METODOLOGAS PARA LA DETECCIN Y EL TIPAJE DE MICROORGANISMOS TRANSPORTADOS POR ALIMENTOS

Durante la dcada pasada, se han observado muchas mejores en los mtodos tanto convencionales como modernos para la deteccin de bacterias patognicas en alimentos. Las modificaciones y la automatizacin de los mtodos convencionales en la microbiologa de los alimentos incluyen la preparacin de muestras, tcnicas de plaqueo, conteo e identificacin. Las tcnicas de bioluminiscencia de ATP son usadas con mayor frecuencia para la medicin de la eficiencia de superficies limpias y utensilios. Mtodos de conteo celular, incluyendo la citometra de flujo y la tcnica directa de filtro epifluorescente son tcnicas adecuadas para la rpida deteccin de microorganismos, especialmente en lquidos. Los sistemas automatizados basados en Impedimetra son capaces de analizar un nmero elevado de muestras basado en el recuento bacteriano diario. Los inmunoensayos en una amplia gama de formatos hacen que la deteccin rpida de muchos posibles patgenos. Recientemente, se han producido avances importantes en el uso de ensayos basados en cidos nucleicos para la deteccin y tipificacin de patgenos transmitidos por los alimentos. La sensibilidad de estos mtodos se ha aumentado de manera significativa por el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa y otras tcnicas de amplificacin. Los mtodos alternativos y rpidos deben cumplir una serie de requisitos relativos a la precisin, la validacin, la velocidad, la automatizacin, la matriz de la muestra, etc Ambos mtodos convencionales y rpidos se utilizan en programas de puntos crticos de control de anlisis de riesgos. Otras mejoras, especialmente en inmunoensayos y mtodos genticos se pueden esperar, incluyendo el uso de biosensores y la tecnologa de los microarreglos (Microarrays).1,2

CUESTIONARIO
1. EN UNA MUESTRA DE YOGURT, AL QUE SE LE AGREGA FRUTAS QUE PUEDEN CONTENER SACAROSA, GLUCOSA O LEVULOSA, DURANTE LA PRUEBA DE COLIFORMES, LA PRODUCCIN DE GAS PUEDE
DEBERSE A LA FERMENTACIN BACTERIANA DE LA LACTOSA DEL MEDIO DE CULTIVO O TAMBIN DE LA SACAROSA, GLUCOSA O LEVULOSA DE LA MUESTRA ANALIZADA, CMO DEBE REALIZARSE LA PRUEBA CONFIRMATORIA?

La norma peruana no hace referencia al tipo de producto fermentado (yogurt) que se pueda presentar bajo su forma comercial. Por norma, el anlisis microbiolgico de leches fermentadas involucra el estudio de Coliformes, Mohos y Levaduras3. Solo para el caso de coliformes en el cual el mtodo del Nmero Ms Probable consiste en dos pruebas consecuentivas, la prueba preliminar que involucra el uso de Caldo Lactosado o Caldo EC, y una prueba confirmatoria que se basa en el uso del Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis 2%, el hecho de que la muestra a analizar posea un ingrediente anlogo a los componentes del cultivo no debera afectar el resultado. Si dicho alimento ha sido expuesto a una mala praxis de higiene durante su tratamiento, ya sea durante el procesado o el almacenamiento, el resultado debe ser siempre el mismo, si es que se tratara de un yogurt frutado o un yogurt normal. La presencia de estos sustratos (frutas en el yogurt) constituyen un riesgo adicional para la preparacin y conservacin del alimento, por lo que los microorganismos oportunistas se pueden ver favorecidos por las condiciones adicionales que existen en un yogurt frutado, sin embargo, la prueba para coliformes debe revelar de forma coherente la presencia y la cantidad ms probable de estos microorganismos

