ una relacin entre los

componentes

principales tercero y quinto con alguno de los hallazgos clnicos e histolgicos.

5.4 Conclusiones
En este trabajo se ha encontrado una relacin significativa entre las propiedades histolgicas de la piel fotoenvejecida y los espectros Raman de la piel expuesta al sol y protegida del sol. Los resultados muestran que el primer componente principal (CP1) obtenido a partir de los espectros Raman de la piel protegida del sol est relacionado con la edad del sujeto, y puede ser tomado como una medida del envejecimiento cronolgico. Los componentes principales segundo (CP2) y cuarto (CP4) obtenidos a partir de Espectros Raman de la piel expuesta al sol, se relacionan con la cantidad de elastosis solar y el colgeno, respectivamente. A pesar de que hay una relacin significativa entre los espectros Raman de la piel expuesta al sol y los hallazgos histolgicos y los espectros Raman de la piel protegida del sol y la edad de los voluntarios, estas relaciones tienen valores bajos de coeficiente de correlacin (r <0.6). Por lo tanto, un mejor modelo deber ser desarrollado, incluyendo una combinacin de los componentes principales obtenidos a partir de los espectros Raman para aumentar el coeficiente de correlacin y obtener una evaluacin no invasiva del envejecimiento con resultados ms cercanos a los obtenidos de las biopsias.

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CAPTULO 6: LA ESPECTROSCOPA RAMAN EN EL DIAGNSTICO EX VIVO DE FIBROSIS HEPTICA


6. 1 Introduccin La fibrosis heptica es una patologa cuya principal caracterstica es la acumulacin desordenada de protenas de la matriz extracelular (MEC), una caracterstica en la mayora de las enfermedades crnicas de hgado(85). Las principales causas de la fibrosis heptica en los pases industrializados son los virus de la hepatitis B y C, el abuso de alcohol, frmacos, ciertas drogas y la enfermedad biliar crnica. La acumulacin de protenas de la MEC disminuye las funciones del hgado, con prdida de la arquitectura normal y la formacin de ndulos de regeneracin. Si no se trata, la fibrosis puede progresar a cirrosis, una fase terminal consecuencia de la fibrosis, que en ltima instancia conduce a insuficiencia heptica y posible muerte(86). Aun en la etapa de fibrosis heptica avanzada, la enfermedad es potencialmente reversible, como se ha demostrado en la dcada de 1990(86). Debido a esto, las compaas biofarmacuticas y los investigadores estn cada vez ms interesados en desarrollar programas antifibrticos y ensayos clnicos estn en curso actualmente. Como es sabido, la terapia ms efectiva para el tratamiento de la fibrosis heptica hasta la fecha aun depende del tratamiento mdico(87). Medicamentos como por ejemplo, los antioxidantes y bloqueadores del sistema renina-angiotensina, son capaces de reducir la acumulacin de tejido cicatricial en los modelos experimentales de lesin heptica crnicas, aunque su eficacia no ha sido probada en seres humanos. La falta de ensayos clnicos se debe al que se requieren de estudios de seguimiento a largo plazo el hecho de que la biopsia heptica, un procedimiento invasivo, sigue siendo el mtodo de "estndar de oro" para el diagnostico histolgico de la fibrosis heptica (88).

