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Captulo 9 ENSAYO DE LA SEMILLA (continuar)

Ensayos de germinacin
De todas las mediciones de la calidad de un lote de semilla, ninguna tiene tanta importancia como la que sirve para determinar la germinacin potencial de las semillas (Bonner 1974). Los ensayos de germinacin que se efectan en laboratorio tienen por finalidad principal estimar el nmero mximo de semillas que pueden germinar en las condicionesptimas. La utilizacin de condiciones ideales normalizadas en el laboratorio, como las que prescribe la ISTA, garantiza que los resultados obtenidos con un determinado lote en un laboratorio sean idnticos con los obtenidos en cualquier otro laboratorio de ese mismo u otro pas. Para las semillas que se mueven por el circuito del comercio internacional es muy til disponer de una norma comn para evaluar el potencial de germinacin. Por el contrario, est claro que los resultados que se obtienen en las condiciones ideales controladas en el laboratorio no son directamente aplicables sobre el terreno, en el vivero, donde slo se puede ejercer un control limitado sobre las condiciones ambientales. Cada viverista debe aplicar su propio factor de correccin, derivado de su experiencia a lo largo de los aos, para convertir el potencial de germinacin de un lote tal como viene determinado por los ensayos de laboratorio en la germinacin efectiva sobre el terreno que puede esperar en las condiciones locales de su vivero. En el otro extremo, hay viveristas que, antes de efectuar una siembra en gran escala, prefieren efectuar su propio ensayo de germinacin en su vivero. Los resultados de estos ensayos deben ser directamente aplicables a siembras ulteriores del mismo lote en el mismo vivero, pero no tienen por qu serlo a otros viveros. No obstante, a veces no hay tiempo suficiente para efectuar ensayos de germinacin antes de la siembra principal, y los administradores de grandes viveros operacionales pueden ser reacios a iniciar una investigacin en pequea escala. Entre ambos extremos se encuentra el caso de la pequea estacin de investigaciones silvcolas que carece de los medios de laboratorio necesarios para observar las prescripciones de la ISTA en materia de ensayos, pero que somete a ensayos de germinacin en el vivero a las partidas de semilla a granel antes de distribuirlas entre proyectos de forestacin repartidos por todo el pas. Tambin en este caso el ingeniero forestal o el viverista local han de aplicar su propio factor de correccin para convertir las cifras de germinacin efectiva obtenidas en el vivero de investigacin en las cifras de germinacin que cabe esperar en su vivero operacional de gran tamao. La descripcin que figura a continuacin se basa en gran parte en la de (Turnbull 1975d). Se ajusta a las Reglas de la ISTA (1976), aunque algunos de los principios

son igualmente aplicables cuando la falta de equipo o de personal capacitado obliga a utilizar mtodos ms sencillos. La germinacin se define como el surgimiento y desarrollo, a partir del embrin de la semilla, de las estructuras esenciales que indican la capacidad de la semilla para producir una planta normal en condiciones favorables (Justice 1972, ISTA 1976). La germinacin se expresa como el porcentaje de semillas puras que produce plntulas normales o como el nmero de semillas que germinan por unidad de peso de la muestra. En el laboratorio, las condiciones ambientales, como la humedad, la temperatura, la ventilacin y la luz, han de ser no slo lo bastante especficas para iniciar la germinacin, sino tambin favorables para el desarrollo de las plntulas hasta una fase en la que puedan identificarse los tipos normales y anormales. Con pocas excepciones, todos los ensayos de germinacin deben efectuarse con semillas puras separadas mediante el ensayo de pureza. Se mezcla bien la semilla pura y se cuenta aleatoriamente en rplicas. Despus se espacian de manera uniforme sobre el substrato del ensayo. Normalmente un ensayo consta de 400 semillas en 4 rplicas de 100 semillas cada una, pero, si 100 semillas son demasiadas para el substrato de que se dispone, entonces las replicaciones pueden subdividirse en un nmero mayor de rplicas ms pequeas, de 50 25 semillas cada una (Bonner 1974). Se recomienda de manera general dejar entre las semillas entre 1,5 y 5 veces la anchura o el dimetro normal de la semilla, para reducir el riesgo de que se desarrollen mohos de hongos (Bonner 1974, Justice 1972). Las excepciones son las especies que tienen la semilla muy pequea, pues en ellas es imposible (algunas especies de Eucalyptus) o muy difcil (Alnus, Betula, Populus, Salix) separar la semilla de la materia inerte o granzas que la acompaan. En estos casos el ensayo se efecta con el mismo nmero de rplicas, pero stas son de igual peso y no de igual nmero de semillas (vase las pginas 322323). El recuento de las semillas para llevar a cabo ensayos de germinacin puede facilitarse empleando tableros contadores como los descritos en las pginas 293294.

Equipo de germinacin
El tipo de germinador que se va a emplear puede seleccionarse segn la clase y la cantidad de semillas que van a ser objeto del ensayo; ser aceptable siempre que pueda ofrecer un control adecuado de las condiciones prescritas en materia de temperatura, humedad y luz. Los germinadores tienen tamaos muy variables, desde pequeas o porttiles unidades individuales hasta cmaras de germinacin en las que una persona puede estar de pie, pasando por armarios de diversas dimensiones y por las grandes masas de germinacin del tipo Jacobsen de Copenhague. Los principales tipos que recomienda la ISTA son los siguientes:

Aparatos de Jacobsen y Rodewald. En Europa es de uso habitual un germinador denominado aparato de Jacobsen o cubeta de Copenhague. Se trata de una cubeta con agua cuya temperatura puede controlarse mediante termostatos. Las semillas se distribuyen encima de un papel y se colocan sobre unas tiras metlicas o de vidrio que estn colgadas a unos 57 cm por encima de la cubeta; bajo el substrato hay unas mechas de papel o algodn que pasan por unos orificios hasta llegar al agua que est debajo. El contenido de humedad del substrato puede ajustarse modificando el nivel del agua, y tambin aumentando o reduciendo la distancia que hay entre el semillero y el agua (Kamra 1968). La humedad se mantiene alta en torno a la semilla, bien cubriendo toda la cubeta con una tapa transparente, bien colocando un embudo de plstico invertido, con un orificio en el extremo cnico, encima de cada plataforma de germinacin. Aunque este aparato puede estar expuesto a la luz natural, suele preferirse la luz artificial. Uno de los inconvenientes de la cubeta de Copenhague habitual es la ausencia de control directo de la temperatura en el semillero. En los trpicos tiende a recalentarse (Robbins 1982b). Se han construido modelos mejorados, como el de Overaa (1962), en el que los listones son de acero inoxidable y estn huecos, de manera que por ellos circula agua de calefaccin o refrigeracin. Otros inconvenientes de este equipo son que exige una gran cantidad de espacio en superficie en relacin con el nmero de ensayos que se pueden realizar, y tambin que manipular las cubiertas y los substratos parece ms pesado que mover una ligera bandeja con substratos de papel (Justice 1972). El aparato de Rodewald consiste en una caja de zinc con tapa de cristal en cuyo interior las semillas estn expuestas a la luz directa o difusa. La base del aparato contiene agua, y encima de sta hay una bandeja con una capa de arena hmeda. El semillero est compuesto por unos platos de porcelana sin vidriar colocados en la arena hmeda, aunque a veces se colocan directamente los platos sobre el agua. La temperatura de sta se controla mediante un termostato, y la arena se humedece mediante unas mechas que llegan hasta el agua. El substrato de arena no est indicado en las especies que necesitan una alternancia de temperaturas, pues tarda en ajustarse a los cambios trmicos. Armario de germinacin. Otro tipo muy extendido de aparato es la cmara cerrada para germinacin de semillas en condiciones de oscuridad, luz difusa o luz directa. Este tipo de germinador suele constituir en un armario de doble pared, convenientemente aislado frente a los cambios de temperatura mediante una cmara de aire o una capa de material aislante. Est dotado de unas guas adecuadas para colocar los tipos de bandejas de germinacin que prefieren los distintos laboratorios. La cmara de germinacin moderna est dotada de calefaccin y refrigeracin. Por lo general, el agua se enfra y pasa entre las paredes de la cmara o por unos conductos de refrigeracin que recorren las paredes interiores. En cuanto a la calefaccin, se calienta el aire o un depsito de agua situado en la base de la cmara. En estos armarios la temperatura puede regularse al nivel que se desee, entre 8C y 40C aproximadamente (ISTA 1976).

