GENTICA Y MICROBIOLOGA

Avances de Investigacin 2011

Miguel Martnez Trujillo Yazmn Carren Abud

Sello UMSNH

Sello SEP

El presente libro resume algunos de los trabajos de investigacin recientes realizados por los integrantes del Laboratorio de Gentica y Microbiologa de la Facultad de Biologa de la Universidad Michoacana y otros investigadores con los cuales se colabora. Se presentan estudios del efecto de metales en el crecimiento y desarrollo de Arabidopsis thaliana y tabaco, haciendo nfasis en la raz. Se reporta el estudio de los hongos micorrzicos arbusculares y su asociacin con plantas de aguacate, as como estrategias para preparar inculos para este cultivo. Asimismo, se presenta una revisin sobre el estado actual de los hongos micorrzicos que se asocian a orqudeas, rea que se trabaja en el laboratorio. Otra revisin consiste en estrategias para la propagacin de rboles forestales, con base en la experiencia de un estudio realizado. Finalmente, se presentan los resultados de un estudio acerca de las enterobacterias del ro Lerma y se analizan los riesgos de enfermedades que pueden causar estos microorganismos en la poblacin circundante.

GENTICA Y MICROBIOLOGA
Avances de Investigacin 2011

Miguel Martnez Trujillo Yazmn Carren Abud

Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo Secretara de Educacin Pblica

Gentica y Microbiologa, Avances de Investigacin 2011 Miguel Martnez Trujillo, Yazmn Carren Abud

Primera edicin 2011 Morelia, Michoacn, Mxico Derechos Reservados conforme a la ley

Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo Secretara de Educacin Pblica

ISBN:

Impreso en Mxico- Printed in Mexico

PRLOGO
El Laboratorio de Gentica y Microbiologa de la Facultad de Biologa de la Universidad Michoacana inici sus actividades en 1990 en un rea improvisada. Desde entonces se han desarrollado proyectos en las reas de citogentica, microbiologa ambiental, regulacin gentica en plantas y micorrizas arbusculares. Actualmente este laboratorio se ubica en el edificio B4 de Ciudad Universitaria y el personal acadmico que labora en el mismo son: Dr. Miguel Martnez Trujillo, Dra. Yazmn Carren Abud, M.C. Mara Gloria Sols Guzmn y M.C. Mara de los ngeles Beltrn Nambo. El objetivo de este libro, al igual que el publicado en 2009, es difundir entre los investigadores y los estudiantes del rea biolgica, algunos resultados recientes que se han obtenido en el laboratorio de Gentica y Microbiologa e investigadores de otras dependencias de la Universidad Michoacana y de otras Instituciones, con las cuales se colabora. Este libro es parte de las actividades del Cuerpo Acadmico de Biologa Microbiana y Vegetal que actualmente se encuentra en consolidacin. Adems de la difusin de estos trabajos, deseamos que stos despierten el inters de estudiantes que deseen incorporarse a nuestros laboratorios de investigacin y por otro lado faciliten la colaboracin e interaccin con investigadores de otros Cuerpos Acadmicos o estructuras acadmicas similares. Agradecemos el apoyo de Subsistema Nacional de Recursos Genticos de Microorganismos (SUBNARGEM) y al Programa Institucional de Fomento Institucional (PIFI) a travs del rea Biolgico Agropecuarias, por el apoyo proporcionado para la impresin de este libro.

Los Autores

CONTENIDO
CAPTULO ANLISIS BIOINFORMTICO DE GENES DE FUNCIN DESCONOCIDA QUE MODIFICAN SU EXPRESIN EN CONCENTRACIONES ESTIMULADORAS E INHIBITORIAS DE Cr(VI) ANLISIS DE LA TOXICIDAD DEL NQUEL, ZINC Y COBRE EN PLANTAS DE Arabidopsis thaliana L., UTILIZANDO UN SISTEMA in vitro ANLISIS DE LA RESPUESTA DE RACES PRIMARIAS Y RACES LATERALES DE Arabidopsis thaliana L. CycB1::uidA A CONDICIONES VARIABLES DE ESTRS CAUSADO POR Cr(VI) EFECTO DEL Cr(VI) EN EL CRECIMIENTO Y EL DESARROLLO DE Nicotiana tabacum L. CULTIVOS MONOESPECFICOS DE HONGOS MICORRZICOS ARBUSCULARES PROVENIENTES DE HUERTAS DE AGUACATE DE MANEJO ORGNICO Y MANEJO CONVENCIONAL, CON FINES DE SER UTILIZADOS COMO BIOINOCULANTES UNA APROXIMACIN AL CONOCIMIENTO DE LOS HONGOS MICORRZICOS EN ORQUDEAS TERRESTRES PROPAGACIN DE RBOLES FORESTALES ESTUDIO DE LAS ENTEROBACTERIAS DEL RO LERMA EN EL MEANDRO DE LA PIEDAD, MICHOACN Y SANTA ANA PACUECO, GUANAJUATO Pgina

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ANLISIS BIOINFORMTICO DE GENES DE FUNCIN DESCONOCIDA QUE MODIFICAN SU EXPRESIN EN CONCENTRACIONES ESTIMULADORAS E INHIBITORIAS DE Cr(VI)
Santiago Jos Torres Ros, Ftima Hernndez Madrigal, Mara Gloria Sols Guzmn y Miguel Martnez Trujillo
Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo

RESUMEN
Los componentes de cromo son altamente txicos para las plantas y son perjudiciales para su crecimiento y desarrollo. En nuestro grupo de trabajo hemos utilizado a Arabidopsis thaliana como modelo y previamente se ha observado una estimulacin del crecimiento y desarrollo en concentraciones de 20 M de Cr(VI), as como una inhibicin a partir de 100 M. Adems, hemos observado interacciones con los nutrientes, como fosfato y sulfato, que revierten el efecto txico del Cr(VI) en concentraciones de 1000 mM o mayores. Actualmente se est determinado cul es el efecto de concentraciones estimuladoras e inhibitorias de Cr(VI) en la expression global de genes, mediante la tcnica de microarreglos. En este trabajo se analiz el efecto de dos concentraciones de Cr(VI), 20 M y 140 M, en los cambios de la expresin en genes. Se hizo una seleccin de los genes que aparecen con function desconocida con base en la intensidad de los cambios de expresin con respecto al control sin Cr(VI) y se determinaron los dominios conservados en cada una de las protenas mediante la herramienta de CCD del National Center of Biotechnology Information. Con base en estos dominios se gener informacin biolgica preliminar de las funciones potenciales de los genes y sobre la conservacin de las protenas en los diversos grupos biolgicos. Los resultados obtenidos permitieron determinar que es posible encontrar informacin preliminar valiosa de los genes mediante herramientas bioinformticas y que el Cr(VI) modifica selectivamente los cambios de expresin de genes en plantas, dependiendo de la concentracin utilizada, orientando la expresin a la adaptacin a las condiciones generadas por el oxianin.

1. INTRODUCCIN
El cromo (Cr) en un elemento natural y ubicuo, que se encuentra en rocas, plantas, suelos, animales, y en los humos y gases volcnicos. Puede funcionar con distintas valencias y en el ambiente se encuentra en varias formas; las ms comunes son las derivadas del cromo trivalente, o Cr(III), y las del cromo hexavalente, o Cr(VI). El incremento de las concentraciones de Cr en el ambiente debido a actividades antropognicas ha hecho necesario entender cmo interacciona con los organismos para dar posibles soluciones a su manejo. Los efectos biolgicos del cromo dependen de su estado de oxidacin y localizacin celular. El Cr(VI) es considerado la forma ms txica de cromo, mientras que el Cr(III) es relativamente inocuo debido a su insolubilidad y subsecuente inhabilidad para cruzar la membrana celular (Katz y Salem, 1993). La reduccin del Cr(VI) a Cr(III) ha sido reportada en muchos sistemas biolgicos, involucrando la formacin intermedia de Cr(V), proceso en el que se generan radicales libres que pueden causar alteraciones al ADN, entre otros efectos txicos (Kawanishi et al., 1986). El Cr(VI) afecta el crecimiento e n p l a n t a s e induce un nmero de sntomas txicos tal como la inhibicin de la germinacin de la semilla, disminucin o inhibicin del crecimiento de la raz primaria, clorosis y modificaciones de la arquitectura de la raz por la induccin de races laterales (Ortiz-Castro et al., 2007; Shanker et al., 2005). En nuestro grupo de trabajo hemos utilizado a Arabidopsis thaliana como modelo y se ha observado tanto una estimulacin del crecimiento y desarrollo en concentraciones de 20 M, s como una inhibicin a partir de 100 M (Hernndez-Madrigal, 2011). Adems, hemos observado interacciones con los nutrientes, como fosfato y sulfato, que revierten el efecto txico del Cr(VI) en concentraciones de 1000 M o mayores (Ortiz-Castro et al., 2007; Ortiz-Castro et al., 2009; Hernndez-Madrigal, 2011). Una manera de contribuir al entendimiento de cmo el Cr(VI) ejerce los efectos de estimulacin o inhibicin en plantas, es mediante el anlisis de la expresin de genes. Para el anlisis de la expresin de genes existen muchas estrategias y metodologas, entre stas se encuentran el aislamiento del ARN de las clulas y la

identificacin posterior de un tipo especfico de stos, mediante la hibridacin con sondas de DNA marcadas radiactivamente; esta tcnica ha sido conocida como Northern (Sambrook et al., 2002). Con los proyectos de secuenciacin de genomas ha sido posible determinar las secuencias de los genes que codifican para protenas y otros cuyos productos funcionales son las molculas de ARN (Gibson y Muse, 2004). Entre los genomas secuenciados se encuentra el de la planta angiosperma A. thaliana, para la cual se reportaron ms de 25000 genes que codifican para protenas. Entre las ventajas que se tienen al conocer los genomas completos adems de entender las relaciones filogenticas de los organismos por comparacin de genes, se encuentra la posibilidad de analizar la expresin de genes de manera global. Esto ltimo es posible mediante la tcnica de microarreglos, la que se basa en principio en que molculas de ADN con secuencias representativas de cada uno de los genes se acomodan en laminillas mediante el uso de robots; a este acomodo se le conoce como microarreglo (Gibson y Muse, 2004). Para determinar cambios en la expresin se comparan dos condiciones contrastantes que permitan generar informacin biolgica. En nuestro grupo de trabajo, mediante la tcnica de microarreglos, se ha probado el efecto de concentraciones de 20 M y 140 M de cromato de potasio en plantas germinadas directamente en medios con el metal y se han comparado los cambios de expresin de estas concentraciones con respecto a plantas crecidas sin Cr(VI) (Hernndez-Madrigal, 2011). De los genes encontrados que modificaron su expresin se encuentran aquellos para los que se tiene una funcin conocida y otros para los cuales se desconoce su funcin. Cuando se desconoce la funcin de un gen existen estrategias bioinformticas que pueden generar informacin preliminar acerca de esta funcin. Entre stas se encuentran las de comparar las secuencias de ADN para determinar similitudes con genes de otros organismos y analizar si en stos existe alguna evaluacin de su posible funcin biolgica. La otra estrategia consiste en determinar aspectos de las conformaciones de las protenas para las cuales codifican los genes. Como parte de la estructura terciaria de una protena, es posible determinar regiones especficas conocidas como dominios, que tienen una estructura tridimensional caracterstica y 3

que puede encontrarse en diferentes protenas. Los dominios pueden ser considerados como unidades funcionales y/o estructurales de una protena. Los dominios son a menudo seleccionados evolutivamente, ya que normalmente poseen una funcin prominente en la biologa de la protena a la que pertenecen. (Murzin et al., 1995; Tatusov et al., 2003; Letunic et al., 2004). Las clasificaciones de protenas en grupos de secuencias relacionadas es en algunos aspectos parecido a una tabla peridica para la biologa, permitindonos entender lo que subyace a la biologa molecular de cualquier organismo. Para esto es necesario establecer bases de datos, de las cuales Pfam representa una coleccin de dominios de protenas y familias en las cuales se agrupan y que tiene como objetivo tener una informacin exacta de stos. Actualmente se estima que en la base de datos Pfam se tiene el 72% de protenas de funcin conocida y el 95% del total de protenas (Sammut et al., 2008). Aunque en un principio se supuso que slo se llegara a aproximadamente 1500 familias de protenas, actualmente se tienen cerca de 10000. Una de las bases de datos de dominios conservados es la CCD (Marchler-Bauer et al., 2004), que comparte informacin con las bases SMART (Letunic et al., 2004) y COG (Tatusov et al., 2003). De las tres bases de datos mencionadas, CDD es la que se encuentra ms depurada, con bloques conservados, separados de las secuencias no alineadas, lo que permite obtener resultados ms confiables cuando se buscan dominios a partir de la secuencia de aminocidos de una protena (Marchler-Bauer et al., 2004). En el presente trabajo, se analizaron los genes de funcin desconocida que modificaron su expresin por efecto del Cr(VI) en plantas de A. thaliana crecidas en medios con el metal. Para generar informacin preliminar del significado biolgico de estas protenas, se utilizaron herramientas bioinformticas para determinar dominios conservados de stas y cul es su conservacin en otros grupos de plantas y otros organismos.

2. MATERIALES Y MTODOS
Se utilizaron bases de datos y herramientas bioinformticas disponibles en las direcciones electrnicas que se describen para cada caso. Los servidores que fueron necesarios para brindar la informacin son: Con secuencias de nucletidos y protenas: http://www.ncbi.nlm.nih.gov http:// www.sanger.ac.uk Con dominios conservados de proteinas: PFAM http://pfam.sanger.ac.uk http://pfam.janelia.org http://pfam.sbc.su.se Para determinar los dominios de protenas a partir de secuencias CCD http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=cdd

PROSITE http://www.expasy.org/prosite/

Las bases de datos de expresin de los genes de A. thaliana que modificaron su expresin en concentraciones de 20 M y 140 M de Cr(VI) se obtuvieron de Hernndez-Madrigal (2011).

3. RESULTADOS Y DISCUSIN
Para determinar el efecto del Cr(VI) en la expresin global de genes de A. thaliana, en nuestro grupo de trabajo se realiz un anlisis creciendo plantas en medios MS (Murashige y Skoog, 1962) en tres condiciones diferentes: a) Sin Cr(VI), b) Con 20 M de Cr(VI), y con c) 140 M de Cr(VI). Las plantas se crecieron durante 10 das y posteriormente fueron cosechadas para la extraccin del ARN total. Se llev a cabo la sntesis de ADNc, el marcaje con fluorforos y el anlisis comparativo de la expresin de genes (Hernndez-Madrigal, 2011). De la base de datos de expresin de genes generada en una primera etapa, en este trabajo se realiz la eleccin de genes de funcin desconocida que modificaron significativamente su expresin. En esta eleccin se consider a los genes que modificaron su expresin inducindose ms de dos veces con respecto al control sin el metal, y los que redujeron su expresin a ms de la mitad con respecto al control. Se encontr una respuesta diferencial en los genes de funcin desconocida que respondieron a cambios en su expresin en medios con Cr(VI). Los genes inducidos y reprimidos son diferentes, lo que indica que la planta responde de manera diferente a este metal de acuerdo a su concentracin. Considerando que el nmero de genes que se inducen o reprimen con los criterios sealados es numeroso, se aplic un segundo criterio, seleccionando aquellos que modificaron su expresin de los genes en concentracin de 20 M en ms de 2 veces y los genes en concentracin de 140 M que modificaron su expresin en ms de 3 veces. Los loci de los genes seleccionados se listan a continuacin: a) Genes que indujeron su expresin en 20 M: At2g07110, At5g63820, At1g44478 At2g43255 At1g20870 At3g04780 At5g53905 At2g16730 At1g01450 b) Genes que reprimieron su expresin en 20 M: At2g12905, At1g27800, At1g56660, At5g02670, At5g51360, At3g54550, At3g21430, At5g40450, At1g23060, At3g55790, At4g04680, At2g07739 At3g07060, At4g20250, At3g29010, At5g45090, At5g53020. 6

c) Genes que indujeron su expresin en 140 M:

At2g42610, At4g12735, At2g14560, At5g42530, At2g25510, At5g40155, At5g61080

d) Genes que reprimieron su expresin en 140 M:

At1g47400, At2g14247, At4g19645, At1g47330, At2g12905, At3g45800, At4g31880, At3g44140, At5g12050, At3g03010, At5g49960, At3g56910, At1g35610, At5g17960, At1g36925, At1g02540, At3g14280, At1g73120, At3g29710, At3g19800, At4g26260, At4g06740, At1g52270, At5g15120, At1g19010, At2g22122, At3g05750, At1g77890.
Para cada uno de los genes seleccionados se busc la secuencia de la protena hipottica reportada. Para esto se utiliz el procedimiento de bsqueda en el cual fue necesario localizar primeramente la secuencia perteneciente a cada gen para encontrar as la secuencia de las protenas (Figura 1). Con la secuencia de la protena se procedi a determinar los dominios conservados y la familia en la cual se agrupa. Para esto se procedi a buscar las secuencias en un BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) de alguno de los servidores ya mencionados (Figura 2). Teniendo las secuencias de las protenas se buscaron caractersticas e informacin que tuviera en relacin con alguna otra especie en relacin con sus dominios conservados (CDD por sus siglas en ingls) (Figura 3).

Figura 1. Pantalla de bsqueda de secuencia de los genes y protenas en el servidor NCBI.

Figura 2. Bsqueda de protenas similares a la protena de inters. Se muestra la pantalla generada con la herramienta BLASTp del servidor NCBI.

Figura 3. Bsqueda de dominios conservados a partir de la protena de inters. Se presenta la pantalla generada en el programa CDD del servidor del NCBI.

