2013

CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES

Practica N8 de Biotecnologa Vegetal

Rosmery Crdenas Hurtado Universidad Catlica Santa Maria 31/10/2013

[CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES]

31 de octubre de 2013

Practica N8 Cultivo de Embriones

1. Objetivos:
Comprender la tcnica de cultivo in vitro de embriones. Establecer in vitro embriones de frutas ctricas. Evaluar la respuesta del explante en condiciones controladas in vitro.

2. Marco terico
La embriognesis somtica consiste en la formacin de embriones a partir de estructuras de origen somtico. Clulas de naranjo obtenidas a partir de callo procedente de cotiledones 18 En los ctricos es fcil inducir embriognesis somtica in vitro a partir de callos embriognicos procedentes de tejidos nucelares presentes en la semilla. Para la obtenc in de los callos embriognicos se emplearon cotiledones presentes en plntulas procedentes se semillas germinadas in vitro (Apartado, 1.3.2) y se ensayaron los siguientes medios de cultivo: - UM5: MS con 5 mg/l de 2,4-D y 0,25 mg/l de Kinetina - MS -N: MS diluido a la mitad y 50 g/L de sacarosa; 0. 250 g/L de Extracto de malta y Agar al 0.6%. Los citricos representan en volumen el principal producto fruticola a nivel mundial, con un frutos total de 64,5 millones de toneladas para el periodo. Aproximadamente 35%de la produccin mundial (22 millones de toneladas) se utiliza para la obetencion de productos derivados de los frutos frescos. Este cultivo es susceptible a una serie de enfermedades, plagas y condiciones a diversas (edaficas, climaticas, etc.), que afectan su rendimiento. La embriognesis somtica, tambin denominada embriognesis xual o adventicia, consiste en el desarrollo de embriones a partir de clulas que no son el producto de una fusin de gametos durante la fecundacin o, en otras palabras, e s un proceso por el cual se produce una estructura bipolar (el embrin) a partir de una clula somtica. Este proceso se produce con cierta asiduidad en la naturaleza, ocurriendo de modo espontneo en ms de 60 familias de plantas, algunas tan importantes como las compuestas, crucferas, cucurbitceas, gramneas, rosceas, leguminosas y palmceas. Es pues un proceso tan natural como la embriognesis cigtica, con casos tan conocidos como el de los ctricos, en los que ambos tipos de embriognesis, la somtica y la cigtica, ocurren casi simultneamente en el interior de la semilla. Mediante cultivo in vitro, los primeros en obtener y desarrollar embriones somticos fueron Steward y Reinert en 1958 a partir de tejidos de zanahoria. A esta especie modelo para el estudio de la embriognesis somtica se han aadido hasta la fecha ms de 30 especies, algunas tan importantes como la alfalfa y varias leosas forestales, las cuales en la actualidad se propagan comercialmente mediante este mtodo. Se pueden obtener embriones somticos de muy diversas partes de la planta, as se pueden utilizar como explantos: pices radiculares y caulinares, hipoctilos, pecolos, pednculos, hojas jvenes y, en general, tejidos y rganos con caractersticas

Biotecnologa Vegetal

Pgina 1

[CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES]

31 de octubre de 2013

embrionarias, meristemticas o reproductivas (embriones e inflorescencias inmaduras, trozos de escutelo, nucela y endosperma, vulos, entre otros). Existen dos tipos de embriognesis somtica in vitro, la embriognesis somtica directa y la indirecta. La forma directa implica la existencia de clulas somticas predeterminadas a seguir la va embriognica de desarrollo y las clulas del explanto primario se desarrollan para formar embriones (como por ejemplo, la nucela de los ctricos). La forma indirecta implica la necesidad de una induccin para que las clulas sigan la va embriognica, tras pasar por una fase proliferativa (callo) y cambiar su competencia a la expresin de embriognesis. El proceso ocurre en dos etapas.

3. Materiales:

A. Material vegetal: a. Embriones de frutas ctricas. Naranja ( Citrus sinensis) B. Medios de cultivo: a. Medio de Murashige y Skoog, suplementado con ANA/ BAP: 5 / 15 C. Material de vidrio: a. Beakers, 250 mL. b. Matraz, 100 mL. c. Tubo de ensayo. D. Insumos: a. Agua destilada estril. E. Reactivos: a. Agua destilada estril. b. Etanol (70%). c. Hipoclorito de sodio (2.5%). F. Instrumentos: a. Bistures. b. Mechero Bunsen. c. Pinzas. G. Otros: a. Algodn. b. Ligas. c. Papel secante estril. d. Plastic wrap. H. Equipos: a. Autoclave. b. Cmara de flujo laminar. c. Estufa.

