14.

REGULACION DE LA EXPRESION GENICA EN EUCARIONTES (II)

Vernica Gonzlez Nez Universidad de Salamanca

ESQUEMA. Regulacin de la expresin gnica en eucariontes (II)

Regulacin de la Iniciacin de la Transcripcin Interaccin con los nucleosomas 1. Protenas no histnicas 2. Desplazamiento de los nucleosomas durante la transcripcin 3. DNase I HS = sitios hipersensitivos a la DNasa I 4. Complejos remodeladores de la cromatina. Complejo SWI / SNF 5. Modificacin de histonas Tipos de factores de transcripcin 1. Enhancers y factores de transcripcin upstream 2. Factores de transcripcin inducibles

INTERACCION CON LOS NUCLEOSOMAS

PROTEINAS NO HISTONICAS

Control pre-transcripcional Determina el acceso de la maquinaria de transcripcin a la cromatina Protenas de interaccin con los nucleosomas

Caractersticas generales de las protenas no histnicas La mayor parte de las protenas de la cromatina Su concentracin es mayor en tejidos transcripcionalmente activos Algunas son especficas de tejido Presentan: dominio de unin al DNA generalmente otro dominio de interaccin con otras protenas Sintetizadas en respuesta una induccin gnica

HMG = High Mobility Group (I)

Protenas no histnicas que contribuyen a la regulacin de la expresin gnica

Caractersticas Bajo Pm (< 30 kDa) = alta movilidad electrofortica en SDS-PAGE Composicin inusual: 25% de bsicos 30% de cidos No son especficas de tejido, ni selectivas en la activacin de la transcripcin No reconocen secuencias especficas en la DNA Interaccionan con el surco menor Reconocen componentes de la cromatina especficos de tejido

HMG = High Mobility Group (II)

2gruposdeprotenasHMG
HMG1&HMG2 25kDa seunenadsDNA yssDNA HMG14&HMG17 10kDa afinidadporlosnucleosomas probablementedesplazanalahistona H1,formandoestructuras abiertasenlacromatina

Desplazamiento de los nucleosomas durante la transcripcin

LaRNApolimerasa desplazalosnucleosomas delDNAdurantelatranscripcin Mecanismo Facilitadoporelenrollamientotoroidal delDNAsobrelashistonas (=superenrollamiento negativo) 1. AproximacindelaRNApolimerasa alnucleosoma:desestabilizalos nucleosomas situadosdelante 2.Exposicindepartedelasuperficiedeloctmero,queseunealDNAsituado detrsdelaRNApolimerasa 3.FormacindeunbucleenelDNA 4.LaRNApolimerasa separacompletamenteeloctmero.Eloctmero seenrolla sobreelbucledeDNA 5.Ensamblajedelnucleosoma detrsdelaRNApolimerasa

DNase I HS = sitios hipersensitivos a la DNasa I (I)

Regiones del DNA localizadas - en el extremo 5 de genes transcripcionalmente activos activables - en secuencias implicadas en la replicacin y recombinacin

Son zonas libres de histonas No hay nucleosomas, pero s otras protenas que evitan la unin de las histonas al DNA Permiten un acceso directo de la RNA polimerasa y otros TF a regiones control de la expresin gnica Se facilita el inicio de la transcripcin gnica

DNase I HS = sitios hipersensitivos a la DNasa I (II)

LCR = Locus Control Region Zona del genoma que contiene sitios HS, donde se unen determinadas protenas que provocan la reestructuracin de la cromatina Activacin gnica Ejemplo: Cluster gnico de la globina Si se produce delecin de un fragmento que contiene el LCR de la globina, que provoca la prdida de un HS, se observa una sntesis reducida de , y globinas talasemia

DNase I HS = sitios hipersensitivos a la DNasa I (III)

DeterminacindelosDnase IHS
1.TratamientodelacromatinaconDnasa I A. Southernblot:sonda para lazona hss si lahss existe:dosfragmentos menores enlahibridacin si lahss noexiste:unfragmento demayortamao B.DNasechip:Marcaje delhss conestreptavidina yseparacin por cromatografa deafinidad por estreptavidina Posteriormente,hibridacin deunmicroarray C.DNasearray:separacin por gradiente desacarosa +hibridacin deunmicroarray

COMPLEJOS REMODELADORES DE LA CROMATINA -RSC- (I)

Remodelan la cromatina, provocando el cambio de estructura de posicin de los nucleosomas: los sitios de unin de TFs a protenas quedan expuestos los TFs (e.g. TBP) tienen acceso al DNA diana

