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ACTIVIDAD CATALITICA DE LAS ENZIMAS SITIO ACTIVO- BASES MOLECULARES Y TERMODINAMICA

ACTIVIDAD CATALITICA DE LAS ENZIMAS Una molcula de enzima no tiene por qu actuar siempre a la misma velocidad. Su actividad puede estarmodulada por: cambios en el pH cambios en la temperatura presencia de cofactores las concentraciones del sustrato y de los productos finales presencia de inhibidores modulacin alostrica modificacin covalente activacin por protelisisisoenzimas

EFECTOS DEL pH SOBRE LA ENZIMA Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica (Figura de la derecha). Este es el llamado pH ptimo. La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. As, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10 (Figura de la izquierda). Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalizacin de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas ms o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiolgicos.

EFECTO DE TEMPERATURA En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima (Figura de la derecha). Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse.

EFECTO DE COFACTORES A veces, un enzima requiere para su funcin la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catlisis: los cofactores. Los cofactores pueden ser iones inorgnicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molcula orgnica se llama coenzima. Muchos de estos coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. En la figura de la izquierda podemos observar una molcula de mioglobina (protena que transporta oxgeno al tejido muscular) y su coenzima (el grupo hemo, representado en color rojo). Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostticos. La forma catalticamente activa del enzima, es decir, el enzima unida a su grupo prosttico, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que: apoenzima + grupo prosttico= holoenzima

EFECTO DE LAS CONCENTRACIONES La velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin de sustrato. La Figura de la

derecha muestra la velocidad de una reaccin enzimtica a 6 concentraciones distintas de sustrato.

Adems, la presencia de los productos finales puede hacer que la reaccin sea ms lenta, o incluso invertir su sentido (Figura inferior)

EFECTO DE INHIBIDORES Ciertas molculas pueden inhibir la accin catal cataltica tica de un enzima: son los inhibidores. Estos inhibidores bien pueden ocupar temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original (inhibidor competitivo) o bien alteran la conformacin espacial del enzima, impidiendo su unin al l sustrato (inhibidor no competitivo) (Figuras inferiores). Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo

SITIO ACTIVO Es el espacio de la enzima en el cual se lleva a cabo la interaccin con el substrato. Los aminocidos que conforman el sitio activo pueden estar en posiciones consecutivas o cercanas dentrode la cadena proteica o bien estar completamente distantes en la estructura p primaria, rimaria, pero cercanos debido a los plegamientos de la cadena proteica.

Incluso, el sitio activo puede estar formado por aminocidos de distintas subunidades proteicas.E ,Modelo de Llave-cerradura, Modelos de interaccin Enzima-Substrat

BASES MOLECULARES Las enzimas1 son molculas de naturaleza proteica y estructural que catalizan reacciones qumicas, siempre que sean termodinmicamente posibles: una enzima hace que una reaccin qumica que es energticamente posible (ver Energa libre de Gibbs), pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima.2 3 En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimticas. Debido a que las enzimas son extremadamente selectivas con sus sustratos y su velocidad crece slo con algunas reacciones, el conjunto (set) de enzimas sintetizadas en una clula determina el tipo de metabolismo que tendr cada clula. A su vez, esta sntesis depende de la regulacin de la expresin gnica. Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energa de activacin (G) de una reaccin, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reaccin. Las enzimas no alteran el balance energtico de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reaccin, pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Una reaccin que se produce bajo el control de una enzima, o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho ms deprisa que la correspondiente reaccin no catalizada.

BASES TERMODINMICA Al igual que sucede con todos los catalizadores, las enzimas no alteran el equilibrio qumico de la reaccin. Generalmente, en presencia de una enzima, la reaccin avanza en la misma direccin en la que lo hara en ausencia de enzima, slo que ms rpido. Sin embargo, en ausencia de enzima, podra producirse una reaccin espontnea que generase un producto diferente debido a que en esas condiciones, dicho producto diferente se forma ms rpidamente. Adems, las enzimas pueden acoplar dos o ms reacciones, por lo que una reaccin termodinmicamente favorable puede ser utilizada para favorecer otra reaccin termodinmicamente desfavorable. Por ejemplo, la hidrlisis de ATP suele ser utilizada para favorecer otras reacciones qumicas.51 Las enzimas catalizan reacciones qumicas tanto en un sentido como en el contrario. Nunca alteran el equilibrio, sino nicamente la velocidad a la que es alcanzado. Por ejemplo, la anhidrasa carbnica cataliza su reaccin en una u otra direccin dependiendo de la concentracin de los reactantes, como se puede ver a continuacin: \mathrm{CO_2 + H_2O \xrightarrow H_2CO_3} (en tejidos; alta concentracin de CO2) \mathrm{H_2CO_3 \xrightarrow CO_2 + H_2O} (en pulmones; baja concentracin de CO2) Si el equilibrio se ve muy desplazado en un sentido de la reaccin, es decir, se convierte en una reaccin muy exergnica, la reaccin se hace efectivamente irreversible. Bajo estas condiciones, la enzima nicamente catalizar la reaccin en la direccin permitida desde un punto de vista termodinmico.