A veces se construyen localmente armarios de germinacin baratos. Gupta y Kumar (1977) han descrito los germinadores de bajo costo que se utilizan en el laboratorio de ensayo de semillas de Dehra Dun, India. La pared exterior del armario es de teca y mide 195 70 40 cm, y los controles elctricos comprenden un termostato, un ventilador de aire caliente, un distribuidor de aire aparte y un cronointerruptor para controlar la iluminacin. Como aislamiento entre la pared interior y la exterior se utiliza fibra de vidrio. El aparato funciona satisfactoriamente a temperaturas que van desde la temperatura ambiente hasta los 45C ( 1C). Los armarios de germinacin deben satisfacer en la medida de lo posible los requisitos siguientes (Oomen y Koppe 1969): humedad del aire - lo ms alta posible, pero preferiblemente nunca inferior al 90 por ciento, para evitar que el substrato de las semillas se seque en exceso; temperatura del aire - ajustable entre 10 y 35C; en toda la seccin de trabajo del armario, y a lo largo de una serie de das, la temperatura ha de ser uniforme en cada uno de los regmenes trmicos, con variaciones de ms o menos 1C; luz - iluminacin uniforme de las bandejas, con intensidad de entre 750 y 1 250 lux al nivel de las semillas; movimiento del aire - el mnimo posible para evitar que las semillas se sequen en exceso; suministro de aire fresco - escaso, del orden de un cambio de aire por hora, que debe ser suficiente para eliminar el dixido de carbono que producen las semillas al germinar; ciclo da-noche - en el cambio del da a la noche debe producirse un descenso inicial de la temperatura rpido, en 30 minutos, para despus alcanzar la temperatura nocturna definitiva en 1 hora; anlogos requisitos en el cambio de la noche al da; condensacin - no debe existir. No obstante, cuando los armarios funcionan con alternancia de temperaturas es muy difcil mantener alta la humedad y secos los substratos; para ello se precisa regar con frecuencia, lo cual afecta negativamente a los resultados de la germinacin y aumenta el nmero de horas-hombre empleadas en el ensayo (Boeke y otros 1969). Existen muchos tipos modificados de armarios de germinacin; pueden encontrarse descripciones pormenorizadas de algunos de ellos en Justice (1972) y Oomen y Koppe (1969). Cmara de germinacin. Cuando el nmero de ensayos es elevado pueden utilizarse para la germinacin habitaciones enteras, con control de temperatura, humedad y luz.

La cmara de germinacin es una modificacin del armario. Su construccin obedece al mismo principio que el armario, pero es lo bastante grande para que los trabajadores puedan entrar en ella y colocar los ensayos a uno u otro lado de un pasillo central. Por lo general se precisan ventiladores para evitar que la temperatura se estratifique, y se necesita tambin equipo especial para mantener alta la humedad relativa. Otra modificacin es la combinacin de cmara y armario de germinacin. La temperatura de toda la habitacin se mantiene en el nivel ms bajo requerido. Dentro de esta habitacin se colocan armarios de germinacin, que se calientan individualmente con energa elctrica para mantener las diversas temperaturas necesarias. Mediante este tipo de germinadoras se pueden obtener temperaturas constantes o alternas. Cajas de germinacin porttiles. Un tipo de germinador sencillo y verstil es el que consiste en una serie de cajas de plstico transparente, con tapa, que pueden apilarse una encima de otra. Robbins (1984) afirma que el recipiente ideal debe (1) ser rectangular y apilable, para ahorrar espacio; (2) ser lo bastante grande para que estn suficientemente espaciadas las semillas de una rplica como mnimo (100, 50 25 semillas segn el tamao de stas); (3) tener un fondo suficiente para que el substrato tenga la altura necesaria y para que los grmenes se puedan desarrollar hasta permitir una evaluacin adecuada; (4) tener una tapa que cierre bien, para mantener alto el contenido de humedad del substrato y el aire circundante; (5) poderse esterilizar fcilmente mediante calor o tratamiento qumico, y (6) ser transparente (al menos la tapa), por si se requiere luz para la germinacin y el desarrollo ulterior de los grmenes. En Honduras se utilizan cajas de 178 117 mm, con 72 mm de fondo, cada una de las cuales contiene una rplica de 100 semillas de pino. De esta manera entre cada semilla y la siguiente queda como mnimo un espacio equivalente a la anchura de una semilla. Cuando se trata de especies cuya semilla es de mayor tamao se colocan menos semillas por caja. Puede utilizarse cualquiera de los substratos habituales que se describen infra en este mismo captulo, como por ejemplo papel filtro o arena. Aadiendo al substrato una cantidad adecuada de agua al comienzo del ensayo y teniendo despus las cajas tapadas en todo momento, salvo cuando se va a evaluar o sacar los grmenes, se puede mantener alto y constante el contenido de humedad del substrato y del aire encerrado en las cajas, sin necesidad de aadir despus ms agua ni de controlar la humedad en la atmsfera que rodea las cajas. Cuando se utiliza como substrato papel filtro o papel secante, este material puede mantenerse permanentemente hmedo colocndolo en una plataforma elevada sobre un depsito de agua conectado con el substrato mediante unas mechas. Esta disposicin se asemeja, en miniatura, a la del aparato de Jacobsen. Las cajas pueden colocarse en una incubadora para controlar la temperatura y la luz conforme a las recomendaciones de la ISTA por ejemplo, o, cuando no se dispone de incubadora, pueden almacenarse en condiciones de temperatua y luz ambientales. En ambos casos las semillas en germinacin que se encuentran en las cajas deben disponer de las condiciones ptimas de humedad.

Investigadores del Instituto Nacional de Silvicultura de Petawawa, Canad, han creado una caja de germinacin, de plstico policarbonato ligero, irrompible y resistente al calor, que tienen la capacidad suficiente para contener cuatro rplicas de 100 semillas de pino u otras semillas de tamao parecido (Wang y Ackerman 1983). La caja tiene 28 cm de largo por 24 cm de ancho. La base tiene 5 cm de fondo, y 1 cm la tapa, pero el especial mecanismo de cierre, de carcter universal, permite unir dos bases; combinando los elementos de esa manera se pueden montar cajas con dos fondos distintos, de 6 y 10 cm, y se utiliza un tipo u otro segn las caractersticas de la especie en ensayo. El substrato de germinacin est apoyado en un falso fondo perforado, sobre ocho patas de 1 cm de largo, y el espacio que queda debajo puede utilizarse en caso deseado como depsito de agua. El material plstico se puede encontrar en dos versiones, transparente o negro, para la germinacin con luz o en la oscuridad respectivamente; para asegurar la oscuridad total es preciso sellar con una cinta opaca la unin entre la base y la tapa. En el tipo de plstico transparente es optativo que haya cuatro orificios de ventilacin en la pared lateral del elemento inferior.

9.7 Tablero de recuento con semillas de Celtis laevigata. Las semillas se extienden en el tablero superior, para que entre una semilla en cada agujero. Despus se mueve hacia la derecha el tablero, que est sujeto con un muelle, hasta que los orificios coinciden con los del tablero inferior; de esa manera caen las semillas. (Servicio Forestal, Dpto. Agric. EE.UU.)

9.8 Placa de recuento de un contador de semillas por aspiracin. Mediante una bomba se hace el vaco en el conducto y en la placa hueca, que tiene 50 100 pequeos orificios en la superficie inferior. Una vez que se ha succionado una semilla por cada orificio, se suelta el vaco accionando el mbolo con el dedo y las semillas caen. (Servicio Forestal, Dpto. Agric. EE.UU.)