Asociacin de diversas protenas con los complejos remodeladores de cromatina, sobre todo con histona acetil-transferasas (HATs) Mecanismo dependiente de ATP Alguna protena del RSC presenta actividad ATPasa

Acciones de los RSC (= chromatin structure remodelling complex) Movimiento de los nucleosomas sobre el DNA, de forma que sitios de unin a protenas quedan expuestos. Re-estructuracin del nucleosoma in situ Transferencia de un nucleosoma de una molcula de DNA a otra

COMPLEJOS REMODELADORES DE LA CROMATINA -RSC- (II)

ComplejoSWI/SNF
Uncomplejoremodelador delacromatina(RSC) Formadoporunas10protenas(aprox.2MDa)conactividadATPasa Muypocoscomplejosporclula,porloqueposiblementehandeactuarde formacataltica Funcin Remodelarlacromatina,provocandoelcambiodeestructura deposicin delosnucleosomas,paraquelosTFs (e.g.TBP)tenganaccesoalDNAdiana Enasociacinconhistona acetiltransferasas TambinformapartedelcomplejomediadordelaRNApolimerasa II

MODIFICACION DE HISTONAS (I)

Alteracin de la afinidad de las histonas por el DNA el DNA se empaqueta ms densamente se relaja

Tiposdemodificacindelashistonas
Acetilacin: unindegruposacetilo,especialmenteenLys Fosforilacin: Ser,Thr &Tyr Metilacin: unindegruposmetilo,especialmenteenLys Ubiquitinacin: unindeubiquitina sobre NH2 deLys SUMOilacin: unindeSUMOprotenas (SmallUbiquitinlikeModifierorSUMO proteins)

Modificacin de histonas (II)

Metilacin &fosforilacin
PrdidadecargapositivanetadeLys,Arg &His ElDNAseempaquetamenosdensamentesobrelosnucleosomas Descondensacin delacromatina Ejemplo LafosforilacindelaHistona H1secorrelacionaconlaremodelacin delacromatina

Acetilacin de histonas (I)

El grado de acetilacin se correlaciona con el nivel de expresin gnica En el extremo N-terminal el NH2 de Lys Efecto Disminucin de la carga positiva neta de las histonas, reduciendo as su afinidad por los grupos fosfato del DNA el DNA no se empaqueta tan densamente el ncleo histnico se puede desplazar del DNA

Actividades Histona acetil-transferasas (HATs) Histona desacetilasas (HDACs)

Acetilacin de histonas (II)

Histona acetil-transferasas (HATs) Muchos TFs activadores tienen actividad HAT p300 / CBP: acetila el extremo N-terminal de la histona H4 PCAF acetilacin de histonas H3 Histona desacetilasas (HDACs) Los complejos represores suelen presentar actividad HDAC

Cromatina compactada

Cromatina descondensada

TIPOS DE FACTORES DE TRANSCRIPCION

TIPOS DE FACTORES DE TRANSCRIPCION (TF)

Generalidades Grandes diferencias en los niveles de transcripcin (x 109) RNA polimerasas eucariticas - no pueden transcribir genes por s mismas - necesitan del ensamblaje de varias subunidades de la maquinaria de transcripcin Activadores y represores - alteran la velocidad de formacin del complejo transcripcional Mecanismos de control - semejantes a los de procariontes - la unin selectiva de protenas a fragmentos del DNA regula la iniciacin de la transcripcin La RNA polimerasa II (que transcribe los genes que codifican para protenas) tiene poca afinidad por los promotores

FACTORES DE TRANSCRIPCION (TF)

3 tipos de factores de transcripcin que regulan el inicio de la transcripcin

TFgenerales basales
necesariosparalasntesisdecualquiermRNA,determinareliniciodela transcripcin ylaunindelaRNApolimerasa IIalpromotor seconsiguennivelesbasales detranscripcin

TFqueactuan upstream delsitiodeiniciacindelatranscripcin

activan inhibenlatranscripcin,unindoseaunsitiodereconocimientoen elDNA sitiosdereconocimientosituadosupstream delatranscripcin sedenominan enhancers =activanlatranscripcin silencers =bloqueanlatranscripcin expresinfinamenteregulada

Factores de transcripcin inducibles

TFinducibles
Suexpresinyactivacinestncontroladas Activados inhibidosmediantediversosprocesos Modificacindesulaexpresingnica&sntesisdenovo Ejemplo:homeoprotenas Fosforilacinvs.Desfosforilacin.Ejemplo:CREB,jun,HSP Unindeligandos.Ejemplo:receptoresnucleares(hormonasesteroideas ) Proteolisis ytraslocacin alncleo Separacindeuninhibidor.Ejemplo:NFkb &Ikb,Rb Intercambiodeparejadeunmonmero.Ejemplo:MyoD