BIBLIOGRAFIA Grisham, Charles M.; Reginald H. Garrett (1999). Biochemistry. Philadelphia: Saunders College Pub. pp. 4267. ISBN 0-03-022318-0.

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Determinacin experimental de los parmetros cinticos de la ecuacin de Michaelis Menten

Para estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la concentracin inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una grfica. Cuando [S]0 es pequea, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentracin de sustrato, y por tanto, la reaccin es de primer orden. A altas [S]0, la enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reaccin es de orden cero y la velocidad es mxima (Vmax). Los estudios sistemticos del efecto de la concentracin inical del sustrato sobre la actividad enzimtica comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catlisis enzimtica. En 1913, Leonor Michaelis y MaudMenten desarrollaron esta teora y propusieron una ecuacin de velocidad que explica el comportamiento cintico de los enzimas. Para explicar la relacin oservada entre la velocidad inicial (v0) y la concentracin inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacin del producto, liberando el enzima libre:

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinticas individuales de cada proceso y tambin reciben el nombre de constantes microscpicas de velocidad. Segn esto, podemos afirmar que: v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES] v3 = k3 [ES] Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentracin total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reaccin) es: [ET] = [E] + [ES] Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cintico adopta la hiptesis del estado estacionario, segn la cual la concentracin del complejo enzima-sustrato es pequea y constante a lo largo de la reaccin. Por tanto, la velocidad de formacin del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociacin (v2+ v3): v1 = v2 + v3 Adems, como [ES] es constante, la velocidad de formacin de los productos es constante: v = v3 = k3 [ES] = constante. Como v1=v2+v3, podemos decir que: k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Despejando [ES], queda que:

, siendo

expresin (k2+k3)/k1 se ha sustitudo por KM, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos aporta una explicacin sobre las razones que hacen de la KM un parmetro cintico importante. Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formacin del producto es:

v = v3 = k3 [ES] = Para cualquier reaccin enzimtica, [ET], k3 y KM son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos: A concentraciones de sustrato pequeas ([S] << KM) v = (k3 [ET]/KM) [S]. Como los trminos entre parntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, kobs, de forma que la expresin queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reaccin es un proceso cintico de primer orden. A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. La velocidad de reaccin es independiente de la concentracin del sustrato, y por tanto, la reaccin es un proceso cintico de orden cero. Adems, tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parmetro, la velocidad mxima de la reaccin (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzara cuando todo el enzima disponible se encuantra unido al sustrato.

Si introducimos el parmetro Vmax en la ecuacin general de la velocidad, (la frmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresin ms conocida de la ecuacin de Michaelis-Menten:

Hay enzimas que no obedecen la ecuacin de Michaelis-Menten. Se dice que su cintica no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostricos, cuya grfica v frente a [S] no es una hiprbola, sino una sigmoide. En la cintica sigmoidea, pequeas variaciones en la [S] en una zona crtica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reaccin.

METODOS DE INHIBICION ENZIMATICA (IRREVERSIBLES, REVERSIBLES, COMPETITIVAS, NO COMPETITIVAS, ACOMPETITIVAS)

Inhibicin enzimtica Los inhibidores enzimticos son agentes moleculares que intervienen en la catlisis, haciendo ms lentas o deteniendo las reacciones. Las enzimas catalizan virtualmente todos los procesos celulares, por lo que no es sorprendente que los inhibidores enzimticos se encuentren entre los agentes farmacuticos ms importantes, por ejemplo, la aspirina (acetilsalicilato) inhibe la enzima que cataliza el primer paso de la sntesis de las prostaglandinas, compuestos que intervienes en muchos procesos, algunos de los cuales producen dolor . El estudio de los inhibidores enzimticos tambin a proporcionado informacin valiosa sobre mecanismos enzimticos y ha ayudado a definir algunas rutas metablicas.