Anlisis de genes que aumentaron su expresin en 20 M de Cr(VI) De los 9 genes analizados que inducen su expresin, no se encontr alguno que estuviera relacionado con el estrs oxidativo, lo que sugiere que la planta no detecta esta concentracin del metal como txica. De hecho, en los resultados obtenidos por HernndezMadrigal (2011) se encontr que a estas concentraciones el crecimiento tanto de la raz como el follaje se estimula. El gen At1g01450 codifica para una protena con dominio de cinasa en aminocidos de serina, treonina y tirosina. Esta protena est altamente conservada en otras dicotiledneas como la vid, el sorgo y la higuerilla, e incluso en el arroz (83%), una planta monocotilednea. Esta conservacin sugiere que la protena tiene una funcin conservada en las plantas, posiblemente relacionada en 10

procesos de transduccin de seales en los que se requiere fosforilacin. El gen At3g04780 codifica para una protena con un dominio que se ha reportado que interacciona con el proteosoma. Este complejo multiproteico est implicado en la degradacin de protenas, en un procedimiento que requiere la unin de ubiquitina y permite eliminar protenas que en ese momento no se requieren, ya sea para encender un proceso fisiolgico o inhibirlo. Resalta la alta conservacin de esta protena no slo en el reino vegetal, sino tambin en animales, como es el caso de Drosophila (98%), lo que indica que la funcin de esta protena es caracterstica de al menos los eucariontes multicelulares. El dominio ACD, presente en la protena codificada por el gen At1g20870, se reporta para protenas de choque trmico para las que se sugiere un papel como chaperonas. Estas protenas se encargan de mantener la conformacin de otras protenas en condiciones de estrs celular, para que sirvan conservando su funcin. En el caso del Cr(VI) utilizado a la concentracin de 20 M, el crecimiento de las plantas se favorece, lo que se puede relacionar con el hecho de que las plantas pueden controlar su respuesta, en parte porque las protenas pueden seguir manteniendo su conformacin por la actividad de chaperonas, como la que increment su expresin en este trabajo. La conservacin de la protena es alta en especies relacionadas, pero se reduce en otras dicotiledneas. La protena codificada por At2g16730 tiene dominios implicados en la hidrlisis de carbohidratos. Considerando que a 20 M de Cr(VI) las plantas aumentan su crecimiento, este incremento en la expresin le permite posiblemente tener disponibles los monosacridos necesarios para mayor obtencin de energa. Al parecer esta protena tiene una funcin conservada en el reino vegetal, ya que las similitudes con las especies encontradas fue del 100% o cercanas a este valor. El dominio de ARNasa PH encontrado en la protena codificada por At2g07110, est implicado en el procesamiento de ARN transportadores. La induccin del gen conduce posiblemente a un procesamiento ms rpido de estas molculas, que se encargan de llevar los aminocidos a los ribosomas. Si en crecimiento de las plantas en mayor a 20 M de Cr(VI), esto implica una mayor sntesis de protenas, lo que se favorece por la mayor 11

disponibilidad de los ARN transportadores. La conservacin de esta protena con similitudes altas ocurre tanto en plantas como e n animales, lo que es de esperarse, ya que la sntesis de protenas es un proceso bsico de los eucariontes. La protena codificada por el gen At1g44478 est poco conservada en el reino vegetal, e incluso con la especie del mismo gnero A. lyrata slo tiene una similitud de 67%. Aunque se relaciona en la morfognesis celular, en A. thaliana no se presenta el dominio RRM (para unin A ARN), lo que suguiere que la funcin en la especie estudiada posiblemente sea diferente. En sntesis, es posible deducir que los genes que inducen su expresin en 20 M de Cr(VI) estn implicados en respuestas adaptativas que le permiten a la planta de A. thaliana tener un mejor crecimiento. Anlisis de genes que redujeron su expresin en 20 M de Cr(VI) Para varias de las protenas codificadas por los genes analizados no se encontraron dominios conservados. Es posible que stas sean protenas caractersticas de A. thaliana y especies muy relacionadas. Tal es el caso de la protena codificada por At1g23060, que slo se conserva en A. lyrata. Incluso At1g56660 codifica para una protena no relacionada con A. lyrata, At5g02670. Tres protenas altamente conservadas son la codificadas por los genes At3g54550, At2g07739 y At3g54550, sin embargo no se sabe de alguna posible funcin de sus dominios. La protena codificada por At3g21430 tiene un dominio presente en represores transcripcionales, particularmente implicados en el proceso del ciclo celular. Considerando lo anterior y a que las plantas aumentan su crecimiento en 20 M, la disminucin de un represor en el ciclo celular permite una mayor produccin de clulas y por lo tanto mayor crecimiento. Esta protena est altamente conservada en las angiospermas, lo que indica una funcin similar en las especies de estos grupos. El dominio de la familia TIR encontrado en la protena codificada por el gen At5g45090, participa en interacciones protena12

protena en procesos de sealizacin, sin embargo, no es posible deducir cmo se relaciona este proceso tan general con la respuesta adaptativa de la planta. Una protena altamente conservada es la codificada por At5g53020, que contiene dominios de protenas del poro nuclear. Estas estructuras permiten la salida de molculas grandes del ncleo, como es el caso de los ARN e incluso las partculas ribosomales. Su disminucin no est clara en el contexto de la respuesta de la planta a un mayor crecimiento. En sntesis, la informacin proporcionada por los genes de funcin desconocida que redujeron su expresin en 20 M de Cr(VI), es muy pobre, aunque es importante resaltar el hecho de que se favorece posiblemente la mayor divisin de las clulas. Anlisis de genes que aumentaron su expresin en 140 M de Cr(VI) Varias protenas no generaron informacin que pudiera relacionarse con una simple funcin. Tal es el caso de la codificada por At2g25510, para la que no se encontr similitud con alguna otra protena. La protena codificada por At5g40155 est incluso poco conservada en A. lyrata, una especie muy relacionada. Aunque la protena codificada por At4g12735 parece conservada en el reino vegetal, no tiene dominios reportados. La protena codificada por At5g42530 est medianamente conservada en el reino vegetal, sin embargo, no hay antecedentes de posible funcin. El gen At2g14560 codifica para una protena con dominio implicado en la redistribucin de fosfolpidos por respuesta al dao. Esta es una clara respuesta adaptativa de la planta, ya que el Cr(VI) en 140 M disminuy el crecimiento. El dominio de RNAsa H presente en la protena codificada por At5g61080 se reporta para el procesamiento de los fragmentos de Okazaki, en la replicacin de las molculas de ADN. El aumento de esta protena implica ajustes en el proceso de replicacin y aunque las plantas redujeron su crecimiento en la concentracin del Cr(VI), lo que implica menor divisin celular, no se vi incremento en la expresin de componentes de las ADN polimerasas, de acuerdo a lo analizado por Hernndez-Madrigal (2011). 13

En sntesis, la induccin en la expresin de genes en Cr(VI) 140 M implica ajustes en la distribucin de fosfolpidos en membranas y en la replicacin del ADN. Aunque en los genes de funcin desconocida no hubo expresin incrementada de genes implicados en dao oxidativo o interaccin con otros nutrientes, Hernndez-Madrigal (2011) tiene resultados de genes de funcin conocida relacionados con estos aspectos. Por lo tanto, las respuestas de las plantas estn orientadas a remediar el dao causado por el metal. Anlisis de genes que disminuyeron su expresin en 140 M de Cr(VI) Varios de los genes analizados no generaron informacin relevante. Tal fue el caso de At2g12905, At1g47400 y At2g14247 At4g19645, que aunque sus protenas se conservan en otras plantas, no se reportan dominios que indiquen alguna funcin probable. La protena codificada por At3g44140 no se encontr en otras plantas, por lo que posiblemente sea caracterstica de esta especie o especies muy relacionadas. Otros genes estn relacionados con la sntesis de protenas. La disminucin de la expresin implica una menor sntesis de estas molculas, lo cual se puede considerar como una respuesta del menor crecimiento de las plantas en el Cr(VI) a 140 M. La protena codificada por At3g03010 tiene dominios relacionados con la actividad de la separacin del ARN transportador de la protena que se est sintetizando, por lo que una menor actividad retrasara la sntesis de las protenas; adems, se encuentra altamente conservada en eucariontes. Adems, una protena relacionada con el ribosoma del cloroplasto codificada por At3g56910, tambin ve disminuida su expresin. La protena codificada por At5g49960 tiene un dominio implicado en el transporte de iones inorgnicos, por lo que su disminucin indica una alteracin en los mecanismos de transporte de otros iones. La afectacin de una protena con dominio transmembranal, codificada por At1g47330, implica una posible disminucin

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en la interaccin con algn ligando, afectndose por lo tanto un proceso de sealizacin. En sntesis, la afectacin de genes implicados en sntesis de protenas es un reflejo del menor crecimiento de las plantas, que se acompaa de alteraciones en el transporte de iones y posibles receptores que modifican las seales celulares.

Anlisis general de los cambios en la expresin de genes La expresin de genes implica un flujo de informacin desde las molculas de ADN hasta la formacin de protenas. En este proceso la clula puede establecer diferentes regulaciones, aunque la induccin o represin de la transcripcin es la que mayoritariamente ocurre en las clulas. Sin embargo, para entender un proceso completamente hay que considerar que puede haber regulaciones al nivel de la sntesis de protenas y de la modificacin covalente de estas ltimas (Alberts et al., 2010). Las plantas son organismos ssiles, por lo que los cambios ambientales no pueden ser evitados y forzosamente han desarrollado estrategias adaptativas que les han permitido sobrevivir hasta nuestros das (Taiz y Zeiger, 2006). Sin embargo, las actividades antropognicas han generado cambios ambientales a un ritmo tan acelerado, que no ha permitido a muchas especies adaptarse y llegan a desaparecer de los ecosistemas. Entre estos cambios se encuentran las acumulaciones de compuestos de Cr, en cantidades en las que de manera natural no se encuentran en los ambientes naturales (Shanker et al., 2007).

Para abordar los problemas ocasionados por metales como el Cr es necesario establecer estrategias que permitan entender el efecto de sus compuestos en la fisiologa de los organismos. Cervantes et al. (2001) han demostrado como el Cr(VI) es internalizado en bacterias mediante transportadores de sulfato y que existen determinantes genticos que permiten expulsar a estos compuestos a travs de protenas transportadoras. Sin embargo, en plantas el trabajo ha sido ms escaso, aunque se ha relacionado la interaccin de algunos nutrientes con el Cr(VI), as como una reduccin en el contenido de protenas (Sherwry y Peterson,1974; Vajpayec, 1999).

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En nuestro grupo de trabajo se caracteriz primeramente la respuesta de las plantas en la germinacin y al ser trasplantadas de medios sin Cr(VI) a medios con el metal, encontrndose una inhibicin del crecimiento de la raz primaria y una estimulacin del crecimiento de races laterales (OrtizCastro et al., 2007). La inhibicin del crecimiento de las races se correlacion con una inhibicin en el ciclo celular, mediante el uso de una lnea reportera con el promotor del gen de ciclina CycB1;1 unido a uidA (Ortiz-Castro et al., 2007). La interaccin del Cr(VI) con otros iones inorgnicos se determin en A. thaliana, al crecerla en medios MS con suplementos de sulfato, fosfato y nitrato, encontrndose que los dos primeros reestablecen tanto la division celular y el crecimiento de las races, incluso en concentraciones inhibitorias de Cr(VI). Lo anterior demostr que hay interacciones entre los iones, aunque no es posible todava establecer si es al nivel de la captacin de los iones o mediante una interferencia en la sealizacin celular. (OrtizCastro et al., 2009). Otra estrategia para entender el efecto del Cr(VI) en plantas no se haba abordado hasta ahora, por lo que nuestro grupo de trabajo inici un anlisis de la expresin global de genes mediante la tcnica de microarreglos. Los genes de funcin conocida se han analizando en un trabajo de tesis de maestra (Hernndez-Madrigal, 2011). Considerando que al menos una tercera parte de los genes de A. thaliana carecen de una funcin clara, en este trabajo se utilizaron herramientas bioinformticas para generar informacin preliminar de los genes que modificaron significativamente su expresin en los medios con Cr(VI). Los cambios de expresin de genes se valoraron para concentraciones de Cr(VI) de 20 M y de 140 M, ya que en estas condiciones se estimula o se inhibe el crecimiento de las plantas, respectivamente (Hernndez-Madrigal, 2011). Los genes con funcin desconocida que modificaron su expresin fueron centenares en los tratamientos de 140 M, por lo que fue necesario abordar slo los que tuvieron mayores cambios. Los resultados de los anlisis en las secciones anteriores demostraron que en la condicin de estimulacin del crecimiento de plantas los genes que se indujeron o reprimieron, algunos de ellos estn implicados en respuestas adaptativas para 16

aumentar la sntesis de protenas, mantener la conformacin de stas y en acelerar el ciclo celular. Por lo tanto, en estas condiciones la planta no slo se sobrepone al efecto del metal, sino que adems la respuesta es generar plantas de crecimiento ms acelerado, posiblemente para una mejor adaptacin. Por el contrario, algunos de los genes que se indujeron o reprimieron en las condiciones de Cr(VI) en las que las plantas disminuyen su crecimiento, estn relacionados con una menor sntesis de protenas y en redistribucin de lpidos de membrana. Estas respuestas son ya un sntoma de los efectos txicos ocasionados por el metal.

4. CONCLUSIONES
El anlisis bioinformtico de molculas, particularmente los dominios de las protenas, permitieron generar informacin preliminar sobre la funcin de stas. Fue posible correlacionar la funcin preliminar de los genes que codifican para protenas de funcin desconocida con los cambios en el crecimiento de las plantas. En condiciones de estimulacin del crecimiento algunos genes orientan su expresin a aumentar la divisin celular, la sntesis de protenas y el mantenimiento de la conformacin de estas ltimas. En condiciones de inhibicin del crecimiento algunos genes orientan su expresin a disminuir la sntesis de protenas y a optimizar los lpidos de las membranas. De las protenas de funcin desconocida que se estimulan o reprimen en dos diferentes condiciones de Cr(VI), existen algunas propias del gnero Arabidopsis, otras de algunas familias de angiospermas y otras de diferentes reinos.

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5. PERSPECTIVAS
El estudio de los mecanismos mediante los cuales el Cr(VI) afecta a las plantas se tiene que seguir abordando por diferentes estrategias. De stas, la expresin de genes es una herramienta poderosa y permiti endender a u n nivel molecular las modificaciones del crecimiento y desarrollo vegetal. Los datos generados en este trabajo servirn para conjuntarlos con el resto de los genes de funcin conocida y establecer un panorama ms completo de las funciones modificadas. Sin embargo, se requieren estudios ms finos, como el establecer los cambios de expresin en diferentes tiempos y en la interaccin con nutrientes inorgnicos. Esta informacin, se espera que contribuya en las estrategias para detoxificar el ambiente contaminado con Cr. No obstante, si bien muchos suelos y aguas ya estn contaminados y deben regenerarse, no debe ser una excusa para seguir virtiendo desechos de este metal al ambiente natural.

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ANLISIS DE LA TOXICIDAD DEL NQUEL, ZINC Y COBRE EN PLANTAS DE Arabidopsis thaliana L., UTILIZANDO UN SISTEMA in vitro
Marco Alejandro Caas Navarro, Mara Gloria Sols Guzmn y Miguel Martnez Trujillo
Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo

RESUMEN
La toxicidad ocasionada por los metales en concentraciones mayores a las que las plantas necesitan puede ser evaluada de diferentes maneras mediante bioensayos. En este trabajo se utilizaron plantas de A. thaliana germinadas y crecidas directamente en medios con nquel, zinc o cobre. Los aspectos que se consideraron para determinar la toxicidad fueron el desarrollo de la raz primaria, el amarillamiento de las hojas, la presencia de pelos radiculares y la actividad mittica de la raz primaria. Los resultados obtenidos demostraron que el nquel y el cobre son los ms txicos, con algunas variantes en los cambios fenotpicos, ya que en 75 M en ambos casos se presenta el amarillamiento de las hojas, la actividad mittica se pierde con nquel y casi desaparece con cobre. Los pelos radiculares se pierden en medios con nquel pero no en los medios con cobre. En cambio, el zinc result ser un metal que se tolera mejor por Arabidopsis, ya que la raz primaria sigue creciendo aun a concentraciones de 300 M, la actividad mittica se conserva aunque disminuida, el amarillamiento de las hojas es notable slo a partir de 200 M y se presenta el desarrollo de races laterales y pelos radiculares de manera normal. Los resultados obtenidos se compararon con los reportados anteriormente, en los que las plantas se germinaban y crecan en medios sin metal y posteriormente eran trasplantadas a medios con metal, encontrndose que las plantas de Arabidopsis toleran mejor la concentracin de nquel cuando se germinan directamente en medios con el metal con relacin a cuando son germinadas en medios sin el metal y posteriormente trasplantadas a medios con el metal, tanto en la actividad mittica como en el crecimiento de la raz primaria. En lo referente al zinc, las plantas toleran mejor el trasplante con relacin a la germinacin y crecimiento directo en el metal. Para el cobre no hubo diferencias notables entre un tratamiento y otro. Los anlisis de toxicidad realizados en A. thaliana 21

permiten simular condiciones de campo que pueden ser de utilidad en estudios ecolgicos, de reforestacin o de biorremediacin.