9.9 Equipo de germinacin de semillas en la Divisin de Investigaciones Forestales, CSIRO, Canberra: A) armario abierto para germinacin de semillas B) grupo de armarios. (Divisin de Investigaciones Forestales, CSIRO, Canberra)

9.10 Germinadora Conviron G30, con una humedad relativa superior al 95% y programacin de temperatura y fotoperodo en 24 horas, que se utiliza en el Instituto Nacional de Silvicultura de Petawawa, Canad. (Servicio de Silvicultura del Canad)

9.11 Dos cajas de germinacin, una transparente y otra negra, que se utilizan para el ensayo de semillas en el Canad; pueden verse cerradas (arriba) y abiertas (abajo). (Servicio de Silvicultura del Canad)

9.12 Cubeta de Copenhague y rollos de papel filtro para ensayos de germinacin. (Centro de Semillas Forestales de DANIDA)

Los ensayos efectuados con esta caja de germinacin han ofrecido resultados muy comparables a los obtenidos con las placas Petri, que son mucho ms pequeas y por lo tanto ms incmodas. Se comprob que al cabo de cuatro semanas la menor prdida de humedad se haba producido en las cajas que tenan el depsito de agua lleno al principio del ensayo y que no tenan orificios de ventilacin. El tipo de plstico transparente y el de plstico negro resultaron a este respecto igualmente buenos, pero el desarrollo de mohos fue mayor en el tipo de plstico negro (sellado) que en el de plstico transparente. Si se colocaba sobre Kimpak (papel de celulosa) un substrato de papel secante, la prdida de humedad era ms lenta que cuando se utilizaba nicamente Kimpak. Eleccin del germinador. Casi todos los laboratorios de semillas forestales que procesan una cantidad moderada de muestras utilizan germinadores del tipo armario o del tipo mesa. En un informe de Boeke y otros (1969) se recomienda a los laboratorios de ensayo de semillas pequeos que utilicen exclusivamente los germinadores de tipo armario. Los armarios tienen, sobre las mesas de germinacin del tipo Copenhague las ventajas de que ahorran espacio y, cuando estn bien construidos, permiten un control ms preciso de la temperatura y la humedad (Oomen y Koppe 1969). Hay que sealar que un depsito de Copenhague de un solo nivel exige una cantidad de espacio en planta entre cinco y ocho veces mayor que la que ocupa un armario de igual capacidad (Boeke y otros 1969). Cuando se estn investigando las condiciones de germinacin, o cuando se estn realizando ensayos sobre muchas semillas distintas, puede ser muy til la flexibilidad que ofrecen varios armarios que funcionan a diferentes temperaturas y/o condiciones de luz. En el caso de los viveros o los pequeos institutos de investigacin, cuya tarea consiste en realizar sencillos ensayos de germinacin sin mantener un control estricto de la temperatura y la luz, son muy recomendables, por su flexibilidad, facilidad de almacenamiento y bajo precio, las cajas de germinacin de plstico. Estas pueden utilizarse asimismo en combinacin con incubadoras, que poseen control de la luz y la temperatura.

Condiciones de la germinacin
Las condiciones ptimas no son las mismas en las diversas fases de la germinacin y el desarrollo del germen, y puede ocurrir incluso que no sean las mismas para todas las semillas de un mismo lote. Por consiguiente, se han dedicado muchos esfuerzos de investigacin en este mbito a determinar la combinacin de condiciones con la que se pueda obtener la germinacin ms regular, rpida y completa de la mayor parte de las semillas de una misma especie. Substrato. La tierra se utiliza muy raramente como substrato en los ensayos de germinacin, pues las muestras pueden ser muy distintas en cuanto a sus propiedades fsicas, qumicas y biolgicas. Aunque los resultados del ensayo podran ser ms comparables si ste se realizara en las mismas condiciones en que viven las

plantas en el campo, la falta de reproducibilidad y la dificultad a la hora de comparar ensayos de diferentes lotes de semilla desaconsejan la utilizacin de este substrato. Los materiales artificiales se prestan mucho mejor a la normalizacin. En la mayora de los ensayos de laboratorio con especies de semillas pequeas se utiliza papel. Entre otros materiales figuran la arena, el musgo de turba granulado y la mica expandida (vermiculita y terralita). Los principales requisitos que debe reunir un substrato (Justice 1972) son los siguientes:

no txico para las plntulas libre de hongos y otros microorganismos de textura porosa para proporcionar ventilacin y humedad suficientes a las semillas en germinacin.

La eleccin del medio en el que se va a colocar las semillas para que germinen depende del equipo, la especie, las condiciones de trabajo y la experiencia del operario. En las Reglas de la ISTA se prescribe el material adecuado para diversos rboles forestales (vase el Cuadro 9.2, pginas 312313). El papel filtro, el cartn fuerte o cualquier otro papel absorbente pueden unirse a una mecha de papel filtro o algodn que est sumergida en agua por el otro extremo, o pueden colocarse encima de una capa de arena o vermiculita. El papel de celulosa se utiliza cada vez ms como medio de germinacin debido a que es ms fcil manipular que la arena y permite igualmente que penetre en l la radcula, lo que facilita una mejor evaluacin de la germinacin anormal. Adems, el contenido de humedad no tiende a estratificarse dentro del medio de papel, a diferencia de lo que ocurre con la arena (Belcher 1974). Los mejores substratos de papel para la germinacin son el papel secante, las toallas de papel, el papel filtro de laboratorio y el papel de celulosa plisado que se utiliza como relleno (Bonner 1974). Siempre que se utilice un substrato de papel debe comprobarse que no estn presentes en l sustancias qumicas txicas. En las Reglas de la ISTA de 1976 figuran especificaciones pormenorizadas sobre tipos de papel y toallas, incluidos aspectos como el peso, la resistencia al estallido, la ascensin capilar y la acidez. Las semillas que no tienen una necesidad de luz especfica pueden colocarse encima del papel o dentro del papel plegado. Este incrementa la superficie de contacto entre las semillas y la fuente de humedad. Las semillas grandes pueden enrollarse en toallas de papel que despus se colocan en vertical; esto hace que las races puedan crecer hacia abajo y evita que se enreden (MacKay 1972). Estos paquetes de papel enrollado o plegado pueden mantenerse hmedos sin necesidad de una mecha sumergida en agua. Los rollos de papel con semillas pueden almacenarse en platos de vidrio colocados encima de un depsito de agua, pero no en contacto con sta, y despus se cubre el conjunto con polietileno (Knudsen 1982). Los rollos en los que se adviertan signos de desecacin pueden rociarse con agua. La utilizacin de papel enrollado es un mtodo muy rpido y cmodo, pero puede hacer que las radculas se encrespen. Esto no importa cuando tras el ensayo no se van a utilizar las semillas

germinadas. En casos de germinacin operacional de grandes cantidades de semilla, en cambio, es preferible el mtodo de papel plegado, aunque sea algo ms lento. En Tailandia se utiliza con xito este mtodo como prctica habitual con Pinus y Eucaliptus spp. (Sirikul 1975). La arena no es un material adecuado cuando las semillas son muy pequeas, pues resulta difcil encontrarlas, pero se utiliza mucho cuando las semillas son ms grandes. Puede esterilizarse, y es un medio menos adecuado que el papel para el desarrollo de hongos. Proporciona asimismo un buen contacto entre la semilla y la humedad, pues las semillas pueden introducirse a presin en el medio. Una norma de sentido comn consiste en cubrir la semilla con una capa de arena cuyo grosor sea como mnimo equivalente a la longitud de la semilla en su eje ms largo (Aldhous 1972). La ISTA (1976) recomienda un grosor de 12 cm segn el tamao de la semilla y prescribe que las partculas de arena deben tener un tamao de entre 0,05 y 0,8 mm y un pH de entre 6,0 y 7,5. Se prefiere la arena como substrato de germinacin para las especies arbreas que tienen un perodo de germinacin ms largo, como por ejemplo Rosa spp., Pinus caribaea, P. elliottii y P. palustris, o semillas de mayor tamao, como por ejemplo P. pinea y Quercus spp. (Magini 1962). Un medio de perlita-arena permite la lixiviacin del agua, lo cual puede ser importante cuando se ensayan semillas recubiertas de un repelente (Belcher 1967), pero puede ser un inconveniente cuando las semillas que se ensayan son sensibles a la desecacin. Humedad y ventilacin. Se ha sugerido que el nivel de humedad del substrato es una de las principales causas de la variacin de los resultados que se obtienen en la investigacin sobre semillas (Everson e Isley 1951). Las Reglas de la ISTA especifican que los substratos de arena deben humedecerse en funcin de sus caractersticas y del tamao de la semilla que se va a ensayar y sugieren que para varios grupos de semillas agrcolas es adecuado un nivel de humedad del 5060 por ciento de la capacidad de retencin de agua de la arena. Los substratos de papel no deben estar tan mojados que se forme en torno a la semilla una pelcula de agua. Cuando trabajaba con Pinus spp., Belcher (1974) lleg a la conclusin de que la mayora de las especies presentaba una considerable tolerancia a diversos niveles de humedad, y de que las principales variaciones de la germinacin se deban a la ausencia de humedad. Este autor encontr algunas especies que eran sensibles a la falta de humedad, mientras que otras lo eran a unos niveles de humedad muy altos. A ttulo general, el substrato debe estar en todo momento lo suficientemente hmedo como para aportar a la semilla la humedad necesaria, pero la humedad excesiva reduce la ventilacin. Todos los ensayos deben examinarse a diario para comprobar que el contenido de humedad del substrato se encuentra cerca del nivel ptimo. El agua debe estar razonablemente libre de impurezas. Control de la temperatura. En los ensayos de laboratorio la temperatura importante es la que existe al nivel de las semillas. La temperatura adecuada vara segn la especie, y en las Reglas Internacionales para el Ensayo de Semillas figuran los valores indicados para muchas especies arbreas. El Cuadro 9.2, en las pginas 312313 es

