Génie Génétique Et Clonage

Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.
ch/nfp37 Introduction Gnrale
A) Introduction gnrale
1) Qu'est-ce qu'une cellule?

La cellule est l'unit du monde vivant et les millions de types diffrents d'organismes qui peuplent la Terre ont tous un dnominateur commun : ils sont constitus de cellules. Elles sont trs petites. Une bactrie, qui est forme d'une seule cellule, a gnralement un diamtre d'un micron (m). Pour avoir une ide de la longueur d'un micron, imaginez que vous divisez la plus petite division d'une rgle gradue (1 millimtre) en 1 000 segments gaux. Chacun de ces segments mesure un micron. Les tres humains sont constitus de billions de cellules, qui sont dix fois plus grosses qu'une cellule bactrienne (10 m), mais qui ne peuvent tre observes l'oeil nu. Il faut un microscope. Les cellules appartenant de grands organismes (comme les tres humains) ne sont pas toutes pareilles. Ces cellules diffrentes ont une fonction et un aspect fort diffrents car elles se sont spcialises dans certaines tches trs diverses. Par exemple, les cellules T, qui font partie de notre systme immunitaire, sont trs diffrentes de nos cellules nerveuses. Les cellules T sont structures de sorte nous aider combattre l'infection, tandis que les cellules nerveuses doivent pouvoir transmettre et recevoir les impulsions lectriques qui caractrisent la fonction crbrale. Mais toutes les cellules humaines ont quelque chose en commun, depuis les cellules du cerveau jusqu' celles des yeux en passant par les cellules des muscles et de la peau : elles contiennent de l'ADN, le patrimoine gntique . Et chacune d'entre elles, peu importe sa forme ou sa fonction, contient une srie complte d'ADN. C'est ce mme ADN que l'on retrouve dans toute cellule du corps d'un individu.
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2) Qu'est-ce que l'ADN?
L'ADN, abrviation d'acide dsoxyribonuclique, se trouve dans le noyau de la plupart des types de cellules. Il contient les instructions propres la cellule et dtermine comment les traits d'une personne seront transmis d'une gnration l'autre. Dans le noyau d'une cellule humaine, on compte 23 paires de chromosomes, soit 46 chromosomes en tout. Chaque chromosome est form de chromatine enroule qui est compose d'ADN enrobant des protines appeles histones. Les 23 paires de chromosomes dans le noyau font office de manuel d'instructions pour le dveloppement d'un individu. L'ADN dtermine si la personne aura les yeux bleus ou bruns ou les cheveux foncs ou blonds. Comment les molcules (et les brins d'ADN sont des molcules) peuvent-elles donner des instructions ? Pour le comprendre, examinons comment nous communiquons et comprenons les livres partir desquels nous obtenons des informations. Au niveau le plus fondamental, nous ne comprenons les livres que s'ils utilisent un code que nous pouvons comprendre. Le code s'appelle par exemple franais ou anglais. Vous comprendrez le texte que vous tes en train de lire si vous comprenez chacun des mots de franais ou d'anglais quil contient. Par ailleurs, les mots vhiculent rarement une information complte ou comprhensible. L'information est mieux communique si l'on regroupe des mots, et, comme vous le savez dj, la srie de mots qui vhicule une pense complte s'appelle une phrase. Le langage de l'ADN, comme l'anglais et le franais, comprend des mots et des phrases galement! Chaque mot est une unit de la molcule d'ADN appele nuclotide. Chaque phrase est une longue chane de nuclotides appele gne. Mais parlons d'abord des mots de l'ADN.
Formation d'une molcule d'ADN : Nuclotides Les mots de l'ADN sont de petites molcules appeles nuclotides. Le gnome humain, constitu de 23 paires de chromosomes, contient au total quelque trois milliards de nuclotides. Chaque nuclotide comprend une armature et une base azote. L'armature sert attacher les nuclotides ensemble.
Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale Il convient de parler d'un autre aspect important des nuclotides : l'adnine (A) se lie uniquement la thymine (T) et la cytosine (C) uniquement la guanine (G). De ce fait, on dit que A est associe T et que C est associe G. Il est bien plus facile de rompre les liaisons A-T et CG (appels liaisons hydrognes) que de rompre des liaisons reliant ensemble l'armature des nuclotides dans la chane d'ADN (appels liaisons covalentes). Cette proprit prendra de l'importance par la suite, lorsque nous parlerons de la synthse des protines.
Formation d'une molcule d'ADN : Comment les nuclotides se lient : Les molcules d'ADN sont formes en ralit de deux chanes parallles de nuclotides. On dit que chaque chane est complmentaire de l'autre, car chaque nuclotide d'une chane se lie son partenaire complmentaire de l'autre ct. Il serait utile de reprsenter la molcule d'ADN comme une chelle, dont les deux montants sont composs des armatures de nuclotides relies entre elles, et dont les chelons sont les paires de base complmentaires A-T et G-C. Ainsi, si un ct de l'chelle a la squence AATGC, le ct complmentaire aura la squence TTACG. En ralit, l'chelle d'ADN est entortille et forme une double hlice. Comme les liaisons hydrognes (reliant G C ou T A) sont plus faibles que les liaisons covalentes reliant les nuclotides entre eux, les deux chanes complmentaires formant l'chelle entortille peuvent facilement tre droules et spares.
3) Gnes: les phrases de l'ADN