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En este sentido, el desarrollo de una tcnica fiable, sencilla y no destructiva para evaluar rpidamente la fibrosis heptica facilitara los ensayos clnicos. 6.1.1 Mtodos de diagnstico actuales para fibrosis heptica La biopsia heptica se considera el mtodo estndar de oro para la evaluacin de la fibrosis heptica (89). El examen histolgico es til en la identificacin de la causa subyacente de la enfermedad heptica y el estadio de fibrosis. La etapa de fibrosis se evala mediante el uso de escalas como Metavir (estadios I-IV) y La puntuacin de Ishak (estadios I-V). El marcaje especfico de protenas de matriz extracelular (por ejemplo, con rojo Sirio) se puede utilizar para cuantificar el grado de fibrosis, mediante el anlisis morfomtrico guiado por computadora. La Biopsia de hgado es un procedimiento invasivo, presentndose dolor y complicaciones graves en el 40% y el 0,5% de los pacientes, respectivamente (90). Errores de muestreo pueden ocurrir, especialmente cuando se analizan las biopsias pequeas. El examen histolgico es propenso a variaciones entre observadores y no predice el progreso de la enfermedad (91). Por lo tanto, hay una necesidad de mtodos fiables, sencillos y no invasivos para evaluar la fibrosis heptica. Se han propuesto pruebas de laboratorio tales como el recuento de plaquetas, los niveles de aminotransferasas sricas, niveles de tiempo de protrombina y protenas de fase aguda (92)(93). La fibrosis heptica puede ser estimada tambin por tcnicas de imagen. La ecografa, la tomografa computarizada y resonancia magntica pueden detectar cambios en el hgado debido a la fibrosis (94). La ecografa es una tcnica atractiva debido a su bajo costo. Es capaz de detectar la cirrosis heptica basndose en los cambios en la ecogenicidad del hgado, as como en los signos de la hipertensin portal. Sin embargo, la ecografa es muy dependiente del operador y el aumento en la ecogenicidad heptica no diferencia de manera fiable la esteatosis heptica de la fibrosis. Actualmente se encuentran en desarrollo otra tcnica para evitar la biopsia heptica que 72

analiza perfiles de protenas en sangre utilizando tecnologa glicmica, que se basa en un secuenciador de ADN capaz de generar los perfiles de protenas sricas N-glicanos (95). Una vez validada la nueva tecnologa, el diagnstico no invasivo de enfermedad del hgado puede convertirse en una prctica clnica habitual. Cabe mencionar que la mayora de estos mtodos son invasivos y requieren complejas etapas de preparacin, como la fijacin de clulas, las manchas, las extracciones de protenas, etc. Por lo tanto es necesario desarrollar una tcnica adecuada, rpida y no invasiva para la deteccin de fibrosis. 6.1.2 Antecedentes de la Espectroscopia Raman en tejido de hgado A la fecha, son pocas las aplicaciones de espectroscopa Raman en hepatologa. Hawi y colaboradores (96) usaron microespectroscopa Raman para caracterizar hepatocitos normales y malignos en clulas cultivadas y tejidos de hgado humano. Fueron observados cambios espectrales, incluido el aumento de intensidad en 1040 y 1083 cm-1 en tejido cirrtico y canceroso. Observaron tambin que el tejido normal de hgado difiere del tumor maligno como del tejido cirrtico en los 1182 cm-1. El incremento en la intensidad de banda 1182 cm-1 puede estar relacionado con un incremento en la fetoprotena, la cual est relacionada con hepatoma. La banda 1040 cm-1 est asociada a la fenilalanina y finalmente el incremento en intensidad Raman de la banda 1083 cm-1 indica un aumento en la concentracin de ADN en tejido canceroso. Por su parte, Li y colaboradores analizaron las diferencias entre los espectros Raman del suero de personas normales y de pacientes con enfermedades de hgado (97). Los resultados de ms de doscientas mediciones mostraron que el diagnstico del espectro concuerda con el del resultado clnico. Shen y colaboradores, estudiaron la viabilidad de un novedoso y eficaz mtodo de diagnstico para la fibrosis heptica mediante 73

espectroscopia Raman Confocal (98). Usando esta tcnica pudieron observar los cambios bioqumicos presentes durante la activacin de las clulas hepticas estelares, as como la prdida de retinoide, el aumento de protena helicoidal, y el aumento de la produccin de matriz extracelular. Adems, desarrollaron un sistema para clasificar a los espectros Raman de los tejidos con lesin heptica con una precisin de 90%. Maternity y colaboradores utilizaron por primera vez espectroscopa Raman para evaluar el efecto del indol-3-carbinol (I3C) en lesin heptica ex vivo (99). Del anlisis de los espectros Raman de secciones de tejido, obtuvieron espectros diferentes que fueron tiles para distinguir lesin de hgado por alcohol y fibrosis heptica inducida por etanol, del estado normal. Haciendo anlisis de picos Raman y Anlisis de Componentes Principales pudieron clasificar los tejidos de hgado con diferentes patologas. Los resultados sugieren que la espectroscopa Raman es un mtodo rpido y fiable para la caracterizacin del tejido heptico. Futuras investigaciones sobre el origen de los cambios espectrales observados proporcionarn informacin sobre los mecanismos subyacentes de la enfermedad. De igual forma, los resultados demuestran el potencial de la espectroscopa Raman en el diagnstico clnico de enfermedades de hgado. Para la presente investigacin, la espectroscopa Raman y el Anlisis de Componentes Principales (ACP) y autofluorescencia del infrarrojo cercano (autofluorescencia NIR) fueron utilizados para diferenciar entre espectros de tejido hgado de rata normal y tejido afectado por fibrosis. Los resultados obtenidos sern validados mediante las tcnicas estndares y as evaluar el desempeo de Raman en el diagnstico de la fibrosis heptica.