Los inhibidores pueden clasificarse en: 1) Reversibles 2) Irreversibles. 3) Competitivos 4) No competitivos 5) Acompetitiva

INHIBICION IRREVERSIBLE En la inhibicin irreversible el inhibidor queda covalentemente o no unido a la enzima o ligado tan fuertemente a el que su disociacin es muy lenta.

Los inhibidores irreversibles son generalmente especficos para un tipo de enzima y no inactivan a todas las protenas. No funcionan destruyendo la estructura protenica, sino alterando especficamente la estructura tridimensional del sitio activo inhabilitndolo. Por ejemplo, el pH y las temperaturas extremas causan la desnaturalizacin de casi todas las protenas, pero este no es un efecto especfico.

Reaccin del diisopropilfluorofosfato (DFP) con una sern-proteasa.

inhibidor

irreversible

INHIBICION REVERSIBLE

La inhibicin reversible se caracteriza, por contraste con la inhibicin irreversible, por la rpida disociacin del complejo enzima- inhibidor. Presentan una unin no covalente de un inhibidor a la enzima, suelen clasificarse en Competitiva No competitiva Acompetitiva

INHIBICION COMPETITIVA

En la inhibicin competitiva el inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debera unir el sustrato, impidiendo por lo tanto la formacin del complejo activo enzima-sustrato. De ah el nombre de competitiva porque efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. Las posibles formas de reaccionar del sustrato y el inhibidor con la enzima pueden presentarse por las ecuaciones:

Por ello este tipo de inhibicin se caracteriza en considerablemente aumentando la concentracin de sustrato.

que

puede

disminuirse

En este tipo de inhibidores se incluyen sustancias que estructuralmente son muyparecidas al sustrato y que por lo pueden ocupar el lugar que ocupara el mismo sobre la enzima pero que no pueden ser atacas por la misma. Un ejemplo clsico de este tipo de inhibicin es el de la inhibicin de la succinatodeshidrogenasa, enzima que tiene por sustrato el cido succnico, por otras sustancias estructuralmente parecidas al cido succnico, como el cido malnico, el cido oxlico, y el cido glutrico.

AC. SUCCINICO

AC. MALONICO

AC. OXALICO

AC. GLUTARICO

El inhibidor reduce la velocidad de reaccin, pero la velocidad mxima (Concentraciones de sustrato grandes) sigue siendo la misma INHIBICION NO COMPETITIVA

competitiva, se postula que el inhibidor se une con la enzima enotro En la inhibicin no competitiva sitio, que no es aquel por el cual se une el sustrato. Por esa razn la unin delsustrato con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor y se puede formar entones un complejo enzima-sustrato- inhibidor. Pero este complejo es catalticamente inactivo y no puede escindirse en n productos de la reaccin y complejo enzima enzima-inhibidor. inhibidor. En este caso, las posibles formas de reaccionar del sustrato y el inhibidor con la enzima se representan por las ecuaciones siguientes.

Este tipo de inhibicin se caracteriza entonces porque no puede ser revertido por un aumento de la concentracin de sustrato. El sustrato no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima.

INHIBICIN ACOMPETITIVA: En inhibidor acompetitivo es el que se fija a un sitio distinto al que se fija el sustrato en el sitio activo y

que, a diferencia del inhibidor competitivo, solo se une al complejo ES. En presencia de un inhibidor acompetitivo, la ecuacin de Michaelis Michaelis-Menten cambia a:

Como se describe en la ecuacin, a elevadas concentraciones de sustrato, Vo se aproxima a Vmx/. As un inhibidor acompetitivo disminuye la Vmx medida. La Km aparente tambin disminuye, debido a que la [S] necesaria para alcanzar la mitad de la Vmax y disminuye en un factor . Grafica representativa de una inhibicin acompetitiva. Los cambios en los puntos de interseccin con los ejes indican cambios enVmx
y

Km.

BIBLIOGRAFIAS Lubert styer, , bioquimica, 6ta edicin pag.(225 pag.(225-230) http://ocw.unicam.es/ciencia-de de-la-salud/bioquimica/material-de-clase1/tema6_enzimas.pdf