Un gne est une srie de nuclotides (mots d'ADN) qui constitue une unit d'information hrditaire. Chacun des chromosomes dans le noyau d'une cellule humaine contient des milliers de gnes. Tout l'ADN contenu sur les 23 paires de chromosomes dans une cellule humaine renferme les 80 000 gnes (et en consquence, toutes les instructions gntiques) qui constituent le gnome humain. Mais qu'entend-on par unit d'information hrditaire ? On peut donner une dfinition plus prcise du gne : rgion d'ADN qui est transcrite. La transcription, processus biologique assur par les enzymes constitue la premire tape du processus de synthse de protines. Comme son nom l'indique, le processus de synthse des protines donne lieu la production d'une protine. Les protines sont les molcules biologiques qui donnent aux cellules vivantes leurs formes et fonctions diverses. Ainsi, un gne est une squence d'A, de T, de C et de G - dans un ordre particulier - qui code pour une fonction biochimique prcise, en gnral par la production d'une protine particulire. Ce sont les protines produites l'aide de gnes comme matrice, qui sont responsables des caractristiques d'une cellule ou d'un organisme particulier. Les gnes ont des tches spcifiques, des moments particuliers. Tous les gnes ne sont pas actifs en mme temps. Par exemple, de nombreux gnes ne sont actifs (entranant la production de protines) que pendant le dveloppement du foetus humain. Une fois l'enfant n, les protines associes ces gnes ne sont plus requises, et ces derniers sont dsactivs , peut-tre jamais, sauf lorsqu'ils sont transmis aux gnrations suivantes. D'autres gnes ne sont activs que lorsque le corps en a besoin. Par exemple, le gne responsable de la production d'insuline est rgi par la quantit de glucose (sucre) prsente dans le sang d'une personne. Aprs la consommation d'un repas, le sang renferme une plus forte concentration de glucose, ce qui dclenche la production d'une quantit accrue d'insuline par les cellules du pancras. L'insuline stimule l'absorption de glucose par des tissus comme les muscles squelettiques et les tissus adipeux (graisse), ce qui ramne la concentration de glucose dans le sang un niveau normal. Une fois que le taux de glucose dans le sang est revenu la normale, la quantit d'insuline scrte par les cellules du pancras est galement rduite.
4) Qu'est-ce que l'ARN?