un extracto del cuadro correspondiente de la ISTA, mucho ms amplio, y contiene los datos relativos a determinadas especies, con hincapi en especies tropicales y subtropicales. Adems de la temperatura, se indican en l las prescripciones en materia de substratos, luz, perodos de recuento y tratamiento previo. La temperatura es uno de los factores ms decisivos de la germinacin de las semillas en laboratorio y por ello debe ser objeto de comprobaciones peridicas. Cuando se precisa una alternancia de temperaturas, el ensayo se realiza por lo general a la temperatura baja durante 16 horas y a la temperatura alta durante ocho horas todos los das. En el caso de las especies arbreas suele prescribirse una alternancia de 20C y 30C. Aunque las fluctuaciones naturales entre las temperaturas diurnas y las nocturnas no son tan pronunciadas en los bosques tropicales hmedos de tierras bajas como en otros tipos de bosque, la alternancia de temperaturas puede no obstante afectar a la germinacin de especies tropicales. En un experimento efectuado con Terminalia ivorensis en Nigeria, con una alternancia de 34C y 24C se obtuvo una germinacin del 93 por ciento en 41 das, frente a un 27 por ciento con una temperatura constante de 30C, en ambos casos con luz constante (Okoro 1976). Luz. Las semillas de muchas especies arbreas necesitan luz para germinar. La luz fluorescente es tan eficaz como la luz diurna natural, y se prefiere en los ensayos debido a que, dentro de unos lmites, pueden normalizarse la longitud de onda y la intensidad. Se recomiendan, por la calidad de su luz y el poco calor que emiten, las lmparas fluorescentes de luz blanca y fra. La luz debe estar distribuida, de manera uniforme por toda la superficie del ensayo, y su intensidad debe oscilar entre 750 y 1 250 lux. Las semillas deben tener luz nicamente durante una parte del perodo de ensayo, por lo general 8 horas de cada 24, pero en el caso de las semillas de algunas especies puede ser conveniente alargar o acortar ese tiempo. Lucha contra los hongos en los ensayos de germinacin. Entre las prcticas de laboratorio que estn encaminadas a reducir el mnimo la difusin de hongos figuran las consistentes en colocar las semillas en el espaciamiento adecuado, controlar la temperatura, retirar las semillas podridas, ventilar adecuadamente y mantener el substrato con un nivel de humedad que no sobrepase el necesario para que se produzca la germinacin. Tambin es til esterilizar el equipo de laboratorio y desinfectar peridicamente los armarios de germinacin y otros aparatos. Como norma general, la semilla no se desinfecta, pues las semillas que presentan podredumbre suelen ser de escasa calidad. Magini (1962) afirma que en diversos experimentos efectuados con distintos mtodos de desinfeccin de la semilla un poco antes de la germinacin o durante ella no se obtuvo una mejora fiable del porcentaje de germinacin. Al ensayar semillas de conferas en Dinamarca se comprob, en cambio, que era beneficioso aadir una pequea cantidad de fungicida al agua que se utiliza para humedecer los rollos de papel (Knudsen 1982). En Australia, al ensayar las semillas de eucalipto en papel de filtro humedecido sobre una capa de vermiculita, result tambin eficaz rociar con fungicida Karathane a una concentracin de 0,8 g en un litro de agua destilada (Boland y otros 1980).

Condiciones de germinacin de determinadas especies

Las condiciones que prescriben la CSIRO y la ISTA para los ensayos de germinacin de determinadas especies tropicales, subtropicales y de la zona templada figuran en los Cuadros 9.1, pgina 311, y 9.2, pginas 312313 respectivamente. Notas al Cuadro 9.1: 1. Cuando las recomendaciones de temperatura estn separadas por punto y coma, es que se ha comprobado que esas temperaturas (constantes) son satisfactorias. No es necesaria la alternancia de temperaturas. 2. A menos que se especifique otra cosa, el substrato utilizado normalmente en los ensayos con eucaliptos en la Divisin de Investigaciones Forestales, CSIRO, Canberra, es papel filtro humedecido sobre vermiculita en una placa Petri. Cuando se recomienda slo vermiculita debe omitirse el papel filtro. 3. Cuando una temperatura figura entre parntesis, por ejemplo (25), es que se han obtenido resultados satisfactorios con esa temperatura pero no se han realizado ensayos con una serie completa de otras posibilidades. Cuadro 9.1 Datos sobre viabilidad de las semillas y recomendaciones para el ensayo de determinados eucaliptos (extrado, con actualizaciones, de Boland y otros 1980)
Recomendaciones para el ensayo de semillas No. medio de semillas viables por gramo de Peso de Primer Recuento semilla y la rplica Temperatura recuento final Recomendaciones granzas (g) (C) 1) (das) (das) especiales 2) 340 670 110 130 4,000 75 0,15 0,10 0.50 0,40 0,01 0,70 25 30 25;30 25 35 25 7 5 5 7 5 5 14 10 14 28 14 14 Esencial la luz Slo vermiculita Slo vermiculita Slo vermiculita

Especie E. brassiana E. camaldulensis E. citriodora E. cloeziana E. deglupta E. globulus subsp. globulus E. grandis E. microtheca

650 380

0,10 0,15

25 35

5 3

14 14 Esencial la luz, slo vermiculita o estratificar 3 semanas,

despus 20C E. regnans E. saligna E. tereticornis E. urophylla 180 540 600 460 0,30 0,10 0,10 0,10 15 25 25;30;35 (25) 3) 10 5 5 5 21 14 14 14

Cuadro 9.2 Tomado de ISTA (1976), Cuadro 5A. Mtodos de germinacin. Parte II, Semillas de Arboles. (Comprende las modificaciones introducidas en ISTA 1978). En este cuadro figuran los substratos, temperaturas y perodos de tiempo que se pueden utilizar, as como otras recomendaciones, como por ejemplo tratamientos especiales para muestras durmientes. En el caso de las especies de la seccin 1, los mtodos de las columnas 26 son prescriptivos, y no pueden utilizarse otros. Cuando en la columna de temperatura aparecen dos cifras, por ejemplo 2030, se trata de la alternancia diaria de esas temperaturas. La inferior debe mantenerse durante 16 horas de cada 24, y la superior durante las 8 horas restantes. Con las especies de la seccin 2 pueden utilizarse otros mtodos siempre que el mtodo elegido se indique en el Certificado Internacional de Anlisis. En el caso de algunas especies, y como se indica en la columna 7, se precisa un doble ensayo (con y sin enfriamiento previo); la fase de germinacin debe ser simultnea en ambos. Los mtodos menos aconsejables figuran en el cuadro entre parntesis. Las abreviaturas tienen los significados siguientes:
PSP - parte superior de papel EP A L TT 1) - entre papeles (incluidos rollos y papel plisado) - arena - esencial la luz - ensayo topogrfico con tetrazolio - en 1981, mediante una modificacin de la ISTA, se suprimi la referencia a rplicas pesadas en Eucaliptus y otros gneros. En el Apndice 3 de Boland y otros 1980 figuran unas orientaciones sencillas y actualizadas para el ensayo de eucaliptos. En el Cuadro 9.1 se reproducen datos tomados de ese apndice y correspondientes a algunas de las especies ms importantes.
Prescripciones en materia de: Otras instrucciones,

PSA - parte superior de arena

Especie

Primer Recuento incluidas Temperatura recuento final recomendaciones para Substrato (C) Luz (das) (das) romper la latencia 1 SECCION 1 (Prescriptiva) Acacia spp. 2 3 4 5 6 7

PSP

2030(20)

21

1) Perforar la semilla, cortar o raspar un fragmento de la testa en el extremo de los cotiledones y remojar durante tres horas, o 2) (Remojar las semillas durante una hora en H2SO4 concentrado, lavarlas bien en agua corriente tras el tratamiento con cido).

