56T00267

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ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA
VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO DE VALORACIN DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL PRODUCIDO POR BETAPHARMA S.A. MEDIANTE HPLC
TESIS DE GRADO
PREVIA LA OBTENCIN DEL TTULO DE
BIOQUMICO FARMACUTICO
PRESENTADO POR
JORGE GONZALO VELASTEGU BARRENO
RIOBAMBA ECUADOR 2011
DEDICATORIA
A mi madre por su abnegacin y lucha diaria.
AGRADECIMIENTO
A Dios por darme ste excelente da. A mi Madre por su sacrificio y por la confianza que deposit en m. A mis hermanos que son el incentivo para seguir adelante. A ti Adriana por ser mi apoyo y felicidad. Al BQF. Fausto Contero, BQF. Diego Vinueza, Dr. Carlos Pilamunga y de forma especial al Dr. Germnico Silva por su valioso aporte en la elaboracin de este trabajo A la empresa BETAPHARMA S.A. que abri la puerta para mi formacin profesional.
ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA
El Tribunal de Tesis certifica que: El trabajo de investigacin: VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO DE VALORACIN DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL PRODUCIDO POR BETAPHARMA S.A., de responsabilidad del seor egresado JORGE GONZALO VELASTEGU BARRENO, ha sido prolijamente revisado por los Miembros del Tribunal de Tesis, quedando autorizada su presentacin. FIRMA Dra. Yolanda Daz __________________ FECHA _______________
DECANA FACULTAD DE CIENCIAS
Dr. Luis Guevara
__________________
_______________
DIRECTOR DE LA ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA
BQF. Fausto Contero DIRECTOR DE TESIS
__________________
_______________
Dr. Carlos Pilamunga MIEMBRO DE TRIBUNAL
__________________
_______________
Tlgo. Carlos Rodrguez
__________________
_______________
DIRECTOR DEL CENTRO DE DOCUMENTACIN
NOTA DE TESIS ESCRITA ______________________
Yo, Jorge Gonzalo Velastegu Barreno, soy responsable de las ideas, doctrinas y resultados expuestos en esta Tesis; y el patrimonio intelectual de la Tesis de Grado, pertenece a la ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO y a la EMPRESA FARMACUTICA BETAPHARMA S.A.
JORGE GONZALO VELASTEGU BARRENO
_______________________________________
NDICE DE ABREVIATURAS
AOAC ASTM Am Ast CLAR Cst Cm d FDA G HPLC ICH IT MDD ML/MIN p.a. ppm R RC RSD SD SI uL
Asociacin de Qumica Analtica Sociedad americana de pruebas y materiales rea de la solucin problema para el pico de amoxicilina rea de solucin estndar para el pico de amoxicilina Cromatografa lquida de alta resolucin Concentracin de la solucin estndar Concentracin de la solucin muestra en mg/ml Densidad e la solucin Administracin de drogas y alimentos Gramos Cromatografa lquida de alta resolucin Conferencia Internacional de Armonizacin Instructivo de trabajo Dosis Mxima Diaria Mililitros Por Minuto Principio activo Partes por Milln Responsable Responsabilidad Compartida Desviacin estndar relativa Desviacin relativa Suministra Informacin Microlitros
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NDICE GENERAL NDICE DE ABREVIATURAS NDICE DE CUADROS NDICE DE GRFICOS NDICE DE FIGURAS NDICE DE FOTOGRAFIAS NDICE DE ANEXOS INTRODUCCIN
PARTE TERICA
1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.3.1 1.1.3.2 1.1.3.3 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.3.1 1.2.3.2 1.2.3.3 1.2.3.4 Validacin.. Definiciones...... La validacin como requisito de la norma COVENIN 2534:2000.... Tipos de validacin........ Validacin prospectiva.. Validacin de la competencia Validacin retrospectiva ...... Validacin del mtodo analtico.. Responsabilidades en el proceso de validacin.. Caractersticas de un estudio de validacin de mtodos.. Alcance de los estudios de validacin El laboratorio debe utilizar un mtodo totalmente validado. El laboratorio debe utilizar un mtodo totalmente validado, pero con una nueva matriz El mtodo ha sido publicado en la literatura cientfica junto con algunas caractersticas analticas...... El mtodo ha sido publicado en la literatura cientfica sin especificacin de sus caractersticas o ha sido desarrollado internamente.. El mtodo es Emprico...
22
22 23 23 25 25 25 26 26 27 27 29 29 30 30
1.2.3.5
30 30
ii
1.2.3.6 1.2.4 1.2.4.1 1.2.4.2 1.2.4.3 1.2.4.4 1.2.5 1.2.5.1 1.2.5.2 1.2.5.3 1.2.5.4 1.2.5.5 1.2.5.6 1.2.5.7 1.2.6 1.2.6.1 1.2.6.1.1 1.2.6.1.2 1.2.6.1.2.1 1.2.6.2 1.2.6.2.1 1.2.6.2.2 1.2.7 1.2.7.1 1.2.7.2 1.2.7.3 1.2.7.4 1.2.7.5 1.2.7.6
Cambios en el personal o el equipo....... Categora del mtodo. Categora I.. Categora II....... Categora III...... Categora IV... Proceso de validacin del mtodo analtico. Especificidad...... Precisin. Repetibilidad.. Reproducibilidad Linealidad. Recuperacin. Robustez. HPLC. Fases y Columnas.. Fase mvil.. Columnas....... Fuentes de dao de una columna de HPLC. Deteccin....... Tipos de detectores en HPLC. Detectores ms utilizados en HPLC...... Principio activo Amoxicilina. Mecanismo de accin Farmacocintica. Indicaciones y Posologa Contraindicaciones. Interacciones.. Reacciones Adversas .
31 31 31 31 32 32 33 33 34 35 35 36 36 37 39 41 41 41 41 41 42 42 43 44 44 45 46 47 50
iii
2 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.3.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7 2.2.8 2.2.8.1 2.2.9 2.2.9.1 2.2.9.2 2.2.9.3 2.2.9.4 2.2.9.5 2.2.9.6 2.2.9.7 2.2.9.8 2.2.10 2.2.11 2.3 2.3.1
Parte experimental..... Diseo experimental.. Caractersticas del diseo experimental. Factores del estudio Manejo especifico del experimento.. Lugar y pruebas de ensayo. Protocolo........ Objetivo.. Alcance... Motivo de la validacin. Responsabilidades. Parmetros de validacin...... Procedimiento de anlisis.. Proceso De Validacin.. Mtodos de anlisis ...... Anlisis Qumico Criterios de aceptacin... Especificidad.. Precisin del sistema.. Precisin del mtodo.. Precisin entre Analistas Precisin entre das de anlisis.. Linealidad... Recuperacin.. Robustez. Acciones para valores fuera de lmites.. Resultados.. Tcnicas a seguir para validacin del Mtodo Analtico. Especificidad..
52 52 52 53 53 53 54 54 54 55 55 56 56 58 59 59 59 59 59 59 60 60 60 60 60 61 61 62 62
iv
10
1 2 3 4 5 6 7 2.3.2 1 2 3 4 5 6 7 8 2.3.3 1 2 3 4 5 6 7 8 2.3.4 1
Objetivo . Alcance.. Responsabilidades . Procedimiento................ Especificaciones. Registros. Referencias. Precisin del sistema.. Objetivo. Alcance.. Responsabilidades. Requerimientos.. Procedimiento Especificaciones. Registros. Referencias Precisin del mtodo. Objetivo. Alcance.. Responsabilidades. Requerimientos.. Procedimiento Especificaciones. Registros. Referencias Precisin entre analistas. Objetivo.
62 62 62 63 65 65 65 66 66 66 66 66 67 68 68 68 69 69 69 69 69 70 71 71 71 72 72
v
11
2 3 4 5 6 7 8 2.3.5 1 2 3 4 5 6 7 8 2.3.6 1 2 3 4 5 6 7 8 2.3.7 1
Alcance.. Responsabilidades. Requerimientos.. Procedimiento Especificaciones. Registros. Referencias Precisin entre das.... Objetivo. Alcance.. Responsabilidades. Requerimientos.. Procedimiento Especificaciones. Registros. Referencias Exactitud / Porcentaje de recuperacin Objetivo. Alcance.. Responsabilidades. Requerimientos.. Procedimiento Especificaciones. Registros. Referencias Linealidad.. Objetivo.
72 72 72 73 74 74 75 76 76 76 76 76 77 78 79 79 80 80 80 80 80 81 82 82 83 84 84
vi
12
2 3 4 5 6 7 8 2.3.8 1 2 3 4 5 6 7 8 3 4 5 6 7 8
Alcance.. Responsabilidades. Requerimientos.. Procedimiento Especificaciones. Registros. Referencias Robustez Objetivo. Alcance.. Responsabilidades. Requerimientos.. Procedimiento Especificaciones. Registros. Referencias Resultados y Discusin. Conclusiones.. Recomendaciones. Resumen........ Bibliografa Anexos.......
84 84 84 85 86 86 86 87 87 87 87 87 88 89 89 89 90 102 104 106 107 112
vii
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NDICE DE CUADROS
Cuadro no. 1.
Anlisis de la especificidad del mtodo frente a los parmetros 90 evaluados................................................................... Anlisis de la precisin del sistema, muestra de estndar utilizado en el anlisis de amoxicilina en polvo para suspensin. Realizado en el laboratorio de control de calidad, empresa farmacutica 91 Betapharma, quito, 2010.. Anlisis de la precisin del mtodo utilizado para la valoracin de amoxicilina en polvo para suspensin oral, realizada en el laboratorio de control de calidad, empresa farmacutica Betapharma, quito, 2010... 92 Anlisis de la precisin entre analistas en la valoracin de amoxicilina para suspensin oral, realizado en el laboratorio de control de calidad, empresa farmacutica Betapharma, quito, 2010............................................. 94 Anlisis de la precisin entre analistas en la valoracin de amoxicilina para suspensin oral, realizado en el laboratorio de control de calidad, empresa farmacutica Betapharma, quito, 2010.......................................................................... 96 Anlisis de la linealidad que presenta el mtodo en cuanto al porcentaje de estndar aadido y la respuesta que ste presenta en la valoracin de amoxicilina para suspensin oral, realizado en el laboratorio de control de calidad, empresa farmacutica 97 Betapharma, quito, 2010........................ Anlisis de la recuperacin del mtodo utilizado en la valoracin de amoxicilina para suspensin oral, realizado en el laboratorio de control de calidad, empresa farmacutica Betapharma, quito, 2010...................................................................................... 99 Anlisis de la robustez que presenta el mtodo utilizado en la valoracin de amoxicilina para suspensin oral frente a un cambio deliberado en alguno de sus parmetros, en ste caso hemos aumentado el flujo en un 10%. Realizado en el laboratorio de control de calidad, empresa farmacutica Betapharma, quito, 2010................................................. 100
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Cuadro no. 2.
Cuadro no. 3.
Cuadro no. 4.
Cuadro no. 5.
Cuadro no. 6.
Cuadro no. 7.
Cuadro no. 8.
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INDICE DE TABLAS
TABLA No. 1. TABLA No. 2. TABLA N 3
Elementos para la validacin de mtodos analticos en funcin del 32 anlisis de categora... Responsabilidades del proceso de validacin del mtodo analtico.. 55 Formula maestra de amoxicilina en polvo para suspensin oral... 63
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NDICE DE GRFICOS
GRFICO No. 1 GRFICO No. 2
Estructura molecular de Amoxicilina............................................ Linealidad del mtodo entre el porcentaje de estndar adicionado y la respuesta producida ...
43
97
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NDICE DE FOTOGRAFAS
FOTOGRAFA N 1 FOTOGRAFA N 2
Amoxicilina en polvo para suspensin oral fabricado por Betapharma S.A. Equipo de HPLC
131 131
xi
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NDICE DE ANEXOS
ANEXO NO. 1. ANEXO NO. 2. ANEXO NO. 3. ANEXO NO. 4. ANEXO NO. 5. ANEXO NO. 6.
Cromatograma del estndar de amoxicilina. Cromatograma de anlisis de sensibilidad frente a degradacin a temperatura ambiente... Cromatograma de anlisis de sensibilidad frente a degradacin con calor............................................ Cromatograma de anlisis de sensibilidad frente a degradacin por hidrlisis bsica. .............................................. Cromatograma de anlisis de sensibilidad frente al diluyente y fase mvil utilizada
112 113 114 115 116 117
Cromatograma de anlisis de amoxicilina en polvo para suspensin oral, preparado por analista 1 en el da de anlisis 1
Cromatograma de anlisis de amoxicilina en polvo para suspensin oral, preparado por analista 2 en el da de anlisis 1. .. Cromatograma de anlisis de amoxicilina en polvo para suspensin oral, preparado por analista 1 en el segundo da de anlisis. ... Cromatograma de anlisis de recuperacin frente al porcentaje de principio activo adicionado en cada frasco de amoxicilina en polvo para suspensin oral al 50% de principio activo.. Cromatograma de anlisis de recuperacin frente al porcentaje de principio activo adicionado en cada frasco de amoxicilina en polvo para suspensin oral al 75% de principio activo.. Cromatograma de anlisis de recuperacin frente al porcentaje de principio activo adicionado en cada frasco de amoxicilina en polvo para suspensin oral al 100% de principio activo Cromatograma de anlisis de recuperacin frente al porcentaje de principio activo adicionado en cada frasco de amoxicilina en polvo para suspensin oral al 125% de principio activo Cromatograma de anlisis de recuperacin frente al porcentaje de principio activo adicionado en cada frasco de amoxicilina en polvo para suspensin oral al 150% de principio activo
ANEXO NO. 7. ANEXO NO. 8. ANEXO NO. 9.
118 119
120
ANEXO NO. 10.
121
ANEXO NO. 11.
122
ANEXO NO. 12.
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ANEXO NO. 13.
124
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ANEXO NO. 14. ANEXO NO. 15. ANEXO NO. 16. ANEXO NO. 17. ANEXO NO. 18. ANEXO NO.19
Cromatograma de linealidad a concentracin de estndar al 50%... Cromatograma de linealidad a concentracin de estndar al 75%... Cromatograma de linealidad a concentracin de estndar al 100% Cromatograma de linealidad a concentracin de estndar al 125%. Cromatograma de linealidad a concentracin de estndar al 150%. Cromatograma de anlisis de robustez con un flujo aumentado en 10%.
125 126 127 128 129 130
xiii
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INTRODUCCIN
El anlisis se considera hoy en da un proceso mediante el cual obtenemos informacin. Se realiza millones de anlisis cada da en los mbitos ms variados: anlisis de productos manufacturados, anlisis medioambientales, anlisis clnicos, forenses, qumicos y fsicos, en todos ellos se requiere una confianza en los resultados obtenidos. La validacin de las metodologas analticas, junto con otras actividades englobadas en el rea de aseguramiento de la calidad, permiten conseguir calidad, otorgando la confianza necesaria a la vez que confieren un grado elevado de comparabilidad entre los resultados de los anlisis qumicos.
El costo de realizar estas mediciones es elevado y surgen costos adicionales de las decisiones tomadas en base a los resultados. Por ejemplo, las pruebas que muestran que algn alimento no es adecuado para su consumo pueden resultar en demandas por compensacin; pruebas que confirmen la presencia de drogas prohibidas podran ocasionar multas, encarcelamiento o ms an, la ejecucin en algunos pases. Claramente es importante determinar el resultado correcto y ser capaz de demostrar que lo es.
Si el resultado de una prueba no es confiable entonces tiene poco valor y la prueba no debi haberse realizado as. Si un cliente encarga un trabajo analtico a un laboratorio, se supone que el laboratorio tiene un nivel de conocimiento experto que el cliente no tiene por s mismo. El cliente espera poder confiar en los resultados reportados y por lo general slo los cuestiona cuando surge una controversia. De este modo, el laboratorio y su personal tienen una clara responsabilidad de corresponder a la confianza del cliente proporcionando la
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respuesta correcta a la parte analtica del problema, en otras palabras, proporcionando resultados que han demostrado ser adecuados a su propsito.
En este afn de proporcionar productos de calidad para el consumidor surge la idea de establecer este proyecto de tesis en la empresa Betapharma S.A. VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO DE VALORACIN DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL PRODUCIDO POR BETAPHARMA S.A. MEDIANTE HPLC
Se realizaron varias pruebas para medir los parmetros propuestos, entre estos tenemos la precisin del sistema en el que se realizaron seis inyecciones repetidas de la misma muestra de estndar y se pudo verificar que est dentro de los parmetros establecidos.
Se determin la precisin del mtodo en el cual se analizaron muestras de acuerdo al protocolo de anlisis, inyectndolas por triplicado y analizando el porcentaje de variacin de este conjunto de datos se obtuvo que se encuentran dentro de los niveles de aceptacin.
En cuanto a la precisin entre das, se realiz el mismo procedimiento anterior variando el da de anlisis con lo cual se obtuvo resultados dentro del rango establecido.
Con respecto a la precisin entre analistas se realiza el mismo procedimiento de precisin del mtodo pero realizado por dos analistas diferentes, obteniendo resultados dentro de los niveles de aceptacin.
En la determinacin de la linealidad, se prepararon muestras de estndar en un rango de 50 a 150 por ciento de la concentracin normal del estndar de Amoxicilina utilizado en la determinacin de Amoxicilina en polvo para suspensin oral.
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En la determinacin de la recuperacin del mtodo se prepar 15 frascos de Amoxicilina en polvo para suspensin oral tal como indica la ficha de produccin del producto, esto se lo hizo en un rango de 50 a 150 por ciento de la cantidad etiquetada y por triplicado.
En cuanto a la robustez del mtodo, se vari deliberadamente el flujo, aumentndolo en un 10 % obteniendo resultados dentro de los niveles de aceptacin.
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CAPITULO I
PARTE TERICA
1.1
VALIDACIN
La validacin de un mtodo de ensayo es un requisito primordial cuando deseamos obtener resultados tcnicamente vlidos, exactos y confiables. Sin embargo, el conocimiento de la importancia de validacin, de por qu debe hacerse, cundo debe hacerse, y saber exactamente lo que necesita realizarse parece ser insuficiente. (40)
Muchas orientaciones relacionadas con los mtodos de validacin son ofrecidas en la literatura cientfica, especialmente sobre mtodos particulares de anlisis y medicin, pero la mayora de las veces estas no son utilizadas adecuadamente. Algunos analistas ven el proceso de validacin del mtodo como algo que solo puede hacerse de una forma externa al laboratorio. Por consiguiente no desarrollan protocolos internos de validacin que son de gran ayuda en numerosas situaciones, adems de ser tcnicamente factibles. La validacin del mtodo es necesaria ya que permite conocer los parmetros de desempeo del mtodo y proporciona un alto grado de confianza y seguridad de los resultados que se obtienen. (40)
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1.1.1. DEFINICIONES
La norma COVENIN-ISO 9000:2000 define a la validacin como: la confirmacin por examen y el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos particulares para una utilizacin o aplicacin especfica prevista. (11)