1. INTRODUCCIN
La contaminacin por metales pesados afecta al 12% de las tierras agrcolas del mundo (Moffat, 1999) y en el hemisferio norte el 80% de sta es generada por actividades antropognicas, mientras que el 20% restante es debido a causas naturales como depsitos de polvo producidos por el viento, erupciones volcnicas y evaporacin del agua contaminada (Buat-Menard,1984). Los metales pesados constituyen un grupo cercano a los 40 elementos de la tabla peridica que normalmente tienen una densidad 3 mayor o igual a 5 g/cm (Passow, 1961). El rasgo distintivo de la fisiologa de los metales pesados es que an cuando muchos de ellos son esenciales para el crecimiento como el Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn y Mo, se ha reportado que tambin tienen eventos txicos sobre las clulas, principalmente como resultado de su capacidad para alterar o desnaturalizar las protenas. Debido a su movilidad en los ecosistemas acuticos naturales y a su toxicidad para las formas superiores de vida, a los iones de metales pesados presentes en los abastecimientos de aguas superficiales y subterrneos se les ha dado prioridad como los contaminantes inorgnicos ms importantes en el ambiente. Aun cuando se encuentran presentes en concentraciones bajas los metales pesados pueden ser detectados ya sea en su estado elemental o enlazados en varios complejos con sales. Una vez en el ambiente los metales pueden sufrir trasformaciones a diferentes formas mviles y/o pueden ser inmovilizados en trampas ambientales (CaizalesVillanueva, 2000). El nquel es requerido por las plantas en concentraciones muy bajas, de 1.7 nmol/g o menos en biomasa seca y es esencial para las plantas, animales y bacterias (Eskew et al., 1984). Este metal es un componente de la enzima ureasa, la cual est presente en un rango muy amplio de especies vegetales y se ha mencionado que puede tener un papel en la sntesis de fitoalexinas y en la resistencia de las plantas a las enfermedades (Brown et al., 1987). La deficiencia de nquel tiene un rango amplio de efectos en el crecimiento y el metabolismo de las plantas y su ausencia impide completar el ciclo de vida de stas (Brown op.cit.).

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Los humanos usan el nquel para muchas aplicaciones diferentes, siendo la ms comn como ingrediente del acero y otros productos metlicos. El exceso de nquel es txico para las plantas, los sntomas de toxicidad se observan entre 0.19 y 0.85 mol/g en peso seco de la planta e incluyen la inhibicin del crecimiento de la raz y clorosis entre las venas de la hoja (Krmer et al., 1997). Algunas plantas como Thlaspi goesingense son tolerantes a concentraciones elevadas de nquel y pueden acumular concentraciones hasta del 3% en peso seco de la planta (Freeman et al., 2004). Esta tolerancia al nquel se ha reportado que depende de protenas que transportan este metal a las vacuolas de las clulas (Persans et al., 2001). El uso del zinc en productos galvanizados ha contribuido a la contaminacin de los suelos, as como su extraccin en zonas de minas (Dudka et al., 1996). El zinc es uno de los micronutrimentos que se encuentra en las plantas en cantidades de aproximadamente 20 mg/Kg de peso seco (Salisbury y Ross, 1991). Este metal es un constituyente de numerosas enzimas como anhidrasas, oxidasas y peroxidasas y juega un papel importante en regular el metabolismo del nitrgeno, la multiplicacin celular, la fotosntesis y la sntesis de auxinas (Rout y Das, 2003). Una de las funciones importantes del zinc es en la regulacin de la expresin de genes al formar parte de factores de transcripcin, particularmente en los motivos de las protenas conocidos como dedos de zinc; varias de estas protenas han sido implicadas en la regulacin de procesos biolgicos importantes como desarrollo de la flor, morfognesis regulada por la luz y respuestas a patgenos (Takatsuji, 1998). Se ha determinado la participacin de 3 genes en la captacin de zinc en plantas de Arabidopsis thaliana, ZIP1 y ZIP2 se expresan en races cuando existe una deficiencia de zinc y ZIP4 se expresa tanto en tallos como en races (Grotz et al., 1998). Se ha reportado que el exceso de zinc no inhibe la germinacin, pero si el crecimiento de la raz en concentraciones de 7 mM en plantas de la leguminosa arbustiva Cajanus cajan. Otros sntomas de la toxicidad ocasionada por zinc son el enanismo de las plantas, clorosis y una reduccin en la produccin de biomasa (Rout y Das, 2003). La contaminacin natural por el cobre en el suelo es relativamente poco comn en la naturaleza. Sin embargo, algunas actividades humanas han contribuido al incremento de los niveles de ste y otros metales traza en el agua y el suelo usados para la agricultura. Algunos de los ejemplos son el uso frecuente de fungicidas, pesticidas y herbicidas con elevadas concentraciones de cobre, la aplicacin excesiva de fertilizantes que contienen metales para corregir las 23

deficiencias nutricionales del suelo y el uso de abonos orgnicos provenientes de animales alimentados con aditivos metlicos, as como desechos secos y hmedos, aguas residuales industriales y actividades mineras (He et al., 2005). El cobre est presente en diversas enzimas o protenas implicadas en los procesos de oxidacin y reduccin, por ejemplo, la citocromo oxidasa una enzima respiratoria que se halla en las mitocondrias y la plastocianina, una protena de los cloroplastos que cataliza la transferencia de electrones entre el citocromo b6f y el foto sistema I (Rae et al., 1999). El receptor de etileno ETR1, es una protena transmembranal que requiere la unin de cobre para su funcionamiento (Rodrguez et al., 1999). Adems, el cobre junto con el zinc es un cofactor de dos superxido dismutasas (CDS1, CDS2) de las siete que se han encontrado en Arabidopsis; CDS1 es activa en el citosol mientras que CDS2 es activa en el estroma del cloroplasto (Bowler et al., 1992). La entrada de iones de cobre en las plantas depende de transportadores especficos, de los cuales se ha identificado COPT1 y otros 4 homlogos en Arabidopsis thaliana (Sancenon et al., 2003). La entrega del cobre al estroma para el funcionamiento de la superxido dismutasa CSD2 slo requiere a la protena transportadora PAA1. Otra protena similar (RAN1) es requerida para la entrega del cobre a los receptores de etileno (Hirayama et al., 1999). Arabidopsis thaliana se ha utilizado para evaluar la toxicidad producida por algunos metales en medios slidos en condiciones in vitro. En estos trabajos las plantas fueron germinadas y crecidas primeramente en medios MS sin suplementos de metales y posteriormente trasplantadas a medios con diferentes concentraciones de metales. Ortiz-Castro (2005) report que el dicromato de potasio inhibe el crecimiento total de la raz primaria en concentraciones de 200 M y asimismo inhibe la actividad mittica del meristemo de la raz. Sntiz (2006) report en las mismas condiciones, que el cloruro cprico inhibe el crecimiento de la raz primaria en concentraciones de 90 M. Se determin que el nquel, plomo y zinc afectan el crecimiento de plantas de Arabidopsis, primero inhibiendo el crecimiento de la raz primaria y a concentraciones mayores afectando el desarrollo del follaje y produccin de races laterales. Vargas (2007) determin que la toxicidad relativa de los metales analizados se encuentra en el siguiente orden: Ni Pb Zn y se confirm que el bioensayo utilizado tiene mayor sensibilidad que los reportados con anterioridad en otras plantas. El crecimiento de la raz primaria se correlacion con la actividad mittica del meristemo.

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En este trabajo se abord la determinacin de la toxicidad de tres micronutrimentos, zinc, nquel y cobre, mediante un sistema de crecimiento de plantas de A. thaliana, germinadas y crecidas directamente en los medios con los metales, para simular otro tipo de condiciones a las que las plantas se pueden enfrentar cuando las semillas llegan a suelos contaminados.

2. MATERIALES Y MTODOS
Material biolgico Las semillas que se utilizaron fueron de A. thaliana ecotipo Columbia (Col 0). Del mismo ecotipo se utiliz adems la lnea transformante CycB1;1::uidA (Coln-Carmona et al., 1999), que contiene el promotor del gen que codifica para la ciclina mittica de A. thaliana CycB1;1 fusionado al gen uidA y adems se adicion al gen una caja de destruccin de ciclina para la enzima -glucuronidasa, por lo que la protena se degrada despus de cada ciclo celular. Esta lnea permite monitorear la actividad del ciclo celular de manera temporal y espacial. Las semillas fueron desinfectadas con etanol al 96% durante 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 500 l de cloro comercial (Cloralex diluido al 20% con agua desionizada estril) durante 8 minutos y se realizaron 3 lavados con agua desionizada estril. Finalmente, se dejaron en 700 ml de agua estril a 4C durante 72 horas para que la germinacin fuera ms uniforme. Todo el procedimiento se llev a cabo en la campana de flujo laminar.

Preparacin de medios para plantas suplementados con metales Para preparar medio MS (Murashige y Skoog,1962), se utiliz un volumen de 100 ml de agua destilada, a la cual se le agreg 2.2 gr de sales MS y 2 gr de sacarosa y se disolvi con agitacin. Se agreg 1.0 gr de agar para plantas y posteriormente se le agregaron los metales para obtener las diferentes concentraciones. El nquel se utiliz a 0 M, 25 M, 50 M y 75 M; El zinc a 0 M, 100 M, 200 M y 300 M; El cobre a 0 M, 25 M, 50 M y 75 M. Se ajust el pH a 5.7- 5.8 y se esteriliz por 20 minutos. Posteriormente se vaci en cajas de petri.

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Condiciones de crecimiento de plantas Las semillas se germinaron directamente en medios con los metales y sus controles respectivos sin metales; la siembra se llev a cabo el mismo da cuando se prepar el medio. Las cajas con las semillas en germinacin se incubaron en una cmara de crecimiento de manera vertical para favorecer el crecimiento de las races sobre la superficie del medio y medir el crecimiento de la raz primaria. Las condiciones de crecimiento fueron: temperatura 22 C, fotoperiodo de -2 -1 18 h de luz (300 M m s ) y 6 h de oscuridad, con una humedad de 70-75 %. A los 8-10 das despus de la germinacin se hicieron las mediciones de las races y la observacin al microscopio compuesto. Anlisis histoqumico de la actividad de -glucuronidasa La actividad de la -glucuronidasa se determin mediante el sustrato x-gluc (Phytotechnology laboratorios X877) que produce una coloracin azul al dimerizarse. El procedimiento fue el siguiente: a) las plantas se incubaron por 24h en una solucin al 0.1% de 5-bromo-4cloro-3-indolil, -Dglucurnido (x-gluc), en amortiguador de fosfatos (NaH2PO4 y Na2HPO4, 0.1 M, pH = 7) conteniendo 2 mM (0.59 g L-1) de ferrocianuro de potasio (0.59 g L-1) y 2 mM (0.65 g L-1) de ferricianuro de potasio.

Microscopa Las races de A. thaliana fueron observadas en un microscopio compuesto Axiostar Zeiss Plus a 40 X. Las imgenes se capturaron con una cmara digital SONY Cybershot DSC-S75 adaptada al microscopio y procesadas con el software Zeiss AxioVision 4AC.

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3. RESULTADOS
Para evaluar la toxicidad ocasionada por el nquel, zinc y cobre en A. thaliana se utiliz un sistema in vitro, germinado y creciendo las plantas en medios MS con diferentes concentraciones de los metales.

Crecimiento de plntulas y raz en medios con nquel Para determinar las concentraciones txicas de nquel, se utilizaron concentraciones iniciales de 0, 100, 200 y 300 M, determinndose una inhibicin completa en 100 M (datos no mostrados). Posteriormente se utilizaron las concentraciones de 0, 25, 50 y 75 M, para analizar el crecimiento. Las plntulas fueron crecidas directamente en el metal (Figura 1). La inhibicin de la raz primaria fue del 50% en 50 M y del 90% en 75 M; en estos casos hubo amarillamiento en el follaje, y poco crecimiento de races laterales, mientras que en la concentracin de 0 y 25 M si hubo crecimiento normal de la raz primaria, crecimiento de races laterales y crecimiento de pelos radiculares (Figura 2). Tambin se pudo observar que en la concentracin de 75 M no hubo crecimiento de pelos radiculares. El amarillamiento de las hojas se present hasta la concentracin de 75 M. Por lo que respecta a la actividad mittica, se observ que a 50 M disminuye y prcticamente se pierde a 75 M (Figura 3). Esto es coincidente con los datos de crecimiento de la raz primaria, ya que en las plantas germinadas directamente en 50 M persiste un crecimiento de la raz primaria.

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Figura 1. Plantas de A. thaliana CycB1;1::uidA en medios con nquel. Las semillas fueron germinadas directamente con el metal. las concentraciones fueron utilizadas fueron A) 0 M, B) 25 M, C) 50 M, y D) 75 M.

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Figura 2. Efecto del nquel en la formacin de pelos radiculares de A. thaliana CycB1;1::uidA. Las semillas fueron germinadas directamente con el metal y las plantas se dejaron crecer durante 8 das. Las concentraciones utilizadas fueron A) 0 M, B) 25 M, C) 50 M y D) 75 M. Las fotografas fueron tomadas en el microscopio estereoscpico a 20X.

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Figura 3. Efecto del nquel en la actividad mittica de las races de A. thaliana CycB1;1::uidA. Las semillas fueron germinadas directamente con el metal y las plantas se dejaron crecer durante 8 das. Las concentraciones utilizadas fueron las siguientes A) 0 M, B) 25 M, C) 50 M y D) 75 M del metal. Las fotografas fueron tomadas en el microscopio compuesto a 400X.

Crecimiento de plntulas en medios con zinc Para determinar la toxicidad de zinc se utiliz una concentracin de 0, 100, 200 y 300 M, las plntulas fueron crecidas directamente en medios con el metal. La inhibicin del crecimiento de la raz primaria se observ desde 200 y 300 M aunque no fue total 30

(Figura 4). En las concentraciones de 100, 200 y 300 M, se observ amarillamiento del rea foliar, pero tambin se observ que si hubo crecimiento de raz lateral y de pelos radiculares en todas las concentraciones (Figura 5). Por lo que respecta a la actividad mittica, se observ en todas las concentraciones utilizadas (100, 200 y 300 M), no obstante que el crecimiento de la raz primaria en la mayor concentracin fue del 25% con respecto al control sin metal (Figura 6).

Figura 4. Plantas de A. thaliana CycB1;1::uidA en medios con zinc. Las semillas fueron germinadas directamente con el metal, las concentraciones fueron las siguientes: Las concentraciones utilizadas fueron las siguientes: A) 0 M, B) 100 M, C) 200 M y D) 300 M del metal.

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Figura 5. Efecto del zinc en la formacin de pelos radiculares de A. thaliana CycB1;1::uidA. Las semillas fueron germinadas directamente con el metal, las concentraciones fueron las siguientes: A) 0 M, B) 100 M, C) 200 M y D) 300 M del metal. Las fotografas fueron tomadas en el microscopio estereoscpico a 20X.

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Figura 6. Efecto del zinc en la actividad mittica de las races de A. thaliana CycB1;1::uidA. Las semillas fueron germinadas directamente con el metal. Las concentraciones utilizadas fueron las siguientes: A) 0 M, B) 100 M, C) 200 M y D) 300 M del metal. Las fotografas fueron tomadas en el microscopio compuesto a 400X.

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Crecimiento de plntulas y raz primaria en medios con cobre Para determinar las concentraciones txicas del cobre se utilizaron concentraciones iniciales de 0, 100, 200 y 300 M, determinndose una inhibicin completa en 100 M (datos no mostrados). Posteriormente se utilizaron las concentraciones de 0, 25, 50 y 75 M para analizar el crecimiento. Las plntulas fueron crecidas directamente en el metal. La inhibicin de la raz primaria se observ desde 50 M y fue mayor a 75 M. En 50 M del metal el crecimiento fue del 50% con respecto al control y en 75 M fue del 20% con respecto al control sin metal (Figura 7). El amarillamiento en el follaje se observ en la concentracin de 75 M. En las concentraciones de 25, 50 y 75 M, no hubo crecimiento de races laterales, tambin se observ que en estas mismas concentraciones si hubo crecimiento de pelos radiculares (Figura 8). Por lo que respecta a la actividad mittica, se present en las plantas crecidas en todos los medios con metal, no obstante la reduccin del crecimiento de la raz primaria (Figura 9).

4. DISCUSIN La toxicidad ocasionada por los metales en concentraciones mayores a las que las plantas necesitan puede ser evaluada de diferentes maneras mediante bioensayos. Khosravi et al. (2005) han utilizado la planta Azolla filicoides en soluciones acuosas y han determinado la biomasa como peso fresco como un indicador para medir la toxicidad. Wang (1987) utiliz al mijo y la lechuga para determinar la toxicidad de metales mediante la inhibicin del crecimiento de la raz primaria al 50%; de igual manera Ivanov et al. (2003) utilizaron plntulas de maz. Considerando la facilidad en el manejo de A. thaliana en condiciones de laboratorio, se han realizado bioensayos utilizando como marcador fenotpico el crecimiento de la raz primaria para determinar la toxicidad. En este trabajo se utilizaron plantas de A. thaliana germinadas y crecidas directamente en medios con nquel, zinc o cobre. Los aspectos que se consideraron para determinar la toxicidad fueron el desarrollo de la raz primaria, el amarillamiento de las hojas, la presencia de pelos radiculares y la actividad mittica de la raz primaria.

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Figura 7. Plantas de A. thaliana CycB1;1::uidA en medios con cobre. Las semillas fueron germinadas directamente con el metal. Las concentraciones utilizadas fueron las siguientes: A) 0, B) 25, C) 50 y D) 75 M del metal.

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Figura 8. Efecto del cobre en la formacin de pelos radiculares de A. thaliana CycB1;1::uidA. Las semillas fueron germinadas directamente con el metal. Las concentraciones utilizadas fueron las siguientes: A) 0, B) 25, C) 50 y D) 75 M del metal. Las fotografas fueron tomadas en el microscopio estereoscpico a 20X.

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Figura 9. Efecto del cobre en la actividad mittica de las races de A.thaliana CycB1;1::uidA. Las semillas fueron germinadas directamente con el metal. Las concentraciones utilizadas fueron las siguientes: A) 0, B) 25, C) 50 y D) 75 M del metal. Las fotografas fueron tomadas en el microscopio compuesto a 400X.