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6.2 Mtodos y Materiales Para esta investigacin se usaron 60 Ratas Wistar. Divididas en grupos Control, Sham y Fibrosis. Para inducir la fibrosis heptica, al grupo Fibrosis se les inyect CCl4 intraperitoneal (I.P.) con una dosis 0.2 ml/ 100 g de peso disuelto en aceite de oliva en una proporcin 1:1 dos veces por semanaCCl4 disuelto en aceite de oliva. El grupo Sham fue inyectado con nicamente aceite de oliva. Y el grupo Control no fue alterado en ninguna forma. 18 ratas fueron sacrificadas la primer semana, 18 ratas despus de un mes y 24 ratas a los 4 meses. De esta manera se midieron ratas con diferentes grados de fibrosis: de leve a grave o incluso con cirrosis. Despus de cada sacrificio se extrajo el hgado a cada rata y una seccin del hgado fue utilizada para medir con espectroscopa Raman. Para las mediciones Raman, se utiliz el espectrmetro Raman R3000 descrito anteriormente en esta Tesis. Las mediciones se realizaron en diferentes puntos de la muestra y los espectros obtenidos fueron promediados. El espectro fue adquirido en la regin de 200 a 1800cm-1. El espectro fue procesado para remover fluorescencia. Un polinomio de quinto grado es el ptimo para modelar la fluorescencia como se demostr en el captulo 3. Este polinomio, que representa la autofluorescencia NIR, es restado al espectro adquirido, para obtener el espectro Raman final. Para el anlisis estadstico se utilizaron el conjunto de espectros Raman sin fluorescencia y los espectros de autofluorescencia NIR. Est reportado que el uso de la espectroscopa Raman en combinacin con la autofluorescencia NIR es una buena alternativa para diferenciar entre tejido normal y tejido enfermo (100). Para el anlisis estadstico se utilizaron dos enfoques: el primero fue aplicar Anlisis de Componentes Principales (ACP) al conjunto de espectros Raman y el segundo fue calcular la intensidad de los espectros de autofluorescencia 75

NIR. Para ACP se utilizo el rango espectral de 800 a 1800cm-1. Todo el anlisis se realiz utilizando The Unscrambler 9.8 (CAMO Software., Oslo, Noruega) y Origin 8 (OriginLab Corp., Northampton, MA) 6.3 Resultados Para ilustrar como los compontes principales permiten diferenciar entre espectros de tejido normal y fibrosis, en la figura 6.1 se muestra la grafica del componente principal 1 (CP1) Vs componente principal 2 (CP2) obtenidos del anlisis de las mediciones Raman realizadas la primer semana donde 6 ratas presentan fibrosis leve. Estos dos componentes explican el 76% de la varianza total de los datos. En la figura 1 se observa que el CP1 es til para diferenciar al tejido con fibrosis. Los espectros del grupo Fibrosis (tejido con fibrosis leve) tienen valores ms positivos de CP1 respecto a los grupos control y Sham (tejido normal). Los espectros de estos grupos (C y S) se encuentran mas cercanos entre si. En la figura 6.2 se grafica la puntuacin para el CP1.

Figura 6.1 Grfica de CP1 Vs CP2. Espectros de grupo Control (C), Sham (S) y Fibrosis (F).

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PC1 SCORE

C
y Fibrosis (F).

Figura 6.2. Grfica de la puntuacion de CP1 para los espectros del grupo Control (C), Sham (S)

En las mediciones finales, del grupo fibrosis 5 presentaron fibrosis grave y 3 cirrosis. En la figura 6.3 se han graficado los CP1 y CP2. Juntos explican el 94% de la varianza. Nuevamente el grupo de fibrosis se localiza hacia valores mas posistivos de CP1, pero podemos observar que tres espectros de este grupo se alejan de los dems, y estos son los que presentaron cirrosis. . En la figura 6.4 se grafica la puntuacin para el CP1.