Biotecnologa Vegetal

Pgina 2

[CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES]

31 de octubre de 2013

4. Metodologa:
Se utilizar como explante, embriones procedentes de frutas ctricas. Realizar la desinfestacin del material vegetal, aislamiento de los explantes y su respectiva inoculacin.

5. Procedimiento:

PR OCEDIMIENTO DE DESINFESTACION DE SEMILLAS

Para nuestra practica con semillas e dispondrn diversos tipos de frutos de ctricos completos (luego no hay que desinfestarlas), pero las semillas aisladas de los frutos ya estn estriles en este caso se procede a esterilizar el fruto entero pulverizando con etanol.

PR OCEDIMIENTO PARA L A SIEMBRA DE SEM ILLAS

En la cmara de flujo laminar se abren los frutos en este caso de naranja y se extraen las semillas con unas pinzas (ver los distintos pasos que s muestras en las imgenes)

Biotecnologa Vegetal

Pgina 3

[CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES]

31 de octubre de 2013

Luego estas se abren para poder extraer los embriones realizar este pas con la ayuda del bistur y las pinzas para poderlos extraer sin daarlos.

En este paso ya obtenidas las semillas hay que extraer el mucilago que se encuentra en la casara de la semillas luego tenemos que tratar de extraer la cascara sin daar el embrin (material vegetal a utilizar).

Una vez que se tiene el material vegetal (embriones de naranja). Las semillas ya estn listas para su siembra en el medio de cultivo MS de concentracin ANA/BAP: 5 / 15

6. Resultados:
Cultivo de embriones caticos es tambin muy usada para la bsqueda de condiciones fsica s y nutricionales requeridas para el desarrollo embrionario, contrarrestando la latencia de la semilla con la finalidad de acortar el ciclo de las plntulas, determinando la viabilidad de la semilla y obtener micro-clones del material fuente.

Biotecnologa Vegetal

Pgina 4

[CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES] EMBRIONES DE NARANJA

SANOS NECROSADOS CONTAMINADOS HONGOS FENOLIZ ADOS

31 de octubre de 2013

CANTIDAD
3 0 0 0 0 / / / / / 3 3 3 3 3

7. Conclusiones:
Los embriones son los mejores explantes a utilizar para la induccin de tejido callognico puesto que gran cantidad del tejido del explante reacciona a la induccin, p resentando un desarrollo de tejido callognico favorable para la multiplicacin o induccin a embriognesis u organognesis.

8. Cuestionario:
o Cules son las partes de la semilla? todas las semillas contienen tres partes esenciales: Embrin, donde se encuentran la radcula (que originar la raz) y la plmula (que originar el tallo y las hojas). Tejidos u rganos de reserva (endosperma o cotiledones). Cubierta o tegumento, que protege al embrin del dao y la desecacin. en el caso del poroto y del maz, se distinguen las siguientes partes:

Biotecnologa Vegetal

Pgina 5

[CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES]

31 de octubre de 2013

o En que consiste el proceso de germinacin? Es el proceso por el cual el embrin se desarrolla para formar una plntula. Esto ocurre cuando la semilla se encuentra en las condiciones adecuadas de humedad, oxgeno, temperatura y a veces luz u oscuridad. En estas condiciones, el embrin alojado dentro de la semilla retoma su crecimiento, aquel que haba frenado al madurar la semilla. Al crecer el embrin, la cubierta se rompe y emerge la radcula. Luego lo hace la plmula, brote que dar lugar al tallo y a las hojas.

o A qu se denomina aborto embrionario? El aborto de los embriones despus de una hibridacin amplia se deba probablemente al rompimiento del equilibrio entre el material que constituyen los tejidos ovulares, el embrin en desarrollo y el endospermo. El aborto embrionario puede resultar tambi n de anomala en el desarrollo, lo que se refleja en un funcionamiento alterado del cigoto; en consecuencia, las anormalidades del suspensores afectaran la toma de nutrimentos. La germinacin in vitro tiene ventajas respecto a la producida en condiciones n aturales: puede solucionar casos de inhibicin total de la germinacin, permitir la germinacin de semillas con intermediario obligado, aumentar la tasa de germinacin, evitar el aborto embrionario, reducir el tiempo necesario y sincronizar la germinacin. o En que consiste el periodo de latencia antes de la germinacin de las semillas?

Algunas semillas no germinar a causa de la latencia. Las causas de la latencia de las semillas son la inmadurez fisiolgicas del embriones y la impermeabilidad de la cubier ta seminal al agua y, algunas veces, al oxigeno. Algunas semillas fisiolgicamente inmaduras antes de germinar tienen que sufrir una serie de cambios enzimticos y bioqumicos que colectivamente reciben el nombre de postmaturacion.