L'ARN est l'abrviation d'acide ribonuclique. Tout comme l'ADN, les molcules d'ARN sont fabriques dans le noyau de la cellule. Toutefois, contrairement l'ADN, l'ARN ne se limite pas au noyau. Il peut migrer dans d'autres parties de la cellule. De l'ARN, appel ARN messager communique le message gntique que l'on retrouve dans l'ADN au reste de la cellule afin de favoriser la synthse de protine. La faon dont une squence de gnes dans l'ADN se traduit par la suite en une protine correspondante fait l'objet de la section sur la synthse des protines. Tout comme l'ADN, les molcules d'ARN sont composes de nuclotides. Toutefois, alors que les molcules d'ADN sont formes de deux brins parallles de nuclotides, une molcule d'ARN n'en compte qu'un. Par ailleurs, la structure chimique de l' armature du nuclotide de l'ARN est lgrement diffrente de la structure de celle de l'ADN. L'armature de l'ADN contient des molcules de sucre dsoxyribose (d'o le D dans ADN) et celui de l'ARN des molcules de sucre ribose (d'o le R dans ARN). Trois des quatre bases azotes pouvant se lier l'armature de l'ARN sont les mmes que celles pour l'ADN. Tout comme l'ADN, les nuclotides de l'ARN peuvent avoir des bases de guanine (G) et de cytosine (C) et tout comme dans les nuclotides d'ADN, le guanine s'associe (se lie) la cytosine (G-C). Une troisime base que l'on retrouve dans l'ARN adnine (A) - est galement la mme que dans l'ADN. Mais au lieu de la thymine (T), l'ARN comporte de l'uracile (U) qui se lie l'adnine (U-A).
5) Les protines
quoi servent les protines? De nombreux gnes codent pour des chanes polypeptidiques particulires. Et les protines comprennent une ou plusieurs chanes polypeptidiques. Ce sont les protines qui sont responsables des caractristiques d'un organisme ou d'une cellule. La faon dont les protines sont construites, selon une matrice gntique, est dcrite dans la section sur la synthse des protines. Les protines ont diverses vocations et donnent aux cellules vivantes leurs diverses formes et fonctions. Certaines protines ont une fonction structurale; ces protines fabriquent le cartilage, les cheveux et les ongles, par exemple. Une catgorie spciale de protines, les
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enzymes, catalysent d'importantes ractions chimiques dans la cellule qui ne pourraient normalement se produire en leur absence. Certaines protines servent de canaux membranaires qui facilitent le passage des particules molculaires vers ou hors de la cellule. Certaines hormones, comme l'insuline, sont des protines qui rgulent les fonctions du corps (l'insuline contrle le taux de sucre dans le sang). Les protines sont galement requises pour la contraction des muscles et aident les cellules du corps se dfendre contre les envahisseurs trangers. Les fonctions susmentionnes ne constituent qu'une partie des diverses fonctions des protines. Structure de la protine Toutes les protines sont constitues d'une ou de plusieurs longues molcules appeles polypeptides. Chaque polypeptide est compos de petites molcules relies bout bout et appeles acides amins. Les 20 types d'acides amins utiliss par les cellules vivantes ont tous une structure d'armature identique, qui sert lier ensemble les acides amins en une longue chane. Chaque type d'acide amin possde galement ce qu'on appelle un groupe latral, distinct sur le plan chimique, selon le type d'acide amin. Bien qu'il ne soit pas ncessaire d'exposer en dtail la faon dont varient les structures des groupes latraux, mentionnons qu'ils peuvent tre regroups en plusieurs catgories. Par exemple, certains groupes latraux sont non polaires, tandis que d'autres sont polaires. Les molcules polaires et non polaires restent gnralement loignes les unes des autres. (Avez-vous jamais remarqu que l'huile de cuisson et l'eau ne se mlangent pas, mais demeurent ensemble dans de grosses bulles? C'est justement parce que les molcules d'huile sont non polaires, et les molcules d'eau, polaires) Les molcules d'eau sont polaires, et comme les molcules non polaires n'aiment pas s'associer des molcules polaires, nous appelons souvent les molcules non polaires hydrophobes (du grec, craignant l'eau ). Par ailleurs, les molcules polaires sont hydrophiles (du grec, aimant l'eau ), car elles aiment interagir avec l'eau. Les protines, qui flottent dans la cellule ou n'importe o dans votre corps, sont entoures d'un milieu principalement aqueux.. Qu'arrive-t-il la longue chane d'acides amins, dont certains sont hydrophobes et d'autres hydrophiles? La protine se plie en une structure en trois dimensions o la plupart des acides amins hydrophobes sont tourns vers l'intrieur de la structure (s'cartant de l'eau) et o la plupart des acides amins hydrophiles se trouvent en surface, tourns vers l'eau. En consquence, les
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Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale types d'acides amins et l'ordre dans lequel ils se situent dans la chane dtermineront comment la protine finira par se plier dans l'eau, et, ds lors, sa structure en trois dimensions dans votre corps. Cette structure tridimensionnelle est essentielle au bon fonctionnement de la protine. Une protine de transport membranaire, par exemple, est intgre dans la membrane de la cellule et a la forme d'un tunnel ou d'un corridor reliant chaque ct de la membrane l'autre. Elle a pour tche de permettre certaines molcules qui le peuvent d'entrer ou de sortir de la cellule. De toute vidence, la forme de la protine de transport est trs importante pour qu'elle puisse remplir correctement sa fonction! Une protine de transport mal forme peut avoir un corridor bloqu , ce qui signifie que les grosses molcules ne peuvent entrer ou sortir de la cellule. Les enzymes constituent un autre exemple de catgorie de protines dont la forme est essentielle leur bon fonctionnement.