Segn la norma ISO 8402 Es la confirmacin mediante exmenes y provisin de evidencias objetivas que se cumplen los requisitos particulares para un uso especfico determinado. (26)
Aplicando el concepto de validacin al ensayo podemos definir que la validacin de un mtodo de ensayo es el proceso que establece mediante amplios estudios de laboratorio que los parmetros de desempeo del mtodo de ensayo cumplen las especificaciones relacionadas con el uso previsto con los resultados del ensayo.
La calificacin de adecuado para el uso aplicada a un mtodo de ensayo o calibracin, es una garanta de que la influencia del mtodo sobre el resultado de la medicin est bajo control, al realizar el anlisis del proceso de medicin como sistema, nico enfoque que evala integralmente el proceso de medicin.
1.1.2. LA VALIDACIN COMO REQUISITO DE LA NORMA COVENIN 2534:2000.
Entre los requisitos tcnicos establecidos en la norma COVENIN 2534:2000 (ISO/ICE 17025:1999) se encuentra la validacin de mtodos, con ellos se garantiza que el laboratorio analice y tenga bajo control unos de los factores que incide en la confiabilidad y exactitud de los resultados que informa. (10)
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En el alcance del requisito, para confirmar que los mtodos que se utilizan en el laboratorio se ajustan al uso propuesto se establece la validacin de:
Mtodos no normalizados. Mtodos diseados o desarrollados por el laboratorio Mtodos normalizados utilizados fuera de su alcance proyectado Mtodos normalizados que han sido modificados o ampliados. (46)
El requisito establece de forma obligatoria que:
El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la validacin y declarar la conformidad acerca de lo apropiado del mtodo de ensayo para el uso previsto. El rango y la exactitud de los valores (parmetros de desempeo) que se obtienen con los mtodos validados (lmite de deteccin, selectividad, linealidad, repetibilidad, reproducibilidad, robustez, etc.) tal como fueron evaluados para el uso previsto deben ser pertinentes a las necesidades del cliente. (17)
El requisito sugiere que:
La validacin sea tan extensiva como el propio mtodo de ensayo lo requiera y pueda incluir los procesos relacionados con el muestreo, el manejo y el trasporte de la muestra.
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Entre las tcnicas disponibles para determinar los parmetros de desempeo del mtodo se aplique la calibracin mediante patrones de referencia o materiales de referencia, la comparacin de los resultados con otros mtodos de anlisis, las comparaciones interlaboratorios y la evaluacin de la incertidumbre. La validacin incluya la especificacin de los requisitos, la determinacin de las caractersticas de los mtodos, la verificacin de que los requisitos pueden cumplirse por el mtodo usado y una declaracin sobre la validez. La validacin sea siempre desde el punto de vista prctico un equilibrio entre costos riesgos y posibilidades tcnicas. (42)
1.1.3. TIPOS DE VALIDACIN
1.1.3.1. Validacin prospectiva
Esta validacin es el enfoque defendido en los textos. Se realiza en un proceso fabricacin de principio activo o de drogas antes de su comercializacin.
1.1.3.2. Validacin de la competencia
Esta validacin se realiza: Cuando todos los datos y parmetros de la produccin no est disponible debido a que un nmero limitado de lotes se produce. Cuando los lotes de los principios activos o drogas rara vez se producen, o cuando el ingrediente activo es producido a partir de un proceso validado pero modificado. (27)
26
1.1.3.3. Validacin retrospectiva
Esta validacin se puede abordar cuando los procesos se han utilizado sin modificaciones significativas en comparacin con la calidad del ingrediente activo. Esta validacin se puede encontrar en la llamado "la validacin de la historia." la serie o lotes seleccionados para la validacin retrospectiva deben ser representativos de todos los lotes fabricados durante el periodo de revisin y debe ser lo suficientemente numerosos para mostrar la consistencia del proceso y reproducibilidad. (11)
1.2
VALIDACIN DEL MTODO ANLITICO
Se puede interpretar la validacin del mtodo analtico como el proceso de definir un requisito (por ejemplo un requisito analtico) y confirmar que el mtodo de ensayo bajo consideracin tiene capacidades de desempeo consistentes con lo que la aplicacin requiere. De hecho la definicin que proporciona la norma ISO 8402 es Confirmacin mediante examen y provisin de evidencias objetivas que se cumplen los requisitos particulares para su uso especfico. (26)
Por consiguiente como algo implcito es necesario evaluar la capacidad de desempeo del mtodo, el juicio de la convivencia del mtodo es importante; en el pasado la validacin del mtodo se tendi a concentrar en el proceso de evaluacin del los parmetros de desempeo. Tambin est implcito en el proceso de validacin del mtodo que los estudios para determinar los parmetros de desempeo del mtodo son llevados a cabo utilizando equipos que estn trabajando correctamente, dentro de su especificacin y adecuadamente calibrados. Igualmente, el analista que lleva a cabo los estudios debe ser competente y tener conocimientos suficientes en el campo de trabajo que facilitar poder tomar decisiones apropiadas a partir de las observaciones realizadas o de los progresos del estudio.
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1.2.1. RESPONSABILIDADES EN EL PROCESO DE VALIDACIN
El laboratorio que utiliza un mtodo analtico es el responsable por asegurar que el mtodo haya sido validado. En ciertos casos el laboratorio debe llevar a cabo trabajo adicional para complementar los datos existentes sobre la validacin. Por ejemplo, cuando un mtodo ha sido validado por organizaciones que publican normas, tales como AOAC (Association of Analytical Chemist) y la ASTM (American society for testing and materials), el usuario slo necesita establecer datos de desempeo para el uso del mtodo. (48)
Mucho se ha publicado en la literatura acerca de la validacin de mtodos analticos mediante comparaciones interlaboratorio. Hay numerosos documentos que relacionan esta tipo de validacin. Si se desarrolla un mtodo de ensayo con amplias perspectivas de uso, quizs como un procedimiento normalizado publicado, entonces, una comparacin que involucre un grupo de laboratorios es probablemente la manera preferida de llevar a cabo la validacin. Sin embargo no siempre es una opcin conveniente para los laboratorios de ensayos industriales. La aplicacin para la que el mtodo se requiere puede ser secreta, en tal magnitud que ningn otro laboratorio estara interesado en colaborar. Aquellos que podran estar interesados serian los competidores. (48)
1.2.2. CARACTERSTICAS DE UN ESTUDIO DE VALIDACIN DE METODOS
Es esencial que los estudios de validacin sean representativos. Esto significa que, en la medida de lo posible, deberan realizarse los estudios necesarios para obtener una estimacin realista del nmero y la gama de efectos que se producen durante el uso normal del mtodo, al tiempo que deben analizar la gama de concentraciones y de tipos de muestra que abarca el mtodo. Por ejemplo, si un factor (la temperatura ambiente) vara sustancialmente durante la
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realizacin de un experimento de fidelidad, los efectos de dicho factor aparecen directamente en la varianza observada y no precisan de un estudio adicional, a menos que se desee mejorar todava ms el mtodo.
En el contexto de la validacin de mtodos, una variacin representativa significa que el factor debe tomar una distribucin de valores adecuada para el rango previsto del parmetro en cuestin. (46)
Para los parmetros continuos medibles, puede ser un rango permitido, una incertidumbre determinada o un rango esperado; para los factores discontinuos, o factores con efectos impredecibles, como la matriz de la muestra, un rango representativo corresponde a los diferentes tipos o niveles de factor permitidos o hallados durante el uso normal del mtodo. Idealmente, la representatividad abarca el rango de valores y tambin su distribucin. Por desgracia, a menudo no es econmicamente viable disponer de la variacin completa de muchos factores a muchos niveles, no obstante, para propsitos prcticos los ensayos basados en extremos del rango esperado o en cambios mayores de lo previsto son un mnimo aceptable.
Al seleccionar los factores de la variacin, es importante asegurarse de "ejercer" al mximo los mayores efectos. Por ejemplo, si la variacin diaria (quizs a causa de los efectos del recalibrado) es sustancial comparada con la repetibilidad, dos determinaciones de cada una durante cinco das ofrecer una mejor estimacin de la fidelidad intermedia que cinco determinaciones de cada una durante dos das. Diez determinaciones individuales en das separados sera todava mejor, aunque no ofrecera informacin adicional sobre la repetibilidad da a da.
Al planificar comprobaciones de significacin, los estudios deben tener suficiente potencia para detectar estos efectos antes de que lleguen a revestir una fuerte importancia prctica (comparable al mayor componente de incertidumbre).
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Adems, cabe tener en cuenta las siguientes consideraciones: Si se sabe o se sospecha que los factores interactan, es importante tener en cuenta el efecto de interaccin. Esto puede lograrse realizando una seleccin aleatoria desde diferentes niveles de interaccin de los parmetros o mediante un meticuloso diseo sistemtico para obtener informacin de los efectos de interaccin o de la covarianza. Al realizar estudios del sesgo global, es importante que los materiales y los valores de referencia sean relevantes para los materiales objeto de los ensayos rutinarios.
1.2.3. ALCANCE DE LOS ESTUDIOS DE VALIDACIN
El alcance de la validacin de un mtodo nuevo, modificado o desconocido depende del estatus del mtodo y de la competencia del laboratorio encargado de llevarla a cabo. A continuacin se indican algunas sugerencias relativas a la validacin y las mediciones de comprobacin en diferentes circunstancias. Salvo indicacin explcita, se supondr que el mtodo tendr un uso peridico. (41)
1.2.3.1. El laboratorio debe utilizar un mtodo totalmente validado.
El mtodo ha sido estudiado en un ensayo colectivo y el laboratorio debe comprobar si es capaz de alcanzar su rendimiento publicado (o si es capaz de cumplir los requisitos de las tareas analticas). (31)
El laboratorio debe realizar estudios de la fidelidad, del sesgo (incluidos estudios de Aparicin de la matriz) y posiblemente estudios de la linealidad, aunque puede omitir algunas pruebas, como por ejemplo la de robustez.
30
1.2.3.2. matriz.
El laboratorio debe utilizar un mtodo totalmente validado, pero con una nueva
El mtodo ha sido estudiado en un ensayo colectivo y el laboratorio debe comprobar que la nueva matriz no introduce nuevas fuentes de error en el sistema. Se precisa el mismo rango de validacin que anteriormente. (32)
1.2.3.3. El mtodo ha sido publicado en la literatura cientfica junto con algunas caractersticas analticas
El laboratorio debe realizar estudios de la fidelidad, del sesgo (incluidos estudios de la variacin de la matriz), de la robustez y de la linealidad.
1.2.3.4. El mtodo ha sido publicado en la literatura cientfica sin especificacin de sus caractersticas o ha sido desarrollado internamente (28)
El laboratorio debe realizar estudios de fidelidad, del sesgo (incluidos estudios de la Aparicin de la matriz), de la robustez y de la linealidad.
1.2.3.5. El mtodo es Emprico
Un mtodo emprico se caracteriza porque la cantidad estimada es simplemente el resultado hallado tras aplicar el procedimiento. Esto difiere de las mediciones que valoran cantidades independientes del mtodo, como la concentracin de un analito particular en una muestra, en las que el sesgo del mtodo es convencionalmente cero y la variacin de la matriz (dentro de la clase definida) es irrelevante. No puede olvidarse el sesgo del laboratorio, pero probablemente sea difcil estimarlo mediante un ensayo en un solo laboratorio. Adems, es improbable que haya materiales de referencia disponibles. En ausencia de datos de un Ensayo colectivo, pueden obtenerse algunas estimaciones de la fidelidad interlaboratorio a
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partir de estudios de robustez especficamente diseados o calculadas utilizando la funcin de Horwitz. (19)
1.2.3.6. Cambios en el personal o el equipo
Cambios en los principales instrumentos, nuevos lotes de reactivos muy variables (por ejemplo, anticuerpos policlonales), cambios realizados en el recinto del laboratorio, mtodos utilizados por primera vez por nuevos empleados o un mtodo validado utilizado tras un perodo de desuso. La accin esencial es demostrar que no se han producido cambios nocivos. La comprobacin mnima es realizar una prueba de sesgo y un experimento a priori y a posteriori de los materiales de prueba o de control habituales. En general, las pruebas realizadas deben reflejar el Posible impacto del cambio en el Procedimiento analtico. (20)
1.2.4. CATEGORIA DEL MTODO
Segn la USP XXII los mtodos analticos se clasifican en varias categoras para su validacin. Los parmetros de validacin que se deben considerar varan segn los requisitos legales exigidos por distintas organizaciones. (17)
1.2.4.1. Categora I - Mtodos analticos para la cuantificacin de los principales componentes de las sustancias activas de medicamentos a granel o ingredientes (incluidos los conservantes) en productos farmacuticos acabados.
1.2.4.2. Categora II - Mtodos analticos para la determinacin de impurezas y compuestos de degradacin a granel sustancias medicinales o productos farmacuticos acabados. Estos mtodos incluyen anlisis cuantitativos y los lmites de las pruebas.
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1.2.4.3. Categora III - mtodos de anlisis empleados para la determinacin de las caractersticas de rendimiento (es decir, la disolucin, liberacin del frmaco).
1.2.4.4. Categora IV - las pruebas de identificacin o las propiedades fsicas. (1)
NOTA: No todos los mtodos analticos fcilmente cabe en una de las cuatro categoras anteriores. Para estos mtodos, cada elemento de datos (punto C 3, abajo) tienen que considerarse caso por caso para aplicabilidad a la medida prevista del mtodo. Discusin con RAS-analticos para orientacin puede ser apropiada.
TABLA No. 1.
ELEMENTOS PARA LA VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS EN FUNCIN DEL ANLISIS DE CATEGORA.
FUENTE: GUIDELINE FOR VALIDATION OF ANALYTICAL METHODS MARZO 16, 2000
*Puede ser necesario en funcin de la naturaleza de la prueba especfica a Tambin requiere una determinacin del factor de respuesta relativo (RRF) como se describe en el texto. b Aadido segn ICH. (42)
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1.2.5. PROCESO DE VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO
Consiste en un plan experimental que debe contener las siguientes especificaciones:
1.2.5.4. Especificidad
Se define como la capacidad de un mtodo analtico para medir exacta y especficamente el analito sin interferencias de impurezas, productos de degradacin o excipientes que pueden estar presentes en la muestra. Se expresa como el grado de inexactitud del mtodo. La evaluacin de este parmetro es especialmente importante en el caso de los mtodos analticos diseados para la cuantificacin del analito en formulaciones y en estudios de estabilidad. (2)
Aunque la especificidad y la selectividad se consideran trminos equivalente, algunos autores los diferencian, considerando la selectividad como la capacidad de detectar simultnea o separadamente sustancias qumicas diferentes presentes en una misma muestra y a la especificidad como la capacidad de detectar el analito sin interferencias de otro compuesto. La selectividad se determina comparando los resultados del anlisis de muestras con los resultados del anlisis de las muestras en presencia de productos relacionados. Rampazoo recomienda el anlisis de muestras del analito sometidas a condiciones de degradacin artificial hasta el 20 % de degradacin, lo cual constituye un criterio de especial inters cuando se desconocen los productos de degradacin. (37)
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La especificidad sugiere que ningn compuesto excepto el analito contribuye al resultado de un ensayo. Esto se logra casi nicamente con las tcnicas acopladas (por ejemplo, generacin de hidruros- absorcin atmica). Para probar esto hay varias posibilidades. Se agrega el componente que interfiere en cantidades sucesivas y se evala su influencia. Se prueba un estndar certificado de la matriz con cantidades conocidas del analito. Si se encuentra el valor correcto, el procedimiento es especfico. En el caso de separaciones Cromatogrficas puede probarse la pureza del pico por mtodos espectroscpicos (espectrometra de masas, infrarroja o ultravioleta- visible. Puede tambin modificarse el sistema de separacin (fase mvil y/o fase estacionaria) en el caso de la cromatografa. Es muy baja la probabilidad de que la misma interferencia produzca en ambos casos el mismo error en los resultados.
1.2.5.5. Precisin
Es una medida de cun cerca estn los resultados unos de otros, y generalmente se expresa por medidas como la desviacin estndar, que describe la dispersin de los resultados.
La forma ms comn de medicin en los laboratorios involucra el uso de distintos equipos y distintos analistas para obtener resultados de un mismo mtodo. Por ello la evaluacin de la precisin del mtodo es mejor que sea validada en trminos de su precisin intermedia, es decir como la reproducibilidad intralaboratorio (distintos analistas, das, equipos, etc.).
La precisin refleja la medida en que los valores de una serie repetida de ensayos analticos que se realizan sobre una muestra homognea son semejantes entre s. La USP XXII expresa que la
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precisin es la expresin del grado de la reproducibilidad, mientras que la Norma Britnica incluye slo la repetibilidad y la reproducibilidad.
1.2.5.6. Repetibilidad:
Refleja la precisin de un mtodo, cuando se desarrolla bajo las mismas condiciones, utilizando la misma muestra, analizada por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos y durante una misma sesin de trabajo en un perodo corto. (33)
El parmetro estadstico que caracteriza a este estudio es la desviacin estndar o preferiblemente el coeficiente de variacin (desviacin estndar relativa). Este parmetro permite evaluar la incertidumbre en la estimacin de la media, es decir, el error aleatorio que se corresponde con la dispersin de los datos alrededor de la media. (34)