Biotecnologa Vegetal

Pgina 6

[CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES]

31 de octubre de 2013

La latencia tiene una gran importancia para la supervivencia de a planta como queda patente en el ejemplo de la portmaturacion, es un mtodo para asegurar. Cuando se produzca la germinacin, las condiciones sean favorables para el crecimiento de la plntula.

Otras semillas permanecen latentes dentro de los conos o frutos hasta que el calor del fuego libera las semillas. Por ejemplo, en algunas especies de pinus el calor derrite la resina que cierra hermticamente las escamas de los conos, y entonces se liberan las semillas; de esta forma se aseguran la persistencia de las especies.

Conos seronicos de un pino (pinus rigida) antes (a) y despus (b) de estar expuestos al fuego. Los cono seroticos permanecencerrado sobre el rbol hasta las semillas maduran. La causa inmediata de la serotinia es el elevado punto de fusin de la resina que sellas las escamas del cono, y parece que esta bajo contol gentico. El fuego
funde la resina, los conos se abren y las semillas son liberadas en lugares abiertos por el fuego. Los individuos de Pinus reigida con conos que se abren normalmente tienen ventaja en habiats donde los claros s e abren por otras perturbaciones que no sean el fuego.

Biotecnologa Vegetal

Pgina 7

o Nombrar 4 especies que se obtienen mediante el cultivo in vitro de embriones. Definir la especie, caracte rsticas de la planta donante, medio nutritivo utilizado, concentracin de reguladores de crecimiento y las condiciones de incubacin de los cultivos. ESPECIE CAATERISTICAS MEDIO CONCENTRACION DE FITOHORMONAS CONDICIONES DE INCUBACION semillas germinan a 20- 25C. La duracin del da es de 12-16 horas ( tubos fluorescentes) se aconseja una irradiacin baja de 2.5-10 w/m2. temperatura promedio de 22C con 60 a 70% de Humedad Relativa, con 16 horas luz (Silvanya Daylight Incandescent 75W ) diarias con una intensidad de 1800 Lux. IMAGEN

Las semillas de orqudeas

, 1-2mm de largo y 0.5-1mm de ancho. encierra un embrin de alrededor de 200 clulas.

Se utiliz semilla proveniente de bosques naturales maduros. Esta semilla fue utilizada inmediatamente dos meses despus de la recoleccin debido a que es una semilla que pierde fcilmente su viabilidad

MS (solido)

0.4mg/L de Tiamina, 0.5mg/L de Acido nicotnico, 2g/L de Carbn activado, 20g/L sucrosa.

Abies guatemalensis (Pinabete)

basal de Murashige y Skoog (MS) (1962), en la presencia y ausencia de carbn activado.

fitohormonas Kinetina y BAP, ambas a una concentracin de 0.1mg/L,

[CULTIVO IN VITRO DE EMBRIONES] 31 de octubre de 2013

raul,
othofagus alpina

Embriones somticos y cigticos provenientes de semillas maduras de raul,

Murashige y Skoog (MS)

0,5 mg L-1 de cido indolactico (IAA), 0,5 mg L-1 de cido naftalenactico (NAA), 2 mg L-1 de 6bencilaminopurina (BAP) y 30 g L-1 de sacarosa.

se dejaron en cmara de cultivo a una temperatura de 25 1 C en ausencia de luz. con un fotoperodo de 16:8 (luz:oscuridad)

Cacao

Para esta investigacin se utilizaron los hbrid os provenientes de semillas aplanadas

El medio consisti
de las sales MS

tiamina-HCl 1, piridoxina - HCl 1, cido nicotnico 1, glicina 4, inositol 200, glutamina 200, casena hidrolizada 200 sacarosa 4000 y gel rite 1.500

incubados a una temperatura de 27 ms menos 3 grados centgrados y un fotoperodo de 16 horas

9.

Bibliografa:
Abdelnour, A. y J. Vincent. 1994. Conceptos bsicos del cultivo de tejidos vegetales. CATIE (Centro Agronmico Tropical de Investigacin y Enseanza). Turrialba, Costa Rica. 38 p. Roca, W . y L. Mroginski. 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical (eds.). Cali, Colombia. 969 p. Razdan, M.K. 2002. Introduction to plan tissue culture. 2 ed. Enfield, New hampsire. Science Publishers (eds) 128 pp

10. Anexos:
El medio de cultivo utilizado fue de 5 / 15 de ANA y BAP Biotecnologa Vegetal Pgina 1