Experiencia #3: Pruebas Cualitativas para aminocidos y protenas

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objeti!os" al #inali$ar el e%&erimento el estudiante &odr'" (. a&licar &ruebas cualitati!as generales ) es&ec*#icas +ue &ermitan reconocer gru&os +u*micos de los amino'cidos ) &rote*nas. ,. someter soluciones de &rote*nas a desnaturali$aci-n con agentes #*sicos ) +u*micos. resumen" los amino'cidos son sustancias cristalinas. casi siem&re de sabor dulce/ tienen car'cter 'cido como &ro&iedad b'sica ) acti!idad -&tica/ +u*micamente son 'cidos carb-nicos con. &or lo menos. un gru&o amino &or mol0cula. ,1 amino'cidos di#erentes son los com&onentes esenciales de las &rote*nas las &rote*nas +ue son los com&uestos nitrogenados m's abundantes del organismo. a la !e$ +ue #undamento mismo de la !ida. en e#ecto. debido a la gran !ariedad de &rote*nas e%istentes ) como consecuencia de su estructura. las &rote*nas cum&len #unciones sumamente di!ersas. &artici&ando en todos los &rocesos biol-gicos ) constitu)endo estructuras #undamentales en los seres !i!os. de este modo. act2an acelerando reacciones +u*micas +ue de otro modo no &odr*an &roducirse en los tiem&os necesarios &ara la !ida 3en$imas4. trans&ortando sustancias 3como la hemoglobina de la sangre. +ue trans&orta o%*geno a los tejidos4. cum&liendo #unciones estructurales 3como la +ueratina del &elo4. sir!iendo como reser!a 3alb2mina de hue!o4. etc marco te-rico" en animales su&eriores. las &rote*nas son los com&uestos org'nicos m's abundantes. &ues re&resentan alrededor del 516 del &eso seco de los tejidos. el &unto de !ista #uncional. su &a&el es #undamental. no e%iste &roceso biol-gico alguno +ue no de&enda de la &resencia ) o acti!idad de este ti&o de sustancias/ las &rote*nas cum&len di#erentes #unciones" en$imas. hormonas. tras&ortadores. los anticuer&os. rece&tores de muchas c0lulas. etc. todas las &rote*nas contienen carbono. hidr-geno. o%*geno ) nitr-geno ) casi todas &oseen tambi0n a$u#re. si bien ha) ligeras !ariaciones en di#erentes &rote*nas. el contenido de nitr-geno re&resenta. t0rmino medio. el (76 de la masa total de la mol0cula. lo cual &ermite calcular la cantidad de &rote*na e%istente en una muestra. &or medici-n del n de la misma. debido a su gran tama8o. cuando se dis&ersa a estas mol0culas en un sol!ente adecuado. #orman obligadamente soluciones coloidales. con caracter*sticas es&eciales +ue las distinguen de las soluciones de mol0culas &e+ue8as. &or medio de la hidr-lisis. las mol0culas &rote*nicas son escindidas en sus mon-meros. los amino'cidos. ) cientos o miles de estos amino'cidos &ueden &artici&ar en la #ormaci-n de la gran mol0cula &olim0rica de una &rote*na. los amino'cidos. como )a hemos comentado. son materia &rima de &rote*nas ) &0&tidos +ue cum&len di#erentes #unciones en nuestro organismo. no obstante. tambi0n &ueden utili$arse como materia &rima del metabolismo energ0tico. de hecho. alrededor del 916 de los amino'cidos.
Object 1

&asan a una ruta metab-lica +ue. des&u0s de eliminar el nitr-geno de la mol0cula. en!*a los &roductos desaminados al ciclo de krebs.