1.2.5.7. Reproducibilidad:
Es la medida de la precisin de los resultados de ensayos realizados sobre la misma muestra homognea, pero ejecutados por diferentes analistas en das diferentes y se expresa con los mismos parmetros matemticos que la repetibilidad. El coeficiente de variacin en el estudio de la reproducibilidad debe ser igual o mayor que el obtenido en el estudio de repetibilidad para la misma cantidad o concentracin debido a la mayor fuente de error que existe en la reproducibilidad.
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1.2.5.8. Linealidad
Es la capacidad del mtodo analtico para obtener resultados directamente proporcionales a la concentracin o cantidad del analito en un rango definido. Se determina mediante el tratamiento matemtico de los resultados obtenidos en el anlisis del analito a diferentes cantidades o concentraciones. La seleccin del rango y del nmero de puntos experimentales est estrictamente relacionado con la aplicacin del mtodo. (29)
Se recomienda en la validacin de mtodos por CLAR para la cuantificacin de un principio activo en forma de materia prima de 80,0 hasta 120,0 % del valor terico y de 3 a 5 puntos experimentales, mientras que para su aplicacin en la determinacin del analito como ingrediente activo de una formulacin recomienda un rango desde 50,0 hasta 150,0 % y con 5 7 puntos experimentales. Para que el mtodo se considere lineal, el coeficiente de correlacin debe ser mayor que 0,99. (43)
1.2.5.9. Recuperacin
El porcentaje de recuperacin es el cociente entre la cantidad de analito medida y el contenido en la muestra. En el caso ideal, se obtiene un 100%. En mediciones experimentales puede perderse analito especialmente en el caso de tratamientos complejos de muestras con analito en cantidades traza, dando lugar a porcentajes de recuperacin menores (importante especialmente en el caso de procedimientos cromatogrficos). (18)
Para calcular la recuperacin se determina la funcin de recuperacin. Para lo cual se agregan a la muestra antes del tratamiento cantidades sucesivas del analito y se determinan
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contra una calibracin base. Las cantidades encontradas se grafican contra las agregadas. En este caso de recuperacin es del 100% y es suficiente una calibracin base, analito en un disolvente.
Si los valores se salen de este marco, debe hacerse una calibracin a partir de matriz y analito en un disolvente para eliminar el efecto de la matriz. Variando el tiempo de adicin del analito (por ejemplo, antes y despus de un paso de concentracin) puede determinarse la recuperacin para pasos aislados de un procedimiento.
En caso de que la matriz introduzca muchas variaciones debe utilizarse en lugar de una calibracin con la matriz de la muestra el mtodo del agregado patrn (o de las adiciones estndar), el cual consiste en agregar concentraciones sucesivas de analito a la muestra. Al graficar el aumento de la seal contra la cantidad adicionada se obtiene una funcin de calibracin, a partir de la cual puede obtenerse la cantidad de analito presente en la muestra original.
Este mtodo conduce a un aumento claro en la concentracin del analito. Para mantener el error lo ms pequeo posible, las cantidades aadidas deben ser tales que no sobrepasen el intervalo de trabajo. (18)
1.2.5.10. Robustez
La robustez de un mtodo analtico es la resistencia al cambio en los resultados obtenidos por un mtodo analtico cuando se realizan desviaciones menores a partir de las condiciones experimentales descritas en el procedimiento. Los lmites de los parmetros experimentales deben especificarse en el protocolo del mtodo, y dichas desviaciones permisibles, por separado o en combinacin, no deben producir cambios significativos en los resultados obtenidos (un cambio significativo implica que el mtodo no puede funcionar dentro de
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los lmites de incertidumbre que definen la adecuacin al propsito). Deben identificarse los aspectos del mtodo susceptibles de afectar a los resultados y debe evaluarse su influencia en el rendimiento del mtodo mediante pruebas de robustez. (15)
Un mtodo es ms robusto entre menos dependan los resultados del ensayo de una modificacin en las condiciones de ste. Al desarrollar un nuevo mtodo analtico debe determinarse la modificacin de los resultados por el cambio en las condiciones del ensayo.
Las condiciones que afectan el mtodo de medicin son por ejemplo, para el caso de cromatografa:
Laboratorio, lugar de la medicin Personal. Aparatos. Reactivos, disolventes, estndares, etc. Caudal de la fase mvil. pH de la fase mvil (p. ej. en HPLC). Gradiente de temperatura (p. ej. en GC).
Modificaciones pequeas a estas condiciones deben afectar muy poco o nada al resultado del anlisis.
Para determinar la robustez de un procedimiento analtico pueden modificarse algunas condiciones del anlisis y seguir las afectaciones a los resultados o a los parmetros estadsticos. A menudo se utiliza tambin la evaluacin de espectros o cromatogramas.
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Un aspecto importante de la robustez es la estabilidad de todas las muestras, estndares y reactivos, tanto en el almacenamiento como durante las condiciones de ensayo. En este caso pueden ser parmetros a probar:
Sensibilidad a la temperatura. Sensibilidad a la luz. Hidrlisis p. ej. por la humedad del aire. Facilidad de oxidacin. Descomposicin qumica. Efectos catalticos, p. ej. por las paredes del contenedor. Adsorcin, p. ej. durante la filtracin de disoluciones con trazas. Precipitacin, p. ej. al dejar mucho tiempo una disolucin. (18)
1.2.6. HPLC
Utilizada como metodologa de eleccin para la cuantificacin de droga residual, tiene como sus principales ventajas que es un mtodo de anlisis cuantitativo, elevada especificidad y sensibilidad. (36)
La cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) es, dentro de las tcnicas Cromatogrficas, la ms utilizada. El proceso de separacin cromatogrfica puede definirse como la transferencia de masas entre una fase estacionaria y una mvil. La mezcla que contiene los compuestos a separar es disuelta e inyectada en una columna rellena de fase estacionaria a travs de la cual es forzada a pasar por una fase mvil impulsada por la bomba de alta presin. Dentro de la columna la mezcla se separa en sus componentes en funcin de su interaccin entre las dos fases. Esta separacin puede ser modificada eligiendo adecuadamente tanto la fase mvil como la estacionaria, el flujo de la fase mvil o la
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temperatura de la separacin. De esta forma la tcnica de HPLC adquiere un alto grado de versatilidad difcil de encontrar en otras tcnicas, siendo capaz de separar los componentes de una gran variedad de mezclas.
En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con ciertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna.
El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eludo de la columna se denomina tiempo de retencin y se considera una propiedad identificativa caracterstica de un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria.
La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce as su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la cromatografa. Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos. (14)
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1.2.6.4. Fases y Columnas
1.2.6.4.1. Fase mvil: es la fase que se mueve en una direccin definida. Puede ser un lquido (cromatografa de lquidos o CEC). un gas (cromatografa de gases) o un fluido supercrtico (cromatografa de fluidos supercrticos). La fase mvil consiste en la muestra que est siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el interior de la columna. En el caso de la cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC, la fase mvil es un disolvente no-polar como el hexano (fase normal) o bien algn disolvente polar (cromatografa de fase reversa) y la muestra que va a ser separada. La fase mvil se mueve a travs de la columna de cromatografa (fase estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la fase estacionaria y se separa.
1.2.6.4.2. Columnas: es la sustancia que est fija en una posicin en el procedimiento de la cromatografa. Un ejemplo es la capa de slica en la cromatografa en capa fina.
1.2.6.4.2.1. Fuentes de dao de una columna de HPLC: Obstruccin por partculas pequeas en los solventes o fases mviles Obstruccin por materiales no eludos en las muestras Variacin de las caractersticas de retencin por incremento de materiales no eludos. (36)
1.2.6.5. Deteccin
La eficiencia de un detector cromatogrfico depende de la relacin entre la cantidad fsica medida y la composicin del efluente, as como tambin de las caractersticas de las seal de transferida.
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1.2.6.5.1.
Tipos de detectores en HPLC:
Detectores basados en una propiedad de la fase mvil. Ejemplo: Detector de Indice de Refraccin Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ejemplo: Detector de Fluorescencia, Detector Ultravioleta
1.2.6.5.2.
Detectores ms utilizados en HPLC:
Detector UV. Hay bsicamente tres tipos: Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Arreglo de Diodos Detector de Indice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos detectores, pero solamente existen ahora dos tipos: Tipo Deflexin Tipo Fresnel Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacin. Detector de Fluorescencia Inducida por Laser Segn la Fuente de Excitancin Segn el sistema ptico Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos: Detector Amperomtrico Detector Conductimtrico Detector Potenciomtrico
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1.2.7. PRINCIPIO ACTIVO AMOXICILINA
GRAFICO N 1. ESTRUCTURA MOLECULAR DE AMOXICILINA
La amoxicilina es una penicilina semi-sinttica similar a la ampicilina, con una mejor biodisponibilidad por va oral que esta ltima. Debido a su mejor absorcin gastrointestinal, la amoxicilina ocasiona unos mayores niveles de antibitico en sangre y unos menores efectos gastrointestinales (en particular, diarrea) que la ampicilina. La amoxicilina tiene un espectro de actividad antibacteriana superior al de la penicilina, si bien no es estable frente a las beta-lactamasas. (30)
Los siguientes microorganismos son considerados, por regla general, susceptibles a la amoxicilina: Actinomyces sp.; Bacillus anthracis; Prevotella melaninogenica;
Bifidobacterium sp.; Bordetella pertussis; Borrelia burgdorferi; Brucella sp.; Clostridium perfringens; Clostridium tetani; Corynebacterium diphtheriae; Eikenella corrodens; Enterococcus faecalis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Eubacterium sp.; Haemophilus influenzae (beta-lactamasa negativa); Helicobacter pylori; Lactobacillus sp.; Listeria monocytogenes; Neisseria meningitidis; Peptococcus sp.; Peptostreptococcus sp.; Propionibacterium sp.; Proteus mirabilis; Salmonella enteritidis; Salmonella sp.; Salmonella typhi; Shigella sp.; Staphylococcus sp. (beta-lactamasa negativa y sensible a
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meticilina/oxacilina slo); Streptococcus agalactiae ( estreptococcos del grupo B); Streptococcus dysgalactiae; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus pyogenes (grupo A beta-hemolticos); Treponema pallidum; Vibrio cholerae; Viridans streptococci.(49)
1.2.7.4. Mecanismo de accin
Los antibiticos beta-lactmicos como la amoxicilina son bactericidas. Actan inhibiendo la ltima etapa de la sntesis de la pared celular bacteriana unindose a unas protenas especficas llamadas PBPs (Penicillin-Binding Proteins) localizadas en la pared celular. Al impedir que la pared celular se construya correctamente, la amoxicilina ocasiona, en ltimo trmino, la lisis de la bacteria y su muerte. La amoxicilina no resiste la accin hidroltica de las beta-lactamasas de muchos estafilococos, por lo que no se usa en el tratamiento de estafilococias.
Aunque la amoxicilina es activa frente a los estreptococos, muchas cepas se estn volviendo resistentes mediante mecanismos diferentes de la induccin de b-lactamasas, por lo que la adicin de cido clavulnico no aumenta la actividad de la amoxicilina frente a estas cepas resistentes. Dado que muchos otros grmenes se estn volviendo resistentes a la amoxicilina, se recomienda realizar un antibiograma antes de instaurar un tratamiento con amoxicilina, siempre que ello sea posible
1.2.7.5. Farmacocintica:
La Amoxicilina es estable en medio cido en presencia de jugos gstricos y puede ser administrada por va oral in tener en cuenta el ritmo de las comidas. Se absorbe rpidamente despus de la administracin oral, alcanzando los niveles mximos en 1-2.5 horas. Difunde
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adecuadamente en la mayor parte de los tejidos y lquidos orgnicos. No difunde a travs de tejido cerebral ni lquido cefalorraqudeo, salvo cuando estn las meninges inflamadas. La vida meda de Amoxicilina es de 61,3 min. El 75% aproximadamente de la dosis de Amoxicilina administrada se excreta por la orina sin cambios mediante excrecin tubular y filtracin glomerular; esta excrecin puede ser retardada administrando probenecid, y tambin es mas lenta en los pacientes con insuficiencia renal que requieren un reajuste de las dosis. La amoxicilina no se liga a las protenas en proporcin elevada (17%). La administracin de una dosis de 500 mg de amoxicilina alcanza, como promedio, unos niveles sricos pico de 7,5 ug/ml y todava puede detectarse amoxicilina en suero 8 horas despus de su administracin. La presencia de alimentos en el estmago no interfiere significativamente la absorcin de la amoxicilina.
Una pequea cantidad de la Amoxicilina se excreta en la leche materna. En cambio, la amoxicilina no cruza la barrera placentaria. (3)
1.2.7.6. Indicaciones y Posologa
La amoxicilina est indicada en el tratamiento de infecciones sistmicas o localizadas causadas por microorganismos gram-positivos y gram-negativos sensibles, en el aparato respiratorio, tracto gastrointestinal o genitourinario, de piel y tejidos blandos, neurolgicas y odontoestomatolgicas. Tambin est indicado en la enfermedad o borreliosis de Lyme, en el tratamiento de la infeccin precoz localizada (primer estadio o eritema migratorio localizado) y en la infeccin diseminada o segundo estadio. Tratamiento de erradicacin de H. pylori en asociacin con un inhibidor de la bomba de protones y en su caso a otros antibiticos: lcera pptica, linfoma gstrico tipo MALT, de bajo grado. Prevencin de endocarditis bacterianas (producidas por bacteriemias postmanipulacin / extraccin dental).
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Administracin oral:
Adultos, adolescentes y nios de ms de 40 kg: las dosis recomendadas son de 500 mg cada 12 horas o 250 mg cada 8 horas. En el caso de infecciones muy severas o causadas por grmenes menos susceptibles, las dosis pueden aumentarse a 500 mg cada 8 horas. Lactantes y nios de < 40 kg: para infecciones moderadas, las dosis recomendadas sobre 20 mg/kg/da divididos en dosis cada 8 horas o 25 mg/kg/da en dosis cada 12 horas. Estas dosis se pueden aumentar hasta 40 mg/kg/da en tres administraciones o a 45 mg/kg/da en dos administraciones. Neonatos y lactantes de < 3 meses de edad: la mxima dosis recomendada es de 30 mg/kg/da en dos dosis al da. (4)
1.2.7.7. Contraindicaciones
La amoxicilina est contraindicada en pacientes con alergias conocidas las penicilinas, cefalosporinas o al imipenem. La incidencia de hipersensibilidad cruzada es del 3 al 5%. Los pacientes con alergias, asma o fiebre del heno son ms susceptibles a reacciones alrgicas a las penicilinas. (13)
En los pacientes con insuficiencia renal (CrCl < 30 ml/min) se deben ajustar las dosis de amoxicilina. La amoxicilina est clasificada en la categora B de riesgo para el embarazo. Los datos en animales indican que el frmaco no es teratognico y, en general, las penicilinas son consideradas como frmacos seguros durante el embarazo. La amoxicilina se excreta en la leche materna en pequeas cantidades y puede producir rash, diarrea o
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superinfecciones en los lactantes. Se debern considerar estos riesgos para el lactante cuando se prescriba un tratamiento con amoxicilina a la madre.
La amoxicilina se debe usar con precaucin en pacientes con leucemia linftica que son ms susceptibles a los rash. Lo mismo ocurre en los pacientes con SIDA, otras infecciones virales y especialmente en los pacientes con mononucleosis
1.2.7.8. Interacciones
La administracin de amiloride antes de la Amoxicilina reduce la biodisponibilidad del antibitico en un 27% y la Cmax en un 25%. No se observaron variaciones en el aclaramiento renal de la Amoxicilina. Aunque se desconoce la significancia clnica de esta interaccin se recomienda no administrar ambos frmacos simultneamente, dejando transcurrir unas dos horas como mnimo entre uno y otro frmaco.
El probenecid inhibe la excrecin tubular de la Amoxicilina, aumentando los niveles plasmticos del antibitico. En la prctica clnica estos dos frmacos se suelen asociar para el tratamiento de la gonorrea. Por regla general, esta interaccin no ocasiona problemas clnicos excepto en pacientes con insuficiencia renal.
En muchas ocasiones, los antibiticos aminoglucsidos de muestran sinrgicos con la amoxicilina frente a enterococos y estreptococos del grupo B. Sin embargo, por existir una incompatibilidad qumica, ambos antibiticos no se deben mezclar ni administrar al mismo
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tiempo. Algunas penicilinas inactivan los antibiticos aminoglucsidos cuando se mezclan en infusiones intravenosas. (1)
La neomicina inhibe parcialmente la absorcin oral de la amoxicilina
El uso concomitante de la amoxicilina y el cido clavulnico mejora la actividad antibacteriana de la amoxicilina frente a las bacterias que producen beta-lactamasas como la H. influenzae. Esta interaccin es aprovechada y existen asociaciones de amoxicilina + cido clavulnico.
La Amoxicilina en grandes dosis inhibe la excrecin tubular renal de metotrexato, aumentando las concentraciones plasmticas de este ltimo y, por consiguiente, su potencial toxicidad. De igual forma, se ha observado que la administracin concomitante de amoxicilina y alopurinol aumenta la incidencia del rash inducido por este ltimo.