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Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que el nquel y el cobre son los ms txicos, con algunas variantes en los cambios fenotpicos, ya que en 75 M en ambos casos se presenta el amarillamiento de las hojas. La actividad mittica se pierde con nquel y casi desaparece con cobre. Los pelos radiculares se pierden en medios con nquel pero no en los medios con cobre. En cambio, el zinc result ser un metal que se tolera mejor por Arabidopsis, ya que la raz primaria sigue creciendo aun a concentraciones de 300 M, la actividad mittica se conserva aunque disminuida, el amarillamiento de las hojas es notable slo a partir de 200 M y se presenta el desarrollo de races laterales y pelos radiculares de manera normal. (Tabla 1). La toxicidad del nquel, zinc y plomo fue evaluada por Vargas (2007) y encontr que con base en los cambios de crecimiento de la raz primaria y actividad mittica, el nquel fue ms txico que el zinc. Por otro lado, Sntiz (2006) analiz los efectos txicos del cobre, incluyendo las variables mencionadas y encontr una alta toxicidad, similar a la reportada por el nquel por Vargas (2007). Los trabajos anteriores fueron realizados con plantas germinadas y crecidas durante 6 das en medios sin metal y posteriormente transferidas a medios con los respectivos metales. Aunque el orden de la toxicidad reportada en estudios de plantas crecidas en medios sin metal y trasplantadas a medios con metal es la misma con relacin a lo reportado en este trabajo en que las plantas se germinan y crecen directamente en los medios con el metal, existen diferencias de magnitud o intensidad. Las plantas de Arabidopsis toleran mejor la concentracin de nquel cuando se germinan directamente en medios con el metal con relacin a cuando son germinadas en medios sin el metal y posteriormente trasplantadas a medios con el metal, tanto en la actividad mittica como en el crecimiento de la raz primaria. En lo referente al zinc, las plantas toleran mejor el trasplante con relacin a la germinacin y crecimiento directo en el metal y respecto al cobre el comportamiento es muy similar (Tabla 2). Podra pensarse que en todos los casos las plantas se adaptaran mejor iniciando su crecimiento en el medio con el metal, pero esto slo se encontr para el nquel, mientras que en el zinc se present el efecto opuesto y en el cobre no hubo diferencias notables. El por qu existen las diferencias anteriores es un aspecto que debe ser analizado considerando las funciones de estos metales, la internalizacin y las interacciones con otros compuestos en el interior celular. 38

Las comparaciones anteriores demuestran que las plantas se adaptan mejor al ser transferidas a medios con zinc con relacin a las germinadas y crecidas directamente en el metal. Esta diferencia puede ser debida a que las funciones mltiples del zinc no son afectadas en tiempos cortos. Sin embargo, el comportamiento fino de estas diferencias debe ser analizado considerando aspectos de transporte de los metales, las actividades enzimticas en que actan cada uno de los metales y las interacciones de otro tipo que pudieran tener en el interior celular, lo que escapa a los objetivos de este trabajo. El anlisis de la toxicidad utilizando A. thaliana en condiciones de germinacin y crecimiento directo en medios con metales, permite simular las condiciones naturales en las que las semillas al dispersarse llegan a los suelos contaminados con metales y se enfrentan al estrs de germinar y crecer en esos suelos. Por otro lado, cuando las plantas se germinan en medios sin metal y se trasplantan a medios con metal, se simulan las condiciones en las que las plantas germinadas y crecidas en vivero se trasplantan a los suelos contaminados con metales, ya sea con propsitos de biorremediacin o de reforestacin. Por lo anterior, los resultados obtenidos en este trabajo, por Vargas (2006) y Sntiz (2006), sern de utilidad en los trabajos de campo que se puedan realizar con otras plantas en suelos contamionados con metales,

5. CONCLUSIONES a) La toxicidad ocasionada por nquel, zinc y cobre puede ser evaluada en plantas germinadas y crecidas en medios con cada uno de los metales. b) La toxicidad es similar en nquel y cobre y mayor con respecto al zinc. c) No existe una relacin clara entre la toxicidad causada en el sistema utilizado de germinacin y crecimiento directo en metales, con relacin a sistemas de trasplante utilizados con anterioridad. d) El uso de A. thaliana para evaluar la toxicidad de metales puede ser de utilidad en la biorremediacin o reforestacin de suelos contaminados, ya que refleja condiciones utilizadas en el campo.

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Tabla 1. Anlisis comparativo de las alteraciones fenotpicas producidas por el nquel, zinc o cobre en A. thaliana, para determinar la toxicidad, en plantas germinadas y crecidas directamente en medios suplementados con los metales
Crecimiento de raz primaria Actividad Mittica Amarillamiento Nmero y crecimiento de pelos radiculares

Nquel

Inhibicin al 50% en 50 M

Prdida a 75 M

Presente a 75 M

Prdida a 75 M

Zinc

Inhibicin desde 200 M

Reduccin al 25% en 300 M

Presente desde 200 M

Presentes de 0 a 300 M

Cobre

Inhibicin al 50% en 50 M

Presente pero reducida a 75 M

Presente a 75 M

Presentes de 0 a 75 M

Orden de Toxicidad:

Ni>Cu>Zn

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Tabla 2. Comparacin semicuantitativa de la intensidad del dao ocasionado por los metales dependiendo de su crecimiento directo en stos con relacin al crecimiento en medios sin metal y posterior trasplante a medios con metal

G D

GD

GD

GD

> Nquel

>

<

<

El Ni es ms txico en el trasplante

< Zinc

<

>

El Zn es ms txico en la germinacin directa

= Cobre

La toxicidad del Cu es la misma en ambas condiciones GD= plantas crecidas en germinacin directa con el metal T= Plantas germinadas y crecidas en MS y transferidas a medios con el metal

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ANLISIS DE LA RESPUESTA DE RACES PRIMARIAS Y RACES LATERALES DE Arabidopsis thaliana L. CycB1::uidA A CONDICIONES VARIABLES DE ESTRS CAUSADO POR Cr(VI)
Juan Carlos Jimnez Saragoz, Mara Glora Sols Guzmn, Randy Ortiz Castro y Miguel Martnez Trujillo
Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo

RESUMEN
El Cr(VI) es un serio contaminante generado por industrias de tratamiento de metales y del curtido de pieles. Previamente se han reportado algunos efectos de esta forma del metal en la inhibicin del crecimiento de las races, amarillamiento de las hojas y germinacin. En este trabajo se utiliz Arabidopsis thaliana CycB1::uidA en 3 condiciones experimentales: A) Se utilizaron plntulas germinadas y crecidas por 6 das en medios MS, sin races laterales, y se trasfirieron a cajas de petri con su respectiva concentracin de Cr(VI): 0 M, 100 M, 150 M, 200 M y 250 M. Esto permiti evaluar como se afectaba el crecimiento de la raz primaria al pasar rpidamente del medio MS al medio MS con Cr(VI) y en qu medida se estimulaba o inhiba la formacin y crecimiento de nuevas races laterales. B) Se utilizaron plntulas germinadas y crecidas durante 8 das en medios MS, ya con races laterales, y se trasplantaron a medios MS con diferentes concentraciones de Cr(VI): 0 M, 100 M, 150 M, 200 M y 250 M. Esta condicin permiti evaluar cmo se afectaba el crecimiento de races primarias y races laterales previamente formadas al pasar rpidamente del medio MS a medios suplementados con Cr(VI). Adems, permiti comparar cmo se comportaban las races laterales nuevas con respecto a las ya existentes al momento del trasplante. C) Se utilizaron plntulas germinadas y crecidas por 6 das en medios MS, sin races laterales, y se trasfirieron a cajas de petri con divisin suplementadas con medios: MS-MS, MS-MS+Cr. Esto permiti determinar cmo se afectaba el crecimiento de las races primarias y laterales al pasar gradualmente de un medio MS a otro suplementado con Cr(VI). Las principales conclusiones obtenidas en este trabajo fueron las siguientes: a) El Cr(VI), dependiendo de su concentracin, tiene un efecto estimulador o inhibitorio en el crecimiento de las races laterales existentes as como de las races formadas de novo. b) La mayor tolerancia de las races laterales al 45

estrs con relacin a la raz primaria es parcialmente innata, pero se refuerza cuando las races laterales se forman de novo en el medio con el estrs generado con el metal, y c) La actividad mittica se correlaciona de manera proporcional a la intensidad del crecimiento, tanto en races primarias como en races laterales.

1. INTRODUCCIN
Las races son rganos adaptados para la captacin de agua y nutrientes del ambiente, as como tambin sirven de sostn a la planta. La raz se diferencia del tallo por su estructura, por el modo en que se forma y por la falta de apndices, como yemas y hojas. La primera raz originada de la planta se llama radcula, que es originada despus de la germinacin de la semilla y forma la raz primaria. Las races originadas a partir de la raz primaria se denominan races laterales. Las races que se desarrollan de otra parte de la planta, tal como el tallo, son llamadas races adventicias. Las races son rganos heterotrficos, puesto que su nutricin depende de la fotosntesis producida por las hojas, sin embargo, la fotosntesis depende del agua y minerales captados por la raz. Debido a que la planta no tiene movimiento, la estrategia para explorar el mundo subterrneo para la captacin de nutrientes y agua es el crecimiento de una raz ms larga o la formacin de nuevas races (Taiz y Zeiger, 2002). Arabidopsis thaliana es una pequea crucfera que gracias a su reducido tamao, pequeo genoma y fcil manipulacin gentica ha llegado a ser uno de los sistemas ms importantes para el estudio de muchos aspectos de la biologa de las plantas (Meyerowitz, 1989). Desde una perspectiva del desarrollo, la raz de Arabidopsis es muy sencilla, un nmero pequeo de clulas madre generan todos los tipos celulares a travs de divisiones estereotpicas seguidas de una diferenciacin y expansin celular. La simetra radial de la raz combinada con una carencia de movimiento de las clulas clonalmente relacionadas, son frecuentemente encontradas en todos los tipos de filas celulares. Estas clulas pueden ser localizadas hasta sus orgenes, identificndose cuatro clulas madres (o clulas iniciales) en el pice de la raz (Dolan et al., 1993). La capa de raz lateral da origen a la epidermis y a la porcin exterior de la capa de la raz conocida como capa de raz lateral. La porcin central de la capa de la raz, la columnela, tiene su propio juego de clulas iniciales. El crtex y endodermis, son generados por las divisiones de las clulas 46

iniciales endodermales del crtex. Finalmente, el tejido vascular y periciclo tienen sus propias clulas iniciales. Internamente y en contacto con todos los tipos de clulas iniciales se encuentra un nmero pequeo de clulas que son mitticamente inactivas y son conocidas como centro quiescente (QC) (Figura 1).

Figura 1. Estructura de la raz de Arabidopsis thaliana. Seccin longitudinal de la raz mostrando los diferentes tipos de clulas y representacin esquemtica de los dos tipos de divisiones asimtricas que las clulas experimentan.

La formacin de races laterales es un proceso organognico de gran importancia que contribuye al establecimiento de la arquitectura de la raz en plantas superiores. El grado de ramificaciones afecta la eficiencia de absorcin de agua, la adquisicin de nutrientes y el anclaje de las plantas (Pret et al., 2009). Los estudios histolgicos han mostrado que en angiospermas las races laterales derivan de una capa interior del periciclo (McCully, 1975; Dubrovsky y Rost, 2003; Casimiro et al., 2003). (Figura 2).

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Figura 2. Etapas de la formacin de la raz lateral. A) Las races laterales se generan a partir de la divisin de clulas del periciclo que se encuentran en contacto con el floema. B) Existen ocho etapas de desarrollo del primordio de la raz lateral, lo cual se muestra en nmeros romanos. C) La concentracin de auxinas, coloreada en azul, es el factor que desencadena la formacin del primordio. D) Observacin al microscopio del desarrollo de un primordio (Pret et al., 2009).

En estudios del efecto de metales sobre el crecimiento y desarrollo de races en Arabidopsis thaliana L., se ha observado que a ciertas concentraciones de metales el crecimiento de la raz primaria se detiene y se generan races laterales nuevas, las que pueden crecer aparentemente sin ningn problema. Lo anterior se ha observado en el Cr(VI), zinc, nquel, cobre y aluminio (Ortiz-Castro et al., 2007; VargasPalominos, 2007; Sntiz-Gmez, 2006, Elizarrars-Salazar, 2005). Para determinar si las races laterales son por si mismas ms tolerantes al estrs de los metales, en este estudio se utiliz un sistema in vitro que analiz el comportamiento de este tipo de races, utilizando como metal estresante el Cr(VI). 48

2. MATERIALES Y MTODOS
Material biolgico y condiciones de crecimiento Se utilizaron plantas de Arabidopsis thaliana L. (ecotipo Col-0) y la lnea transgnica CyCB1:uidA (Coln-Carmona et al., 1999), la cual lleva fusionado el promotor de la ciclina mittica CycB1;1 de Arabidopsis al gen reportero uidA (Jefferson et al.,1987) que codifica la enzima -glucuronidasa. Las semillas fueron desinfectadas durante 5 min mediante tratamiento superficial con etanol al 95% (v/v) y por 8 min con solucin al 6 % de hipoclorito de sodio comercial diluido al 20%. Las semillas se lavaron 3 veces con agua tridestilada estril y se incubaron en la oscuridad a 4C durante 48 h en agua tridestilada estril. Las semillas fueron sembradas en medios MS (Murashige y Skoog, 1962) 0.2x, la formulacin sugerida es de 4.3 g/L de sales para una concentracin 1x, se utiliz 0.9 g/L a la cual referimos como MS 0.2x. Este medio carece de aminocidos y vitaminas. El medio fue suplementado con sacarosa al 2 % y agar para plantas (Phytotechnology A111) al 1% (p/v) y el pH se ajust a 5.7. Las plantas fueron colocadas en una cmara de crecimiento -2 -1 con un fotoperiodo de 18 h de luz (300 M m s ) y 6 h de oscuridad, con una humedad de 70-75%. Las plantas fueron colocadas en una posicin vertical para permitir el crecimiento de la raz primara sobre el medio.

Anlisis del crecimiento de races primarias y laterales de Arabidopsis thaliana en diferentes condiciones de estrs causado por Cr(VI) Se realizarn tres bioensayos para evaluar el efecto txico del cromo sobre el crecimiento de la raz primaria y races laterales de A. thaliana (Figura 3): A) Se germinaron semillas en cajas de petri con medio MS 0.2x y se dejaron crecer durante 6 das despus de la germinacin (6 ddg). Estas plantas carecan de races laterales y se trasplantaron a nuevas cajas de petri con divisin suplementadas con medios: MS-MS (control) MS-MS+Cr. Esto permiti determinar cmo se afectaba el crecimiento de las races primarias y laterales al pasar gradualmente de un medio MS a otro suplementado con Cr(VI).

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B) De igual manera que en el experimento A, se utilizaron plntulas de 6 (ddg), sin races laterales, y se trasplantaron a cajas de petri sin divisin y con su respectiva concentracin de Cr(VI): 0 M, 100 M, 150 M, 200 M y 250 M. Esto permiti evaluar como se afectaba el crecimiento de la raz primaria al pasar rpidamente del medio MS al medio MS con Cr(VI) y en qu medida se estimulaba o inhiba la formacin y crecimiento de nuevas races laterales. C) Se utilizaron plntulas de 8 das de germinacin en MS, ya con races laterales, y se trasplantaron a medios MS con diferentes concentraciones de Cr(VI): 0 M, 100 M, 150 M, 200 M y 250 M, durante 4 das. Esto permiti evaluar cmo se afectaba el crecimiento de races primarias, races laterales previamente formadas y races laterales nuevas, al pasar rpidamente del medio MS a medios suplementados con Cr(VI). Adems, esto permiti comparar cmo se comportaban las races laterales nuevas con respecto a las races laterales ya existentes en su crecimiento despus del trasplante.

Anlisis del crecimiento El crecimiento de la raz primaria y races laterales fue registrado utilizando una regla graduada en mm. Para tener un mejor entendimiento del escrutinio de la raz, se establecieron dos zonas de inters: Z1, que comprende la zona de la raz que creci antes del trasplante a los medios con Cr(VI) y Z2, que comprende la zona de la raz que creci a partir del trasplante a los medios con Cr(VI). Anlisis histquimico de la actividad de la -glucuronidasa Las plantas transgnicas que expresan el gen reportero uidA (Jefferson et al., 1987) fueron teidas en 0.1% de X-Gluc (5-bromo-4chlorium-3-indolyl, -D-glucoronide) en un buffer de fosfatos (NaH2PO4 y Na2HPO4, 0.1M, pH= 7) con 2 mM de ferrocianuro de potasio y 2 mM de ferricianuro de potasio, por 12 h a 37C. Las plantas fueron aclaradas y fijadas con HCl en 20% de metanol (v/v) e incubadas por 60 minutos a 62C. La solucin fue sustituida por NaOH al 7% (p/v) en 60% de etanol (v/v), por 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las plantas fueron rehidratas con tratamiento de etanol a 40, 20 y 10% (v/v), por un periodo de 24 h entre cada tratamiento y fijadas en glicerol al 50% (v/v). Las races procesadas fueron incluidas en un portaobjetos y selladas con barniz de uas comercial. 50

Figura 3. Tipos de experimentos realizados para el anlisis del crecimiento de races expuestas a Cr(VI). En los tres casos las plantas se germinan primeramente en medios MS sin metal y se dejan crecer varios das para posteriormente trasplantarlas a los medios con Cr(VI) y sus controles. A) Las plntulas de 6 (ddg) se transfieren a cajas divididas en las que el primer medio es MS y se dejan crecer para que las races lleguen al segundo medio con el Cr(VI); los controles carecen del metal en el segundo medio. B) Las plntulas de 6 (ddg), sin races laterales, son transferidas a medios MS con diferentes concentraciones de Cr(VI). C) Las plntulas de 8 (ddg), ya con races laterales, son transferidas a medios MS con diferentes concentraciones de Cr(VI).