&ruebas generales &ara amino'cidos"

reacci-n con la ninhidrina los gru&os amino libres de los amino'cidos. de los &0&tidos ) las &rote*nas reaccionan con la ninhidrina a un &h entre : ) ;. &ara dar un com&uesto de intensocolor a$ul &2r&ura. la &rueba tambi0n es &ositi!a con aminas &rimarias ) amon*aco &ero sin des&rendimiento de co,. los amino'cidos &rolina e hidro%i&rolina dan un color amarillo en lugar del color &2r&ura con la ninhidrina. la reacci-n es mu) sensible ) es ideal &ara la detecci-n de amino'cidos en cromatogramas ) &ara su cuanti#icaci-n mediante t0cnicas es&ectro#otom0tricas de las #racciones +ue se obtienen de columnas cromatogr'#icas. los aa. +ue contienen un n2cleo arom'tico #orman nitroderi!ados de color amarillo cuando se calientan con 'cido n*trico concentrado. las sales de estos deri!ados son de color naranja intenso en medio alcalino. la #enilalanina. la tirosina ) en cierto grado el tri&t-#ano. as* como todas las &rote*nas +ue los contienen. dan &ositi!a la &rueba.

reacci-n %anto&roteica

reacci-n del 'cido el gru&o ind-lico del tri&t-#ano reacciona con 'cido glio%*lico en &resencia de glio%*lico &ara 'cido sul#2rico concentrado dando un com&lejo de color &2r&ura. el 'cido tri&t-#ano ac0tico glacial +ue ha sido e%&uesto a la lu$ contiene 'cido glio%*lico. reacci-n &ara el tri&t-#ano este amino'cido se condensa #'cilmente con !arios aldeh*dos en &resencia de 'cidos #uertes &ara dar com&uestos coloreados. en la reacci-n se utili$a el reacti!o de ehrlich 3&<dimetilaminoben$aldeh*do al (16 en hcl conc.4 +ue reacciona con un buen n2mero de com&uestos org'nicos tales como indoles. aminas arom'ticas ) com&uestos ureicos &ara dar com&lejos coloreados. cuando los aa ) las &rote*nas +ue contienen gru&os ti-licos se calientan en medio #uertemente alcalino. el a$u#re &resente reacciona &ara #ormar sul#uros. este sul#uro &uede detectarse &or la #ormaci-n de un &reci&itado negro de sul#uro de &lomo &or adici-n de acetato de &lomo. los gru&os tioles tambi0n reaccionan con el nitro&rusiato de sodio en &resencia de un e%ceso de amon*aco &ara dar un com&lejo de color rojo. el aa. arginina contiene un gru&o guanidino en la cadena lateral. este gru&o reacciona con el reacti!o de sakaguchi 3a<na#tol agua de bromo4 en medio alcalino &ara dar un com&uesto de color rojo. los com&uestos +ue tienen dos gru&os carbamidos 3<conh<4. )a sea unidos directamente o a tra!0s de un 'tomo de carbono o nitr-geno. dan un color !ioleta con el sul#ato de cobre alcalino 3reacti!o de biureth4. los tri&0&tidos son las mol0culas m's &e+ue8as ca&aces de dar una &rueba de biureth &ositi!a. mientras +ue esto no ocurre con los amino'cidos. la &rueba de biureth es una buena &rueba general &ara las &rote*nas ) la intensidad del color !ioleta es una medida del n2mero de enlaces &e&t*dicos. algunas sustancias como la o%amida &ueden dar #alsos resultados &ositi!os en ensa)os cualitati!os de &rote*nas.

reacciones &ara ciste*na ) cistina

&rueba &ara arginina

&ruebas generales &ara &rote*nas"

&rueba de biureth

desnaturali$aci la desnaturali$aci-n es cual+uier &roceso &or el cual el arreglo es&acial de una -n &or calor ) &rote*na cambia de la estructura ordenada de la mol0cula nati!a a una #orma &h e%tremos tridimensional desordenada. durante la desnaturali$aci-n se &ierden las estructuras de orden su&erior de las &rote*nas. con &0rdida de la acti!idad biol-gica. las en$imas &or ejem&lo. +ue reali$an trabajos catal*ticos en las c0lulas. tienen una tem&eratura ) un &h -&timo en el cual &resentan un m'%imo de acti!idad. &ero la acti!idad disminu)e signi#icati!amente hacia !alores e%tremos de &h ) a bajas o ele!adas tem&eraturas. &reci&itaci-n con cationes ) aniones &esados ) sales concentradas los cationes de metales &esados ) los aniones de ele!ado &eso molecular son mu) usados en la se&araci-n de &rote*nas ) en la &re&araci-n de #iltrados libres de &rote*nas. a &h neutro &or lo general las &rote*nas tienen carga neta negati!a ) se combinan #'cilmente con iones de metales &esados +ue. al neutrali$ar la carga &roducen la &reci&itaci-n. a &h &or debajo del &unto isoel0ctrico en cambio. se combinan con aniones &or+ue &resentan carga neta &ositi!a. soluciones concentradas de sales. de sul#ato de amonio. &or ejem&lo. reducen en gran medida la solubilidad de las &rote*nas. &or+ue com&iten &or las mol0culas de agua de