2. EN QU CONSISTE LA TCNICA DE LA IMPEDANCIA EN LECHE, UTILIZANDO EL BACTMETRO?5 Actualmente, existe una serie de laboratorios que han diseado sus propios instrumentos de evaluacin y monitoreo por el mtodo de la Impedancia. La impedancia en Microbiologa (o denominada Microbiologa de la Impedancia o Espectroscopa dielctrica) constituye un conjunto de tcnicas que permiten detectar, monitorear, cuantificar e identificar microorganismos en muestras del inters de cada analista. La impedancia (En fsica denominada como Z) es la tensin generada que se opone al paso de la corriente alterna. Generalmente aplicado al campo de los condensadores en los cuales se ven involucradas variables como Conductancia, capacitancia y otros. Se trata, as, de un concepto fsico que ha sido trasladado al campo de la microbiologa aplicada, til para microbiologa clnica, de los alimentos y molecular. La tcnica consiste en realizar mediciones de los componentes de impedancia (por ejemplo conductancia, capacidad, mdulo de impedancia o ngulo de fase) empleando el mtodo bipolar con dos electrodos sumergidos en una celda que contiene un medio de cultivo inoculado, el cual es mantenido a condiciones definidas de la evaluacin (P. Ej. Prueba de coliaergenes, 37 C 1, 24hrs). Se ha subdividido en dos tipos dependiendo del fundamento que cada uno presenta.

Impedancia Directa

Impedancia Indirecta

La deteccin de microorganismos por Impedancia Directa se basa en la capacidad de los microorganismos de metabolizar las molculas del medio de cultivo, para crecer. Los nutrientes del medio de cultivo (glcidos, protenas...) son molculas elctricamente neutras o estn dbilmente ionizadas. Estas molculas son metabolizadas por los microorganismos en crecimiento, y transformadas en molculas ms pequeas, con polaridad y/o carga elctrica, como por ejemplo cido lctico, actico, ctrico, aminocidos... El efecto final de esta actividad metablica es un incremento de la conductividad elctrica del medio de cultivo, medible mediante dos electrodos sumergidos en el medio de cultivo.

Algunos microorganismos, como los mohos y levaduras, de crecimiento lento, pueden ser detectados ms rpidamente registrando la produccin de CO 2 debida a su metabolismo. Para registrar la produccin de CO2 la muestra se inocula en un vial junto con el medio de cultivo. Este vial se introduce a su vez en una celdilla que contiene una solucin de KOH (potasa). El CO2 generado por los microorganismos se ir disolviendo en la potasa, modificando su impedancia. La reaccin qumica entre el CO2 y el KOH se basa en la siguiente reaccin qumica:

El BacTrac registra en continuo los cambios producidos generando una curva que permite cuantificar los microorganismo presentes en funcin de la generacin de CO2.

La Interpretacin de los resultados mostrados por el equipo (Bactmetro) es dependiente del ritmo de crecimiento de los microorganismos, los cuales estn sujetos a su curva de crecimiento normal. Existen 3 fases marcadas claramente: Fase Inicial, es aquella en la cual los microorganismos se adaptan a los nutrientes hallados en el medio y preparan la maquinaria enzimtica para aprovecharlos. Fase Exponencial, se da el crecimiento de forma logartmica de los microorganismos Fase Estacionaria, finalmente como consecuencia del agotamiento de los nutrientes y la acumulacin de metabolitos txicos, los microorganismos cesan su actividad metablica, por ende, su crecimiento.

El equipo est compuesto por unos lectores electromagnticos los cuales son capaces de cuantificar las seales elctricas manifestadas en el medio de cultivo. El diagrama de abajo muestra cmo se da el fenmeno fsico de conductancia. Este fenmeno est sujeto a las leyes del electromagnetismo anclado en su pilar fundamental: , donde C es capacitancia, Q es carga

elctrica y V es la tensin elctrica o diferencia de voltajes.

3. DESCRIBA UNA TCNICA PARA LA DETECCIN DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN ALIMENTOS, 4 MENCIONA LA FUENTE . La metodologa sealada es la que el Bacteriological Analysis Manual, publicado por la FDA, seala en el captulo 10: Listeria monocytogenes. Este manual se ha alimentado del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9th edition, el cual lista a 8 especies en el gnero Listeria: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. grayi, L. murrayi, L. denitrificans. Sin embargo, el BAM sugiere unas salvedades menores para facilitar la interpretacin de resultados durante la identificacin de estas especies, por lo que resume su clasificacin de la siguiente forma:

Solamente Listeria monocytogenes es capaz de causar enfermedad en los humanos. En la metodologa presentada por el BAM para el aislamiento de L. monocytogenes, los alimentos sospechosos son muestreados para luego tomar una muestra analtica, la cual seala la BAM que debe ser de 25g (01 unidad analtica, aunque existe todo un plan de muestreo dependiendo del tipo de alimento del que se trate). Las muestras analticas (25g) son enriquecidas para especies de listeria en un caldo selectivo de enriquecimiento a 30 C por 48 horas. El cultivo enriquecido es sembrado por estriamiento (durante 24 a 48 horas) en dos diferentes, pero complementarios, agares diferenciales para aislar a listeria. Estos organismos aislados en los cultivos son purificados en agares nuevos no selectivos, para luego ser diferenciados por pruebas bioqumicas, o puede ser preliminarmente identificado como miembros del gnero Listeria por medio de ELISA o sondas de DNA especficas para el gnero.