Figura 6.3 Grfica de CP1 Vs CP2. Espectros de grupo Control (C), Sham (S) y Fibrosis (F). Los tres espectros que se alejan del resto de los espectros fueron diagnosticados como cirrticos.

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PC1 SCORE
C
Fibrosis (F)Y Cirrosis (X).

Figura 6.4 Grfica de la puntuacion de CP1 para los espectros del grupo Control (C), Sham (S)

Los resultados indican que ACP es til para identificar tejidos de hgado con fibrosis y con cirrosis. Otra manera de diferenciar entre los diferentes grupos, fue calculando la

intensidad de los espectros de autofluorescencia NIR para cada uno de los grupos. En la figura 6.5 se muestran los valores de la media y desviacin estndar de la intensidad de la autofluorescencia NIR para los grupos Control, Sham y Fibrosis de las mediciones de la primer semana.

NIR-AF INTENSITY

C
(S) y Fibrosis (F).

FIG. 6.5 Intensidades de autofluorescencia NIR para los diferentes grupos: Control (C), Sham

78

Observamos una intensidad de autofluorescencia NIR mayor en tejido con Fibrosis que en tejido normal (Control y Sham). Est reportado que diversos fluorforos en el tejido como el colgeno (100), la melanina(101) y porfirinas (102) y muestran autofluorescencia NIR. Se sabe que la fibrosis se caracteriza por una excesiva acumulacin de protenas de la MEC, en la cual el colgeno est incluido principalmente(103). Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que el aumento en la intensidad de la autofluorescencia NIR en el tejido con Fibrosis se debe al incremento en la cantidad de colgeno caracterstico de esta enfermedad. De manera similar, en la figura 6.6, se muestran los valores de la intensidad de la autofluorescencia NIR (media y desviacin estndar) para las mediciones finales, en estas mediciones 5 presentaron fibrosis grave y 3 cirrosis. Los resultados permiten identificar al tejido con fibrosis (F) y al tejido con cirrosis (indicado por una X).

NIR-AF INTENSITY

C
(S), Fibrosis (F) y Cirrosis (X)

FIG. 6.6 Intensidades de autofluorescencia NIR para los diferentes grupos: Control (C), Sham

Como mencionamos anteriormente, el aumento en la intensidad de la autofluorescencia NIR esta asicado al incremento en la cantidad de colgeno. 79

En el tejido con cirrosis hay una cantidad mayor de colgeno, por lo que este exhibe una normal. 6.4 Conclusiones Los resultados de este estudio mostraron que utilizando la espectroscopa Raman es posible identificar diferencias entre tejido de hgado normal y con fibrosis. Utilizando Anlisis de Componentes Principales se ha podido identificar de manera grfica, observando los valores del primer componente principal, a los espectros de tejido fibrtico (en la primera medicin Raman) y a los espectros de tejido fibrtico y cirrtico (en la tercera medicin Raman). Adicionalmente, calculando la intensidad de los espectros de autofluorescencia NIR se ha podido identificar tambin a los espectros de tejido fibrtico y cirrtico. Estos mostraron mayor intensidad en autofluorescencia NIR debido al incremento en la cantidad de colgeno en el tejido. As, hemos demostrado que la espectroscopa Raman en combinacin con ACP y Autofluorescencia NIR tiene una gran potencial como mtodo rpido para la deteccin de fibrosis heptica. mayor autofluorescencia NIR mucho mayor respecto al tejido