dis&onibles &ara la sol!ataci-n ) las interacciones &rote*na<&rote*na se hacen m's im&ortantes.

Pruebas Cualitativas para aminocidos y protenas Objetivos:

1. Aplicar pruebas cualitativas generales y especficas que permitan reconocer grupos qumicos de los aminocidos y protenas. . !ometer soluciones de protenas a desnaturali"aci#n con agentes fsicos y qumicos.

$arco %e#rico:
1. &eacci#n con la nin'idrina: (os grupos amino libres de los aminocidos) de los p*ptidos y las protenas reaccionan con la nin'idrina a un p+ entre , y -) para dar un compuesto de intenso color a"ul p.rpura. (a prueba tambi*n es positiva con aminas primarias y amonaco pero sin

desprendimiento de CO . (os aminocidos prolina e 'idro/iprolina dan un color amarillo en lugar del color p.rpura con la nin'idrina. (a reacci#n es muy sensible y es ideal para la detecci#n de aminocidos en cromatogramas y para su cuantificaci#n mediante t*cnicas espectrofotom*tricas de las fracciones que se obtienen de columnas cromatogrficas. . &eacci#n /antoproteica: (os aa) que contienen un n.cleo aromtico forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con cido ntrico concentrado. (as sales de estos derivados son de color naranja intenso en medio alcalino. (a fenilalanina) la tirosina y en cierto grado el %ript#fano) as como todas las protenas que los contienen) dan positiva la prueba. 0. &eacci#n del cido glio/lico para tript#fano: 1l grupo ind#lico del tript#fano reacciona con cido glio/lico en presencia de cido sulf.rico concentrado dando un complejo de color p.rpura. 1l cido ac*tico glacial que 'a sido e/puesto a la lu" contiene cido glio/lico. ,. &eacci#n para el tript#fano: 1ste aminocido se condensa fcilmente con varios alde'dos en presencia de cidos fuertes para dar compuestos coloreados. 1n la reacci#n se utili"a el reactivo de 1'rlic' 2p3dimetilaminoben"alde'do al 145 en +C( conc.6 que reacciona con un buen n.mero de compuestos orgnicos tales como indoles) aminas aromticas y compuestos ureicos para dar complejos coloreados. 7. &eacciones para cistena y cistina: Cuando los aa y las protenas que contienen grupos ti#licos se calientan en medio fuertemente alcalino) el a"ufre presente reacciona para formar sulfuros. 1ste sulfuro puede detectarse por la formaci#n de un precipitado negro de sulfuro de plomo por adici#n de acetato de plomo. (os grupos tioles tambi*n reaccionan con el nitroprusiato de sodio en presencia de un e/ceso de amonaco para dar un complejo de color rojo. 8. Prueba para Arginina: 1l aa. Arginina contiene un grupo guanidino en la cadena lateral) este grupo reacciona con el reactivo de !a9aguc'i 2a3naftol:agua de ;romo6 en medio alcalino para dar un compuesto de color rojo.

Pruebas Cualitativas para Aminocidos y Protenas

Objetivos: 1. Aplicar pruebas cualitativas generales y especficas que permitan reconocer grupos qumicos de los aminocidos y protenas. 2. Someter soluciones de protenas a desnaturalizaci n con agentes fsicos y qumicos.

Marco Terico:

v Pruebas generales para aminocidos. 1.Reaccin con la ninhidrina: !os grupos amino libres de los aminocidos" de los p#ptidos y las protenas reaccionan con la nin$idrina a un p% entre & y '" para dar un compuesto de intenso color azul p(rpura. !a prueba tambi#n es positiva con aminas primarias y amonaco pero sin desprendimiento de C)2 . !os aminocidos prolina e $idro*iprolina dan un color amarillo en lugar del color p(rpura con la nin$idrina.