Ailanthus altissima

PSP

2030

21

Quitando el pericarpo tras 24 horas de remojo se puede acelerar la germinacin. (Puede ensayarse tambin mediante cuatro rplicas pesadas de entre 0,10 y 0,25 g cada una, segn la especie).

1) Alnus spp.

PSP

2030

21

Cedrela spp. Cryptomeria japonica Cupressus sempervirens 1) Eucalyptus camaldulensis Liquidambar styraciflua Nothofagus obliqua

PSP PSP PSP PSP

2030 2030 20 30

L L L L

7 7 7 3

28 28 28 14 Utilizar cuatro rplicas pesadas de 0,10 gramos cada una. Sensible a la desecacin durante el ensayo. Sin enfriamiento y con enfriamiento previo durante 28 das a 3 5C. Ensayos dobles.

PSP PSP

2030 2030

L L

7 7

21 28

Pinus caribaea P. elliottii

PSP PSP

2030 22;2030

L L

7 7

21 28

P. pinaster

PSP

20

35

1) Sin enfriamiento previo y con enfriamiento previo durante 28 das a 35C. Luz durante no ms de 16 horas al da. Ensayos dobles. 2) (Utilizar TT).

P. radiata P. taeda Quercus spp.

PSP PSP PSA(A)

20 20;2030 20

7 7 7

28 28 28 Remojar las semillas durante un perodo de hasta 48 horas, cortar en el extremo de la cicatriz de la semilla y quitar la testa. 1) Perforar la semilla o cortar o raspar un fragmento de la testa en el extremo de los cotiledones y remojar durante tres horas. 2) (Remojar las semillas enteras durante una hora en H2SO4 concentrado, durante el tiempo necesario para que se pique la superficie de la testa. Lavar las semillas a fondo en agua corriente).

Robinia pseudoacacia

PSP

2030

14

SECCION 2 (No Prescriptiva) Pinus kesiya P. merkusii P. oocarpa P. patula Tectona grandis

PSP PSP PSP PSP A

2030 2030 2030 20(2030) 30

L L L L L

7 7 7 7 14

21 21 21 21 28 Remojar en agua y dejar secar durante tres das - repetir la operacin seis veces.

Evaluacin

Se considera que una semilla ha germinado cuando han surgido de su embrin, y se han desarrollado a partir de l, las estructuras esenciales que indican la capacidad de la semilla para producir una plntula normal en condiciones favorables. En el recuento de germinacin no se incluye a los grmenes anormales, pues stos raras veces sobreviven para producir plantas. En las Reglas de la ISTA (ISTA 1976) se identifican cuatro grupos de grmenes anormales: (a) grmenes daados, (b) grmenes deformados, (c) grmenes podridos, y (d) grmenes con un desarrollo inusual del hipoctilo. En las Reglas de la ISTA se definen en detalle estos grupos y sus caractersticas. En un ensayo de laboratorio lo normal es que se saque la mayor parte de los grmenes normales en los recuentos intermedios, pero la valoracin de muchos de los grmenes dudosos y anormales ha de dejarse hasta el final del ensayo, de manera que no se clasifiquen errneamente como anormales los grmenes que son de crecimiento ms lento pero no presentan anormalidad alguna. En muchas especies el recuento inicial se efecta a la semana de iniciarse el ensayo, y pueden realizarse evaluaciones semanales hasta que termina el ensayo. Cuando se desea obtener una idea ms exacta de la velocidad de germinacin, la frecuencia de las evaluaciones habr de ser mayor. Al trmino del perodo del ensayo deben cortarse y examinarse todas las semillas que hayan quedado sin germinar, y debe registrarse el nmero de semillas frescas, firmes y posiblemente viables (Bonner 1974). Al mismo tiempo pueden efectuarse observaciones sobre el estado de las semillas no germinadas y no viables, como por ejemplo una incidencia inusualmente alta de semillas daadas por insectos o mecnicamente, lo cual indicara la necesidad de mejorar la higiene de la semilla o los mtodos de procesamiento de sta. El resultado de un ensayo de germinacin suele indicar por separado el porcentaje de semillas germinadas y el de semillas no germinadas pero aparentemente viables, por ejemplo en el caso siguiente:
Porcentaje de germinacin Porcentaje de semillas no germinadas pero viables Porcentaje de viabilidad = 82% = 6%

= 82% + 6% (= 88%)

9.13 Bellotas de Quercus alba germinando en Kimpak, en los Estados Unidos. Advirtase el espaciamiento entre las semillas. (Servicio Forestal, Dpto. Agric. EE.UU.)

9.14 Germinacin de semillas de abeto Douglas y pino torcido en Kimpak (A izquierda) y papel secante/Kimpak (A derecha) en placas Petri (A) y cajas transparentes canadienses (B-C). (Servicio de Silvicultura del Canad)

En los Cuadros 9.1 y 9.2 puede observarse que lo habitual es que los ensayos duren entre dos y cinco semanas, pero en este tiempo no est incluido el posible perodo de tratamiento previo para romper la latencia (vase el Captulo 8). Son muchas las especies que no necesitan un tratamiento previo, y algunos tipos de latencia de la cubierta seminal pueden tratarse satisfactoriamente en cuestin de horas. El tratamiento previo que se prescribe para Tectona, en cambio, dura 18 das, y en algunos casos el enfriamiento previo que est prescrito debe prolongarse durante 39 meses. Al planificar un programa de ensayos es necesario tener en cuenta no slo el tiempo del ensayo propiamente dicho, sino tambin el del tratamiento previo. En casos extremos puede ser necesario sustituir el ensayo de germinacin por uno de los ensayos indirectos de viabilidad que se describen infra.

Energa de germinacin
Hay ms de una forma de definir la energa de germinacin (Ford - Robertson 1971): (1) el porcentaje, en nmero, de semillas de una muestra determinada que germinan dentro de un perodo determinado (que se denomina el perodo de energa), por ejemplo en 7 14 das, en ptimas o determinadas condiciones, y (2) el porcentaje, en nmero, de semillas de una muestra determinada que germinan hasta llegar al momento de germinacin mxima, que generalmente significa el nmero mximo de germinaciones en 24 horas. En ambas definiciones la duracin del perodo de energa es considerablemente inferior a la del perodo del ensayo completo que prescribe la ISTA. La energa germinativa es una medida de la velocidad de la germinacin, y por ello se supone que tambin lo es del vigor de la semilla y del germen que produce. El inters por la energa germinativa se basa en la teora de que probablemente slo las semillas que germinan con rapidez y vigor en las condiciones favorables del laboratorio sern capaces de producir plntulas vigorosas en las condiciones que existen sobre el terreno, donde una germinacin dbil o retrasada suele tener consecuencias fatales (Aldhous 1972). Se han publicado pocos datos experimentales que avalen esta teora, pero los germinantes que presenten un retraso excesivo deben eliminarse automticamente del vivero, bien porque sucumben ante competidores ms antiguos y ms vigorosos, bien porque, si ya se ha terminado el trasplante, no justifican el esfuerzo de un trasplante especial suplementario. En las pginas 342343 se ofrece un ejemplo de la forma de calcular la energa de germinacin. Otro mtodo para comparar la energa de germinacin de diferentes lotes de semilla consiste en registrar la tasa de germinacin, es decir, el nmero de das que se necesitan para conseguir el 50 por ciento de la capacidad de germinacin (Allen 1958). Cuanto ms breve sea ese perodo, tanto mayor ser la energa de germinacin. Existe todava otro mtodo, consistente en evaluar la fase de desarrollo en que se encuentran las semillas germinadas y clasificar stas en una serie de clases en funcin del desarrollo o vigor. Por ejemplo, Wang (1976) utiliz siete clases para las semillas germinadas normales de Picea glauca, adems de las semillas no germinadas y las germinadas de manera anormal; esas clases iban desde grmenes con raz sana, hipoctilo plenamente desarrollado y cada total de la cubierta seminal

hasta que las semillas en las que la cubierta ya se haba abierto pero an no haba surgido la radcula.