La Amoxicilina puede reducir la eficacia de los anticonceptivos orales que contienen estrgenos debido, bien a una estimulacin del metabolismo de estos, bien a un reduccin de su circulacin enteroheptica al reducirse la flora gastrointestinal por accin del antibitico. Se han documentado casos de fracasos anticonceptivos en pacientes tratadas con amoxicilina, aunque se desconoce la naturaleza de esta interaccin. Por lo tanto, se recomienda advertir a las pacientes que se encuentre bajo anticonceptivos orales de la posibilidad de un fallo anticonceptivos para que tomen medidas alternativas durante el tratamiento con amoxicilina
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La nifedipina parece aumentar la absorcin de la amoxicilina estimulando el transporte activo del antibitico a travs del epitelio intestinal. Sin embargo esta interaccin parece no tener ninguna significancia clnica
La bromelana aumenta la absorcin de la amoxicilina. Se observ que 80 mg de bromelaina administrados conjuntamente con la amoxicilina aumentaba los niveles plasmticos del antibitico, aunque se desconoce el mecanismo de esta interaccin. Una antigua publicacin tambin informa que la bromelana mejora la accin antibacteriana de algunos antibiticos como la penicilina, el cloramfenicol y la eritromicina en el tratamiento de una serie de infecciones, y pacientes que no haban respondido al tratamiento previamente, fueron curados al aadir bromelana 4 veces al da. Algunos mdicos prescriben dosis de bromelana de 2.400 u.d.g (unidades disolventes de gelatina).
Probiticos : la levadura Saccharomyces boulardii ha mostrado reducir la frecuencia de la diarrea en pacientes tratados con amoxicilina, aunque el estudio que describe esta interaccin consta de pocos casos. Las dosis de Saccharomyces boulardii eran de 1 g/da.
Por el contrario, nios que fueron tratados con una combinacin de Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus bulgaricus, y amoxicilina no mostraron una reduccin en la incidencia de la diarrea. De esta manera, no parece que el yogurt proteja significativamente de la diarrea inducida por la amoxicilina.
Se han observado falsos positivos en los tests de glucosa en orina de pacientes tratados con penicilinas, en las pruebas que usan solucin de Benedict o de Fehling o Clinitest. Sin
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embargo, esta interaccin no se produce con las tiras reactivas basadas en la glucosaoxidasa. (13)
1.2.7.9. Reacciones Adversas
Los efectos secundarios ms frecuentes son los asociados a reacciones de hipersensibilidad y pueden ir desde rash sin importancia a serias reacciones anafilcticas. Se ha descrito eritema multiforme, dermatitis exfoliativa, rash maculopapular con eritema, necrolisis epidrmica txica, sndrome de Stevens-Johnson, vasculitis y urticaria.
En alguna rara ocasin se observado nefritis intersticial con necrosis tubular renal y sndrome nefrtico.
Los efectos secundarios ms comunes, asociados al tracto digestivo son similares a los de otros antibiticos y se deben a la reduccin de la flora: Nasea/vmitos, anorexia, darrea, gastritis, y dolor abdominal. En algn caso puede producirse colitis pseudomembranosa durante el tratamiento o despus, si bien este efecto suele ser bastante raro.
Pueden producirse superinfecciones durante un tratamiento con amoxicilina, en particular si es de larga duracin. Se han comunicado candidiasis orales y vaginales.
Los efectos adversos sobre el sistema nervioso central incluyen cefaleas, agitacin, insomnio, y confusin, aunque no son muy frecuentes. Se han comunicado convulsiones en
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pacientes con insuficiencia renal a los que se administraron penicilinas en grandes dosis y por lo tanto las dosis de amoxicilina deben reajustarse convenientemente en estos pacientes.
Los efectos hematolgicos son poco frecuentes y suelen ir asociados a reacciones de hipersensibilidad: se han descrito eosinofilia y hemolisis anemia (incluyendo anemia hemoltica) trombocitopenia, prpura trombocitopnica, neutropenia, agranulocitosis, y leucopenia. Estas reacciones adversas son reversibles al discontinuar el tratamiento. (30)
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CAPITULO II
PARTE EXPERIMENTAL
Diseo experimental Protocolo Tcnicas para validacin del mtodo de anlisis.
El presente capitulo tiene por objeto describir un programa experimental empleado como base de trabajo para ejecutar la validacin del procedimiento de anlisis de Amoxicilina en polvo para suspensin oral. Ciertas partes que conforman el protocolo expuesto a continuacin estn estructuradas como Instructivo de Trabajo (IT).
2.1
DISEO EXPERIMENTAL
2.1.1 CARACTERISTICAS DEL DISEO EXPERIMENTAL
LUGAR: Industria Farmacutica Betapharma
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CANTN: Quito PROVINCIA: Pichincha
2.1.2 FACTORES DEL ESTUDIO
POBLACIN
Se tomar como poblacin las muestras de retencin de Amoxicilina en polvo para suspensin fabricado por Betapharma S.A.
MUESTRA
Las muestras que se tomarn para el estudio son muestras de retencin de Amoxicilina en polvo para suspensin oral fabricado por Betapharma S.A. Las muestras de retencin se toman en un nmero de 10 las cuales provienen del principio, medio y final en el proceso de produccin. Para ste estudio de validacin se han tomado tres muestras de cada uno de los lotes: 0810094, 0810095 y 0810096
2.1.3
MANEJO ESPECIFICO DEL EXPERIMENTO
2.1.3.1 Lugar y Pruebas De Ensayo
Industria Farmacutica Betapharma S.A. QUITO-ECUADOR
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Las pruebas a realizarse son:
Precisin del sistema Precisin del mtodo Precisin entre analistas Precisin entre das Linealidad Recuperacin Robustez.
2.2
PROTOCOLO
TITULO: VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO DE VALORACIN DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL PRODUCIDO POR BETAPHARMA S.A. MEDIANTE HPLC
2.2.1 OBJETIVO
Demostrar que el mtodo analtico de valoracin de Amoxicilina en polvo para suspensin oral es efectivo para obtener un producto 100% dentro de los parmetros establecidos.
2.2.2 ALCANCE
El presente protocolo est dirigido a la validacin del mtodo analtico de valoracin de Amoxicilina en polvo para suspensin oral, el estudio se llevara a cabo tomando en cuenta los siguientes parmetros: Precisin del sistema, Precisin del mtodo, Precisin entre
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analistas, Precisin entre das de anlisis, Linealidad, Recuperacin del mtodo y Robustez del mtodo
2.2.3 MOTIVO DE LA VALIDACIN
No se ha establecido una validacin documentada del mtodo analtico para la valoracin de Amoxicilina en polvo para suspensin.
2.2.4 RESPONSABILIDADES
TABLA No. 2.
RESPONSABILIDADES DEL PROCESO DE VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO.
Accin Responsable Elaborar el Protocolo Revisar el Protocolo Autorizar el Protocolo Anlisis de muestra Preparar Informe Tcnico Emitir Certificado de Validacin
Jefe de Control de Calidad
Analista de Validacin R
Comit de Validacin
R R R R RC
RC Responsabilidad Compartida
R RC
R Responsable
JEFE DE CONTROL DE CALIDAD: Dra. Jeannette Checa COMIT DE VALIDACIN: Dra. Jeannette Checa Jorge Velastegu B.
56
ANALISTA DE VALIDACIN: Jorge Velastegu B.
2.2.5 PARMETROS DE VALIDACIN
Principio Activo (AMOXICILINA)
2.2.6 PROCEDIMIENTO DE ANLISIS
Se utilizar el mtodo de anlisis descrito en el Instructivo de trabajo N: BA01PPS002.2.
Condiciones Cromatogrficas: Fase mvil: Columna: Flujo: Detector: Vol. Inyeccin: Diluyente: Acetonitrilo (96: 40) Lichrospher 100 RP 18, 12.5 cm, 5 1,5 ml/min 230 nm 20 l
La desviacin estndar relativa para inyecciones sucesivas del estndar (5) no debe ser mayor que el 2.0%.
57
DiluyenteDisolver 13.6 g de fosfato monobsico de potasio (KH2P04) en 2000 mL de agua, y ajuste con una solucin de hidrxido de potasio al 45% (w/w) a pH de 5.0 0.1.
Fase mvilPrepare una adecuada fase filtrada y desgasificada de la mezcla de Diluyente.
Acetonitrilo (96:4). Realice los ajustes de ser necesarios. Disminuya la concentracin de Acetonitrilo para incrementar el tiempo de retencin de la Amoxicilina.
Preparacin de la solucin estndar Pesar 30 mg de estndar de referencia de Amoxicilina en un baln aforado de 25 ml, (o el equivalente de Amoxicilina trihidrato), adicionar 15 ml de diluyente, agitar y sonicar hasta completa disolucin. Tomar 1,0 ml de la solucin anterior y llevar a un baln aforado de 100 ml, disolver y aforar con diluyente. Filtre las soluciones por tamao de poro de 0.45 m
Concentracin aproximada: 0.01 mg/ml Solucin problema (Preparar por triplicado)
Reconstituir la suspensin, homogenizar la muestra y pesar 5 ml de suspensin en un baln aforado de 200 ml, adicionar 150 ml de diluyente, agitar y sonicar por 20 minutos, enfriar y aforar.
Tomar 1,0 ml de la solucin anterior y llevar a un baln aforado de 100 ml, disolver y aforar con diluyente.
Filtrar las muestras por 0,45 l.
58
Procedimiento Inyectar separadamente volmenes iguales (20 L) de la preparacin del estndar y solucin problema, registre los cromatogramas y mida la respuesta del pico principal Calcule la cantidad, en mg, de Amoxicilina (C16H19N3O5S) en cada vial considerando la frmula:
mg Amoxicilina / 5mL =
Am Cst x5xd x Ast Cm
Donde: Am = rea de la solucin problema para el pico de Amoxicilina. Ast = rea de la solucin estndar para el pico de Amoxicilina. Cst = Concentracin de la solucin st en mg/ml Cm = Concentracin de la solucin muestra en mg/ml d = Densidad de la suspensin en mg/ml
%=
mg Amoxicilina / 5ml x 100 250
2.2.7 PROCESO DE VALIDACIN
Se realizar el anlisis de los parmetros antes mencionados
59
2.2.8 MTODOS DE ANLISIS
2.2.8.1 Anlisis Qumico:
La cromatografa liquida de alta eficiencia ser empleada en la determinacin cuantitativa de cada uno de los parmetros de control.
.
2.2.9 CRITERIOS DE ACEPTACIN
Cada uno de los parmetros tiene su criterio de aceptacin, as tenemos:
2.2.9.1. Especificidad: Los excipientes que se utilizan en la fabricacin de los productos, la
fase mvil, diluyente y productos de degradacin, no deben presentar picos con el mismo tiempo de retencin en el que aparece. (24)
2.2.9.2. Precisin del sistema: se analizan 6 muestras de estndar a una concentracin del
100% de lo que describe el mtodo de anlisis, sta desviacin estndar relativa debe ser menor a 2,8. (24)
2.2.9.3. Precisin del mtodo: se analizan 6 muestras provenientes de la misma muestra
madre o solucin homognea, cada una por triplicado, la desviacin estndar relativa no debe ser superior al 3.9. (24)
60
2.2.9.4. Precisin entre analistas: se analizan 6 muestras provenientes de la misma muestra
madre o solucin homognea, cada una por triplicado, por diferentes analistas en el mismo da, la desviacin estndar relativa global no debe ser superior al 3,9. (24)
2.2.9.5. Precisin entre das de anlisis: se analizan 6 muestras provenientes de la misma
muestra madre o solucin homognea, cada una por triplicado, en diferentes das de anlisis y realizadas por un mismo analista, la desviacin estndar relativa global no debe ser superior al 3,9. (24)
2.2.9.6. Linealidad: se evala por medio de la respuesta que se obtiene variando el
porcentaje de concentracin del estndar entre un 50 y 150%, el coeficiente de correlacin debe ser mayor a 0,99. (24)
2.2.9.7. Recuperacin: se prepara 15 frascos variando la concentracin de principio activo
entre un 50 y 150% del valor etiquetado. El porcentaje de recuperacin debe variar hasta un 2,5% con relacin a la concentracin de principio activo etiquetado, es decir debe estar entre un 97.5 y 102.5%. (24)
2.2.9.8. Robustez: se analizan 6 muestras provenientes de la misma muestra madre o
solucin homognea, cada una por triplicado, variando deliberadamente uno de los parmetros de anlisis con respecto a las condiciones normales, la desviacin estndar relativa global no debe ser superior al 3,9. (24)
61
2.2.9. ACCIONES PARA VALORES FUERA DE LMITES
Muestras qumicas fuera de especificaciones.
Si los resultados se encuentran fuera de los lmites predefinidos, se informar inmediatamente al departamento de control de calidad y en coordinacin con validacin se tomarn las siguientes acciones:
a)
Revisar el correspondiente IT de anlisis de Amoxicilina en polvo para suspensin oral.
b)
Detectar la falla y realizar las correcciones que sean necesarias ya sea en el mtodo de anlisis o en el proceso de produccin.
2.2.10 RESULTADOS
Se reportar los resultados en Hojas de Reporte de Anlisis de Validacin del mtodo analtico de Amoxicilina en polvo para suspensin oral. Se elaborara un informe y posteriormente se emitir el Certificado de Validacin del mtodo analtico de Amoxicilina en polvo para suspensin oral.
62
2.3
TECNICAS A SEGUIR PARA VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO
2.3.1 ESPECIFICIDAD
1. OBJETIVO
Evaluar la capacidad que el mtodo analtico tiene para ser especfico frente a diluyente, fase mvil, excipientes, etc. (24)
2. ALCANCE
El presente IT debe ser aplicado a cualquier principio activo que vaya a ser evaluado para descartar la interferencia de compuestos que se espera que estn presentes como excipientes, productos de degradacin, fase mvil y diluyente.
3. RESPONSABILIDADES
El analista de validacin es el responsable de realizar las pruebas del principio activo con respecto a cada una de las sustancias antes mencionadas. (24)
63
4. PROCEDIMIENTO
Preparar una cantidad determinada de placebo segn el procedimiento de manufactura tomando como referencia la frmula maestra del producto. (24)
TABLA N 3 FORMULA MAESTRA DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL
COMPONENTE Amoxicilina 3H2O 85% Benzoato de sodio Colorante rojo 40 FDC Goma Xanthan Syloid 64 FP Sabor fresa polvo Citrato trisdico trihidratado Azcar Micropulverizada
PESO (g) 6,18 0,10 0,00 0,30 0,22 0,16 0,36 30,67
Analizar una muestra del solvente empleado para la preparacin de las soluciones, como se indica en el procedimiento de anlisis.
Preparar una muestra del placebo y analizarla como indica el procedimiento de anlisis.
Analizar un estndar en una concentracin correspondiente al 100% de la especificada.
Analizar muestras de placebo con un 100% del principio activo, como lo indica el procedimiento de anlisis.
64
En caso de conocer los productos de degradacin o impurezas presentes en el producto preparar una muestra con ellas y analizarla de acuerdo al procedimiento de anlisis.
Especificidad con respecto a los productos de degradacin en medio acido
Someter una muestra de peso equivalente a 25mg de Amoxicilina a calentamiento con 5 ml de HCL 3N hasta sequedad, despus disolver, diluir y analizar de acuerdo al procedimiento.
Degradacin en medio bsico
Someter una muestra de peso equivalente a 25 mg de Amoxicilina a calentamiento con 5 ml de NaOH 3N hasta sequedad, despus disolver, diluir y analizar de acuerdo al procedimiento.
Degradacin trmica.
Colocar en la balanza infrarroja una cantidad equivalente a 25mg de Amoxicilina y someterla a 115C por 2 horas, despus, disolver y analizar segn el procedimiento de anlisis.
65
Degradacin a temperatura ambiente.
Preparar una solucin estndar de Amoxicilina, dejarla a temperatura ambiente y analizarla luego de 48 horas.
5. ESPECIFICACIONES
No deber observarse picos Significativos en tiempos de retencin diferentes a los de la Amoxicilina en ninguno de los casos de especificidad analizados.
6. REGISTROS
Documente los resultados del anlisis y archive en la respectiva carpeta de validacin para su posterior revisin y aprobacin.
7. REFERENCIAS
Gua Para Validacin De Mtodos De Ensayo 26-09-2003 ICH
66
2.3.2 PRECISIN DEL SISTEMA
1. OBJETIVO
Establecer la repetitividad midiendo la precisin del sistema. (24)
2. ALCANCE
Este procedimiento debe ser empleado por cualquier departamento de control de calidad para verificar que existe reproducibilidad en lo que se refiere al equipo utilizado para el anlisis.
Analista de validacin: es responsable de preparar el estndar que ser inyectado en un mnimo de 6 veces. Con los resultados obtenidos calcular el RSD y verificar si est dentro de los parmetros. (24)
4. REQUERIMIENTOS
Equipos
HPLC
67
Balanza Analtica
Materiales
Baln aforado 25mL Baln aforado 100mL Pipetas volumtricas Viales para inyeccin.
Sustancias -
Fosfato monobsico de potasio (KH2P04) Hidrxido de potasio Acetonitrilo
5. PROCEDIMIENTO
Establecer la precisin del sistema analizando repetidamente una solucin de estndar, en un mismo laboratorio, por un mismo analista, usando el mismo equipo y en el mismo da. Se determinar en ste caso solamente las diferencias producidas por el equipo.
Preparar una solucin estndar como lo indica el procedimiento de anlisis y realizar 6 determinaciones.
68
Peso del estndar: 25mg Primera dilucin: 25ml Segunda dilucin: 100ml (24)
6. ESPECIFICACIONES
Tomar en cuenta la humedad y pureza de estndar para tener un peso del principio activo equivalente a 25mg.
Condicin Cromatogrfica: Fase mvil Columna Flujo Detector Vol. Inyeccin Diluyente: Acetonitrilo (96: 40) Lichrospher 100 RP 18, 12.5 cm, 5 1,5 mL/min 230 nm 20 l
7. REGISTROS
El analista deber codificar las muestras, deber indicar cualquier desviacin durante el anlisis. Documentar los resultados y archivar en la respectiva carpeta de validacin para su posterior revisin y aprobacin.
8. REFERENCIAS
GUIA PARA VALIDACION DE METODOS DE ENSAYO 26-09-2003 ICH
69
2.3.3 PRECISIN DEL MTODO
1. OBJETIVO
Establecer la repetitibilidad midiendo la precisin del mtodo empleado. (24)
2. ALCANCE
El presente IT debe ser aplicado cuando se requiera analizar la variacin producida por el mtodo de anlisis utilizado.
Analista de validacin: valoraciones de las muestras preparadas como indica el procedimiento de anlisis.
4. REQUERIMIENTOS
Equipos
HPLC Balanza Analtica
70
Materiales
Baln aforado 25mL Baln aforado 100 mL Baln aforado 200 mL Pipetas volumtricas.
Sustancias
Fosfato monobsico de potasio (KH2P04) hidrxido de potasio Acetonitrilo
5. PROCEDIMIENTO
Establecer la precisin del mtodo, analizando 6 muestras (principio activo + placebo) provenientes de una misma mezcla homognea o de la misma solucin madre. Realizar el anlisis en un mismo laboratorio, por un mismo analista, usando el mismo equipo en un mismo da.se determina en este caso solamente las diferencias producidas por el mtodo empleado.
-
Preparar las 6 muestras de acuerdo al procedimiento de anlisis y determinar la respuesta de cada una (3 inyecciones de cada muestra por HPLC).
Obtener las respuestas y determinar la concentracin de activo presente en cada muestra. (24) (25)
71
6. ESPECIFICACIONES
Usar la solucin estndar tan pronto sea preparada.