Microscopa y toma de imgenes El sistema radicular de A. thaliana fue analizado utilizando un microscopio compuesto (Axiostar Zeiss Pluss). Se capturaron las imgenes utilizando una cmara digital SONY Cybert-shot DSC-S75 de 3.3 megapixeles adaptada al microscopio. Las imgenes fueron analizadas con el software Zeiss AxioVision 4AC. 51

3. RESULTADOS
Efecto del Cr(VI) en el crecimiento de la raz primaria y nuevas races laterales de plntulas de A. thaliana sin races laterales, al pasar rpidamente (trasplante) de un medio MS a en medio suplementado con Cr(VI) Se transfirieron plntulas de A. thaliana de 6 ddg, germinadas y crecidas en medios MS, a medios MS suplementados con Cr(VI). Las plntulas carecan de races laterales. Despus de la transferencia, se dejaron crecer 5 das ms y se analiz el crecimiento de la raz primaria y de las nuevas races laterales. Para tener un mejor anlisis de los resultados se procedi a dividir la raz en dos zonas (Z1 y Z2). Z1 corresponde a la zona hasta donde haba crecido la raz primaria en el momento del trasplante. Z2 corresponde a la zona de crecimiento de la raz primaria a partir del trasplante. Las plantas transferidas a medio MS 0.2x sin Cr(VI), mantuvieron un crecimiento constante de la raz primaria y formacin de races laterales. Cuando las plantas fueron transferidas a medios MS 0.2x con Cr(VI) se observ una inhibicin del crecimiento de la raz primaria del 50% en 100 M y casi del 100% en 150 M. (Figuras 4 y 5). Por el contrario, se observ una estimulacin del crecimiento de las races laterales nuevas de la zona Z1, del 60% en 100 M de Cr(VI) comparado con las races laterales de los medios sin Cr(VI). En 150 M el crecimiento fue igual al control MS, y a partir de 200 M hubo una inhibicin del crecimiento de ms del 80%. (Figuras 4 y 5). Las races laterales nuevas de la zona Z2 se inhibieron en su crecimiento de manera casi total en 100 M, y a partir de 150 M no se gener una zona Z2 significativa que permitiera el crecimiento de races laterales. (Figuras 4 y 5).

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Figura 4. Efecto del Cr(VI) en el sistema radicular de plntulas de A. thaliana sin races laterales trasferidas de medios MS a medios con Cr(VI). Las plantas de 6 ddg germinadas y crecidas en MS 0.2x se trasfirieron a medios MS con diferentes concentraciones de Cr(VI) y se dejaron crecer por 5 das ms. A) Control MS, B) 100 M, C) 150 M D), 200 M, E) 250 M. Imgenes representativas de al menos 5 plantas analizadas. La flecha indica la posicin de la raz primaria al momento del trasplante.

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Figura 5. Efecto del Cr(VI) en el crecimiento de la raz primaria y races laterales nuevas de Arabidopsis thaliana trasferidas de medios MS a medios suplementados con Cr(VI). Las plantas de 6 ddg germinadas y crecidas en MS 0.2x se trasfirieron a medios MS con diferentes concentraciones de Cr(VI) y se dejaron crecer por 5 das ms. Z1 consiste en la zona de la raz primaria hasta el momento del trasplante; Z2 comprende la zona de la raz primaria que creci a partir del trasplante. RP= Races primarias; RL N Z1 = Races laterales nuevas de la zona 1, RL N Z2 = Races laterales nuevas de la zona 2. Las barras indican el intervalo de confianza para alfa= 0.05.

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Efecto del Cr(VI) en el crecimiento de la raz primaria, races laterales preexistentes y races laterales nuevas al pasar rpidamente (trasplante) de un medio MS a un medio suplementado con Cr(VI) Plantas de A. thaliana de 8 ddg, con races laterales, fueron transferidas a medios MS 0.2x suplementadas con diferentes concentraciones de dicromato, 0, 100, 150, 200 y 250 M, y se dejaron crecer por 5 das ms despus del transplante. Al igual que en la seccin anterior, se procedi a dividir la raz en dos zonas (Z1 y Z2). Las plantas crecidas en tratamientos sin Cr(VI) mostraron un crecimiento constante en la raz primaria. Se observ una disminucin del crecimiento del 20% a 100 M y 150 M y a partir de 200 M se inhibi completamente el crecimiento de la raz primaria (Figuras 6 y 7). Por lo que respecta a las races laterales, las ya existentes de la zona Z1 se estimularon en su crecimiento a 100 M en ms del 40% con respecto al control y en cambio se inhibieron en 150 M en 50%. A 200 M la inhibicin del crecimiento fue casi total y no hubo crecimiento en 250 M. (Figuras 6 y 7). En la zona Z1 se formaron nuevas races laterales, que se estimularon en su crecimiento en 200%, tanto a 100 M como a 150 M. En 200 M la inhibicin fue del 60% y la inhibicin fue total en 250 M. (Figuras 6 y 7). Las races laterales nuevas que se formaron en la zona Z2 se inhibieron en su crecimiento en ms del 60%, tanto en 100 M como en 150 M. La inhibicin del crecimiento fue total en 200 M y 250 M. (Figuras 6 y 7).

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Figura 6. Efecto del Cr(VI) en el sistema radicular de plntulas de A. thaliana trasplantadas de un medio MS a medios suplementados con Cr(VI). Las semillas de A. thaliana fueron germinadas en el medio MS 0.2x y crecidas durante 8 das, posteriormente fueron transferidas a medios MS con diferentes concentraciones de Cr(VI). A) 0 M, B) 100 M, C) 150 M, D) 200 M, E) 250M. Los puntos indican las posiciones de la raz primaria y races laterales ya existentes al momento del trasplante.

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Figura 7. Efecto del Cr(VI) en el crecimiento de la raz primaria, races laterales preexistentes y races laterales nuevas, en plantas de A. thaliana trasferidas de un medio MS a medios suplementados con Cr(VI). Plantas de 8 ddg, con races laterales, fueron transferidas a medios MS 0.2x suplementados con Cr(VI) y crecidas por 5 das ms en los tratamientos. Z1 consiste en la zona de la raz primaria hasta el momento del trasplante; Z2 comprende la zona de la raz primaria que creci a partir del trasplante. RP= Races primarias; RL PRE Z1= Races laterales preexistentes de la zona 1; RL N Z1= Races laterales nuevas de la zona 1; RL N Z2= Races laterales nuevas de la zona 2. Las barras indican el intervalo de confianza para alfa= 0.05.

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Anlisis del crecimiento de races primarias y races laterales nuevas al pasar gradualmente de un medio MS a un medio MS con Cr(VI) Considerando que tanto las races primarias como las races laterales preexistentes son inhibidas al pasar rpidamente (trasplante) de un medio MS a otro medio suplementado con 250 M de Cr(VI), se decidi analizar si ocurra lo mismo cuando las races pasan gradualmente de un medio MS a otro medio suplementado con 250 M de Cr(VI). Plntulas de 5 das crecidas en medios MS fueron transferidas a medios MS en cajas divididas. El primer medio consisti en MS y el segundo estuvo suplementado con 250 M de Cr(VI), excepto el control que consisti en medio MS sin el metal. Las plantas transferidas se dejaron crecer hasta que las races llegaran al medio con el metal y 3 das ms. Los resultados mostraron que las plantas transferidas a medios MS-MS (control) tuvieron un crecimiento continuo de la raz primaria y de las nuevas races laterales. En las plantas que fueron transferidas a medios MS-MS+Cr 250 M, cuando la raz primaria y las races laterales entraron en contacto con el medio suplementado con Cr(VI), pudieron crecer a travs del medio con el metal. Aunque se pudo notar un cambio en la velocidad de crecimiento de las races primarias y races laterales al pasar del medio MS al medio con Cr(VI), no se registr el crecimiento diario, por lo que no se puede precisar la magnitud en la inhibicin del crecimiento. (Figura 8).

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Figura 8. Efecto del Cr(VI) en el crecimiento de races primarias y races laterales de A. thaliana al pasar de manera gradual de un medio MS a otro medio suplementado con el metal. Las semillas de Arabidopsis fueron germinadas y crecidas en medios MS 0.2x por 6 das y posteriormente transplantadas a cajas divididas con medios MS 0.2x suplementados con diferentes concentraciones de Cr(VI). Las plntulas transferidas carecan de races laterales. Las placas divididas permitieron el crecimiento gradual de la raz primaria y races laterales hacia el medio con Cr(VI). Imgenes representativas del crecimiento de la raz de plantas de A. thaliana a diferentes condiciones de crecimiento. A) Medios MS-MS, B) Medios MS-MS+250M de Cr(VI). La lnea en negro delimita el cambio de un medio a otro. Las flechas en blanco indican el extremo de la raz primaria. 59

Efecto del Cr(VI) en la divisin celular de la raz primaria y races laterales de plntulas de A. thaliana al pasar rpidamente (trasplante) de medio MS a medios MS suplementados con Cr(VI) En los meristemos de la raz se presenta una intensa divisin de las clulas mediante el proceso de mitosis y las nuevas clulas generadas permiten el crecimiento de la raz, dando origen a los diferentes tipos celulares. Para investigar el patrn de actividad mittica en respuesta a Cr(VI), se analiz la expresin del marcador CyCB1:uidA, el cual colorea de azul a las clulas en divisin (ColnCarmona et al., 1999). Las plantas de la lnea CyCB1:uidA fueron crecidas en medios MS 0.2x durante 8 das y posteriormente fueron transferidas a medios MS 0.2x suplementados con 0, 100, 150, 200 y 250 M de Cr(VI). A los 5 das despus de la transferencia las plantas fueron incubadas en el sustrato X-gluc para observar la tincin en azul, producto de la dimerizacin del sustrato por la -glucuronidasa. Las plantas fueron clarificadas y montadas para su anlisis al microscopio. La inhibicin del crecimiento de la raz primaria en 200 M de Cr(VI) se correlacion con la prdida de expresin del gene reportero uidA en el meristemo de la raz primaria de las plantas transgnicas CyCB1:uidA (Figura 9A-E). En las races laterales previamente formadas al momento de la transferencia, se observ una inhibicin en la expresin del gen reportero uidA en 200 M (Figura 9F-J). En cambio, en las races laterales de nueva formacin se observ una expresin del gen reportero hasta en 200 M de dicromato (Figura 9KO). Los resultados de actividad mittica se correlacionaron con el crecimiento observado de las races primarias y races laterales.

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Figura 9. Efectos del dicromato sobre la actividad mittica de races de A. thaliana CycB1::uidA. Plantas de 8 ddg, germinadas y crecidas en medios MS 0.2x, fueron transferidas a medios MS 0.2x suplementados con dicromato. Las plantas se dejaron crecer por 5 das ms (tiempo 1). Las races fueron teidas con x-gluc, de acuerdo a materiales y mtodos. RP (t1) = Races primarias al tiempo 1; RL PRE (t1) = Races laterales preexistentes al tiempo 1; RL N (t1) = Races laterales nuevas al tiempo 1.

4. DISCUSIN
El efecto de la inhibicin del crecimiento de la raz debido a metales pesados ha sido documentado en rboles y en cultivos (Breckle, 1991; Tang et al., 2001). Prasad et al. (2001) reportaron que el orden de toxicidad de los metales sobre primordios de raz en Salix viminalis es Cd>Ni>Cr>Pb, mientras que la longitud de la raz fue ms afectada por el Cr que por otro metal pesado. Ortiz-Castro et al. (2007) demostraron que en plantas de A. thaliana transferidas de medio MS a medio MS suplementado con Cr(VI), la concentracin de 200 M detiene el crecimiento de la raz primaria e induce la formacin de nuevas races laterales, mostrando estas ltimas actividad mittica. Efectos similares en A. thaliana se han encontrado en experimentos de trasplante a medios con cobre, nquel, plomo y zinc (Vargas-Palominos et al., 2007). Por lo anterior, se gener la interrogante de si las races laterales son siempre ms tolerantes al efecto de los metales con relacin a las races primarias o 61

bien depende de la etapa del desarrollo de las races laterales, por lo que en este trabajo se abord este aspecto en tres condiciones diferentes utilizando Cr(VI). En los resultados obtenidos, si bien las races primarias A. thaliana no mostraron una estimulacin del crecimiento en alguna de las concentraciones de Cr(VI) utilizadas, la tolerancia vara de acuerdo al estadio de desarrollo, ya que cuando la planta es trasplantada a los 6 das de crecimiento despus de la germinacin, la inhibicin es mayor que cuando el trasplante es a los 8 das despus de la germinacin. La razn de este comportamiento puede estar en la mayor capacidad fotosinttica de la planta y el que su sistema radicular es ms grande y puede compensar mejor las condiciones de estrs, manteniendo la absorcin de agua y nutrientes en mejores condiciones. De manera contraria a lo que ocurre con races primarias, las races laterales se estimulan en su crecimiento en las concentraciones ms bajas utilizadas de Cr(VI) y en las concentraciones mayores se inhiben. Existe adems una diferencia entre las races laterales preexistentes al momento de la transferencia a los medios con Cr(VI) con relacin a las que se generan de novo despus del trasplante, ya que estas ltimas se estimulan en mayor magnitud en su crecimiento e incluso a mayores concentraciones del metal. Lo pudiera explicarse considerando que las plantas prefieren canalizar su crecimiento a las races laterales nuevas, posiblemente debido a que las clulas de las races laterales preexistentes, entre ellas las clulas de la zona del meristemo tuvieron un estrs y un dao al pasar repentinamente del medio sin metal al medio con Cr(VI). En cambio, las races laterales nuevas se formarn de clulas interiores de la raz, particularmente del periciclo (McCully, 1975; Dubrovsky y Rost, 2003), que al no haber estado en contacto directo con el metal, al emerger como races laterales se van adaptando gradualmente al estrs y tienen como consecuencia mejor crecimiento. Para que las races laterales nuevas tengan un mejor crecimiento, es posible que la planta canalice ms recursos energticos y un balance adecuado de reguladores de crecimiento, todo ello encaminado a la mayor divisin celular. Este ltimo planteamiento deber ser probado con otro tipo de experimentos. Es interesante considerar que las races laterales preexistentes son ms tolerantes al metal que las races primarias. Si ambos tipos de raz se pasaron repentinamente del medio sin metal al medio con el Cr(VI), entonces el dao causado por el estrs es similar o igual en las 62

clulas de la regin meristemtica de ambos tipos de races, por lo que el mejor crecimiento de las races laterales preexistentes puede deberse a una estrategia de la planta de canalizar un mejor crecimiento a las races laterales, que son mayores en nmero y cada una de ellas puede aportar ms races laterales y pelos radiculares, que finalmente mejorarn las condiciones de absorcin. De hecho, en plantas de A. thaliana transferidas a medios con Cr(VI) se ha encontrado un mayor nmero y tamao de pelos radiculares (OrtizCastro et al., 2007). De manera que en las races de A. thaliana transferidas repentinamente a un medio con Cr(VI), la prioridad es favorecer el crecimiento de races laterales formadas de clulas interiores del periciclo, que no estuvieron en contacto tan directo con el metal y por lo tanto tuvieron un dao menor. En segundo orden de prioridad se favorecen las races laterales preexistentes, ya que al ser varias en cada raz, la superficie de absorcin puede aumentar ms rpidamente. El ltimo orden de prioridad es la raz primaria, ya que por ser nica en cada sistema radicular, su mayor crecimiento implicara destinar mayores recursos energticos para aumentar la superficie de absorcin. Cuando la generacin de estrs en la raz se presenta de manera gradual, los diferentes tipos de races son ms tolerantes. No obstante, se sigue favoreciendo el crecimiento de races laterales nuevas, que se forman tanto de la raz primaria como de races laterales. Considerados de manera global, los resultados obtenidos sugieren que la diferencia en crecimiento de races primarias, races laterales preexistentes y races laterales nuevas, sometidas a condiciones de estrs generado por el Cr(VI), se deben a dos prioridades: favorecer primeramente las clulas con menor dao y en segundo aquellas que pueden aumentar ms rpido la superficie de absorcin.

REFERENCIAS
Breckle, S.W. (1991). Growth under stress: heavy metals in: Plant root: The hidden half. (Eds Y. Waisel, A. Eshel and U. Kafkafi), Marcel Dekker, NY, USA. pp. 351-373. 63

Casimiro I, Beeckman T, Graham N, Bhalerao R, Zhang H, Casero P, Sandberg G, Bennett MJ. (2003). Dissecting Arabidopsis lateral root development. Trends Plant Sci. 8: 165-171. Coln-Carmona A, You R, Haimovitch-Gal T, Doerner P. (1999). Technical advance: spatio-temporal analysis of mitotic activity with a labile cyclin-GUS fusion protein. Plant Journal 20: 503-508. Dolan L, Janmaat K, Willemsen V, Linstead P, Poethig S, Roberts K, Scheres B (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119: 7184. Dubrovsky J.G. y Rost T.L. (2003) Lateral root initiation. In Brian T., Denis J.M., Brian G.M. (eds) Encyclopedia of Applied Plant Sciences. Pp.1101-1107. Elizarrars-Alcaraz, M. (2005). Efecto del Aluminio en el crecimiento y desarrollo de la raz de Arabidopsis thaliana L. Tesis profesional de Bilogo. Universidad Michoacana. Morelia, Michoacn, Mxico. Jefferson RA, Kavanagh T A. Bevan M W. (1987). Gus fusion: glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plnats. EMBO Journal. 6: 3901-3907. McCully ME (1975) The development of lateral roots. In Torrey JG and Clarkson DT (eds) The Development and Function of Roots, pp. 105124. New York: Academic Press. Meyerowitz, E.M. (1989) Arabidopsis, a useful weed. Cell, 56, 263269. Murashige T, Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 15:473497. Ortiz-Castro R., Martnez-Trujillo M., Lpez-Bucio J., Cervantes C., Dubrovsky J. (2007) Effects of dichromate on growth and root system architecture of Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Science 172: 684691. Pret B, de Rybel B, Casimiro I, Benkova I, Swarup R, Laplaze L, Beeckman T, Bennett MJ. (2009). Arabidopsis lateral root development: an emerging story. Trends Plant Sci. 14: 399408.