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CAPTULO 7: CONCLUSIONES
En esta tesis doctoral, hemos demostrado que es posible utilizar la espectroscopa Raman para la diferenciacin de tejido sano y enfermo. La espectroscopa Raman ha permitido la deteccin temprana de dermatitis atpica, estimar el dao cronolgico y fotoinducido en piel, as como la deteccin de fibrosis en tejidos de hgado. Hemos aplicado una tcnica de estadstica multivariante, el Anlisis de Componentes Principales (ACP), para el diagnstico de enfermedades en tejido en lugar de utilizar el mtodo emprico que emplea la intensidad mxima de las bandas Raman, y la desventaja de este ltimo es que solo seleccionamos algunas bandas. A diferencia de este mtodo, con ACP podemos utilizar todo el espectro Raman adquirido o enfocarnos en la regin donde se encuentran las molculas de inters, evitando perdida de informacin como cuando se seleccin algunas bandas. Por ejemplo en los espectros Raman de la piel la mayora de la seal Raman se produce en la regin de 800 a 1800 cm-1, pero en otros casos no sabemos que regin pueda contener informacin relevante por lo que podemos tomar todo el espectro adquirido. El ACP sin tener un conocimiento previo, ha permitido encontrar relaciones entre los espectros Raman con parmetros como el ruido, el calentamiento, y la resolucin espectral de sistema. Tambin ha permitido encontrar relaciones con la histopatologa de los tejidos. Una desventaja del uso de ACP es que esta tcnica depende de la base de datos, otra desventaja es que si los espectros Raman son tomados de forma errnea o en diferentes condiciones a las establecidas en el experimento, estos espectros pudieran ser detectados como tejido con alguna patologa, a pesar de no tenerla. En este sentido, hemos investigado el uso de otros enfoques como la correlacin entre espectros y la autofluorescencia NIR. La correlacin de entre espectros no depende de una base de espectros y es una tcnica establecida para bsquedas en libreras de espectros Raman. La autofluorescencia NIR ha sido utilizada como complemento a la espectroscopa Raman, debido al hecho de 81

que la mayora de las muestras biolgicas presentan Autofluorescencia en la regin del infrarrojo cercano. El objetivo principal de esta tesis fue evaluar la espectroscopa Raman como mtodo en el diagnostico mdico, este proceso involucr varias etapas como la obtencin de los espectros de tejido, el anlisis de ruido en las mediciones, y la correlacin de los resultados con los hallazgos clnicos. Debido a lo complejo de los espectros Raman de tejido, el uso de ACP fue fundamental en estas etapas. En el primer estudio realizamos la caracterizacin de ruido en las mediciones Raman y el ACP permiti encontrar el error en la determinacin del nmero de onda del sistema y el tiempo de calentamiento del dispositivo de medicin. En el anlisis de los mtodos para eliminar la fluorescencia, encontramos que el mtodo de Vancouver puede ser considerado como mejor opcin para eliminar fluorescencia en espectros Raman de piel humana, de los dos mtodos estudiados. Esto se obtuvo en parte observando los resultados del porcentaje de varianza explicada por los componentes independientes y en parte por los resultados de la reconstruccin de los espectros originales. De estos resultados se obtuvo que el algoritmo de Vancouver reconstruye mejor los datos originales y que el primer componente explica un porcentaje mayor de la varianza de los datos, en comparacin con el primer componente obtenido usando ajuste polinomial. En base a estos resultados pudimos concluir que el Algoritmo de Vancouver es ms efectivo para eliminar fluorescencia sin perder informacin de la seal Raman y a la vez evitando la produccin de picos artificiales que contribuyen al ruido total. Debido a esto, el algoritmo de Vancouver fue utilizado en todas nuestras investigaciones. En el segundo captulo pudimos detectar a pacientes que son ms susceptibles a desarrollar Dermatitis Atpica (DA), utilizando como referencia el espectro de la protena Filagrina (FLG) y tomando el espectro Raman de la piel en el momento en el que todava no se ha desarrollado ningn sntoma o signo de enfermedad, este enfoque puede ser utilizado 82 como un procedimiento de

deteccin temprana de DA relacionada a la filagrina y como un posible marcador de mutaciones en el gen de la FLG. En el tercer estudio incluido en esta tesis, se encontr una relacin significativa entre las propiedades histolgicas de la piel fotoenvejecida y los espectros Raman de la piel expuesta al sol y protegida del sol. Se obtuvo una relacin significativa entre los diferentes componentes principales y la edad del sujeto, cantidad de elastosis solar y el colgeno. A pesar de que hay una relacin significativa entre los componentes principales de los espectros, estas relaciones tienen valores bajos de coeficiente de correlacin (r <0.6). Por lo que se deber desarrollar un mejor modelo del cual se obtengan resultados ms cercanos a los obtenidos de las biopsias. Finalmente, detectamos fibrosis heptica usando ACP y a los espectros de tejido fibrtico (en la autofluorescencia NIR. Observando las puntuaciones del primer componente principal se ha podido identificar primera medicin Raman) y a los espectros de tejido fibrtico y cirrtico (en la tercera medicin Raman). Adicionalmente, calculando la intensidad de los espectros de autofluorescencia NIR se ha podido identificar tambin a los espectros de tejido fibrtico y cirrtico. Estos mostraron mayor intensidad en autofluorescencia NIR debido al incremento en la cantidad de colgeno en el tejido. La investigacin contenida en esta tesis demuestra que la espectroscopa

Raman, junto con el Anlisis de Componentes Principales, tiene el potencial para la deteccin de enfermedades y pueden ser utilizadas como una herramienta en el diagnstico mdico de tejido biolgico.