Condiciones Cromatogrfica:
Fase mvil Columna Flujo Detector Vol. Inyeccin
Diluyente: Acetonitrilo (96: 40) Lichrospher 100 RP 18, 12.5 cm, 5 1,5 ml/min 230 nm
20 l
7. REGISTRO
8. REFERENCIAS
USP 28 -NF 23; Brithish Pharmacopoeia 2002 (BP 2002); Ph. Eur. 3; Mtodo General (MG)
72
2.3.4 PRECISIN ENTRE ANALISTAS
1.
OBJETIVO
Establecer la repetitibilidad midiendo la precisin entre analistas. (24)
2.
ALCANCE
El presente IT debe ser aplicado cuando se requiera analizar la variacin producida entre analistas.
3.
RESPONSABILIDADES
Analistas de validacin: valoraciones de las muestras homogneas provenientes de la misma muestra madre y preparadas como indica el procedimiento de anlisis, cada uno por separado, en un mismo equipo, en el mismo laboratorio y el mismo da de anlisis.
4.
REQUERIMIENTOS
Equipos
73
Materiales
Sustancias
5.
PROCEDIMIENTO
Establecer la precisin intermedia, analizando 6 muestras provenientes de una misma mezcla homognea o de la misma solucin madre, en un mismo laboratorio, el mismo da, usando el mismo equipo y entre 2 analistas diferentes.
Se determina en este caso solamente las diferencias producidas por los analistas.
A partir de una muestra homognea o de la misma solucin madre, preparar 6 muestras como lo indica el procedimiento de anlisis. De cada muestra realizar como mnimo 3 inyecciones HPLC.
74
Las respuestas obtenidas correspondern a los datos para el analista 1. El mismo da repetir el procedimiento anterior pero realizado por otro analista. Los dos analistas deben preparar las diluciones el mismo da y a partir de la misma muestra homognea o de la misma solucin madre. Calcular un coeficiente de variacin global para todos los datos. Cantidad a pesar (24)
6.
ESPECIFICACIONES
Usar la solucin estndar tan pronto sea preparada. Condiciones Cromatogrfica: Fase mvil Columna Flujo Detector Vol. Inyeccin Diluyente: Acetonitrilo (96: 40) Lichrospher 100 RP 18, 12.5 cm, 5 1,5 mL/min 230 nm
20 l
7.
REGISTRO
75
8.
REFERENCIAS
76
2.3.5 PRECISIN ENTRE DAS
1.
OBJETIVO
Establecer la repetitibilidad midiendo la precisin entre das de anlisis.
2.
ALCANCE
El presente IT debe ser aplicado cuando se requiera analizar la variacin producida entre das de anlisis.
3.
RESPONSABILIDADES
Analistas de validacin: valoraciones de las muestras homogneas provenientes de la misma muestra madre y preparadas como indica el procedimiento de anlisis, en un mismo equipo, en el mismo laboratorio, pero en diferentes das de anlisis.
4.
REQUERIMIENTOS
Equipos
77
Materiales
Sustancias
5.
PROCEDIMIENTO
Establecer la precisin intermedia, analizando 6 muestras provenientes de una misma mezcla homognea o de la misma solucin madre, en un mismo laboratorio, el mismo da, usando el mismo equipo. Se determina en este caso solamente las diferencias producidas en los das de anlisis.
A partir de una muestra homognea o de la misma solucin madre, preparar 6 muestras como lo indica el procedimiento de anlisis. De cada muestra realizar como mnimo 3 inyecciones HPLC.
78
Las respuestas obtenidas correspondern a los datos para el da de anlisis 1. Repetir el mismo procedimiento pero en el da de anlisis 2.
Los dos das de anlisis no deben ser necesariamente consecutivos, pero el procedimiento debe ser seguido por un solo analista y a partir de la misma muestra homognea y a partir de la misma solucin madre.
Calcular un coeficiente de variacin global para todos los datos.
Cantidad a pesar: 250mg (p.a.) Primera dilucin: 200ml Segunda dilucin: 10/100ml
peso del estndar: 25mg primera dilucin: 25ml segunda dilucin: 10/100
6.
ESPECIFICACIONES
Usar la solucin estndar tan pronto sea preparada. Condiciones Cromatogrfica: Fase mvil Columna Flujo Detector Vol. Inyeccin Diluyente: Acetonitrilo (96: 40) Lichrospher 100 RP 18, 12.5 cm, 5 1,5 mL/min 230 nm
20 l
79
7.
REGISTRO
8.
REFERENCIAS
80
2.3.6 EXACTITUD / PORCENTAJE DE RECUPERACIN:
1.
OBJETIVO
Determinar la capacidad el procedimiento de anlisis para presentar valores de concentracin del principio activo muy cercanos al valor terico o real.
2.
ALCANCE
El presente IT debe ser aplicado cuando se requiera analizar la relacin que existe entre el valor terico y real.
3.
RESPONSABILIDADES
Analista de validacin: preparar frascos de Amoxicilina en polvo para suspensin oral como consta en el procedimiento de elaboracin del producto, variando la concentracin etiquetada entre un 50 a un 150%.
4.
REQUERIMIENTOS
Equipos
81
Materiales
Baln aforado 25mL Baln aforado 100 mL Baln aforado 200 mL Pipetas volumtricas. Frascos mbar Esptula.
Sustancias
Fosfato monobsico de potasio (KH2P04) hidrxido de potasio Acetonitrilo Excipientes
5.
PROCEDIMIENTO
Preparar una muestra homognea de placebo. Preparar 5 muestras adicionando cantidades conocidas de principio activo dentro del rango de concentracin, comprendido generalmente entre el 50% y el 150% de la cantidad rotulada.
Variar la concentracin del placebo proporcionalmente en cada muestra.
82
Analizar cada muestra realizando como mnimo 3 inyecciones de cada muestra (HPLC).
Preparar un estndar de concentracin correspondiente al 100% y analizarlo de acuerdo al procedimiento.
Calcular el porcentaje de recuperacin como base en la comparacin entre las concentraciones halladas y las concentraciones adicionadas.
Con base en los resultados obtenidos calcular el promedio del porcentaje de recuperacin para todos los niveles de concentracin, la desviacin estndar de los datos y el coeficiente de variacin.
6.
ESPECIFICACIONES
- Usar la solucin estndar tan pronto sea preparada. - Realizar un pesaje lo ms exacto posible para minimizar los errores.
- Condiciones Cromatogrfica: Fase mvil Columna Flujo Detector Vol. Inyeccin