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Prasad, M.N.V., Greger M., Landberg T. (2001). Acacia nilotica L. bark removes toxic elements from solution: corroboration from toxicity bioassay using Salix viminalis L. in hydroponic system. Int. J. Phytorem. 3: 289-300. Sntiz-Gmez M. (2006). Efecto del cobre en el crecimiento y desarrollo de la raz de Arabidopsis thaliana L. Tesis profesional de Bilogo. Universidad Michoacana. Morelia, Michoacn, Mxico. Taiz L, Zeiger E (2006) Plant physiology 6a Ed. Sinauer Associates Inc. Usa. 774 pp. Tang, S.R., Wilke, B.M., Brooks, R.R., Tang, S.R. (2001). Heavy-metal uptake by metal-tolerant Elsholtzia haichowensis and Commelina communis from China. Commun Soil Sci. Plant Anal. 32: 895-905. Vargas-Palominos L. (2007). Determinacin de la toxicidad causada por zinc, nquel y plomo mediante el anlisis del crecimiento y actividad mittica de la raz de Arabidopsis thaliana L. Tesis profesional de Bilogo. Universidad Michoacana. Morelia, Michoacn, Mxico.

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EFECTO DEL Cr(VI) EN EL CRECIMIENTO Y EL DESARROLLO DE Nicotiana tabacum L.

Giovana Darinka Mndez Ferreira y Miguel Martnez Trujillo
Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo

RESUMEN
Con el propsito de determinar el efecto del Cr(VI) en Nicotiana tabacum se utiliz un sistema in vitro con medios MS suplementados con sacarosa y diferentes concentraciones de dicromato de potasio. Las plantas se germinaron y crecieron primeramente en medios sin el metal durante una semana y posteriormente se trasplantaron a medios con dicromato, donde se dejaron crecer durante una semana ms. Se realizaron dos experimentos con concentraciones de 0 M a 400 M y de 0 M a 40 M para cubrir diferentes rangos de concentraciones. Se analizaron las siguientes variables: a) Cambios morfolgicos generales de las plantas, b) Morfologa de la raz, b) Morfologa del follaje, d) Peso de la raz y el follaje. Los resultados obtenidos mostraron que slo hay un efecto inhibitorio y no estimulador en las concentraciones utilizadas del metal y que el peso de la raz y el follaje se disminuyen en concentraciones de 40 M o mayores siendo ms sensible el follaje a esta respuesta. Adems se encontr que la disminucin en el tamao de los pelos radiculares se correlacion de manera general con la disminucin del peso de las plantas. Por otro lado, no se encontraron cambios en la morfologa de las clulas epidrmicas de las hojas, lo que sugiere que las afectaciones producidas por el metal en estas estructuras son a nivel bioqumico. De manera general se puede concluir que el tabaco es una planta que puede ser utilizada junto con A. thaliana para estudiar los efectos del Cr(VI) en el crecimiento y desarrollo de las plantas y establecer aspectos generales del efecto del metal en ambas plantas y a la vez determinar diferencias sutiles en la respuesta de estas dos especies.

1.

INTRODUCCIN

Los metales pesados son definidos como aquellos elementos -3 qumicos que presentan una densidad igual o superior a 5g cm cuando estn en forma elemental o cuyo nmero atmico es superior a 66

20 (excluyendo a los metales alcalinos y alcalinotrreos). Su presencia en la corteza terrestre es inferior al 0.1% y casi siempre menor del 0.01%. No obstante, conviene clarificar que el trmino metales pesados es impreciso y se pretende indicar con este trmino aquellos metales que siendo elementos pesados son txicos para el medio ambiente. Sin embargo, en realidad cualquier elemento que a priori es beneficioso para el ambiente, en concentraciones excesivas puede llegar a ser txico (Ivanov et al., 2003). La actividad industrial y minera arroja al ambiente metales txicos, muy dainos para la salud humana y para la mayora de formas de vida. Adems, los metales originados en las fuentes de emisin generadas por el hombre (antropognicas), incluyendo la combustin de nafta con plomo, se encuentran en la atmsfera como material suspendido que respiramos. Por otro lado, las aguas residuales no tratadas, provenientes de minas y fbricas, llegan a los ros, mientras los desechos contaminan las aguas subterrneas. Cuando se abandonan metales txicos en el ambiente contaminan el suelo y se acumulan en las plantas y los tejidos orgnicos. (Duffus, 2002). La abundancia del Cromo (Cr) en la corteza terrestre vara en un rango de 100 a 300 g/g y el suelo puede contener entre 5 y 3000 g/g (Shewry y Peterson, 1976). El Cr(VI) se encuentra de forma natural como constituyente de un mineral llamado crocoita (Irwin et al., 7 1997). La produccin de Cr en el mundo est en el orden de 10 toneladas por ao; el 60-70% se utiliza en aleaciones, incluyendo el acero inoxidable y el 15% es utilizado en procesos qumicos industriales, principalmente el curtido de pieles, en pigmentos y galvanoplastia. Estas aplicaciones (entre otras) incrementan su concentracin en el medio, por lo cual se ha convertido en un serio contaminante del aire, suelo y agua (Armienta-Hernndez y RodrguezCastillo, 1995). El Cr(VI) se considera la forma ms txica de Cr, generalmente 2se encuentra asociado con oxgeno para formar el cromato (CrO4 ) o 2el dicromato (Cr2O7 ) (Cervantes et al., 2001; Shanker et al., 2005). Esta forma del Cr es un fuerte agente oxidante y en presencia de materia orgnica es reducido a Cr(III), el cual forma xidos, hidrxidos o sulfatos, siendo una forma menos mvil y txica (Zayed et al., 1998). No se conoce mucho acerca de los mecanismos de resistencia a cromato en plantas. La aplicacin de la ingeniera gentica ha sido empleada para generar especies resistentes a metales pesados como

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Hg, Cd, Al, Ni, Pb y Zn, para efectos de biorremediacin de suelos contaminados (Herrera-Estrella et al., 2001). Estudios con Arabidopsis thaliana revelaron que concentraciones de 400 M de dicromato de potasio reducen en un 60% la germinacin, mientras que a 800 M la germinacin se nulifica. Una concentracin relativamente baja de dicromato de potasio (100 M) caus un incremento significativo en la produccin de biomasa tanto de raz como de follaje, y por el contrario, concentraciones altas (de 400 a 800 M) redujeron dramticamente el peso fresco de la planta, produciendo adems un amarillamiento de las hojas. La arquitectura de la raz tambin se vio afectada por la presencia de Cr en el medio; la exposicin a 100 M de dicromato caus un incremento en la longitud de los pelos radicales en ms de 40 veces respecto al control sin dicromato; concentraciones mayores de 100 M de dicromato ocasionaron una disminucin en el crecimiento de la raz primaria (RP), y a 200 M se detuvo el crecimiento de la RP y se desarrollaron ms races laterales. Tambin se report una reduccin de la longitud en la zona de crecimiento de la raz primaria, as como el engrosamiento de las races primaria y lateral a 200 M. (Ortiz-Castro et al., 2006, 2007). Es necesario conocer el efecto del cromo en especies vegetales ms cercanas a algunos cultivos de importancia agronmica, para tener datos sobre la toxicidad que puedan extrapolarse a esas especies. Nicotiana tabacum L es una planta herbcea perenne, de la familia de las solanceas, de cuyas hojas se produce la mayor parte del tabaco consumido hoy en el mundo. Es oriunda de Amrica tropical, y est estrechamente emparentada con otras plantas cultivadas comercialmente, como el tomate (Solanum lycopersicum) y la papa (Solanum tuberosum). La raz tiene una organizacin similar a la de Arabidopsis thaliana, aunque con mayor nmero de clulas en cada regin y por lo tanto mayor complejidad (Figura 1). En este trabajo se analiz el efecto de diferentes concentraciones de Cr en el crecimiento y desarrollo del tabaco encontrndose algunas diferencias con relacin a A. thaliana. ,

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Figura 1. Raz de Nicotiana tabacum L. Se observa una transicin entre la caliptra y el meristemo, as como un cilindro central, en el que se estn formando los tejidos conductores.

2. MATERIALES Y MTODOS
Material biolgico Semillas de Nicotiana tabacum L. var. Xanthi

Desinfeccin de semillas de tabaco La desinfeccin se realiz por medio de los siguientes pasos: Tomar 1000 M de etanol al 95% y dejar 10 minutos Decantar Adicionar 1000 l de Cloralex + 0.2 % de Tween 20 (o tritn X-100) y dejar 15 minutos

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Adicionar agua (llenar el tubo) estril para diluir el cloro Enjuagar 3 veces con agua estril Resuspender con agua (700 l) 0 Dejar en refrigeracin a 4 C por 24 horas Preparacin del medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) Para 1 litro: Vaciar un lt de agua tridestilada en un matra Pesar 20 g de sacarosa comercial y sevaciar al agu Pesar 2.2 g de sales MS (Phytotechnology) y vaciar al agua Pesar 2.5 g de Gelrite y agregar a la solucin Ajustar el pH a 5.7-5.8

Condiciones de crecimiento de plantas Las semillas de N. tabacum se sembraron y crecieron en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) al 0.5X y con 2% de sacarosa y 1% de agar para plantas, sin dicromato de potasio. Las condiciones de crecimiento fueron de acuerdo a la temperatura ambiental del laboratorio y con un fotoperiodo de 12 horas luz y 12 horas oscuridad. Posteriormente las plntulas se trasplantaron a medio MS con diferentes concentraciones de Cr (VI).

Preparacin de solucin stock de Cr Se disolvieron 0.29 g de dicromato de potasio en 10 ml de agua para obtener una solucin 0.1 M. Se guard a -4C, cubierto con papel aluminio.

Medio MS slido (Murashige y Skoog, 1962) con Cr a diferentes concentraciones Se prepararon 500 ml de medio MS. Se reparti el medio en 5 matraces (100 ml por cada matraz). Se pes por separado el Gelrite y se agreg a cada matraz. Se agreg al medio las diferentes concentraciones de cromo de acuerdo a la tabla siguiente:

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Concentracin (M) 0 50 100 200 400

Cantidad en l del stock 0.1 M de dicromato de potasio 0 50 100 200 400

Se ajust el pH a 5.7-5.8 Se esteriliz el medio en autoclave Se vaci en cajas de Petri y se esper hasta su solidificacin para posteriormente trasplantar Debido a que los resultados no fueron concluyentes, se realiz un segundo experimento con concentraciones de cromo ms bajas (10 M, 20 M, 30 M y 40 M).

3. RESULTADOS
Para determinar el efecto del Cr(VI) en el crecimiento y desarrollo de Nicotiana tabacum L., se utiliz un sistema in vitro con medio MS, sacarosa y diferentes concentraciones de cromo. Este sistema permiti tener un control sobre los factores nutrimentales, pH, luz y temperatura, as como un mejor crecimiento de las plantas.

Efecto del Cr(VI) en el crecimiento de N. tabacum L Para determinar el efecto del cromo en crecimiento de Nicotiana tabacum se dejaron crecer las semillas en medios MS durante una semana, para ser trasplantadas al medio MS con cromo con las diferentes concentraciones del metal, donde se dejaron crecer durante otra semana. Como se puede apreciar en la figura 2, en el experimento de 0 a 40 M el crecimiento aparentemente no se vio disminuido, al menos en el anlisis morfolgico. En el experimento de 0 a 400 M la disminucin fue apreciable a partir de 100 M y se vio afectado notablemente en las concentraciones mayores. Se observ 71

un amarillamiento en el follaje (clorosis) de manera progresiva con el aumento de la concentracin del cromo, lo que fue notable a partir de 200 M.

Efecto del Cr(VI) en la morfologa de la raz de Nicotiana tabacum L Para determinar cambios anatmicos de la raz se observ el desarrollo radicular al microscopio estereoscpico. El cambio ms notable consisti en la disminucin del tamao y el nmero de los pelos radiculares, ya que a 200 M y 400 M hay una disminucin en las dos variables mencionadas (Figura 3). Esto sugiere que la disminucin del crecimiento de las plantas en el medio con Cr se debe al menos en parte a la disminucin del tamao y nmero de los pelos radiculares, ya que estas estructuras son las que permiten absorber el agua y los nutrimentos del sustrato.

Efecto del Cr(VI) en la morfologa de las clulas de las hojas de N. tabacum L La morfologa de las hojas y de las clulas de stas se analiz al microscopio compuesto. En cuanto al tamao y acomodo de las clulas foliares en estas figuras tanto en el haz como en el envs, no se apreciaron cambios por efecto del metal. Las figura 4 muestra la imgenes de las hojas en la regin del envs en plantas transferidas a medios con concentraciones de 0, 50, 100, 200 y 400 M de dicromato de potasio.

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Figura 2. Plantas de N. tabacum con diferentes concentraciones de dicromato de potasio. Las semillas fueron germinadas y desarrolladas en medio MS durante una semana y posteriormente trasplantadas a los medios con Cr donde se dejaron crecer una semana ms. La concentracin se indica como micromolaridad. A y B corresponden a diferentes experimentos.

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Figura 3. Races de N. tabacum con diferentes concentraciones de dicromato de potasio. Las semillas fueron germinadas y desarrolladas en medio MS durante una semana y posteriormente trasplantadas a los medios con cromo donde se dejaron crecer una semana ms. La concentracin se indica como micromolaridad. Las fotografas fueron tomadas al microscopio estereoscpico a 32X. A y B corresponden a diferentes experimentos.

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Figura 4. Morfologa de las hojas y de sus clulas de la regin del envs de N. tabacum en concentraciones de 0 a 400 M de dicromato de potasio. Las semillas fueron germinadas y desarrolladas en medio MS durante una semana y posteriormente trasplantadas a los medios con cromo donde se dejaron crecer una semana ms. La concentracin se indica como micromolaridad. Las fotografas fueron tomadas al microscopio compuesto con los aumentos indicados en la parte superior. 75

Efecto del dicromato de potasio en el peso de la raz y el follaje de N. tabacum L En un primer experimento se determin el peso del follaje y de la raz en plantas crecidas en concentraciones de 0 a 400 M. Los resultados obtenidos (figura 5), muestran que el peso de la raz se disminuye desde la concentracin de 50 M conservando slo el 20% del peso con relacin a las plantas sin el metal. En las concentraciones mayores, el peso disminuye gradualmente y en 400 M es slo de 2% aproximadamente. En el follaje tambin hay una disminucin del peso pero en menor magnitud con relacin a la raz, ya que a 50 y 100 M se conserva aproximadamente el 50% del peso de la raz; el incremento de Cr a 200 y 400 M reducen a slo un 12% el peso de este rgano. Para determinar si a concentraciones menores de 50 M se presentaba una estimulacin por el Cr(VI), se realiz un segundo experimento (figura 6): Los resultados muestran que el peso del follaje se mantiene sin cambios significativos hasta 30 M y slo a 40 M hay una disminucin del peso, conservndose un 60% de ste con relacin al control sin el metal. En lo referente a la raz hay una disminucin del peso en la concentracin de 40 M, conservndose alrededor de un 80% del peso original.

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Figura 5. Peso de la raz y el follaje de N. tabacum en concentraciones de 0 a 400 M de dicromato de potasio. Las semillas fueron germinadas y desarrolladas en medio MS durante una semana y posteriormente trasplantadas a los medios con cromo donde se dejaron crecer una semana ms. La concentracin se indica como micromolaridad. Las barras representan el intervalo de confianza para = 0.05. El tamao de muestra fue de 15 individuos.

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Figura 6. Peso de la raz y el follaje de N. tabacum en concentraciones de 0 a 40 M de dicromato de potasio. Las semillas fueron germinadas y desarrolladas en medio MS durante una semana y posteriormente trasplantadas a los medios con cromo donde se dejaron crecer una semana ms. La concentracin se indica como micromolaridad. Las barras representan el intervalo de confianza para = 0.05. El tamao de muestra fue de 15 individuos.

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4. DISCUSIN
Debido a que el cromo es un metal txico de uso industrial, en lugares cercanos a donde se practica el curtido de pieles o el cromado de metales para industrias automotrices, como por ejemplo el estado de Guanajuato, ha contaminado las reas de cultivo. La fitotoxicidad del Cr ha sido reportada por varios autores, entre ellos Donghua et al. (1992), pero de acuerdo con otros autores el Cr es un elemento benfico para el crecimiento de la planta a bajas concentraciones. En este trabajo se utiliz un sistema in vitro con medio MS suplementado con sacarosa y diferentes concentraciones de dicromato de potasio. Los resultados obtenidos permitieron analizar adecuadamente varios aspectos de la planta de tabaco en medios con el metal. El desarrollo de las plantas a nivel morfolgico pudo ser observado y detectar disminucin en el tamao de la raz en concentraciones de 100 M o mayores. Esta disminucin pudo ser apreciada a mayor detalle analizando el peso de las plantas tanto en la raz como en el follaje y se pudo determinar que desde concentraciones de 40 M hay disminucin del peso tanto de la raz como del follaje, siendo ms afectada en proporcin la raz con respecto al follaje. Lo anterior puede deberse en parte al contacto ms directo de la raz con el medio para la captacin de nutrimentos. No obstante que en A. thaliana se ha observado un efecto estimulador del dicromato de potasio en el peso del follaje y la raz en concentraciones entre 100 y 150 M (Ortiz Castro et al., 2007), en tabaco no se encontr este comportamiento, lo que puede deberse a diferencias en la afinidad de los sistemas de captacin de metales. Los pelos radiculares son clulas diferenciadas que permiten aumentar la superficie de absorcin de las races y se pueden inducir bajo condiciones de baja disponibilidad de P y Fe. Ortiz-Castro et al. (2007) encontraron que el Cr a concentracin de 200 M aumenta la longitud de los pelos radiculares, lo que contrasta con lo encontrado en este trabajo ya que existi una inhibicin apreciable en el tamao y nmero de estas estructuras a partir de la concentracin de 200 M. Esto demuestra que existen respuestas diferentes de las plantas al Cr dependiendo de su concentracin, lo que puede ser debido a factores internos como concentraciones de hormonas. Aunque hubo una disminucin significativa en el peso del follaje a partir de concentraciones bajas desde 40 M, no se

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observaron cambios en el tamao, acomodo o morfologa de las clulas epidrmicas de las hojas, tanto del haz como del envs. Esto puede indicar que las alteraciones en el follaje en las concentraciones de Cr analizadas se presentan a nivel bioqumico como puede ser la afectacin de la fotosntesis, ya que en las concentraciones mayores de 400 M se observ un amarillamiento de las hojas. En sntesis, el tabaco es una planta que puede ser utilizada junto con A. thaliana para estudiar los efectos del Cr(VI) en el crecimiento y desarrollo de las plantas y establecer aspectos generales del efecto del metal en ambas plantas y a la vez determinar diferencias sutiles en la respuesta de estas dos especies.