ENHANCERS = UAS & TF UPSTREAM (I)

Enhancer o UAS = Upstream Activation Sequences Secuencia de un gen que activa un promotor, aumentando la expresin gnica en un factor de x200 x400 Promotor Enhancer TATA Iniciador

Proteina deunin alenhancer Seencuentrana200bp msdel iniciodelatranscripcin (=muyalejados) Para interaccionar con el complejo preininciador (PIC) se forma un bucleenelDNA

TFIID

RNApol II

Enhancers = UAS & TF upstream (II)

Enhancer o UAS = Upstream Activation Sequences Pueden presentar localizaciones y orientaciones distintas en relacin con el promotor, incluso actuar de manera bidireccional Promotor Enhancer TATA Iniciador

Promotor Enhancer TATA Iniciador

Promotor TATA Iniciador Enhancer

Enhancers = UAS & TFs upstream (III)

Enhacersoma
Grancomplejodeprotenasqueseunenaunenhancer,generalmente deformasecuencial,modificandolaexpresindelgendiana LosTFseunende formacooperativa entres y/oconelcomplejo preiniciador (PIC)delaRNApolimerasa II,estimulando inhibiendoel iniciodelatranscripcin

Coactivador
TransmitenlassealesdesdelosactivadoreshastalosTFs generales

Enhancers = UAS & TFs upstream (IV)

Elementos frontera o elementos aisladores (insulators) Impiden la accin de un enhancer ms all de dicho elemento frontera

gen A Enhancer Elenhanceracta sobre elgen Aysobre elgen B

Insulator

gen B

gen A Enhancer Insulator

gen B

Elelemento aislador impide que elenhanceracte sobre elgen B

Enhancers = UAS & TFs upstream (V)

Ejemplosdeenhancer cajaCCAAT#TFCP1 elementoCACCC#TFSp1 cajaGATA#TFGATA1(lneaeritroide) Losenhancers suelenposeerestructuramodular Laprdidadeunelementoreducelaactividaddelenhancer,peronolaelimina Respuestagradual adiferentesestmulos Activadores

gen A Activadores

gen B

ESTRUCTURA DE LOS FACTORES DE TRANSCRIPCION Dominiosestructuralmentediferenciados

DominiodeuninalDNA: seunealasecuenciadianadelenhancer Dominioactivadordelatranscripcin: regionesconresiduoscidos InteraccionesentreTFyPICmediadaspor:interaccioneselectrostticasinespecficas zonasricasenGln enPro Otrosdominios: dimerizacin formacindeunbucleenelDNA unindeefectores Noexisteningunapreferenciarespectoalalocalizacin(N CT)delosdominios
N-terminal C-terminal

Dominio de dimerizacin

Dominio de unin al DNA

Dominio de unin de efectores

Dominio de activacin

Interaccin de los TFs con el DNA

Reconocimiento macromolecular La protena presenta una estructura 3D estructural y qumicamente complementaria a la estructura del DNA

Ajuste inducido entre protenas y DNA: cambios conformacionales en ambas molculas

Interacciones DNA # protena: a nivel atmico - principalmente puentes de hidrgeno e interacciones electrostticas - Lys & Arg con bases nitrogenadas y con los grupos fosfato - Asn y Adenina: forman 2 puentes de hidrgeno - hidrofbicos con -CH3 de la timina - H2O: puentes entre las protenas y el DNA

Ensayo pCAT. Ensayo para determinar la existencia de enhancers

CAT = Cloranfenicol Acetil Tranferasa - no est presente en eucariontes - plsmido pCAT: ORF de CAT, pero sin promotor 1. Clonacin en 5 del plsmido pCAT de las secuencias de un promotor que se quiera estudiar 2. Transfeccin de clulas con este plsmido pCAT-Promotor 3. Adicin de distintos TFs 4. Evaluacin de la actividad CAT: cantidad de coranfenicol acetilado en el medio Resultado esperable Si hay actividad cloranfenicol acetilado en el medio, es porque hay actividad CAT El gen se ha transcrito porque el TF presenta secuencia de unin en el fragmento clonado El TF se une al promotor y activa la transcripcin

DNase I footprinting

Determinacin del sitio de unin de un TF sobre el DNA 1. Fragmento de DNA marcado radiactivamente que pueda contener un enhancer para TFs 2. Adicin de TF 3. Digestin con DNasa I: cortes aleatorios en el DNA Si el TF interacciona con el DNA, lo proteger frente a la digestin 4. Desnaturalizacin del DNA y separacin de las protenas 5. Separacin de los fragmentos de DNA por electroforesis

DNase I footprinting (II)