La serotipificacin, el test de virulencia y la enumeracin de Listeria por conteo directo en agar selectivo o por el mtodo del Nmero Ms Probable son mtodos opcionales de identificacin y cuantificacin.

Preenriquecimiento
Caldo lactosado, Caldo de enriquecimiento (BAM)

Enriquecimiento

Aislamiento

Agar Oxford Agar LPM / LPM + Esculina/Fe+3 PALCAM Agar

Identificacin

Crecimiento de colonias tpicas en TSA o TSB suplementado con Extracto de levadura al 0.6%. Serologa Test de CAMP

AGAR OXFORD4
Agar Sangre Columbia Base Esculina Citrato de amonio frrico Cloruro de litio Cicloheximida Sulfato de colistina Acrifalvina Cefotetan Fosfomicina Agua destilada 39.00g 1.000g 0.500g 15.000g 0.400g 0.020g 0.005g 0.002g 0.010g 1L La base de agar Columbia suplementado con sangre de carnero al 5% es fundamental para el crecimiento de microorganismos exigentes. La esculina es uno de los indicadores bioqumicos que permite diferenciar la presencia de Listeria. El uso de la cicloheximida permite evitar el crecimiento de hongos, mohos y/o levaduras, la fosfomicina y la fosfomicina permite inhibir el crecimiento de la flora acompaante que podra inhibir el crecimiento de Listeria.

4. EXPLIQUE CMO SE REALIZA LA DETECCIN DE ANTIBITICOS EN LECHE4 Cabe resaltar que el Bacteriological Analysis Manual (BAM) plantea dos mtodos, uno cualitativo y otro cuantitativo, para el estudio de residuos lactmicos (derivados de anillos Beta lactmicos) en leche. El mtodo del plato cilindro es considerado el mtodo oficial cuantitativo para la deteccin de residuos lactmicos, descrito en el captulo 16 de Productos lcteos, en el Official Methods of Analysis. El mtodo del disco es considerado el mtodo oficial para la deteccin cualitativa de sustancias inhibitorias en la leche, siendo este una modificacin del mtodo aprobado por la International Dairy Federation para la deteccin cualitativa de penicilina en leche.

MTODO CUALITATIVO
Mtodo del disco de papel Mtodo oficial para la deteccin cualitativa de sustancias inhibitorias en leche Bacillus stearothermophilus

MTODO CUANTITATIVO
Mtodo del plato cilindro Mtodo oficial para la deteccin cuantitativo de residuos lactmicos en leche. Micrococcus luteus

Preparacin del estndar de Penicilina G

Preparacin de Micrococcus luteus

Preparacin de Bacillus stearothermophilus

Preparacin de la placa

Preparacin de la solucin de leche estndar

Preparacin de la curva estndar

Preparacin de la placa

Preparacin de la muestra

Ensayo preliminar

Evaluacin de la potencia

Ensayo confirmatorio

5. MENCIONE LOS BROTES DE ETA CUYO ALIMENTO IMPLICADO FUE LA LECHE O LOS PRODUCTOS LCTEOS, INDICANDO EL LUGAR, LA FECHA, EL PATGENO. La brucelosis en humano, ha sido diagnosticada en todos los continentes y se estima que afecta aproximadamente a unas 500.000 personas cada ao en todo el mundo. De acuerdo al informe estadstico de Salud Mundial de la OMS, los pases que notificaron el mayor nmero de casos fueron la antigua Unin Sovitica, Espaa, Italia, Irn, Grecia, Per, Argentina, Mxico, Francia, Portugal, Estados Unidos, Polonia, Australia y Nueva Zelanda, es importante hacer notar que Mxico, Per y Argentina son los tres pases en Amrica Latina que tienen Brucella melitensis La situacin epidemiolgica de la brucelosis en Espaa, segn los datos del Sistema de Enfermedades de Declaracin Obligatoria (EDO) y del Sistema de Brotes presenta una tasa de incidencia en 2011 de 0,22 casos/100.000 habitantes. En ese ao se produjo un brote por consumo de leche infectada y tres brotes por contacto con animales enfermos. Esta zoonosis est asociada fundamentalmente al mbito rural y ganadero, y su incidencia ha disminuido de forma notable los ltimos aos debido a las campaas de saneamiento.5