6) Les enzymes
Qu'est-ce qu'un enzyme? Un enzyme est un catalyseur biologique. Mais qu'est-ce qu'un catalyseur? Un catalyseur est une substance qui acclre la vitesse d'une raction biochimique sans tre altre dans le processus. Des centaines de ractions chimiques diffrentes se produisent sans arrt dans nos cellules et dans notre corps. Dans notre estomac et notre intestin grle, des ractions chimiques dcomposent les aliments que nous mangeons en particules plus petites qui peuvent tre absorbes par nos cellules. Par exemple, une molcule de sucre complexe prsente dans les produits laitiers, appele lactose, doit d'abord tre dcompose en deux molcules -- glucose et galactose -- avant de pouvoir tre absorbe par les cellules somatiques. Cette raction se produit normalement avec l'aide d'un enzyme appel lactase prsent dans l'intestin grle. De nombreuses ractions chimiques, y compris la dcomposition du lactose, ne se produisent pas spontanment. Le lactose ne se dcompose pas s'il ne rside pas suffisamment longtemps dans du lait ou du fromage, car les molcules en cause doivent possder une certaine quantit d'nergie pour que la raction puisse se produire.
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La quantit d'nergie requise pour qu'une raction donne ait lieu s'appelle nergie d'activation. Bien que la dcomposition du lactose soit possible, elle ne se produira que si les molcules du lactose possdent l'nergie requise. Dans le lait, le fromage ou la crme glace, la molcule moyenne de lactose ne dispose tout simplement pas de l'nergie ncessaire pour subir la raction de dcomposition, ce qui fait qu'il faudrait attendre bien longtemps avant que cette raction ne se produise par elle-mme. Comment les catalyseurs acclrent-ils donc les ractions chimiques? Ils permettent la raction de se produire alors que l'nergie d'activation est insuffisante. En d'autres termes, en prsence d'un catalyseur adquat, les molcules ractantes auront besoin de moins d'nergie pour se transformer en produits. Le catalyseur ne ragit pas lui-mme et n'est pas altr par la raction. Les catalyseurs facilitent la raction en permettant une srie de molcules ractantes de se transformer en produits, pour ensuite aider d'autres molcules subir la mme raction. Certains catalyseurs biologiques (enzymes) sont si efficaces qu'un seul suffit pour qu' chaque seconde, plus de 600 000 molcules ractantes se convertissent en molcules de produit! Il convient de noter que les enzymes sont trs spcialiss. La lactase qui aide les molcules de lactose se dcomposer en molcules de galactose et de glucose, est structure de sorte ne pouvoir catalyser qu'un seul type de raction. Les enzymes sont si slectifs qu'ils ignorent les milliers de molcules dans les cellules somatiques et les fluides organiques pour lesquels ils ne sont pas conus. On appelle substrat la molcule qu'un enzyme aide ragir. Ainsi, le lactose est le substrat de la lactase. Pour comprendre comment les enzymes peuvent tre spcifiques, nous examinons la structure de l'enzyme et le modle cl-serrure de la fonction enzymatique.
Structure de l'enzyme : le modle cl-serrure l'exception de quelques enzymes composs d'ARN, les enzymes sont des protines. Souvenez-vous qu'une protine est compose d'une ou de plusieurs chanes d'acides amins relies, et que chaque chane d'acides amins prend une forme tridimensionnelle selon la squence d'acide amin et la faon dont les acides amins de la chane interagissent entre eux et avec la solution environnante. Les enzymes se plient de telle faon qu'on observe une chancrure ou une poche leur surface. On appelle cette poche site actif. Le modle cl-serrure repose sur le principe selon lequel les formes des molcules ragissantes (les substrats) et le site actif de l'enzyme s'embotent comme une cl dans la serrure pour laquelle elle est conue. Ainsi, la molcule de lactose s'adapte parfaitement au site actif de la lactase, ce qui signifie que cet enzyme peut uniquement catalyser la dcomposition du lactose.
Les enzymes sont importants! Les enzymes produisent des centaines de ractions chimiques essentielles notre survie. Ils
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provoquent les ractions ncessaires la digestion des aliments, la formation et la dcomposition de l'ADN et de l'ARN, ainsi qu' de nombreux autres processus vitaux. Une dficience en lactase, par exemple (relativement courante chez les tres humains) rend impossible la dcomposition du lactose et entrane une intolrance au lactose, tat qu'il est possible de surmonter en prenant des pilules contenant des enzymes de lactase avant de consommer des produits laitiers. LISTE DES OUVRAGES DE RFRENCE 1. S.S. Zumdahl, Chemical Principles, D.C. Health, Lexington, 1995 2. L.A. Moran, K. G. Scrimgeour, H. R. Horton, R. S. Ochs et J. D. Rawn. Biochemistry, Neil Patterson, New Jersey, 1994
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7) Synthse des protines