7. REGISTRO
Diluyente: Acetonitrilo (96: 40) Lichrospher 100 RP 18, 12.5 cm, 5 1,5 mL/min 230 nm
20 l
El analista deber codificar las muestras, deber indicar cualquier desviacin durante el anlisis.
83
Elaborar las muestras tal como consta en el protocolo de manufactura del producto. Documentar los resultados y archivar en la respectiva carpeta de validacin para su posterior revisin y aprobacin.
8.
REFERENCIAS
84
2.3.7 LINEALIDAD.
1.
OBJETIVO
Determinar si existe proporcionalidad entre las concentraciones del estndar y su respuesta.
2.
ALCANCE
El presente IT debe ser aplicado cuando se requiera verificar la proporcionalidad entre concentraciones aadidas y su respuesta.
3.
RESPONSABILIDADES
Analista de validacin: preparar las muestras a analizar variando su concentracin entre u 50 y 150% del estndar.
4.
REQUERIMIENTOS
Equipos
85
Materiales
Sustancias
5.
PROCEDIMIENTO
Determinar la respuesta por triplicado de una serie de 5 diluciones del estndar, cuyas concentraciones estn entre 50 y 150% de la cantidad establecida en el procedimiento de anlisis.
Analizarlas de acuerdo al procedimiento de anlisis y determinar las respuestas respectivas.
Determinar la curva de regresin de reas versus concentracin. Determinar la pendiente (b) y el intercepto (a) y el coeficiente de correlacin. Definir la ecuacin de la recta. y= mx+ b
86
6.
ESPECIFICACIONES
Usar la solucin estndar tan pronto sea preparada. Realizar un pesaje lo ms exacto posible para minimizar los errores. Condiciones Cromatogrfica: Fase mvil Columna Flujo Detector Vol. Inyeccin Diluyente: Acetonitrilo (96: 40) Lichrospher 100 RP 18, 12.5 cm, 5 1,5 mL/min 230 nm
20 l
7.
REGISTRO
8. REFERENCIAS
87
2.3.8 ROBUSTEZ
1.
OBJETIVO
Investigar la influencia de algn cambio en las condiciones analticas sobre la fiabilidad del mtodo analtico, localizando factores que originan fluctuaciones menores y lo que necesitan una atencin especial por cuanto son origen de variaciones significativas.
2.
ALCANCE
El presente IT debe ser aplicado cuando se requiera verificar posibles puntos crticos dentro del proceso de anlisis.
3.
RESPONSABILIDADES
Analista de validacin: tomar la decisin sobre cual es el factor a modificar en la verificacin de la robustez del mtodo.
4.
REQUERIMIENTOS
Equipos
88
Materiales
Sustancias
5.
PROCEDIMIENTO
Especificar la variable con la cual se probar la robustez del mtodo. Se variar el flujo (pasando de un flujo de 1,5 ml /min a uno de 1,65ml /min).
Determinar la respuesta de 6 muestras (3 inyecciones de cada muestra) como lo indica el procedimiento en condiciones normales y de manera similar determinar la respuesta de la misma muestra aplicando el cambio a ser evaluado (condicin alternativa).
Hallar el coeficiente de variacin global entre las respuestas obtenidas en las condiciones normales y las medidas obtenidas con la condicin alterna.
Con base a los resultados obtenidos establecer si la variable es crtica en el desarrollo de la metodologa.
89
6.
ESPECIFICACIONES
- Usar la solucin estndar tan pronto sea preparada. - Tener cuidado con la nueva presin, monitorearla hasta que esta se estabilice.
- Condiciones Cromatogrfica: Fase mvil Columna Flujo Detector Vol. Inyeccin