Valor de germinacin
El concepto de valor de germinacin, tal como lo define Czabator (1962), tiene por finalidad combinar en una sola cifra una expresin de la germinacin total al trmino del perodo de ensayo y una expresin de la energa o velocidad de germinacin. La germinacin total se expresa en forma de germinacin diaria media (GDM) (final), que se calcula como el porcentaje acumulado de semillas llenas germinadas al final del ensayo dividido por el nmero de das que transcurren desde la siembra hasta el trmino del ensayo. La velocidad de germinacin se expresa en forma de valor mximo (VM), que es la germinacin diaria media mxima (porcentaje acumulado de germinacin de semilla llena dividido por el nmero de das transcurridos desde la fecha de siembra) que se alcanza en cualquier momento del perodo del ensayo. El valor de germinacin (VG) puede por tanto calcularse mediante la frmula siguiente: VG = GDM (final) VM El valor de germinacin se ha utilizado, en tanto que medida integrada de la calidad de la semilla, en varios trabajos sobre semillas tropicales, por ejemplo con Terminalia ivorensis(Okoro 1976) y Pinus kesiya (Costales y Veracion 1978). Otro mtodo para calcular el valor de germinacin es el que han propuesto Djavanshir y Pourbeik (1976), quienes comprobaron que, en el caso de Pinus ponderosa y P. eldaricaen el Irn, se ajustaba ms que el mtodo de Czabator a la supervivencia de las plantas en viveros sobre el terreno. La frmula propuesta por estos autores es la siguiente:

donde:
VG PG VGD = Valor de la germinacin = Porcentaje de germinacin al final del ensayo = Velocidad de germinacin diaria, que se obtiene dividiendo el porcentaje de germinacin acumulado por el nmero de das transcurridos desde la siembra

VGD = Total que se obtienen sumando todas las cifras de VGD obtenidas en los recuentos diarios N = Nmero de recuentos diarios, empezando a contar a partir de la fecha de la primera germinacin

Los clculos que se requieren son algo ms largos que los del mtodo de Czabator, y, en el caso de muchas modalidades de germinacin, es probable que el mtodo ms sencillo permita establecer comparaciones entre lotes suficientemente exactas. En las pginas 344345 se ofrecen ejemplos de clculo del VG con uno y otro mtodo.

Ensayos de germinacin en el vivero


Un buen ejemplo de mtodo adecuado para realizar ensayos de germinacin en el vivero es el procedimiento que se ha recomendado para los pinos tropicales de Malasia occidental (Paul 1972): Tomar 400 semillas puras y dividirlas en cuatro muestras, cada una de 100 semillas. Tomar cuatro cajas de madera o plstico (son muy aconsejables las cajas de varias capas de plstico flexible opaco) de 30 30 cm y unos 10 cm de fondo y llenarlas al mximo, casi un poco en exceso, de arena cernida, hasta llegar al lmite superior de las paredes. Mojar la arena poniendo en cada caja medio litro de agua. Nivelar la arena enrasndola con la parte superior de la caja y hacer a intervalos de 2,5 cm unos orificios de 6 mm de profundidad (en el caso de P. oocarpa los orificios deben tener slo 3 mm de profundidad). Sembrar las semillas (100) a intervalos de 2,5 cm y, presionando suavemente, introducirlas en los orificios abiertos en la arena. Cubrir con una capa de 6 mm (3 mm en P. oocarpa) de arena que pase por un tamiz del No 12 (4,76 mm de malla) pero no por uno del No 8 (3, 18 mm). Mojar ligeramente con un nebulizador fino. Tapar con polietileno transparente de 0,2 mm de grosor montado sobre la parte superior de un bastidor de madera cuadrado, perfectamente ajustado, de 5 cm de grosor. A las 24 horas se apreciar condensacin por la parte interior de la tapa de polietileno. Si durante los siete das siguientes se observa en algn momento que ha desaparecido la humedad, rociar ligeramente con un nebulizador y volver a tapar. Lo normal es que la germinacin se inicie el sptimo da, momento en el que se puede quitar la tapa. Mantener la arena hmeda. Se considera que una semilla ha germinado cuando ha alcanzado una altura de 1 cm en total, con la cubierta que recubre los cotiledones. Llevar un registro distinto para cada una de las cuatro cajas y consignar en l toda la germinacin que se produce entre el sptimo y el vigsimo octavo da. Sacar los grmenes nada ms registrarlos, y sacar tambin todos los grmenes enfermos, aunque no hayan alcanzado la altura de 1 cm, para evitar que infecten a otros. En el vigsimo octavo da despus de la siembra, cribar la capa superior de arena de cada caja por un tamiz del No 12 (4,76 mm de malla) y registrar el nmero de semillas completas que no han germinado. (Utilizar para ello el ensayo de corte).

Determinacin de la homogeneidad de los resultados de la germinacin


Mediante la utilizacin de cuatro rplicas en el ensayo de germinacin se puede medir el grado de variacin que existe en la muestra. Un mtodo sencillo consiste en calcular el intervalo de diferencia de porcentaje de germinacin que existe entre la submuestra ms alta y la ms baja. Este intervalo puede compararse despus con el cuadro que ha publicado la ISTA (1976) y que se reproduce aqu como Cuadro 9.3,

pgina 321 (es aplicable a rplicas de igual nmero de semillas, no de igual peso). Siempre que el intervalo efectivo sea inferior al intervalo mximo que figura en el cuadro, la muestra podr considerarse homognea, y aceptarse el promedio de las cuatro rplicas. Si el intervalo efectivo es superior al mximo del cuadro, entonces debe tomarse una nueva muestra para repetir el ensayo. Son causas frecuentes de esas situaciones la falta de homogeneidad en la semilla y, en los ensayos que se realizan en el vivero, el dao por hongos e insectos en una o varias rplicas (Paul 1972). Tambin es necesario repetir el ensayo cuando al trmino de ste queda un porcentaje sumamente alto de semillas llenas pero no germinadas (Bonner 1974). En ese caso, la repeticin del ensayo debe efectuarse con un tratamiento previo distinto, para tratar de romper la latencia y mejorar la germinacin total. Cuadro 9.3 Intervalos mximos tolerados entre rplicas (tomado del Cuadro 5 B, ISTA 1976) En este cuadro se indica el intervalo mximo (es decir, la diferencia mxima entre el valor ms alto y el ms bajo) de porcentaje de germinacin que es tolerable entre rplicas, lo que permite una variacin de muestreo aleatorio solamente con una probabilidad de 0,025. Para hallar el mximo intervalo tolerado en un caso determinado, hay que calcular el porcentaje medio, redondeado al nmero entero ms prximo, de las cuatro rplicas: en caso necesario, se formarn rplicas de 100 semillas combinando las subrplicas de 50 25 semillas que estaban ms prximas en el germinador. Despus se localiza el promedio en la columna 1 2 del cuadro y se lee el intervalo mximo tolerado correspondiente en la columna 3.
Porcentaje de germinacin medio 1 99 98 97 96 95 93 a 94 91 a 92 89 a 90 87 a 88 84 a 86 81 a 83 78 a 80 73 a 77 67 a 72 56 a 66 2 2 3 4 5 6 7a8 9 a 10 11 a 12 13 a 14 15 a 17 18 a 20 21 a 23 24 a 28 29 a 34 35 a 45 Intervalo mximo 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