5. CONCLUSIONES
a) El tabaco es una planta que puede ser utilizada como modelo para estudiar el efecto del Cr(VI) en condiciones in vitro. b) Slo se encontr un efecto inhibitorio y no estimulador en las concentraciones utilizadas del metal. c) El peso de la raz y el follaje se disminuye en concentraciones de 40 M o mayores. d) La disminucin en el tamao de los pelos radiculares se correlacion de manera general con la disminucin del peso de las plantas. e) No se encontraron cambios en la morfologa de las clulas epidrmicas de las hojas, lo que sugiere que las afectaciones producidas por el metal en estas estructuras son a nivel bioqumico.

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REFERENCIAS
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Ortiz-Castro R, Martnez-Trujillo M, Lpez-Bucio J, Cervantes C. (2007) Effects of dichromate on growth and root system architecture of Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Science 172: 684-691. Shanker AK, Cervantes C, Loza-Tavera H, Avudainayagam S. (2005). Chromium toxicity in plants. Environ. Int. 31: 739-753. Shewry PR, Peterson PJ. (1976) Distribution of chromium and nickel in plants and soil from serpentine and other sites. J. Ecol. 64: 195-212. Zayed A, Lytle CM, Qian JH. Terry N. (1998) Chromium accumulation, translocation and chemical speciation in vegetable crops. Planta 206: 293-299.

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CULTIVOS MONOESPECFICOS DE HONGOS MICORRZICOS ARBUSCULARES PROVENIENTES DE HUERTAS DE AGUACATE DE MANEJO ORGNICO Y MANEJO CONVENCIONAL, CON FINES DE SER UTILIZADOS COMO BIOINOCULANTES
Eduardo Jernimo Trevio , Mara de los ngeles Beltrn Nambo , 2 3 Luca Varela Fregoso , Mayra E. Gavito Pardo y Yazmn Carren 1 Abud .
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Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo, 3 Hongos y Asociados A.C., Universidad Nacional Autnoma de Mxico

RESUMEN
Los Hongos Micorrzicos Arbusculares (HMA) han sido utilizados en la agricultura, a manera de bioinoculantes ya que favorecen la absorcin de nutrimentos esenciales como el fsforo y el nitrgeno, la absorcin de agua y ayudan a la planta brindndoles proteccin contra organismos patgenos. Para obtener xito en la simbiosis entre el hongo y la planta es indispensable hacer una seleccin de la especie micorrzica a inocular y el cultivo puro tiene diversas ventajas y aplicaciones: en el control de calidad de inculo producidos, en el control de la variabilidad intraespecfica en diseos experimentales, en estudios de ontogenia y taxonoma. Por lo que en este trabajo se aislaron HMA de la rizosfera de aguacate en Huertas de manejo orgnico y convencional con fines de ser utilizados como bioinoculantes. Se extrajeron 15 morfotipos de los que se lograron identificar 12 a nivel de gnero y especie, 3 no se pudieron identificar aunque muestran afinidad con Glomus. La diversidad de especies de HMA encontradas coincide con los valores reportados para suelos que presentan perturbacin y debido a que las cuatro zonas analizadas han sufrido procesos de cambios en el uso de suelo de bosque a huertas y que el establecimiento del tipo de manejo orgnico es muy reciente no se encontraron evidencias contundentes que indiquen que el tipo de manejo ha influido sobre el aumento o prdida de esta diversidad. De la propagacin en cultivos mono especficos en minirizotrn se obtuvo un 27.2% de xito con tres especies repropagadas de las 11 seleccionadas, R. aff. intraradices, S. rubifomis y Glomus sp 1, por lo que este sistema prob ser ms efectivo que otros mtodos empleados que reportan porcentajes menores. S. rubiformis tuvo un 18.75% de xito en relacin al nmero de rplicas, 83

Glomus sp 1 10% y R. aff. Intraradices 7.7%. El consorcio de Glomus sp. y R. aff. intraradices fue altamente infectivo con valores del 75.3% de colonizacin desde las primeras etapas, alcanzando el 95% al final del experimento en comparacin con el cultivo puro de S. rubiformis que mostr porcentajes inferiores al 12% durante las primeras etapas y de 58.4% al final del experimento. No todas las especies de HMA probadas lograron establecer la colonizacin debido probablemente al tipo de planta trampa utilizado.

1.INTRODUCCIN
Los hongos micorrzicos arbusculares (HMA) han sido estudiados intensamente en los ltimos aos, debido por una parte a que interactan simbiticamente con cerca del 80% de las familias de plantas terrestres con las cuales son capaces de formar Micorrizas Arbusculares (MA), encontrndose en casi todos los ecosistemas terrestres (Smith y Read, 1997) y por otra parte, debido a la diversidad de mecanismos morfolgicos, fisiolgicos y ecolgicos que presentan (Simon et al., 1993). Su origen se remonta al periodo Devnico hace unos 400 millones de aos, cuando segn evidencias fsiles (Taylor et al. 1995) y moleculares (Simon et al. 1993), se asociaron a las primeras plantas terrestres haciendo posible su adaptacin a las nuevas condiciones ambientales que implicaban el paso de un ambiente acutico a uno terrestre (Malloch et al., 1980). Desde entonces los HMA y las plantas han evolucionado en una estrecha relacin. Quiz sea esta evolucin conjunta la causa de una de las caractersticas principales de este tipo de hongos, que es su biotrofa obligada (Cornejo, 2006), siendo sta una de las principales limitantes del estudio de este grupo de hongos, ya que no es posible su multiplicacin en condiciones axnicas (Bago et al., 2000). La biotrofa obligada condiciona a que el hongo tenga la necesidad de encontrar y colonizar una raz hospedera para poder continuar su crecimiento y completar su ciclo de vida, que culmina con la formacin de nuevos propgulos viables, como las esporas (AzcnAguilar et al., 1998). Estos hongos, han sido utilizados en la agricultura, a manera de bioinoculantes ya que favorecen la absorcin de nutrimentos esenciales como el fsforo y el nitrgeno, la absorcin de agua y ayudan a la planta brindndoles proteccin contra organismos patgenos. Para obtener xito en la simbiosis entre el hongo y la planta es indispensable hacer una seleccin de la especie micorrzica 84

a inocular, ya que las diversas especies tienen comportamientos diferentes dependiendo del hospedante con el que se asocie por lo que es importante conocer los Hongos Micorrzicos de agroecosistemas especficos para reintroducirlos en dichos hbitats y promover el crecimiento vegetal, sobre todo en suelos que presentan grados de disturbio. La multiplicacin de esporas a partir de una o varias esporas iniciales tiene diversas ventajas y aplicaciones: en el control de calidad de los inculos producidos para distintos fines; en el control de la variabilidad intraespecfica en diseos experimentales; para obtener material con un elevado control de calidad para estudios fisiolgicos e in vitro. Dado que las esporas son la entidad ms conveniente de control, ya que es la unidad taxonmica por excelencia, las tcnicas de propagacin de hongos arbusculares se reduce significativamente al cultivo monoespecfico multiesprico o monosprico (Ortega-Larrocea et al., 2008). Es por eso que se hace necesario extraer del suelo de inters dichos hongos, para repropagarlos y despus utilizarlos como bioinoculantes en los agroecosistemas con plantas micotrficas afines y compatibles con la flora micolgica del suelo.

2. MATERIALES Y MTODOS
Ubicacin y descripcin de sitios de muestreo El estudio se realiz en la ciudad de Uruapan, localizada en el municipio del mismo nombre en el estado de Michoacn. La ciudad se ubica entre los paralelos 19 11 y 19 38 de latitud Norte y los meridianos 101 56 y 102 24de longitud Oeste, con una altitud entre los 700 y 3300 msnm (Figura 1). El clima que se reporta es Templado Subhmedo con lluvias en verano; los suelos dominantes en la regin son Andosol (51.98%), Leptosol (15.99%), Luvisol (13.98%), Cambisol (6.59%), Phaeozem (3.76%), Regosol (1.71%) y Vertisol (0.19%). La vegetacin original es Bosque (54.19%), pastizal (4 %) y selva (5.47%) y el uso de suelo es para la agricultura (30.57%) y zona urbana (5.57%) (INEGI, 2009).

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Figura 1. Ubicacin del rea de estudio y sitios de muestreo. Mapa elaborado por Beltrn A. a partir de imgenes georeferenciadas (Google earth, 2011). Se colectaron muestras de suelo de dos huertas de aguacate localizadas a las afueras de la zona urbana de la ciudad de Uruapan, una denominada Huitzichio y la otra el Puerto, en las cuales se lleva a cabo un manejo convencional y orgnico dentro de la misma huerta. La superficie de la primera huerta est ubicada en las coordenadas 19 27 09. 48 N, 102 00 52.35 O, aproximadamente a 1.81 km al noreste de la ciudad de Uruapan y a una altitud de 1836 msnm; las coordenadas de la segunda huerta son 19 22 07.51 N, 102 01 27.88 O, a una altura de 1631 msnm, a 3.81km hacia el sureste de la misma ciudad (Figura 2).

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Figura 2. Mapa de acceso y ubicacin de sitios de muestreo. Mapa elaborado por Beltrn A. a partir de imgenes referenciadas (Google earth, 2011).

La edad de la huerta Huitzichio es de 30 aos aproximadamente, el tipo de suelo predominante es Andosol, la vegetacin original corresponda a bosque de pino y posteriormente se realiz el cambio de uso de suelo para el cultivo de maz. Actualmente esta superficie se destina al cultivo de aguacate en su mayor parte, aunque existen pequeas reas de hortalizas para el cultivo de chile, caf y jitomate para autoconsumo. El riego que se realiza es el de temporada y en las zonas de manejo convencional se aplican fungicidas de las marcas Troxil, Caldo Bordelex y pesticidas Paration y Malatin, la distancia promedio entre cada rbol es de 10 x 10 m. Las zonas de uso orgnico anteriormente eran tratadas con agroqumicos y a partir del 2002 se cambi el tipo de manejo utilizando para su fertilizacin aditamentos de tipo orgnico como lombricomposta y guano de murcilago y para el control de plagas se adiciona cal perla, jabn en polvo marca ROMA, as como ajo molido y chile (Figura 3).

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Figura 3. Aspecto de la huerta de aguacate orgnica Huitzichio en donde se observan plantas de caf como parte de la vegetacin secundaria que es mucho ms densa en los sitios con este tipo de manejo. La edad de la huerta El Puerto es de 26 aos aproximadamente, el tipo de suelo es Cambisol y al igual que la anterior la vegetacin original corresponda a bosque de pino, realizndose el cambio de uso de suelo para el cultivo de aguacate. A partir del ao 2000 una zona de la huerta se maneja con productos orgnicos. Para el control de plagas en esta zona se aplican preparados especiales y/o melaza. En la zona de uso convencional se adicionan agroqumicos (Figura 4).

Figura 4. Aspecto de la huerta convencional El Puerto en donde se observa la poca presencia de vegetacin secundaria asociada a los rboles. 88

Colecta de muestras De cada una de las huertas se colectaron 10 Kg de suelo de la zona de uso orgnico y 10 Kg de la de uso convencional, las muestras se tomaron de la rizosfera de los arboles a una profundidad de entre 10-30 cm, realizando el muestreo al azar cubriendo toda el rea correspondiente a cada zona. El material colectado se transport en costales debidamente etiquetados. Una vez en el laboratorio las muestras se secaron a temperatura ambiente y se almacenaron a 4C para su posterior procesamiento y revisin. Aislamiento y seleccin de esporas A partir de las muestras obtenidas en el suelo directo de las huertas de aguacate se procedi a separar las esporas por el mtodo de tamizado hmedo y decantacin (Gerdemann y Nicolson, 1963), con modificaciones, seguido por centrifugacin en gradiente de sacarosa al 60% (Walker, 1997). En trminos generales, se trata de un mtodo basado en la suspensin de una muestra de suelo en agua corriente pasndola ms de dos ocasiones a travs de varios tamices de dimetro descendiente. Se utilizaron tamices con abertura de malla de 1 mm, 400 m y 40 m para aislar esporas de diversos tamaos. El mtodo de tamizado hmedo y decantacin permite la extraccin de esporas en alto porcentaje y el mtodo de centrifugacin en gradiente de sacarosa mejora la separacin de las esporas del suelo y del material orgnico para facilitar el aislamiento e identificacin. Una vez aisladas las esporas se procedi a seleccionar esporas viables considerando caractersticas fsicas como apariencia, brillo y turgencia, observables con ayuda de un microscopio estereoscpico. Las esporas se separaron por morfotipos, en base a tamaos, color, forma y presencia/ausencia de hifa de sostn en tubos ependorff con solucin de azida de sodio al 0.05% y mantenidas en refrigeracin hasta su inoculacin. Cultivo en Minirizotrn El bajo xito en la obtencin de cultivo monospricos de hongos arbusculares (menor al 10% y usualmente entre 1 y 2%) los han hecho poco utilizados como mtodos de propagacin mono especficos. Por lo que se utiliz una metodologa que incrementa las probabilidades de obtencin de cultivos monospricos. El sistema a manera de minirizotrn consiste de cajas de Petri en donde se mantiene el cocultivo por dos a tres meses y permite obtener un 50% 89

aproximadamente de unidades colonizadas (Ortega-Larrocea et al., 2008). Es posible que en estas condiciones se promueva la colonizacin al restringir el rea de crecimiento de las races, incrementar la concentracin de CO2 de la atmosfera del sustrato y con ello promover la ramificacin de las hifas germinativas incrementando la posibilidad de colonizacin. Pasado este tiempo, el sistema se trasplanta a macetas con el mismo sustrato en donde se incrementa el volumen del mismo y se promueve un mayor desarrollo vegetal, estimulando la esporulacin. Las unidades permanecen durante tres meses en bolsas de polietileno para evitar contaminacin cruzada. Otros factores de igual importancia son la propagacin previa de las esporas para obtenerlas en un buen nmero y calidad, su almacenamiento en frio para estimular la germinacin, la calibracin de las condiciones ptimas de textura y humedad de los sustratos y la seleccin del hospedero adecuado para el crecimiento en caja Petri. Para realizar la inoculacin se seleccionaron aquellos morfotipos aislados que presentaron mayor abundancia de esporas con la finalidad de repropagar la mayor cantidad de rplicas posibles de un mismo inoculo (Cuadro 1). En cada caja de Petri se inocularon de 8 a 10 esporas morfolgicamente iguales, utilizando como planta trampa Brachiaria decumbens Var. Seal, y como sustrato se utiliz suelo orgnico estril procedente de CINVESTAV Irapuato mezclado con vermiculita en proporcin 3:1. Las cajas se sellaron y cubrieron con papel aluminio. El sistema se mantuvo por un periodo de tres meses regando una vez por semana con jeringas de 10 ml, en cmara de luz con un fotoperiodo de 12 horas luz/obscuridad. Despus de este tiempo se extrajeron algunas races de cada una de las cajas y se analiz la colonizacin, aquellas cajas que resultaron positivas se llevaron a la segunda etapa de repropagacin en maceta trampa.

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REPROPAGACIN

PROPAGACIN

CONTEO DE ESPORAS/GR DE SUELO

Huerta Huitzichio

Huerta El Puerto

Orgnica A Conven -cional A Orgnica B Convencional B

3a5

3a5 3a5 3a5

3a5 rplicas 3a5 rplicas 3a5 replicas 3a5 rplicas

3 tubos 3 tubos

3 tubos 3 tubos

3 rplicas x morfotipo al final del experimento

90 observaciones mensuales por morfotipo

Cuadro 1. Diseo experimental para la propagacin de cultivos mono especficos en sistema de minirizotrn (Fase 1) y maceta trampa (Fase 2).

Cultivo en macetas trampa Para el montaje del sistema se utilizaron tubos de 30 cm de largo por 2.5 cm de dimetro con capacidad aproximada de 100 g, los cuales se lavaron y desinfectaron con cloro al 10%; se utiliz el mismo tipo de sustrato empleado para la etapa de minirizotrn y como planta trampa se utilizaron plantas con abundante sistema radical perennes como fue el pasto (Brachiaria decumbens Var. Seal) y planta de ciclo de corto que fue el jitomate (Licopersicum sculentum). Este mtodo de propagacin de inoculo es el ms comnmente utilizado para la propagacin de los HMA y su capacidad de produccin depende del tamao del recipiente utilizado as como del nivel de escalamiento que se planee. La seleccin de la planta trampa y sobre todo el sustrato de 91

DETERMINACIN DE % DE COLONIZACIN

SITIOS DE MUESTREO

RPLICAS

Fase 1 Minirizotrn

ZONAS

Fase 2 Macetas trampa

crecimiento tiene especial importancia en la esporulacin de los hongos. El sistema se mantuvo por dos meses, regando una o dos veces por semana a capacidad de campo, dependiendo de las condiciones ambientales y cuando las condiciones fsicas de las plantas lo requirieron se adicion solucin nutritiva de Long-Ashton baja en fsforo (Varela y Hernndez 1997). Pasado este tiempo se dej de regar y una vez seca la parte area la planta fue cortada para dejar secar el suelo y promover la esporulacin.