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CAPTULO 8: TRABAJO A FUTURO


Como demostramos, se han obtenido espectros Raman in vivo en piel de

manera exitosa y seguramente seguirn siendo reportadas ms aplicaciones clnicas, y para su futura implementacin clnica estas debern ser acompaadas de una validacin en el algoritmo de diagnstico. Los experimentos presentados en esta tesis demuestran que la espectroscopa Raman puede ser utilizada in vivo en el diagnstico de enfermedades en tejido, es importante que las aplicaciones sean in vivo, para evitar en lo posible los mtodos invasivos como las biopsias, que siguen siendo el estndar de oro en el diagnstico de tejido. Es importante tambin realizar nmero mayor de pacientes para darle mayor investigaciones. estudios con un a nuestras validez

Adems del Anlisis de componentes principales, podemos

debemos considerar tambin combinar Raman y la autofluorescencia NIR, dado que los resultados sugieren que estas dos tcnicas proveen informacin relevante para la deteccin de tejido enfermo y podrn ser utilizadas para el anlisis de los espectros Raman. En una situacin clnica, a menudo existe la necesidad de determinar el tipo de tejidos en ms de dos grupos como los diversos grados de la enfermedad. Sin embargo, en esta tesis slo se ha clasificado como tejido normal y tejido con lesiones. Para poder clasificar el tejido segn el grado de lesin ser necesario evaluar diferentes algoritmos de diagnstico. Los resultados sugieren que la espectroscopa Raman puede ofrecer

informacin de diagnstico de manera rpida y mnimamente invasiva. El desarrollo de algoritmos basados en la composicin bioqumica y/o estructura del tejido permitirn un diagnstico clnico ms objetivo y que dependa menos de la experiencia del mdico. Para la aceptacin clnica varias preguntas deben ser contestadas como la exactitud en el diagnstico, la informacin de diagnstico obtenida, y si esta tcnica puede llegar a reemplazar a la biopsia 84

actual. Estas tesis contiene investigaciones que van dirigidas hacia la futura implementacin clnica de la espectroscopa Raman, es un meta que solo podr ser alcanzada mediante una estrecha colaboracin entre espectroscopistas y mdicos. Tambin un elemento importante ser que la informacin clnica derivada del los espectros est disponible para el mdico en tiempo real. Para esto ser necesario desarrollar un algoritmo que lleve a cabo todo el pretratamiento y anlisis de la seal inmediatamente despus de la medicin, para que este resultado pueda ser usado para un diagnostico rpido o como gua durante una intervencin quirrgica. La espectroscopa Raman tiene mucho potencial para proveer a la comunidad mdica con una nueva herramienta de diagnstico rpida, no invasiva y que proporcione informacin til sobre el estado del tejido.

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APNDICE: CDIGO DE MATLAB PARA OBTENER ACP % Analizador de espectros Raman % Cargar datos clear all close all load filaggrin numespectros=size(Matrix,1); nlambdas=size(Matrix,2); for jj=1:nlambdas; kondas(jj)=str2num(VarLabels(jj,:)); end for jj=1: numespectros espectros(jj,:)=Matrix(jj,:); end nkondas=length(kondas); % Anlisis PCA [v,pc,l,d]=princomp(espectros'); pesos=l./sum(l); mapcaplot(espectros);

%Figura Matriz Espectros 90

figure('Name','Spectra','NumberTitle','on') imagesc(kondas,1:numespectros,espectros) % Grfica Conjunto de espectros figure('Name','Raman Spectra','NumberTitle','on') plot(kondas,Matrix) %Agrupamiento procesos niveldeconfianza=0.99; grupos=clasifica(l,nkondas,niveldeconfianza); %C-Correlacin s=cov(espectros'); scorr=corrcoef(espectros'); %Figura Matriz C-Correlacin figure('Name','CCorrelation Matrix','NumberTitle','on') imagesc(abs(scorr))