51 a 55

46 a 50

20

Combinacin de los ensayos de pureza y germinacin


En los lotes comerciales de semilla de Eucalyptus no suele efectuarse el ensayo de pureza, pues es difcil o imposible separar la semilla de las granzas de algunas especies (Boland y otros 1980). Entre las especies en las que las semillas y las granzas son muy parecidas de tamao, peso y color figuran E. cloeziana, E. regnans y E. delegatensis. Otros gneros de semillas pequeas en los que resulta difcil separar la semilla pura son Alnus, Betula, Populus y Salix. Y cuando es posible, la separacin es muy laboriosa en estas especies. En el laboratorio de semillas de Canberra se tarda slo 67 minutos en preparar un ensayo de semillas de eucalipto con cuatro rplicas pesadas, mientras que en separar las semillas para efectuar un ensayo de pureza y en montar ste con cuatro muestras de 100 semillas cada una se tarda entre 20 y 50 minutos, segn el grado de dificultad que tenga la eliminacin de las granzas (Turnbull 1983). El pequeo tamao de las semillas impide asimismo realizar un ensayo de corte para determinar el nmero de semillas llenas pero no germinadas al trmino del ensayo. Por esas razones, lo mejor es realizar los ensayos sobre rplicas en peso y registrar los resultados como nmero de semillas germinadas por unidad de peso de la mezcla impura de semilla y material inerte. Tambin se puede efectuar un ensayo de aplastamiento para obtener una estimacin aproximada de la viabilidad. Cuando la semilla se siembra al voleo, al ingeniero forestal que ejerce en la prctica le interesa sobre todo el nmero de plantas que puede esperar obtener de una determinada parte, en peso, del lote de semilla que recibe. Siempre que se le diga que un kilogramo de semilla impura producir 36 000 plntulas germinadas, le da igual que ese resultado se deba a una combinacin de 90 por ciento de pureza por 80 por ciento de germinacin de semilla pura o de 80 por ciento de pureza por 90 por ciento de germinacin de semilla pura. En los ensayos locales, por consiguiente, y cuando el laboratorio de semillas no tiene personal suficiente, no hay objecin a que se omita el ensayo de pureza incluso en las especies en las que sera factible efectuarlo. En el caso de la siembra directa en recipientes individuales, en cambio, son evidentes las ventajas de obtener cifras por separado sobre la pureza y la germinacin, pues la siembra se efecta sobre la base de un determinado nmero de semillas (de una a varias) por recipiente, y no de peso de semilla por metro cuadrado de semillero o bandeja.

Ensayos para determinar indirectamente la viabilidad


Para estimar el potencial de germinacin de un lote de semilla, el mtodo ms indicado en la silvicultura prctica suele ser el que consiste en germinar efectivamente una muestra de ese lote. Pero se tarda varias semanas en completar estos ensayos, a lo que hay que aadir en algunas especies algunas semanas ms, o meses, de tratamiento previo. Este es el motivo de que se haya investigado ampliamente la posibilidad de otros mtodos mediante los cuales se pueda estimar la viabilidad de la semilla con precisin y a la vez en mucho menos tiempo que el que precisan los

ensayos de germinacin. La descripcin de esos mtodos que figura a continuacin est fielmente basada en la de Turnbull (1975d). Los ensayos rpidos de viabilidad persiguen los dos objetivos siguientes:

determinar rpidamente la viabilidad de semillas de especies que normalmente germinan con lentitud o muestran latencia cuando se le aplican los mtodos de germinacin normales. determinar la viabilidad de muestras que al trmino del ensayo de germinacin presentan un elevado porcentaje de semillas frescas pero no germinadas o duras.

Hasta hace poco tiempo, la Asociacin Internacional de Ensayo de Semillas solamente aceptaba dos mtodos, el ensayo topogrfico de tetrazolio y el ensayo de excisin del embrin, como mtodos oficiales para algunos tipos de semillas. Recientemente la ISTA ha aceptado el mtodo de rayos X como alternativa vlida al ensayo de corte para detectar las semillas vacas y daadas por insectos. Segn las circunstancias, puede aplicarse cualquiera de los ensayos que se describen a continuacin:

Ensayo de corte
El mtodo ms sencillo para determinar la viabilidad es la inspeccin visual directa de las semillas, previamente abiertas con un cuchillo o escalpelo. Si el endosperma tiene un color normal y el embrin est bien desarrollado, la semilla tiene muchas posibilidades de germinar. Este ensayo no es muy fiable. No es difcil considerar como no viables las semillas que tienen el embrin lechoso, poco firme, mohoso, podrido, consumido o con olor rancio y las semillas abortivas que carecen de embrin (Bonner 1974). Pero no es posible distinguir las semillas moribundas, recin muertas o recin daadas que siguen teniendo el mismo aspecto que las semillas viables. Como ya se ha sealado, el ensayo de corte se utiliza al trmino de un ensayo de germinacin para determinar la viabilidad aparente de las semillas que no han germinado; es tambin un instrumento til para estimar el tamao y la madurez de la produccin de semilla antes de la recoleccin (Captulo 3), as como la eficiencia de los mtodos de procesamiento. En Filipinas se ha comprobado que existe una buena correlacin entre el ensayo de corte y el de germinacin en especies de semilla bastante grande, como Leucaena, Intsia bijuga y Lagerstroemia speciosa (Seeber y Agpaoa 1976), aunque el porcentaje de germinacin era sistemticamente un 1020 por ciento inferior al porcentaje de semillas viables que arrojaba el ensayo de corte.

Ensayo topogrfico de tetrazolio


El mtodo de tetrazolio es uno ms de los varios ejemplos de ensayo bioqumico de semillas que se han ideado. En Moore (1969) figura un breve examen de esos diversos tipos de ensayo. El de tetrazolio lo introdujo G. Lakon en 1942 en Alemania.

En este mtodo se tien de rojo las clulas vivas mediante la reduccin de una sal de tetrazolio, que es incolora, para formar un formazano rojo. Se hace hincapi en la necesidad de conocer la viabilidad de las distintas partes del embrin para predecir el desarrollo de embriones y su conversin en grmenes que se puedan contar (Moore 1973). El procedimiento del ensayo se describe pormenorizadamente en las Reglas de la ISTA (ISTA 1976), que aprueban el ensayo en algunas especies de frondosas y conferas que germinan con lentitud cuando se les aplican los mtodos habituales. La prctica normal consiste en poner las semillas en remojo en agua durante unas 20 horas, despus cortar o perforar la cubierta seminal para facilitar la entrada de la solucin acuosa de tetrazolio (TZ), al 1 por ciento, y despus dejar las semillas en ese lquido, en un lugar oscuro, durante 48 horas (Bonner 1974). El proceso puede acelerarse considerablemente cortando por completo la semilla a una distancia de un tercio del micrpilo y colocndola durante slo media hora en una mquina de vaco tipo Vitascope. Aunque este mtodo dio resultados satisfactorios en Dinamarca, para interpretar los resultados es preciso que el operario tenga ms experiencia que en el mtodo de inmersin de la semilla y excisin del embrin teido (Knudsen 1982). El ensayo se efecta sobre cuatro rplicas de 100 semillas cada una (ISTA 1976). Justice (1972) seala que, aunque el procedimiento del tetrazolio es bueno en principio, su utilizacin prctica en los ensayos rutinarios se ve limitada por numerosos problemas, entre ellos los siguientes: la resistencia a teirse que presentan algunas semillas; la necesidad de cortar o diseccionar las semillas para poder observar las partes teidas; la escasa coincidencia con los resultados de los ensayos de germinacin en algunos casos, especialmente en las semillas que tienen una capacidad germinativa baja; la ausencia de una interpretacin uniforme del teido y la dificultad de interpretar la significacin de los diferentes grados del mismo, y un mayor nmero de horas-hombre para ensayar 400 semillas en comparacin con los ensayos de germinacin ordinarios. Moore (1973) admite que para que este ensayo de sentido comn funcione perfectamente es necesario contar con un analista experimentado. Es indudable que puede ser til para determinar la viabilidad de algunas especies, siempre que se disponga de personal capacitado para preparar las semillas y evaluar los resultados.

Ensayo de excisin del embrin


Este mtodo consiste en dejar las semillas en remojo durante 14 das y despus excindir los embriones de las semillas y colocarlos en papel filtro o discos secantes humedecidos en placas Petri. Se colocan despus a la luz, con una temperatura constante de 20C. Todos los das se examina el estado de los embriones. Segn la especie y el lote de que se trate, el ensayo puede concluir en unos pocos das, prolongarse hasta un mximo de 14 das o mantenerse hasta que es posible diferenciar claramente los embriones viables de los no viables. El ensayo de excisin del embrin se asemeja a los ensayos de germinacin en que se basa en la germinacin real de la semilla para medir su calidad. Adems, permite

efectuar tambin una medicin de la latencia del embrin, pues se cuentan las semillas que, aunque sin crecer normalmente, se han desarrollado algo, se han mantenido firmes y han conservado su color durante el perodo del ensayo. Este no es vlido para las semillas germinadas secas. Para que el ensayo se realice satisfactoriamente es neceario que el operario posea un nivel considerable de aptitud y experiencia, y adems las Reglas de la ISTA lo limitan nicamente a unas cuantas especies. En un estudio completo, Schubert (1965) compar el mtodo de excisin del embrin con el de tetrazolio para determinar la viabilidad de las semillas de rboles que presentan latencia. Lleg a la conclusin de que debe preferirse el mtodo de tetrazolio al de excisin del embrin, pero que debe mejorarse el primero incorporando la utilizacin de bactericidas y aplicando soluciones reductoras ms fuertes para resolver las dudas que plantean los tejidos dbilmente teidos.