Voici un aperu de la faon dont un gne (une section de la molcule d'ADN) sert de matrice pour la synthse d'une protine. Le processus peut tre divis en deux phases : la Transcription, suivie de la Traduction. Transcription : La transcription est le processus par lequel un morceau particulier d'ARN appel ARN messager (ARNm) - est construit l'aide d'une squence gntique particulire (ADN) comme matrice. Tout d'abord, les enzymes droulent une partie de l'hlice d'ADN bicatnaire et rompent les liaisons entre les paires de base complmentaires dans la section non droule. Ensuite, un brin complmentaire d'ARN messager est synthtis, utilisant comme matrice l'un des brins de l'ADN non drouls. Par exemple, si une partie d'un brin de l'ADN non dfait lit GATCAT, la squence d'ARN messager complmentaire lira CUAGUA. (Souvenez-vous que les nuclotides d'uracile [U] prennent la place de la thymine dans l'ARN). Enfin, une fois que l'ARN messager complmentaire est form, le segment d'ADN reprend sa forme originale, soit celle d'une double hlice. La transcription donne lieu la cration d'une molcule d'ARN messager complmentaire une section donne d'ADN (qui constitue un gne). Contrairement aux molcules d'ADN, les molcules d'ARN messager sont libres de sortir du noyau par les pores de la membrane nuclaire pour voyager dans le reste de la cellule (appel cytosol). C'est dans le cytosol que prend place la traduction.
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Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale Traduction : C'est le processus de fabrication d'une molcule, en fonction de l'information contenue dans une molcule d'ARN messager. Mentionnons d'abord que comme l'ADN et l'ARN, les protines sont des chanes de petits lments relis entre eux. Dans le cas de l'ADN, ces petits lments s'appellent nuclotides, et dans le cas des protines, on les appelle acides amins. La squence de nuclotides dans l'ARN messager est simplement transforme en une squence d'acides amins, selon un code uniforme. Chaque squence de trois bases d'ARN messager code pour un acide amin particulier. Par exemple, la squence d'ARN messager AUG code pour un acide amin appel mthionine. Les ribosomes, les machines qui assurent la synthse des protines, s'attachent au brin d'ARN messager et descendent, lisant ainsi la squence de nuclotides et reconstituant la protine adquate mesure qu'ils se dplacent. La premire srie de trois nuclotides que lit le ribosome est toujours AUG, et ce parce que la squence AUG sert de balise, indiquant au ribosome o il doit commencer lire . mesure que le ribosome descend le long de l'ARN messager, il ajoute l'acide amin adquat la chane grossissante correspondant chaque srie de trois nuclotides. Chaque triplet de nuclotides qui code pour un acide amin particulier s'appelle codon. Les vingt acides amins employs pour fabriquer des protines biologiques ont au moins un codon correspondant.
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Par exemple, le codon CGA code pour un acide amin appel alanine. Et le codon AAU code pour un acide amin appel asparagine. En consquence, une partie d'une squence d'ARN
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Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale messager qui se lit AUG GCA AAU donnera lieu la chane suivante d'acides amins : mthionine-alanine-asparagine. En lisant toute la squence d'ARN messager, le ribosome construit une longue chane d'acides amins, qui constituent la protine. OUVRAGE DE RFRENCE
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1. P. H. Raven et G. B. Johnson. Biology, troisime dition, Mosby Year Book, St. Louis, 1992, p. 308.
8) Les bactries
Les bactries sont des organismes unicellulaires. Bien que certaines bactries soient un agent infectieux dans de nombreuses maladies humaines, il existe de nombreuses souches inoffensives voire mme essentielles aux tres humains. De nombreuses souches sont trs importantes dans les laboratoires de biotechnologie! Les cultures bactriennes servent, entre autres, la production de protines utiles. Par exemple, une espce de bactrie appele E. coli peut tre gntiquement modifie de faon produire d'importantes quantits d'insuline humaine, qui peut tre administre aux diabtiques. Voici un aperu de Photographie : Conseil national de certaines caractristiques des bactries qui font recherches du Canada qu'elles conviennent parfaitement de nombreuses applications biotechnologiques. Les bactries sont des procaryotes, ce qui signifie qu'elles ne contiennent pas de noyau. Bien qu'ils prolifrent souvent en groupes o les bactries adhrent l'une l'autre, les procaryotes sont composs d'une seule cellule. On appelle ces groupes de bactries des colonies. Le gnome bactrien comprend un grande molcule circulaire d'ADN bicatnaire situe dans le cytoplasme cellulaire. Cette grande molcule d'ADN, le chromosome bactrien, contient la plupart des gnes bactriens. Outre cette grande molcule d'ADN, les bactries renferment souvent de petites molcules d'ADN circulaires appeles plasmides. Ces plasmides contiennent galement des gnes, mais contrairement au grand chromosome circulaire, ils sont extrmement mobiles. Ils peuvent passer facilement
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Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale d'une bactrie l'autre, et, de cette faon, les gnes sont transmis entre bactries. Les molcules de plasmide, une fois dans la cellule bactrienne hte, peuvent s'intgrer en permanence au grand chromosome bactrien.
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La capacit des plasmides pntrer dans les cellules bactriennes et s'intgrer au chromosome de ces cellules en fait des outils trs utiles pour insrer un gne dans une cellule bactrienne. Nous expliquerons comment les plasmides sont employs de cette faon dans la section portant sur le gnie gntique.
9) Les virus
Qu'est-ce qu'un virus? Les virus sont constitus de matriel gntique (soit d'ADN soit d'ARN) entour d'une couche protectrice de protines. Certains virus d'animaux sont galement entours d'une membrane de lipides (gras). Un virus n'est pas un organisme vivant de manire autonome. Les virus n'existent que pour se multiplier, et moins qu'un virus ne se trouve dans une cellule vivante, il est inactif et ne peut se reproduire. Lorsqu'un virus ou une partie de virus parvient pntrer dans une cellule, on parle d'infection. Selon le virus, c'est le virus tout entier qui pntre dans la cellule ou seulement le matriel gntique qui est inject dans la cellule tandis que la couche externe demeure l'extrieur. Dans le cas du bactriophage T14 -- un type de virus qui infecte certaines bactries --, l'ADN interne est inject dans la cellule infecter. En revanche, tout le virus du sida (appel VIH) pntre dans les cellules T de l'tre humain pour les infecter. Dans les deux cas, par suite de l'infection virale, le matriel gntique du virus pntre dans le cytoplasme de la cellule, qui renferme tous les enzymes ncessaires et d'autres matriels indispensables la reproduction du matriel gntique du virus et la synthse de ses protines. Pourquoi une infection virale peut-elle nuire une cellule? Un virus nuit la cellule qu'il infecte, car il prend les commandes du gne de la cellule et de la machine fabriquer les protines, ce qui donne lieu la production de morceaux de virus uniquement. Une fois ceux-ci fabriqus, ils forment une myriade de nouveaux virus, qui remplissent la cellule. Ces nouveaux virus quittent la cellule, quelques-uns la fois (bourgeonnement) ou par un processus appel lyse, o l'on assiste une rupture de la membrane cellulaire, qui libre toutes les particules du virus en mme temps, ce qui a pour effet de tuer la cellule hte, tandis que les particules du virus libres s'en vont infecter d'autres cellules.
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Rtrovirus -- un type d'infection diffrent Parfois, un virus ne prend pas les commandes de la machine fabriquer des cellules ds qu'il l'infecte. Les rtrovirus, qui possdent de l'ARN comme principal matriel gntique, portent galement un enzyme spcial qui utilise l'ARN pour fabriquer une molcule d'ADN bicatnaire complmentaire. L'enzyme (connu sous le nom de transcriptase inverse) synthtise l'ADN partir de l'ARN du virus, et cet ADN peut s'intgrer au gnome de la cellule hte situ dans le noyau. Pendant une priode de latence, les gnes viraux sont dormants dans les chromosomes de la cellule hte. On pense que de nombreux segments du gnome humain sont forms de rtrovirus endognes, qui sont de l'ancien ADN dfectueux d'un rtrovirus, qui s'est intgr il y a des milliers d'annes et qui est prsent, sans causer d'effets nocifs depuis. On pourrait dire que la priode de latence de ces virus est pratiquement infinie! Par ailleurs, le virus du sida (un rtrovirus) a une priode de latence beaucoup plus courte (une moyenne d'environ 8 ans). Aprs la priode de latence, les gnes viraux seront activs et, selon le processus ordinaire de synthse de protines, ils prendront les commandes de la machinerie cellulaire, rendant viraux l'ARN et les protines et entranant la production de particules de virus.
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Comme les rtrovirus parviennent bien incorporer leur propre matriel gntique au gnome de leur cellule hte, ils sont souvent utiliss comme vecteurs d'ADN recombinant. En d'autres termes, si nous voulons intgrer un gne particulier qui a t isol, mis au point ou modifi l'aide du gnie gntique (c'est ce qu'on entend par recombinant), dans le gnome d'une cellule, nous ajoutons le gne dans l'ADN du rtrovirus, enlevons les parties nocives de l'ADN du rtrovirus qui provoquent la prise des commandes de la cellule, et utilisons le rtrovirus pour transporter le gne voulu dans la cellule. Lorsque nous permettons au virus modifi d'infecter la cellule hte, l'ADN viral ainsi que le nouveau gne s'intgrent au gnome de la cellule hte. On trouvera une description plus complte de ce processus dans les sections sur le gnie gntique et sur la thrapie gnique.
10) Gnie gntique