% Figura correlacin Standard Vs Spectra# figure('Name','C-Correlation','NumberTitle','on') plot([1:numespec],abs(scorr([1],1:numespec)),'og','MarkerSize',16); xlabel('#','FontSize',16') ylabel('CorrCoeff (absolute value)','FontSize',16) set(gca,'FontSize',12,'YGrid','on','XGrid','off') 91

set(gca,'XTick',[1:numespec]) %Pesos Relativos CPs figure('Name','Relative Weight PCs','NumberTitle','on') pesos=l./sum(l); semilogy([1:numespec],pesos(1:numespec),'o','MarkerSize',14,'MarkerFaceColo r','w',... 'MarkerEdgeColor','k'); xlabel('PC #','FontSize',16') ylabel('Relative Weight (Log scale)','FontSize',16) set(gca,'FontSize',12,'YGrid','on','XGrid','off') %Variabilidad Regin Espectral figure('Name','Variabilidad','NumberTitle','on') plot(kondas,d) set(gca,'FontSize',12,'YGrid','on','XGrid','on') %Grfica CPs figure('Name','PCs LOADINGS','NumberTitle','on') plot(kondas,(-pc(:,1))) set(gca,'FontSize',12,'YGrid','off','XGrid','off')

% Figura Standard PC Score Vs Pc # 92

figure('Name','Standard PC score Vs PC','NumberTitle','on') plot([1:numespec],abs(v([2],1:numespec)),'og','MarkerSize',16); nmero[1] indica # del estndar% xlabel('PC #','FontSize',16') ylabel('Standard Score (absolute value)','FontSize',16) set(gca,'FontSize',12,'YGrid','on','XGrid','off') set(gca,'XTick',[1:numespec]) %Figura CP Vs CP figure('Name','PC Vs PC','NumberTitle','on') jj=1;kk=2; %indices PCs plot((v(:,jj)),(v(:,kk)),'O','MarkerSize',16,'MarkerEdgeColor','k'); for hh=1:size(v,1) text((v(hh,jj)),(v(hh,kk)),num2str((hh))); end xlabel(strcat('Coefficient PC #',num2str(jj)),'FontSize',16) ylabel(strcat('Coefficient PC #',num2str(kk)),'FontSize',16) set(gca,'FontSize',12,'YGrid','on','XGrid','on') % ANALISIS AUTOVECTORES figure('Name','eigenvector','NumberTitle','on') % plot([1:numespec],abs(v(:,1)),':ok','MarkerSize',8,'MarkerFaceColor','k') set(gca,'XTick',[1:numespec]) %set(gca,'XTickLabel',{ObjLabels}) %etiquetar x labels hold plot([1:numespec],abs(v(:,2)),':squarek','MarkerSize',8,'MarkerFaceColor','b') % plot([1:numespec],abs(v(:,3)),':^k','MarkerSize',8,'MarkerFaceColor','k') % plot([1:numespec],abs(v(:,4)),':>k','MarkerSize',8,'MarkerFaceColor','r') 93 %el

% plot([1:numespec],abs(v(:,5)),':<k','MarkerSize',8,'MarkerFaceColor','g') % plot([1:numespec],(v(:,6)),':.k','MarkerSize',8,'MarkerFaceColor','r') % Reconstruccin indicesrecons=[ ]; %ndices PCs para reconstruccin medias=mean(espectros,2); reconstruccion=(v(:,indicesrecons))*pc(:,indicesrecons)'; reconstruccion=reconstruccion'; for jj=1:numespectros-length(indquita) reconstruccion(:,jj)=reconstruccion(:,jj)+medias(jj); end diferencia=espectros'-reconstruccion; desviacionestandar=std(diferencia,0,1); %Figura Reconstruccin figure('Name','Reconstruccion ','NumberTitle','on') plot(desviacionestandar,'o','MarkerSize',10,... 'MarkerEdgeColor','k'); xlabel('Spectrum #','FontSize',16') ylabel('STD spectrum-reconstruction','FontSize',16) set(gca,'FontSize',12,'YGrid','on','XGrid','on') set(gca,'XTick',[0:1:numespec]) title(strcat('Reconstruction with PC# ',num2str(indicesrecons)))

94