Resultados esperables DNA control (sin TF) Escalera de bandas de DNA que se diferencian en un nucletido entre s DNA muestra (con TF) Secuencias de DNA protegidas por los TF de la digestin: no presentan tales bandas footprint o huella Ejemplo. TF Sp1 se une a las cajas CG Actualmente,una tcnica alternativa alensayo dehuella para laDNasa Ies la

Inmunoprecipitacin decromatina
Ensayoparadeterminarsiunaprotenaseuneaunasecuenciadeterminada delDNA EnsayoChIP /ChIPonchip

FACTORES DE TRANSCRIPCION INDUCIBLES

Ejemplos de TF inducibles Por unin de ligando - receptores nucleares: hormonas esteroideas, cido retinoico

Por fosforilacin - NF- (P- de I-), c-fos / jun

Activacion por medio de cascadas de sealizacion intracelular - CREB

Mecanismo de activacin gnica mediado por CREB

CREB=cAMP ResponseElement Binding Protein

Fosforilacin por diversas protenkinasas que mediandiferentes cascadas de sealizacin intracelular estrs:p38,SAPK,JNK MSK1,CREBK neurotransmisores:PKa,CaMK factores decrecimiento:PI3K,RTK AKT,MAPK CREBP: punto deconvergencia ydeintegracin deseales PCREB setrasloca alnucleo yseune aCRE(cAMP ResponseElement) activacin delatranscripcin delosC/EBPs =IEGs:genesdeactivacin temprana.LosC/EBPs sonTFs losC/EBPs seunen aC/EBPbindingsitesenelDNAyactivan latranscripcin delosgenesderespuesta tarda =dianas delacascada desealizacin

Activacin gnica

SUPERFAMILIA DE LOS RECEPTORES NUCLEARES Tiposdereceptoresnucleares

Receptoresdehormonasesteroideas glucocorticoides:uninaGRE Regulacindelmetabolismoglucdico hormonassexuales:estrgenos,andrgenos unamismahormonainducelaexpresindiferencialdegenesenvarios tejidos,probablementeporquelossitiosderespuestaestnexpuestos (i.e.comoeucromatina,ynocomoheterocromatina) ReceptoresdevitaminaD Receptoresdecidoretinoico actacomomorfgeno induceladiferenciaciny/ocontrolaeldesarrollo ej.determinaelejeanteroposteriorduranteeldesarrollodelasextremidades Hormonastiroideas puedenactuarcomomorfgenos ej.inducenlametamorfosisenrenacuajos

Estructura de los receptores nucleares

Estructuramodularconservada:variosdominios Dominiodeactivacin: variable;interaccionaconotrosTFs DominiodeuninalDNA: muyconservado;66 Dominiodeuninalligando 240 Enausenciadehormona:estedominioimpidequeeldominiodeunin interaccioneconelDNA Cuandoseunelahormonaalreceptor:seliberalarepresin,eldominio deunininteraccionaconelDNAyseactivalaexpresingnica Reginbisagra(hinge) Dominiodedimerizacin

Transactivacin

Unin al DNA

Regin bisagra

Dimerizacin

Unin al ligando

Elementos de respuesta a hormonas

Los receptores intracelulares de hormonas, vitamina D y acido retinoico se unen a elementos de respuesta (RE) en el DNA y median la activacin o la represin gnica HREs = Hormone Response Element Secuencia palindrmica (con un eje de simetra) de 6 bp separadas por 3 bp Generalmente localizadas en los enhancers y dispuestas como mltiples copias Diferencias en la secuencia entre GRE, Estrogen RE etc. Glucocorticoides: Acido retinoico: Vitamina D: Hormonas tiroideas: GGTACAN3TGTTCT AGGTCAN5AGGTCA AGGTCAN3AGGTCA AGGTCAN3AGGTCA

Control de la expresin gnica por hormonas esteroideas Union H#R

1.Hormonasesteroideas:compuestosapolares ehidrofbicos:difundenatravsde lam.p.,llegandohastaelcitosol Lahormonaslotieneefectoenaquellostejidosqueexpresenelreceptordiana 2. UninH#R:cambioconformacional enelreceptor enciertoscasos,elreceptorseencuentraformandounheterodmero conun inhibidorancladoalam.p.(Hsp90) launinH#Rhacequeelreceptorseseparedelinhibidorydifundaporelcitosol 3.ElcomplejoH#R entraalncleoyseuneasuelementoderespuesta(RE) Seproducelainduccinolarepresingnica Importante: lashormonasesteroideas noalteranlaactividaddeunaenzima,sino quemodificanlaexpresingnica Elefectodeestashormonasnoesinmediato