QU'EST-CE QUE LE GNIE GNTIQUE? Le gnie gntique est le processus par lequel on identifie et isole l'ADN d'une cellule vivante ou morte pour l'introduire dans une autre cellule vivante. Avant d'introduire le matriel gntique, on peut le modifier en laboratoire. Lorsque la manipulation gntique russit, le nouvel ADN est intgr jamais dans les chromosomes de la nouvelle cellule, et apparatra galement dans l'ADN des cellules des descendants. Comment les scientifiques peuvent-ils faire des manipulations gntiques? Ils utilisent la technologie de recombinaison de l'ADN. TECHNOLOGIE DE RECOMBINAISON DE L'ADN On appelle technologie de recombinaison de l'ADN les mthodes mises au point pour isoler, manipuler, amplifier, couper et pisser des squences identifiables d'ADN. Dans les trois prochaines sections, nous prsentons plusieurs techniques de recombinaison de l'ADN employes pour localiser, isoler et amplifier l'ADN. Dans la dernire section, nous montrons comment utiliser d'autres techniques de recombinaison pour introduire du nouvel ADN dans
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Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale les cellules.
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11) Localisation d'un gne

De nombreuses techniques en biologie molculaire sont employes pour dterminer o se trouve un gne spcifique dans le gnome humain. Cette tche est loin d'tre facile, puisque le gnome humain contient des milliers de gnes, dont bon nombre n'ont pas encore t dcouverts ou squencs. Les sondes d'ADN sont bien utiles cette fin. Qu'est-ce qu'une sonde d'ADN? Il est possible de trouver un gne particulier l'aide d'une sonde d'ADN, une molcule d'ADN monocatnaire relativement courte qui est complmentaire de la squence sur le gne recherch. En d'autres termes, si un segment du gne recherch est connu comme tant AGTTCG, le segment complmentaire de la sonde d'ADN sera TCAAGC, car A se lie T et C se lie G. (En fait, en raison de certains dtails structurels sur les molcules d'ADN, la squence complmentaire s'crirait en fait comme suit : CGAACT, ce qui donne TCAAGC l'envers. Toutefois, nous utilisons le format techniquement incorrect ici, pour viter toute confusion.) Une vritable sonde d'ADN serait probablement constitue d'au moins quelques douzaines de nuclotides associs un segment de la mme longueur sur le gne recherch. La sonde est conue de faon tre radioactive, de sorte qu'elle puisse tre dtecte facilement. Comme la sonde d'ADN se lie l'ADN monocatnaire, on a recours une technique appele transfert de Southern qui permet de sparer l'chantillon d'ADN bicatnaire en un seul brin et de le transfrer une membrane en nylon. Lorsque les sondes sont incubes avec la membrane dans une solution, elles se lient des rgions complmentaires dans l'ADN et adhrent la membrane. Ensuite, la membrane est mise en contact avec une pellicule photographique sensible
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Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale aux missions radioactives. Les sections de l'chantillon o se trouve le gne ressortent en fonc sur le papier, car ce sont les seules sections lies une sonde radioactive.
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Les sondes d'ADN ont plusieurs applications en biologie molculaire, y compris les mthodes gntiques de prdiction et de diagnostic des maladies, o l'on emploie des sondes qui identifient les squences de gnes que l'on sait responsables de maladies. Les sondes d'ADN peuvent galement tre employes pour les empreintes gntiques, technique laquelle les experts en criminalistique ont souvent recours pour dterminer si l'ADN retrouv sur les lieux d'un crime correspond celui du suspect.
Comment construit-on les sondes d'ADN? Il est possible de construire une sonde d'ADN bien avant de connatre la squence des gnes ellemme! Pour ce faire, on travaille partir du produit protique du gne. Rappelez-vous que dans notre description de la fabrication des protines, nous avons dit qu'un gne tait transcrit en ARN messager (ARNm), selon les simples rgles de la complmentarit des bases. L'ARN messager est transport hors du noyau et utilis comme matrice pour la formation d'une chane d'acides amins, qui se transforme en une protine. Nous pouvons isoler la protine produite par le gne qui nous intresse, et trouver quels sont les 30 premiers acides amins de la protine. Selon cette information, nous pouvons dterminer les 90 premiers nuclotides de cette matrice d'ARN messager de la protine (n'oubliez pas que chaque triplet de nuclotides code pour un acide amin, d'o le rapport 90:30). Et comme la matrice d'ARN messager est complmentaire du gne recherch, nous savons que notre sonde d'ADN devrait avoir une squence complmentaire des 90 premiers nuclotides du gne recherch. Pour construire une sonde d'ADN, nous utilisons une machine gnes capable de synthtiser en quelques heures peine une molcule courte d'ADN monocatnaire contenant la squence voulue de nuclotides.
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12) Isolement d'un gne