7. REGISTRO
Diluyente: Acetonitrilo (96: 40) Lichrospher 100 RP 18, 12.5 cm, 5 1,5 mL/min a 1.65mL/min 230 nm
20 l
El analista deber codificar las muestras, deber indicar la desviacin deliberada durante el anlisis y monitorear que la presin sea estable. Documentar los resultados y archivar en la respectiva carpeta de validacin para su posterior revisin y aprobacin.
8.
REFERENCIAS
90
CAPITULO III
RESULTADOS Y DISCUSIN
CUADRO No. 1. ANLISIS DE LA ESPECIFICIDAD DEL MTODO FRENTE A LOS PARMETROS EVALUADOS.
PARMETRO EVALUADO
RESULTADOS
Interferencias encontradas con fase mvil Interferencias encontradas con el solvente Interferencias encontradas con el placebo Interferencias encontradas por degradacin cida Interferencias encontradas por degradacin bsica. Interferencias encontradas por degradacin trmica Interferencias encontradas por degradacin a T ambiente
No presenta Interferencias No presenta Interferencias No presenta Interferencias No presenta Interferencias No presenta Interferencias No presenta Interferencias No presenta Interferencias
91
Los parmetros evaluados en especificidad no muestran ninguna interferencia con el pico normal de amoxicilina, por ejemplo el solvente, fase mvil, diluyente y placebo no muestran ningn pico en el corrido de la muestra, en cuanto a la degradacin por calor y en medios cido y bsico los picos obtenidos no son significativos en relacin al estndar de amoxicilina.
CUADRO No. 2. ANLISIS DE LA PRECISIN DEL SISTEMA, MUESTRA DE ESTNDAR UTILIZADO EN EL ANLISIS DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN. REALIZADO EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD, EMPRESA FARMACEUTICA BETAPHARMA, QUITO, 2010.
MUESTRA 1 2 3 4 5 6 PROMEDIO SD RSD CRITERIO DE ACEPTACIN
RESPUESTA 434660 446433 435107 434202 434234 434656 436548,66 4853,70 1,11 RSD < 2,8
Como podemos ver en el cuadro nmero 2 hemos realizado 6 inyecciones consecutivas del estndar utilizado para la valoracin de Amoxicilina en polvo para suspensin. Se tom un peso de 30.1mg de estndar, con humedad de 13.22% y 99.1% de pureza. Obtuvimos un promedio de las reas, la desviacin estndar SD y la desviacin estndar relativa RSD con la que comparamos el criterio de aceptacin que en ste caso es de 2.8. El RSD resultante del anlisis es 1.11 que est dentro del valor de referencia.
92
CUADRO No. 3.
ANLISIS DE LA PRECISIN DEL MTODO UTILIZADO PARA LA VALORACIN DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL, REALIZADA EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD, EMPRESA FARMACEUTICA BETAPHARMA, QUITO, 2010.
MUESTRA
PESO ACTIVO mg
RESPUESTA 622038
CONCENTRACIN PROMEDIO mg/5ml
PORCENTAJE de p.a. en la muestra
250
681250 676228 626427
659838,6667
237,89
95,16
250
675479 676056 676551
659320,6667
237,67
95,07
250
675906 653657 655116
668704,6667
241,08
96,43
250
664143 664629 613285
661296
238,41
95,36
250
639570 675767 653125
642874
231,76
92,7
250
654189 651664 PROMEDIO CONCENTRACIN SD CONCENTRACIN RSD CONCENTRACIN CRITERIO DE ACEPTACIN
652992,6667
235,41
94,16
237,036 3,15 1,33 RSD < 3,9
93
En el cuadro nmero 3 vemos un proceso detallado donde se analizaron 6 muestras provenientes de la misma muestra madre, cada una se inyect por triplicado obteniendo un promedio de reas con las cuales calculamos la concentracin de cada una con respecto a un estndar. Hallamos un promedio, SD y RSD. El valor obtenido fue de 1.33 el cual est por debajo del valor de referencia para ste anlisis.
94
CUADRO No. 4.
ANLISIS DE LA PRECISIN ENTRE ANALISTAS EN LA VALORACIN DE AMOXICILINA PARA SUSPENSIN ORAL, REALIZADO EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD, EMPRESA FARMACEUTICA BETAPHARMA, QUITO, 2010
ANALISTA 1 CONCENTRACIN mg/5ml RESPUESTA PROMEDIO 622038 681250 659838,67 676228 626427 675479 659320,67 676056 676551 675906 668704,67 653657 655116 664143 661296 664629 613285 639570 642874 675767 653125 654189 652992,67 651664 PROM SD RSD PORCENTAJE 237,89 95,16 237,669 95,07 241,08 96,43 238,41 95,36 231,76 92,7 235,41 94,16 237,03 3,15 1,33
ANALISTA 2 CONCENTRACIN mg/5ml PORCENTAJE de RESPUESTA PROMEDIO p.a. en la muestra 623203 224,79 626642 623503 90 620664 652102 232,8 610905 645734,33 93,12 674196 643028 233,31 656669 647153,33 93,32 641763 669185 242,15 674789 671677,67 96,81 671059 666479 240,03 662623 665797,33 96,01 668290 635759 234,66 686090 650880,33 93,86 630792 PROM 234,62 SD 2,41 RSD 1,02
PROM CONCENTRACIN SD GLOBAL RSD GLOBAL CRITERIO DE ACEPTACIN
235,82 4,81 2,04 RSD < 3,9
Como podemos ver en el cuadro numero 4 se presenta el mismo procedimiento de anlisis de 6 muestras preparadas y analizadas por diferentes analistas en un mismo da, en este caso
95
se toma en cuenta la desviacin estndar relativa RSD Global la cual es 2.041 para este anlisis, el criterio de aceptacin es menor a 3.9 as que cumple en cuanto a la precisin entre analistas.
96
CUADRO No. 5.
ANLISIS DE LA PRECISIN ENTRE ANALISTAS EN LA VALORACIN DE AMOXICILINA PARA SUSPENSIN ORAL, REALIZADO EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD, EMPRESA FARMACEUTICA BETAPHARMA, QUITO, 2010. ANALISTA 1 DIA 2 CONCENTRACIN mg/5ml PORCENTAJE RESPUESTA PROMEDIO 237,89 635100 95,16% 634531 635651,33 637323 237,669 670295 95,07% 670063 667879,33 663280 241,08 669402 96,43% 671322 669516,67 667826 238,41 665333 95,36% 655950 654119,33 641075 231,76 661603 92,70% 657146 661828,33 666736 235,41 661636 94,16% 662422 664949,67 670791 237,03 3,15 1,33
PROM CONCENTRACIN
ANALISTA 1 DIA 1
RESPUESTA
PROMEDIO 659838,67
622038 681250 676228 626427 675479 676056 676551 675906 653657 655116 664143 664629 613285 639570 675767 653125 654189 651664
CONCENTRACIN mg/5ml PORCENTAJE 230,89 92,36% 242,6 97,04% 243,2 97,28% 237,6 95,04% 240,4 96,16% 241,54 96,62% 239,37 4,6 1,92
659320,67
668704,67
661296
642874
652992,67
PROM CONCENTRACIN
SD RSD
SD RSD
PROM DAS SD GLOBAL DAS RSD GLOBAL DAS CRITERIO DE ACEPTACIN
238,20 3,95 1,66 RSD < 3,9
El cuadro nmero 5 muestra el mismo procedimiento de anlisis de 6 muestras preparadas desde una misma muestra homognea y analizadas por un mismo analista pero en diferentes das, con lo que se busca verificar que el mtodo es preciso entre das de anlisis, en este caso la desviacin estndar relativa RSD Global es 1.66, el criterio de aceptacin es menor a 3.9 as que cumple con el parmetro de control.
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CUADRO No. 6.
ANLISIS DE LA LINEALIDAD QUE PRESENTA EL MTODO EN CUANTO AL PORCENTAJE DE ESTNDAR AADIDO Y LA RESPUESTA QUE STE PRESENTA EN LA VALORACIN DE AMOXICILINA PARA SUSPENSIN ORAL, REALIZADO EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD, EMPRESA FARMACEUTICA BETAPHARMA, QUITO, 2010
% DE ESTNDAR 50
75
100
125
150
CONCENTRACIN mg/ml 0,0585 0,0593 0,0597 0,0863 0,0863 0,0867 0,1173 0,116 0,116 0,145 0,1457 0,1459 0,1744 0,174 0,174
PROMEDIO 0,0592
0,0864
0,1164
0,1456
0,174
RESP (Y) 187532 185333 184546 250869 253900 253590 347494 346749 346193 443101 441696 444480 546289 546031 545229
PROMEDIO 185803,6667
252786,3333
346812
443092,3333
545849,6667
GRAFICO N: 2
Linealidad del mtodo entre el porcentaje de estndar adicionado y la respuesta producida.
98
La ecuacin que presenta la recta es: y = 91040x + 81749 Y su R = 0,994
El cuadro nmero 6 muestra la preparacin de soluciones estndar a diferentes concentraciones, inyectadas por triplicado, los datos de la curva de regresin lineal permite concluir que el sistema es lineal en un rango de concentracin entre 0,0592mg/ml y 0,174 mg/ml, correspondientes al rango de concentracin del 50% al 150% de la cantidad propuesta.
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CUADRO No. 7.
ANALISIS DE LA RECUPERACIN DEL MTODO UTILIZADO EN LA VALORACIN DE AMOXICILINA PARA SUSPENSIN ORAL, REALIZADO EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD, EMPRESA FARMACEUTICA BETAPHARMA, QUITO, 2010.
P.A. EN LA MUESTRA (%)
RESPUESTA
PROMEDIO
CONCENT HALLADA (mg/ml)
% de RECUPERACIN
309323 50 318377 324377 440774 75 483709 448395 650926 100 637298 657857 825404 125 838420 756640 878540 150 997580 941620 PROM RECUPERACIN SD RSD CRITERIO DE ACEPTACIN 97,93 2,40 2,45 < 2,5 939246,6667 363,31 96,88 806821,3333 312,09 99,9 648693,6667 250,92 100,3 457626 177,01 94,4 317359 122,76 98,2
El cuadro nmero 7 muestra la preparacin de 15 frascos de Amoxicilina en polvo para suspensin siguiendo el protocolo de fabricacin, variando en ste el porcentaje de Amoxicilina, el procedimiento se lo hace por triplicado y se hace una inyeccin por cada uno. Con base en los resultados obtenidos en cuanto a promedio y coeficiente de variacin, se concluye que el mtodo es exacto dentro de las concentraciones evaluadas (122,76 mg/ml - 363,31mg/ml) del producto.
100
CUADRO No. 8.
ANLISIS DE LA ROBUSTEZ QUE PRESENTA EL MTODO UTILIZADO EN LA VALORACIN DE AMOXICILINA PARA SUSPENSIN ORAL FRENTE A UN CAMBIO DELIBERADO EN ALGUNO DE SUS PARMETROS, EN STE CASO HEMOS AUMENTADO EL FLUJO EN UN 10%. REALIZADO EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD, EMPRESA FARMACEUTICA BETAPHARMA, QUITO, 2010
CONDICIN NORMAL RESPUESTA PROMEDIO
CONCENTRACIN mg/5ml PORCENTAJE
FLUJO + 10% RESPUESTA PROMEDIO
CONCENTRACIN mg/5ml PORCENTAJE de p.a. en la muestra
635100 634531 637323 670295 670063 663280 669402 671322 667826 665333 655950 641075 661603 657146 666736 661636 662422 670791
635651,333
230,89 92,36% 242,6 97,04% 243,2 97,28% 237,6 95,04% 240,4 96,16% 241,54 96,62% 239,37 4,60 1,92
667879,333
669516,667
654119,333
661828,333
664949,667 PROM SD RSD
561259 561830 564239 570564 569310 574373 574412 574472 574227 566249 568391 570329 570291 570450 570720 569320 569418 569612
562442,6667
239,22 95,70% 243,04 97,22% 244,3 97,72% 241,72 96,69% 242,65 97,06% 242,2 96,88% 242,18 1,69 0,70
571415,6667
574370,3333
568323
570487
569450 PROM SD RSD
PROM CONCENTRACIN GLOBAL DESV EST GLOBAL RSD GLOBAL CRITERIO DE ACEPTACIN
240,78 3,61 1,5 RSD < 3,9
101
En el cuadro nmero 8 podemos ver la respuesta que presentan en condicin normal de flujo 6 muestras inyectadas cada una por triplicado y su respectiva concentracin en miligramos por mililitro, su promedio, variacin estndar y variacin estndar relativa, la cual es de 1.92. En la parte derecha vemos las mismas muestras analizadas con un flujo aumentado en un 10%, las reas, incluyendo las del estndar disminuyen, las concentraciones varan y se produce una menor RSD de 0,7. La RSD GLOBAL que es la que debemos tomar en cuenta es de 1,5 la cual est por debajo del lmite establecido de 3,9 para ste anlisis.
102
CAPITULO IV
4. CONCLUSIONES
Se logr:
1. Validar el Mtodo Analtico de valoracin de Amoxicilina en polvo para suspensin oral fabricado por Betapharma S.A. mediante HPLC
2. Verificar que el mtodo analtico utilizado para la valoracin de Amoxicilina en polvo para suspensin oral mediante HPLC, cumple con los requerimientos para los que fue diseado, esto fue establecido gracias a diferentes parmetros y los resultados fueron satisfactorios para todos los anlisis para la precisin del mtodo se obtuvo un RSD de 1,33 por debajo del lmite de 3,9 permitido. En cuanto a la precisin entre das, se obtuvo un RSD de 2,04 por debajo de 3,9 que es el lmite permitido. Con respecto a la precisin entre analistas se obtuvo un RSD de 1,66 que est por debajo del lmite permitido que es de 3,9. En la determinacin de la linealidad se obtuvo un R2 de 0,994 que est por arriba del 0,99 planteado inicialmente. En la determinacin de la recuperacin del mtodo se obtuvo un porcentaje de 97,94% que est dentro de los parmetros establecidos entre 97.5% y 102,5%. En cuanto a la robustez del mtodo se obtuvo un RSD de 1,5 que se encuentra por debajo de 3,9 que es el lmite permitido.
103
3. Documentar los procedimientos de validacin para la implementacin clara e inequvoca del mtodo.
4. Demostrar mediante estudios de laboratorio que los parmetros de desempeo de los equipos estn dentro de su especificacin, ya que el resultado obtenido para la precisin del sistema fue de RSD = 1,11 por debajo de 2,8 que es el lmite permitido.
5. Establecer un instructivo escrito para la empresa Betapharma referente a la validacin del mtodo analtico en la manufactura de Amoxicilina en polvo para suspensin oral, para asegurar que los resultados sean confiables, reproducibles y que se encuentren dentro del rango de trabajo establecido. El instructivo const de un protocolo de validacin y las respectivas tcnicas, para asegurar que los resultados sean confiables, reproducibles y que se encuentren dentro del rango de trabajo establecido
104
CAPITULO V
5. RECOMENDACIONES
1. Bajo ninguna circunstancia refrigerar la muestra antes de analizar ya que podra producirse una degradacin de principio activo, ya que la molcula es inestable frente a la temperatura y conllevara a una lectura errnea.
2. Inyectar las muestras lo ms pronto posible ya que si se dejan a la intemperie podran sufrir degradaciones por la luz, ya que es una molcula fotosensible.
3. Tener extremo cuidado en el pesaje de principio activo o estndar utilizado ya que el equipo de HPLC tiene una gran sensibilidad y cualquier error por pequeo que parezca tendr su efecto en la concentracin calculada.
4. Es sumamente importante que las columnas tengan un buen proceso de lavado antes de su almacenaje o posterior uso, ya que cuando ste no realiza por un tiempo ideal los picos cromatogrficos tienen una distorsin que hace imposible realizar un anlisis correcto y el posterior clculo de concentracin.
105
5. El proceso de anlisis debe ser documentado en forma minuciosa para que no exista ambigedades y otro analista sea capaz de reproducir el mtodo con facilidad.
6. El instructivo de validacin debe ser elaborado conjuntamente con el departamento de control de calidad, el de aseguramiento de calidad y el analista que realiz la validacin para que se tomen en cuenta todos los criterios.
106
CAPITULO VI
6 RESUMEN
El objetivo de la investigacin es, validar el mtodo analtico usado en la valoracin de Amoxicilina en polvo para suspensin oral fabricado por la Empresa Farmacutica Betapharma S.A. de la ciudad de Quito, usando la tcnica de Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia, con el fin de verificar la calidad en lo referente a dosis de principio activo, para lo cual se analizaron varios parmetros establecidos por organismos internacionales, como precisin del sistema, obteniendo una RSD de 1.11 por debajo del lmite de 2.8 para la precisin del mtodo se obtuvo un RSD de 1,33 por debajo del lmite de 3,9 permitido. Referente a la precisin entre das, se obtuvo un RSD de 2,04 por debajo de 3,9 que es el lmite permitido. Referente a la precisin entre analistas se obtuvo un RSD de 1,66 por debajo del lmite permitido de 3,9. En la determinacin de la linealidad se obtuvo un R2 de 0,994 por arriba del 0,99 planteado inicialmente. En la determinacin de la recuperacin del mtodo se obtuvo un porcentaje de 97,94% que est dentro de los parmetros establecidos entre 97.5% y 102,5%. En cuanto a la robustez del mtodo se obtuvo un RSD de 1,5 por debajo de 3,9 que es el lmite permitido. Los resultados encontrados se encuentran dentro de los parmetros establecidos. En conclusin el mtodo analtico usado en la valoracin de Amoxicilina en polvo para suspensin oral fabricado por la Empresa Farmacutica Betapharma S.A. fue validado. Por lo tanto se recomienda su aplicacin para garantizar la calidad de sus medicamentos.
107
CAPITULO VII
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112
CAPITULO VIII
Anexos
ANEXO No. 1. CROMATOGRAMA DEL ESTNDAR DE AMOXICILINA
113
ANEXO No. 2. CROMATOGRAMA DE ANALISIS DE SENSIBILIDAD DEGRADACIN A TEMPERATURA AMBIENTE
FRENTE
114
ANEXO No. 3. CROMATOGRAMA DE ANALISIS DEGRADACIN CON CALOR.
DE
SENSIBILIDAD
FRENTE
115
ANEXO No. 4. CROMATOGRAMA DE ANALISIS DE DEGRADACIN POR HIDRLISIS BASICA.
SENSIBILIDAD
FRENTE
116
ANEXO No. 5. CROMATOGRAMA DE ANALISIS DE SENSIBILIDAD FRENTE AL DILUYENTE Y FASE MVIL UTILIZADA
117
ANEXO No. 6. CROMATOGRAMA DE ANLISIS DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL, PERPARADO POR ANALISTA 1 EN EL DA DE ANLISIS 1.
118
ANEXO No. 7. CROMATOGRAMA DE ANLISIS DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL, PERPARADO POR ANALISTA 2 EN EL DA DE ANLISIS 1.
119
ANEXO No. 8. CROMATOGRAMA DE ANLISIS DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL, PERPARADO POR ANALISTA 1 EN EL SEGUNDO DA DE ANLISIS.
120
ANEXO No. 9.
CROMATOGRAMA DE ANLISIS DE RECUPERACIN FRENTE AL PORCENTAJE DE PRINCIPIO ACTIVO ADICIONADO EN CADA FRASCO DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL AL 50% DE PRINCIPIO ACTIVO
121
ANEXO No. 10. CROMATOGRAMA DE ANLISIS DE RECUPERACIN FRENTE AL PORCENTAJE DE PRINCIPIO ACTIVO ADICIONADO EN CADA FRASCO DE AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL AL 75% DE PRINCIPIO ACTIVO
122
123
124
125
ANEXO No. 14. CROMATOGRAMA DE LINEALIDAD A CONCENTRACION DE ESTNDAR AL 50%
126
127
128
129
130
ANEXO No.19
CROMATOGRAMA DE ANLISIS DE ROBUSTEZ CON UN FLUJO AUMENTADO EN 10%
131
FOTOGRAFA N 1
AMOXICILINA EN POLVO PARA SUSPENSIN ORAL FABRICADO POR BETAPHARMA S.A.
FOTOGRAFA N 2
EQUIPO DE HPLC