2. Reaccin xantoproteica+ !os aa" que contienen un n(cleo aromtico forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con cido ntrico concentrado. !as sales de estos derivados son de color naran,a intenso en medio alcalino. !a fenilalanina" la tirosina y en cierto grado el -ript fano" as como todas las protenas que los contienen" dan positiva la prueba. .. Reaccin del cido gliox lico para tript!ano: /l grupo ind lico del tript fano reacciona con cido glio*lico en presencia de cido sulf(rico concentrado dando un comple,o de color p(rpura. /l cido ac#tico glacial que $a sido e*puesto a la luz contiene cido glio*lico. &. Reaccin para el tript!ano: /ste aminocido se condensa fcilmente con varios alde$dos en presencia de cidos fuertes para dar compuestos coloreados. /n la reacci n se utiliza el reactivo de /$rlic$ 0p1dimetilaminobenzalde$do al 123 en %C! conc.4 que reacciona con un buen n(mero de compuestos orgnicos tales como indoles" aminas aromticas y compuestos ureicos para dar comple,os coloreados. ". Reacciones para ciste na # cistina: Cuando los aa y las protenas que contienen grupos ti licos se calientan en medio fuertemente alcalino" el azufre presente reacciona para formar sulfuros. /ste sulfuro puede detectarse por la formaci n de un precipitado negro de sulfuro de plomo por adici n de acetato de plomo. !os grupos tioles tambi#n reaccionan con el nitroprusiato de sodio en presencia de un e*ceso de amonaco para dar un comple,o de color ro,o. $. Prueba para %rginina+ /l aa. Arginina contiene un grupo guanidino en la cadena lateral" este grupo reacciona con el reactivo de Sa5aguc$i 0a1naftol6agua de 7romo4 en medio alcalino para dar un compuesto de color ro,o. v Pruebas generales de las prote nas+

1. Prueba de &iureth: !os compuestos que tienen dos grupos carbamidos 01C)8%14" ya sea unidos directamente o a trav#s de un tomo de carbono o nitr geno" dan un color violeta con el sulfato de cobre alcalino 09eactivo de 7iuret$4. !os trip#ptidos son las mol#culas ms peque:as capaces de dar una prueba de 7iuret$ positiva" mientras que esto no ocurre con los aminocidos. !a prueba de 7iuret$ es una buena prueba general para las protenas y la intensidad del color violeta es una medida del n(mero de enlaces peptdicos. Algunas sustancias como la o*amida pueden dar falsos resultados positivos en ensayos cualitativos de protenas. '. (esnaturali)acin por calor # p* extremos: !a desnaturalizaci n es cualquier proceso por el cual el arreglo espacial de una protena cambia de la estructura ordenada de la mol#cula nativa a una forma tridimensional desordenada. ;urante la desnaturalizaci n se pierden las estructuras de orden superior de las protenas" con p#rdida de la actividad biol gica. !as enzimas por e,emplo" que realizan traba,os catalticos en las c#lulas" tienen una temperatura y un p% ptimo en el cual presentan un m*imo de actividad" pero la actividad disminuye significativamente $acia valores e*tremos de p% y a ba,as o elevadas temperaturas. +. Precipitacin con cationes # aniones pesados # sales concentradas: !os cationes de metales pesados y los aniones de elevado peso molecular son muy usados en la separaci n de protenas y en la preparaci n de filtrados libres de protenas. A p% neutro por lo general las protenas tienen carga neta negativa y se combinan fcilmente con iones de metales pesados que" al neutralizar la carga producen la precipitaci n. A p% por deba,o del punto isoel#ctrico en cambio" se combinan con aniones porque presentan carga neta positiva. Soluciones concentradas de sales" de sulfato de amonio" por e,emplo" reducen en gran medida la solubilidad de las protenas" porque compiten por las mol#culas de agua de disponibles para la solvataci n y las interacciones protena1protena se $acen ms importantes.