Si nous voulions introduire un gne humain dans une autre cellule, il ne nous suffirait pas de savoir o se trouve ce gne dans le gnome humain. Nous devrions galement isoler une copie du gne, de faon pouvoir l'insrer dans la nouvelle cellule. Par exemple, le gne de l'insuline humaine doit tre isol des cellules humaines de sorte pouvoir tre introduit dans les cellules de la bactrie E. coli. Par suite de l'incorporation du gne, les cellules bactriennes produisent la protine de l'insuline humaine que l'on peut administrer aux diabtiques. Pour isoler un gne, on peut travailler rebours partir de son produit protique. Tout d'abord, au moins une partie de la protine est squence, ce qui signifie que l'ordre des acides amins qui constituent la chane protique est dtermin. En gnral, il suffit de connatre les 30 premiers acides amins de la protine. Ensuite, selon la squence connue d'acides amins et si l'on comprend le processus de synthse des protines, on peut prdire la squence de nuclotides d'une partie de la matrice d'ARN messager de la protine.
Ensuite, on construit une sonde d'ADN monocatnaire complmentaire de la squence prvue d'ARN messager. Par exemple, si une partie de la squence prvue d'ARN messager est CUA GUA CGA, la section correspondante de la sonde d'ADN serait GAT CAT GCT, car G s'associe C et A T. (En fait, en raison de certains dtails structurels relatifs aux molcules d'ADN, la squence complmentaire devrait rellement s'crire comme suit : TCG TAC TAG, qui correspond GAT CAT GCT l'envers. Toutefois, nous utilisons un format techniquement incorrect ici, pour viter la confusion.) La sonde d'ADN est conue pour tre radioactive, de sorte qu'elle soit dcelable lorsqu'elle se lie son image symtrique d'ADN.
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La sonde d'ADN monocatnaire est ensuite incube avec un chantillon cens contenir la matrice complte de la protine d'ARN messager. Lorsque nous isolerons l'ARN messager auquel se lie la sonde d'ADN, nous aurons probablement trouv l'ARN messager que nous cherchions.
Une fois que l'on a trouv le brin d'ARN messager, il suffit de travailler rebours -- nous devons synthtiser le brin d'ADN qui aurait servi de matrice pour l'ARN messager. Il nous faut synthtiser de l'ADN partir d'ARN. Il existe un enzyme appel transcriptase inverse qui nous permet de faire cela. On retrouve cet enzyme dans certains virus appels rtrovirus. Ces virus emploient l'ARN comme matriel gntique et utilisent la transcriptase inverse pour gnrer de l'ADN une fois qu'ils ont infect une cellule hte. Les biotechnologistes peuvent mlanger une transcriptase inverse avec des ARN messagers in vitro ( l'extrieur de cellules vivantes, en laboratoire, gnralement dans un petit tube en plastique). Par consquent, la squence d'ADN pour le gne recherch est synthtise par l'enzyme, selon le brin d'ARN messager prsent. Comme l'ADN produit a t fabriqu de manire artificielle en vue d'tre complmentaire de l'ARN messager, on l'appelle ADN complmentaire.
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13) Amplification de l'ADN : amplification en chane par la polymrase

Souvent, la quantit des chantillons d'ADN est trop petite pour qu'on puisse les utiliser. Heureusement, on peut avoir recours une technique invente dans les annes 1980, l'amplification en chane par la polymrase (ACP) pour amplifier les quantits d'ADN de ces chantillons. La machine d'ACP n'est en fait rien de plus qu'un dispositif trs prcis de chauffage et de refroidissement. La machine comporte de petites fentes o sont insrs de petits tubes contenant l'chantillon d'ADN et d'autres ingrdients ncessaires la raction. Ces ingrdients supplmentaires englobent une bonne quantit de nuclotides (A, T, C et G), de courtes molcules d'ADN monocatnaire appeles amorces et un enzyme appel polymrase Thermus aquaticus (polymrase Taq, en abrg). La polymrase Taq est drive de bactries qui vivent dans des sources chaudes et comptent parmi les rares enzymes capables de fonctionner de trs hautes tempratures. Le cycle commence lorsque la machine chauffe le tube une temprature d'environ 90-95 C, ce qui entrane la sparation de chaque molcule d'ADN bicatnaire de l'chantillon d'origine en deux brins. (Souvenez-vous que les liaisons hydrognes qui relient deux brins complmentaires d'une double hlice d'ADN sont bien plus faibles que les liaisons covalentes qui relient les nuclotides formant chaque chane. Le chauffage provoque la rupture des liaisons hydrognes, qui droulent et sparent les deux brins, tandis que les liaisons covalentes ne sont pas touches.) Ensuite, on abaisse la temprature lgrement, ce qui permet aux amorces d'ADN de se lier aux brins spars. Les amorces se lient, car elles sont complmentaires de certaines squences de chaque brin d'ADN qui flanquent l'ADN rpliquer au milieu. Une fois que les amorces se sont attaches aux brins, la polymrase Taq se synthtise, en utilisant les nuclotides flottant dans le tube, un brin complmentaire pour chaque
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Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale brin monocatnaire d'origine. Cette raction boucle le premier cycle, et double la quantit d'ADN prsente dans le tube. Au cours du cycle suivant, la machine d'ACP chauffe et refroidit comme auparavant, ce qui entrane la sparation des nouvelles molcules d'ADN bicatnaire, et la synthse des nouveaux brins complmentaires par la polymrase Taq.
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Chaque fois qu'un cycle est complt, la quantit de copies de la squence d'ADN dsire (situe entre les deux amorces) est, en thorie, multiplie par deux. Aprs une trentaine de cycles (qui durent gnralement environ trois heures), on disposera de suffisamment de copies de cette squence d'ADN pour l'application d'autres techniques biotechnologiques.
14) Introduction d'un gne dans une cellule