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1

ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

JORGE GONZALO VELASTEGU BARRENO

RIOBAMBA ECUADOR 2011

A mi madre por su abnegacin y lucha diaria.

ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

DECANA FACULTAD DE CIENCIAS

Dr. Luis Guevara

DIRECTOR DE LA ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA

BQF. Fausto Contero DIRECTOR DE TESIS

Dr. Carlos Pilamunga MIEMBRO DE TRIBUNAL

Tlgo. Carlos Rodrguez

DIRECTOR DEL CENTRO DE DOCUMENTACIN

NOTA DE TESIS ESCRITA ______________________

JORGE GONZALO VELASTEGU BARRENO

1 2 3 4 5 6 7 2.3.2 1 2 3 4 5 6 7 8 2.3.3 1 2 3 4 5 6 7 8 2.3.4 1

2 3 4 5 6 7 8 2.3.5 1 2 3 4 5 6 7 8 2.3.6 1 2 3 4 5 6 7 8 2.3.7 1

84 84 84 85 86 86 86 87 87 87 87 87 88 89 89 89 90 102 104 106 107 112

TABLA No. 1. TABLA No. 2. TABLA N 3

GRFICO No. 1 GRFICO No. 2

112 113 114 115 116 117

ANEXO NO. 7. ANEXO NO. 8. ANEXO NO. 9.

ANEXO NO. 10.

ANEXO NO. 11.

ANEXO NO. 12.

ANEXO NO. 13.

125 126 127 128 129 130

1.1.2. LA VALIDACIN COMO REQUISITO DE LA NORMA COVENIN 2534:2000.

El requisito establece de forma obligatoria que:

El requisito sugiere que:

1.1.3. TIPOS DE VALIDACIN

1.1.3.1. Validacin prospectiva

1.1.3.2. Validacin de la competencia

1.1.3.3. Validacin retrospectiva

VALIDACIN DEL MTODO ANLITICO

1.2.1. RESPONSABILIDADES EN EL PROCESO DE VALIDACIN

1.2.2. CARACTERSTICAS DE UN ESTUDIO DE VALIDACIN DE METODOS

1.2.3. ALCANCE DE LOS ESTUDIOS DE VALIDACIN

1.2.3.1. El laboratorio debe utilizar un mtodo totalmente validado.

1.2.3.5. El mtodo es Emprico

1.2.3.6. Cambios en el personal o el equipo

1.2.4. CATEGORIA DEL MTODO

1.2.4.4. Categora IV - las pruebas de identificacin o las propiedades fsicas. (1)

ELEMENTOS PARA LA VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS EN FUNCIN DEL ANLISIS DE CATEGORA.

FUENTE: GUIDELINE FOR VALIDATION OF ANALYTICAL METHODS MARZO 16, 2000

1.2.5. PROCESO DE VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO

Consiste en un plan experimental que debe contener las siguientes especificaciones:

1.2.6.4. Fases y Columnas

Tipos de detectores en HPLC:

Detectores ms utilizados en HPLC:

1.2.7. PRINCIPIO ACTIVO AMOXICILINA

GRAFICO N 1. ESTRUCTURA MOLECULAR DE AMOXICILINA

1.2.7.4. Mecanismo de accin

1.2.7.6. Indicaciones y Posologa

La neomicina inhibe parcialmente la absorcin oral de la amoxicilina

1.2.7.9. Reacciones Adversas

Diseo experimental Protocolo Tcnicas para validacin del mtodo de anlisis.

2.1.1 CARACTERISTICAS DEL DISEO EXPERIMENTAL

LUGAR: Industria Farmacutica Betapharma

CANTN: Quito PROVINCIA: Pichincha

2.1.2 FACTORES DEL ESTUDIO

MANEJO ESPECIFICO DEL EXPERIMENTO

2.1.3.1 Lugar y Pruebas De Ensayo

Industria Farmacutica Betapharma S.A. QUITO-ECUADOR