Brotes de brucelosis humana declarados en Espaa, por categora de transmisin, 19962011

La incidencia anual de brucelosis en Mxico se calcula de 28.7 casos por milln de habitantes, En Mxico, la enfermedad est relacionada con rebaos de cabras, donde la seroprevalencia fue de 9.8% para el estado de Michoacn, as como mayor en rebaos de ms de 34 animales, rebaos en hacinamiento y animales mayores de 24 meses de edad; similar a lo reportado para el Valle de Mexicali.13,14 Asimismo, es ms comn en mujeres entre 29 y 39 aos de edad, en primer lugar Brucella melitensis seguida de Brucella suis.6 La Brucelosis en el Per como en otros pases en desarrollo, tiene caractersticas epidemiolgicas peculiares; no es una enfermedad ocupacional, afecta a personas de cualquier edad y sexo, es endmica con brotes epidmicos ocasionales y es producida por Brucella melitensis. En nuestro pas, ocupa el dcimo lugar dentro de las enfermedades reportables de declaracin obligatoria y es transmitida al ingerir leche cruda de cabra o sus derivados, particularmente queso fresco.7 La brucelosis tiene una tasa de incidencia anual promedio para 1958-1967 de 20.47 por 100,000 habitantes en el territorio nacional y tasas tan altas como de 205:34 por 100,000 habitantes en el departamento de Ica; 136.99 en el Callao; 21.57 en Lima, y 6.62 en Ancash. Todos estos departamentos estn ubicados en la costa, dentro de la zona endmica. En el pas, especialmente en el litoral, son varias las especies animales que sirven como fuentes de infeccin en el hombre-el ganado bovino porcino y principalmente el caprino-mediante ingestin, contacto, inhalacin e inoculacin. En un estudio realizado en 1967 se descubri que de 86 cepas tipificadas el 93% era de Br. melitensis; un 4% Br. abortus, y un 2% Br. suis, lo cual ha sido tambin constatado por otros autores. Un factor asociado a los brotes epidmicos de la enfermedad en el hombre (primavera y verano), es la migracin de rebaos de caprinos de la serrana al litoral del Per para aprovechar los pastos de las Lomas y los rastrojos de los cultivos de algodn, arroz, maz, sorgo y chala.8

Brucelosis humana en el Per, por departamentos, 1958-1967.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Enne de Boer et al. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. International Journal of Food Microbiology, Volume 50, Issues 12, 15 september 1999, Pages 119-130. 2. Niederhauser C., et al. Use of Polymerase Chain Reaction for Detection of Listeria monocytogenes in Food. Applied and Environmental Microbiology, May 1992, p. 1564-1568 NTS N - MINSA/DIGESA-V.01. Norma sanitaria que establece los criterios microbiolgicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano. Food and Drug Administration (FDA). Bacteriological Analysis Manual. Chapter 10: Listeria monocytogenes. Chapter 20A: Inhibitory Susbtances in Milk. Yadollah, Zafari & Martin, W. Comparison of the BACTOMETER Microbial Monitoring System with Conventional Methods for Detection of Microorganisms in Urine Specimens. Journal of Clinical Microbiology, May 1977, p. 545 547. SITUACIN DE LA BRUCELOSIS HUMANA EN ESPAA. Boletn epidemiolgico semanal, Vol 20, No 17 (2012). Disponible en http://revista.isciii.es/index.php/bes/article/view/761/867 Uvetis anterior como manifestacin de brucelosis: Reporte de un caso y revisin de literatura. ENF INF MICROBIOL 2010 30 (2): 66-69. GOTUZZO Eduardo, CARRILLO Carlos, SEAS Carlos, GUERRA Jorge, MAGUIA Ciro*.Caractersticas Epidemiolgicas y clnicas de la Brucelosis en 50 grupos familiares. Disponible en: http://www.upch.edu.pe/famed/rmh/1-2/v1n2ao2.pdf Juan Zapaiel y Hernn Mlaga. EPIDEMIOLOGIA DE LA BRUCELOSIS CAPRINA EN EL PERU. Disponible en: http://hist.library.paho.org/spanish/Bol/v71n2p121.pdf

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.