Un gne, probablement isol sous forme d'ADN complmentaire, peut tre introduit dans une cellule l'aide d'un vecteur. Un vecteur est un vhicule par lequel de l'ADN tranger est transmis d'une cellule une autre. Par exemple, les virus modifis et les plasmides sont des vecteurs. Les virus en tant que vecteurs Les virus constituent d'excellents vecteurs, car au terme de longues priodes d'volution, ils ont acquis la capacit d'viter d'tre dtruits par le systme immunitaire humain et d'insrer leur propre matriel gntique dans certaines cellules. Comme nous l'avons vu dans la section portant sur les virus, une infection virale se produit lorsque du matriel gntique tranger (viral) pntre dans la cellule et emploie la machine fabriquer des protines et de l'acide nuclique de la cellule pour produire ses propres protines ainsi que son propre ADN et ARN. Pour utiliser un virus comme vecteur, on remplace les segments nocifs de son ADN par l'ADN complmentaire que l'on souhaite introduire dans la cellule. Ensuite, on laisse le virus infecter la cellule hte et, si tout va bien, l'ADN complmentaire pntre dans la cellule et servira fabriquer la protine voulue. Certains virus peuvent produire leur propre ADN et l'insrer dans le gnome de la cellule hte. Ces rtrovirus base d'ARN sont les vecteurs viraux les plus courants utiliss en thrapie gnique o les gnes ayant une valeur thrapeutique sont introduits dans les rtrovirus qui, au moment de l'infection, les insrent dans le gnome de la cellule hte. Il convient de noter que les virus employs comme vecteurs sont conus de sorte ne pouvoir se reproduire. En d'autres termes, les
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Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale segments nocifs du gnome viral qui servent produire un nombre accru de particules virales ont t enlevs et remplacs par une squence qui code pour la protine recherche. Les plasmides en tant que vecteurs L'ADN complmentaire de l'insuline humaine est introduit dans des cellules bactriennes l'aide d'un plasmide. Un plasmide est simplement une molcule d'ADN circulaire contenant des gnes qui peuvent facilement se rpandre dans des cellules bactriennes ou en sortir. Bien que les plasmides soient prsents naturellement dans certaines bactries, ceux employs en vue d'introduire un gne tranger dans une cellule et de l'en extraire ont t modifis de telle sorte que les squences qu'ils renferment sont fort diffrentes des plasmides prsents l'tat naturel desquels ils sont tirs.
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En premier lieu, le plasmide contient plusieurs squences courtes spcialises appeles sites de restriction. Les enzymes appels endonuclases de restriction reconnaissent ces sites et coupent l'ADN du plasmide. Par exemple, un enzyme de restriction appel EcoR1 reconnat la squence GAATTC et procde la coupure entre le G et le premier A. Il convient de noter que la squence complmentaire est CTTAAG, soit GAATTC l'envers! Ainsi, l'enzyme coupe les deux brins de plasmide comme suit :
Mentionnons que la dcoupe l'aide de l'EcoR1 donne lieu deux extrmits adhsives qui consistent en un seul brin de nuclotides qui se lieront une srie complmentaire d' extrmits adhsives monocatnaires. Qui plus est, le plasmide est conu de sorte que cette squence particulire de restriction n'est prsente qu'une seule fois, coupera le plasmide bicatnaire en un seul site. L'ADN complmentaire (qui renferme le gne de l'insuline humaine) insrer dans le plasmide est modifi selon l'enzyme de restriction employ pour couper le plasmide. Pour revenir notre exemple avec l'EcoR1, il faudrait les extrmits adhsives suivantes chaque extrmit de
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Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale l'ADN complmentaire :
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Maintenant, nous incubons la squence d'ADN complmentaire modifie dans une solution renfermant un plasmide coup l'aide de l'enzyme EcoR1 et un enzyme qui relie les segments d'ADN (appel ADN ligase). On obtient alors un plasmide circulaire ferm qui renferme l'ADN complmentaire et, par l mme, le gne de l'insuline humaine.
Le plasmide est ensuite incub avec des cellules bactriennes (dans le cas du processus de fabrication de l'insuline, l'espce de bactrie employe est E. coli) dans des conditions particulires qui favorisent l'absorption du plasmide par les cellules bactriennes. En thorie, le plasmide contenant le gne de l'insuline humaine pntrera dans toutes les cellules bactriennes et toutes ces cellules transcriront la protine et produiront de l'insuline humaine, qui pourra ensuite tre rcupre et utilise pour traiter les patients diabtiques. Malheureusement, les cellules bactriennes n'absorberont pas toutes le plasmide. En fait, dans la plupart des cas, elles seront peu nombreuses le faire. Comment les biotechnologues peuvent-ils uniquement slectionner les cellules bactriennes qui ont absorb le plasmide?
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Cottier & /Guerry 2000, Gnie Gntique et Clonage www.unifr.ch/nfp37 Introduction Gnrale Ils le peuvent en fonction des conditions de la culture bactrienne et d'une autre modification spciale intgre dans les plasmides issus du gnie gntique. Les bactries, aprs avoir t incubes en prsence du plasmide (et certaines l'ont absorb), sont cultives dans un milieu qui renferme un antibiotique, comme l'ampicilline. L'ampicilline tuera la bactrie E. Coli, moins qu'elle ne soit protge d'une faon ou d'une autre. Le plasmide que les bactries ont absorb contient galement un gne qui confre une rsistance l'ampicilline. En consquence, seules les bactries ayant absorb le plasmide rsisteront l'antibiotique et survivront. Comme le plasmide renferme galement le gne de l'insuline humaine, nous ne permettons qu'aux bactries capables de produire de l'insuline de survivre et de se reproduire.
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OUVRAGES DE RFRENCE 1. P. H. Raven et G.B. Johnson. Biology, troisime dition, Mosby Year Book, St. Louis, 1992 2. W. Bains. Biotechnology: From A to Z, Oxford, New York, 1993 3. L.A. Moran et K.G. Scrimgeour, Biochemistry Resource Book, Neil Patterson, New Jersey, 1994
4.
L. A. Moran et K. G. Scrimgeour, H.R. Horton, R.S. Ochs et J.D. Rawn. Biochemistry, Neil Patterson, New Jersey, 1994
5. J. L. Southin, Fourty-Eight Lectures in Modern Biology, Kendall/Hunt, Dubuque, 1993 6. E. S. Grace, Biotechnology Unzipped: Promises & Realities, Trifolium, Toronto, 1997
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ch/nfp37 Introduction Gnrale

1) Qu'est-ce qu'une cellule?

2) Qu'est-ce que l'ADN?

3) Gnes: les phrases de l'ADN

4) Qu'est-ce que l'ARN?

7) Synthse des protines

10) Gnie gntique

11) Localisation d'un gne

12) Isolement d'un gne

13) Amplification de l'ADN : amplification en chane par la polymrase

14) Introduction d'un gne dans une cellule

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