Mtodos radiogrficos
Hace ms de 70 aos que se utilizaron por vez primera las radiografas para determinar la calidad de las semillas (Lundstrom, 1903, citado por Kamra 1964). Los estudios de Simak y Gustafsson (1953) destacaron la importancia de la tcnica de rayos X como mtodo de diagnstico en el anlisis de las semillas arbreas. Se desarroll as el mtodo de contraste con rayos X, que utiliza diversos agentes de contraste o radiopacos y que se ha aplicado con xito a especies de Pinus y Picea (Simak 1957; Kamra 1963a, b). El mtodo de rayos X permite detectar las semillas vacas y las estructuras seminales que presentan dao mecnico o un desarrollo interno anormal, medir el grosor de la cubierta y evaluar la viabilidad de la semilla cuando se combina con un agente de contraste. El mtodo de contraste con rayos X se basa en el principio de semipermeabilidad. Cuando se tratan las semillas con un agente de contraste, por ejemplo BaCl 2 acuoso o CHCl3en forma de vapor, sus tejidos vivos son capaces de evitar la entrada de este agente debido a su semipermeabilidad, mientras que los tejidos muertos se impregnan de l. Los tejidos impregnados absorben los rayos X de una manera ms intensa que los no impregnados, y por lo tanto aparecen en la pelcula con un color ms claro que stos. El contraste permite localizar en la semilla los tejidos que estn vivos y los que estn muertos, as como estimar su viabilidad (Kamra 1964). En la actualidad ya es posible utilizar, como agente de contraste para determinar la viabilidad de la semilla, agua no txica en vez de BaCl2 o CHCl3, que son txicos (Simak 1982). La aparicin de equipo de rayos X blandos ha simplificado considerablemente la operacin (Belcher 1973). No se precisa equipo fotogrfico complicado, y puede utilizarse pelcula polaroid, con la que se obtienen radiografas claras y detalladas en 30 segundos (Edwards 1973).

La radiografa de rayos X se ha aplicado con xito a la determinacin del nmero de semillas en los frutos de teka (Tectona grandis) y al estudio de sus fases de desarrollo (Kamra 1973). Esta tcnica se ha ensayado en los frutos o semillas de 60 especies arbreas tropicales, y los resultados indican que puede aplicarse con fiabilidad en su procesamiento (Kamra 1974, 1976, 1980). Kamra, Meyer y Wegelius (1973) han desarrollado una tcnica de estereorradiografa que complementa el mtodo de contraste con rayos X como procedimiento para determinar la calidad de las semillas. La principal ventaja de la estereorradiografa es que el observador puede obtener una visin tridimensional del objeto a partir de dos radiografas. De esta manera puede determinarse con fiabilidad la ubicacin topogrfica exacta del agente de contraste en la semilla. Con ello se ampla la informacin que puede obtenerse de las radiografas y se aumenta la precisin analtica. El mtodo de rayos X es un mtodo til, y es probable que desempee un papel cada vez ms importante en el ensayo de semillas. Los primeros modelos de aparatos de rayos X eran costosos, pero los modelos recientes, especialmente los japoneses, son mucho ms baratos, y en la actualidad su costo es inferior al de una germinadora de armario. Las mejoras introducidas en la pelcula y el papel fotogrficos han acelerado el proceso y simplificado la interpretacin, de manera que es fcil capacitar a tcnicos en la obtencin de resultados congruentes. La ISTA ha aceptado el mtodo como alternativa vlida al ensayo de corte para detectar las semillas vacas y daadas por insectos. Ha ofrecido tambin resultados muy prometedores como medio de distinguir, entre las semillas llenas, las que son viables de las que no lo son (Simak 1980, Simak y Sahln 1981). En el caso de algunas conferas de la zona templada se ha podido obtener una buena correlacin entre la clase de desarrollo (CD) de las semillas, sobre la base del desarrollo tanto del embrin como del endosperma y su germinabilidad. En la Figura 9.16 se indican las CD que se han determinado para las conferas, y en el Cuadro 9.4 figura la germinabilidad correspondiente a cada clase respecto de Pinus sylvestris y Picea abies (Simak 1980).

9.15 Radiografa con rayos X de frutos de teca, en los que se observa una variacin en el nmero de lculos (de dos a seis). (S.K. Kamra)

9.16 Radiografas con rayos X que muestran distintas clases de embrin y endosperma en las semillas de conferas. (M. Simak) O I Ni embrin ni endosperma (= semilla vaca). Endosperma y cavidad embrionaria desarrollados, pero sin que se observe embrin.

IIP Endosperma y uno o ms embriones pequeos cuya longitud no supera su anchura (embriones puntuales). II III Endosperma y uno o varios embriones, ninguno de los cuales es ms largo que la mitad de la cavidad embrionaria. Endosperma y uno o ms embriones, el ms largo de los cuales mide entre la mitad y tres cuartas partes de la cavidad embrionaria.

IV Endosperma con un solo embrin plenamente desarrollado, que ocupa por completo o casi por completo la cavidad embrionaria. En raras ocasiones

aparecen embriones diminutos. A B El endosperma llena casi por completo la capacidad de la cubierta seminal y absorbe fcilmente los rayos X. El endosperma llena la cubierta seminal de manera incompleta, y suele presentar encogimiento u otra deformacin. La absorcin de rayos X es inferior a la del tipo A. Semillas daadas por insectos, con larvas (JI) o excremento de stas (Je).

Ab Semilla con desarrollo anormal del endosperma o el embrin. J

Cuadro 9.4 Germinabilidad, en porcentaje y determinada por el mtodo radiogrfico, de semillas recin recolectadas y sin dao pertenecientes a diversas CD (Material: muestras de semilla con amplia distribucin por toda Suecia. Ensayo de germinacin: aparato de Jacobsen, temperatura de 23C constantes, luz de 1 000 lux 8 horas diarias).
Especie IA Pinus sylvestris Picea abies 0 0 II A 50 36 III A 88 82 IV A 99 97 CD II P 0 0 II B 5 15 III B 43 71 IV B 68 92

La clave de las distintas clases de desarrollo (CD) puede encontrarse en la Figura 9.16.

Perxido de hidrgeno
El perxido de hidrgeno (H2O2) tiene un efecto de estimulacin de la germinacin de las semillas, y se ha utilizado en la parte occidental de los Estados Unidos en un ensayo rpido de germinacin de varias conferas (Bonner 1974). Se dejan las semillas en remojo durante toda la noche en H2O2 al uno por ciento. Se corta despus la cubierta seminal para dejar al descubierto el extremo de la radcula, y se vuelven a poner las semillas en H2O2 al uno por ciento, en un lugar oscuro, y con alternancia de temperaturas, (20C y 30C). A los tres o cuatro das se efecta un recuento y se renueva el H2O2, y la evaluacin final se efecta a los siete u ocho das. Si la radcula tiene 5 mm o ms, la germinacin se considera evidente; cuando tiene entre 0 y 5 mm se considera escasa, y cuando no ha habido crecimiento alguno de la radcula se considera que la semilla es no viable o vaca (Danielson 1972, citado por Bonner 1974). El ensayo es ms rpido pero menos fiable que un ensayo de germinacin normal (en el que se suele obtener una germinacin final ms rpida y elevada), ms lento pero ms sencillo de realizar que el ensayo de excisin del embrin y ms fcil de interpretar que el ensayo de tetrazolio.

9.17 Radiografa con rayos X de semillas de Pinus caribaea. Casi todas ellas tienen el gametfito y el embrin muy poco desarrollados, y estn muertas. Las pocas que son germinables estn contorneadas en negro. (M. Simak)

9.18 Semillas de Quercus cortadas por la mitad para pasar a la estufa, a fin de determinar su contenido de humedad. (Servicio Forestal, Dpto. Agric. EE.UU.)

9.19 Humidmetro elctrico Dole para semillas que se utiliza en los Estados Unidos. (Servicio Forestal, Dpto. Agric. EE.UU.)

9.20 Humidmetros elctricos que se utilizan en Dinamarca. A: aparato de infrarrojos de Jacoby. B: Super-matic. C: Mettler. (C