Determinacin de porcentaje de colonizacin micorrzica y cuantificacin de esporas Durante el tiempo de repropagacin en sistema en maceta se hicieron extracciones mensuales de races de las plantas asociadas con los diferentes inculos para observar colonizacin micorrzica mediante su tincin con azul de Tripano (Phillips y Hayman, 1970) y observacin al microscopio electrnico de las estructuras caractersticas de esta asociacin (hifas, arbsculos y vesculas) y se determin el porcentaje de colonizacin mediante la tcnica de McGonigle et al. (1990). Los resultados fueron reportados como valores promedios por tipo de inculo. Se realiz el conteo de esporas de los hongos micorrzicos arbusculares repropagados que mostraron colonizacin. Se tomaron muestras de 1 g del sustrato de repropagacin y se procedi a separar las esporas por el mtodo de tamizado hmedo y decantacin (Gerdemann y Nicolson, 1963), junto al de centrifugacin en gradiente de sacarosa al 60% (Walker, 1997). Una vez recuperadas las esporas se realiz el conteo con ayuda de un microscopio estereoscpico. Se hicieron conteos por triplicado en cada uno de los inculos que resultaron positivos en la colonizacin y el nmero de esporas presentes por gramo de suelo se obtuvo de promediar los tres valores correspondientes. Los valores obtenidos para porcentaje de colonizacin se sometieron a pruebas estadsticas de ANOVA y Tuckey utilizando el programa JMP versin 6.0.

Montaje e identificacin taxonmica Las esporas aisladas se separaron en grupos discretos en base a caractersticas morfolgicas tales como: tamao, color, hifa de sostn y ornamentacin principalmente. Con las esporas obtenidas se elaboraron preparaciones permanentes. Se colocaron un promedio de 92

10 esporas en el centro y un extremo del portaobjetos. En cada uno de los grupos de esporas se coloc una gota de lquido de montaje PVLG (Alcohol Polivinilico Lactoglicerol) y a uno de los grupos se le adicion Reactivo Melzer mezclando con el PVLG. Las esporas se cubrieron con cubreobjetos haciendo una ligera presin en la superficie del grupo teido con reactivo Melzer para romper las esporas y poder observar la reaccin al mismo. Las preparaciones se secaron a temperatura ambiente por tres das antes de obsrvalas al microscopio. La identificacin de especies se realiz con ayuda del Manual para la identificacin de Hongos Micorrizgenos Arbusculares (Shenck y Perez, 1990), as como literatura especializada que incluye las descripciones originales y la informacin de las bases de datos del INVAM (2010) y de Glomeromycota AMF PHYLOGENY (2011). Para la observacin de los montajes se utiliz un microscopio compuesto Carl Zeiss, Axiostar Plus 1169-149. Las preparaciones se sellaron y etiquetaron y se realiz toma de fotografas de cada ejemplar identificado. La identificacin se realiz en una primera etapa con esporas extradas del suelo colectado y posteriormente se corrobor la identidad de las especies una vez repropagadas por extraccin de esporas de los cultivos puros obtenidos.

Depsito de ejemplares propagados e identificados en el SUBNARGEM Los ejemplares que se lograron propagar e identificar en cultivos mono especficos, sern depositados en el Subsistema de Recursos Genticos Microbianos, dependiente del COLPOS Y SAGARPA, para su mantenimiento y conservacin. Para lo cual el sustrato de repropagacin con esporas, micelio y trozos de races fueron almacenados en bolsas de plstico Sellapack, etiquetadas segn los criterios establecidos por el INVAM y mantenidos en refrigeracin a 4C hasta su entrega o nueva repropagacin. Las preparaciones fijas tambin se etiquetaron, sellaron y almacenaron en cajas de plstico especiales para preparaciones fijas.

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3. RESULTADOS Y DISCUSIN
Aislamiento, seleccin e identificacin taxonmica de HMA de suelos directos provenientes de dos sitios de Huertas de manejo convencional y orgnico Se extrajeron esporas del suelo directo recolectado de las zonas de manejo orgnico y convencional de las dos huertas de aguacate analizadas, de las que se lograron identificar 12 morfotipos a nivel de gnero y especie, quedando 3 que no se pudieron identificar para hacer un total de 15 morfotipos extrados. La descripcin de las especies y morfoespecies identificadas se describen a continuacin y es importante mencionar que se reportan en base a la nueva clasificacin propuesta por Schler y Walker (2010) a partir de analisis filogenticos moleculares y segn la cual especies como Glomus intraradices, G. geosporum y G. rubiforme cambian de gnero. Acaulospora delicata Walker et al. (1986) Estas esporas presentan un color que va de subhialinas (0-5-100) a amarrillo plido con tinte verde (0-5-20-0), tienen una forma globosas a subglobosas, su tamao va de 80 a 120 m. Su pared consta de dos capas. En la madurez esta espora se separa del cuello del sculo, esto da a la espora una caracterstica distintiva que es la formacin de una cicatriz, producto de esta separacin (Figura 5a).

Figura 5. Especies pertenecientes a los gneros Acaulospora y Ambispora. a) Acaulospora delicata 40X, en PVLG (la flecha seala la cicatriz caracterstica de este gnero); b) Acaulospora mellea 40X, en reactivo Melzer (las flechas sealan la cicatriz y la reaccin de su pared interna); c) Ambispora leptoticha 40X, en reactivo de Melzer.

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Acaulospora mellea Schenck et al. (1984) Espora solitaria en el suelo, se desarrolla lateramente del cuello del sculo esporfero. Su color va de marrn-naranja plido (0-20-40-0) a oscuro naranja-marrn (0-40-100-10), su forma en la gran mayora es globosa, subglobosas, a veces irregulares. Su tamao varia de 90 a 140 m. En las paredes de la espora claramente se distinguen tres capas (L1, L2, L3), la primera hialina y delgada tambin se define como una pared membranosa, la segunda es una capa compuesta de subcapas finas y adherentes, la tercera capa es de color amarrillo plido, es delgada y un poco flexible cuando se separa de la segunda capa. Su cicatriz mide 8 micras de ancho. Reaccin Melzer, la pared ms interna se torna de color rojo oscuro, sin embargo no siempre se da la reaccin en las esporas (Figura 5b). Ambispora leptoticha Schenck & G.S. Sm.) C. Walker, Vestberg & A. Schler, in C. Walker, Vestberg, Demircik, Stockinger, Saito, Sawaki, Nishmura & Schler, Mycol. Res. 111(2): 148 (2007).Anteriormente Glomus leptotichum N.C. Schenck & G.S. Sm., Mycologia 74(1): 82 (1982), Appendicispora leptoticha (N.C. Schenck & G.S. Sm.) C. Walker, Vestberg & A. Schler, Mycol. Res. 111(3): 255 (2007), Archaeospora leptoticha (N.C. Schenck & G.S. Sm.) J.B. Morton & D. Redecker, Mycologia 93(1): 184 (2001), Pseudoglomus leptotichum (N.C. Schenck & G.S. Sm.) S.P. Gautam & U.S. Patel, The Mycorrhizae, Diversity, Ecology and Applications (Delhi): 10 (2007) (Tomado de Schler y Walker 2010) Esporas de color crema (0-0-15-0) a naranja marrn (0-40-10010), cuando todas las capas de la pared de la espora estn presentes. La forma de las esporas van de globosas a subglobosas, su dimetro es de 160 a 240 m, presentan cuatro capas las cuales pueden o no tener reaccin al reactivo de Melzer. Una caracterstica importante de esta especie es la presencia de un pedicelo, que surge como una rama del cuello del sculo esporfero (Figura 5c). Funneliformis geosporum (T.H. Nicolson & Gerd.) C. Walker & A. Schler comb. nov. Anteriormente: Endogone macrocarpa var. geospora T.H. Nicolson & Gerd., Mycologia 60(2): 318 (1968), Glomus geosporum (T.H. Nicolson & Gerd.) C. Walker, Mycotaxon 15: 56 (1982) (Tomado de Schler y Walker, 2010). Esporas de color Amarillo- marrn (0-10-40-0) a oscuro naranjamarrn (0-30-100-10), siendo las primeras ms frecuentes y variables con el aislamiento, su forma va de globosa a subglobosa, algunas 95

irregulares, su tamao es de 120 a 240 m, la pared de la espora presenta tres capas L1 una capa hialina, L2 una capa rgida que consiste en subcapas adherentes (o lminas), L3 es una capa semirgida a la capa rgida. Su hifa de sostn presenta una forma recta a un poco encorvada. No presentan reaccin al Melzer. Las esporas de este gnero presentan un tabique recurvado de 00-30 m que inicia desde el punto de unin con la espora (Figura 6a).

Figura 6. Especies pertenecientes a los gneros Funneliformis, Rhizophagus y Sclerocystis. a) Funneliformis geosporum 40X, en reactivo Melzer (la flecha seala detalle de la hifa sostn); b) Rhizophagus aff. Intraradices 40X, en reactivo Melzer (la flecha seala la coloracin rosada adquirida por reaccin al reactivo); c) Esporocarpo de Sclerocystis rubiformis 40X, en reactivo Melzer (la flecha seala detalle de la pared). Rhizophagus aff. intraradices (N.C. Schenck & G.S. Sm.) C. Walker & A. Schler (2010) comb. nov. Anteriormente Glomus intraradices N.C. Schenck & G.S. Sm., Mycologia 74(1): 78 (1982) (Tomado de Schler y Walker 2010). Esporas solitarias, globosas a subglobosas, de color amarillo paja (00200) a caf amarillento (00400), de 70130 m de dimetro, pared de tres capas, de 7.210.8 m de ancho. La primera capa es hialina evanescente, se tie de color rosa (0 40200) con reactivo Melzer, tiene un grosor de 2.4 m, la segunda capa es unitaria hialina, se tie del mismo color que la primera capa, con el reactivo Melzer y la tercera capa tiene un grosor de 3.9 8.1 m de grosor formada por varias lminas de color amarillo paja (00400). La hifa de sostn es de forma cilndrica, tiene un grosor de 18.0 m en el punto de unin con la espora, la pared est formada de igual manera que la pared de la espora (Figura 6b). 96

Sclerocystis rubiformis Gerd. & Trappe, Mycol. Mem. 5: 60 (1974) Anteriormente: Glomus rubiforme (Gerd. & Trappe) R.T. Almeida & N.C. Schenck, Mycologia 82(6): 709 (1990), Sclerocystis indica Bhattacharjee & Mukerji, in Bhattacharjee, Mukerji & Misra, Acta Bot. Indica 8(1): 99 (1980), Sclerocystis pachycaulis C.G. Wu & Z.C. Chen, Taiwania 31: 74 (1986) (Tomado de Schler y Walker, 2010). Se producen en esporocarpos que van de color amarillo plido (3A3) a caf claro (6D8), tienen forma globosa de 200 a 260 m a ovoide; 100 a 200 x 190 hasta 360 m; sin peridio, esporocarpos formados de 3 a 18 esporas. Las esporas individuales presentan un color amarillo plido (3A3) a caf claro (6D8), su forma va de globosa a subglobosa, (40) 52 (-70) m de dimetro o bien ovoides; 35-45 X 5070 m, presentan una nica hifa de sostn. Su pared est compuesta por dos capas, capa 1 evanescente, hialina, capa 2 laminada de color amarillo plido. En Polonia se ha encontrado en muchos suelos provenientes de diferentes regiones fisiogrficas (Blaszkowski et al. 1998, 2002; Tadych and Blaszkowski 2000 a, b). Esta especie es probablemente unas de las ms ampliamente distribuida en el mundo (Figura 6c). Gigaspora decipiens I.R. Hall & L.K. Abbott (1984) (Tomado de Schler y Walker 2010). Presentan un color de blanco a crema (0-5-30-0), llegando a tomar un color amarillo-marrn (0-10-80-10) con la edad o el almacenamiento prolongado, su forma va de globosa a subglobosa, con un tamao de 280 440 m. La pared de la espora consta de tres capas, las dos primeras son adherentes de igual grosor y la L3 presenta un preludio a la formacin del tubo germinal, esta capa presenta tambin numerosas verrugas o papilas. Presentan reaccin al Melzer. La hifa de sostn se caracteriza por la presencia de un bulbo (Figura 7a).

97

Figura 7. Especies pertenecientes a los generos Gigaspora, Pacispora y Racocetra. a) Gigaspora decipiens 10X, en reactivo Melzer (las flechas sealan detalles de paredes y capas); b) Pacispora sp 100X, en PVLG; c) Racocetra gregaria 10X, en reactivo Melzer (flechas sealan ornamentaciones y hifa de sosten bulbosa).

Pacispora sp Las esporas se forman terminalmente sobre una hifa de sostn, caracterstica que comparten con los gneros Glomus y Paraglomus. El tubo de germinacin se origina de un plato de germinacin que se forma de la pared ms interna. Est constituida de tres capas. La pared de menor espesor de la mayora de las especies de este gnero presentan una sola capa continua y su superficie es suave o adornada. Despus de la diferenciacin completa de la primera capa que suele acompaar a la terminacin de la expansin de las esporas y que es delgada y flexible de color hialina, una segunda capa laminada comienza a formarse, esta capa es hialina, relativamente gruesa, coricea presentan manchas de color rojo a morado en reactivo Melzer. Una vez que se desarrolla completamente la segunda capa se da origen a la tercera. La tercera capa en todas las especies de este gnero es delgada, flexible del mismo color que la segunda capa laminada a la que est adherida por lo cual es muy difcil observar (Figura 7b). Racocetra gregaria (N.C. Schenck & T.H. Nicolson) Oehl, F.A. Souza & Sieverd. (2008) (Tomado de Schler y Walker 2010). Estas esporas se forman por separado en el suelo, rara vez en las races, tienen forma bulbosa y las clulas esporognicas surgen de las hifas terminales del micelio. La pared exterior de la espora est constituida por tres capas: la capa externa es semi-persistente a 98

persistente y rgida, la segunda capa es laminada y delgada y la tercera capa es membranosa, hay presencia de un escudo hialino a incoloro en la superficie interna por debajo de la capa externa de la pared interior, adems presenta ornamentaciones por la formacin de lbulos (Figura 7c). Glomus sp 1 Esporas solitarias con una hifa de sostn cilndrica, generalmente globosas a subglobosas, de color amarillo-claro hialino, su tamao entre 80-160 m, con al menos dos capas, la ms interna presenta reaccin al reactivo de Melzer adquiriendo una tonalidad rosada (Figura 8a).

Figura 8. Esporas pertenecientes al gnero Glomus. a) Glomus sp 1 100X, en PVLG (flecha seala hifa de sostn cilndrica); b) Glomus sp 2 40X, en reactivo Melzer (flecha seala detalle de la pared); c) Glomus sp 3 40X, en reactivo Melzer (flecha seala hifa de sostn recta a ligeramente curva).

Glomus sp 2 Esporas solitarias, generalmente globosas, de color amarillo, su tamao de 80-140 m, con al menos dos capas, la capa ms externa gruesa en las esporas maduras, no presenta reaccin al Melzer (Figura 8b).

Glomus sp 3 Esporas solitarias con hifa de sostn recta a ligeramente curva, de apariencia subglobosas, su tamao promedio va de 167.5 m de 99

largo X 125 m de ancho, su color va de naranja a caf-rojizo, pared externa gruesa no se aprecia la presencia de capas. No presenta reaccin al reactivo Melzer (Figura 8c).

Morfotipo 1 Esporas solitarias con hifa de sostn recta, de apariencia globosa, su tamao promedio es de 102.5 m, su tonalidad vara entre amarillo a caf, pared externa gruesa no se aprecia la presencia de capas (Figura 9a).

Morfotipo 2 Esporas solitarias con hifa de sostn presente, de apariencia globosa, su tamao promedio es de 340 m, las esporas maduras presentan tonalidades que varan de caf a caf-rojiza, pared ornamentada, con dos capas. No presentan reaccin al Melzer (Figura 9b).

Morfotipo 3 Esporas solitarias con hifa de sostn presente, de apariencia globosa, su tamao promedio es de 162.5 m, las esporas maduras presentan color amarillo cremoso, pared laminada, con dos capas. No presentan reaccin al Melzer (Figura 9c).

Figura 9. Morfotipos aislados con algunas de sus caractersticas. a) Morfotipo 1 100X, en reactivo Melzer (flechas sealan hifa de sostn recta y detalle de pared); b) Morfotipo 2 40X, en PVLG (flecha seala detalle de ornamentacin); c) Morfotipo 3 100X, en reactivo Melzer (flechas sealan hifa de sostn y detalle de pared laminada). 100

Por otra parte los resultados obtenidos muestran que en la huerta Huitzichio la riqueza de HMA es mayor en las zonas con manejo orgnico en donde se encontraron 9 especies mientras que en la de uso convencional nicamente se aislaron 5. Mientras que en la huerta El Puerto el tipo de manejo no parece influir sobre la riqueza encontrada ya que el nmero de morfotipos o especies es semejante (6 a 7), pero menor a los valores encontrados en la zona de la huerta Huitzichio con manejo orgnico. Estos resultados pueden explicarse si se considera que en las zonas de uso orgnico de Huitzichio adems del cultivo de aguacate se siembran hortalizas, que permiten entonces una mayor diversidad de especies de plantas y por lo tanto mayores posibilidades de asociacin al existir mayor cobertura vegetal y variedad de la misma (Liu y Wang, 2003). En cuanto a la riqueza total entre huertas, sin considerar tipo de manejo no se observ algn tipo de diferencia que pudiera estar relacionada con otros factores ya que a pesar de que el tipo de suelo es diferente, la riqueza presente fue semejante, 14 para la huerta Huitzichio y 13 para la huerta El Puerto (Cuadro 2).
RANCHO HUITZICHIO
ESPECIE ORGANICA A CONVENCIONA A ORGANICA B CONVENCIONAL B
Sclerocystis rubiformis Funneliformis geosporum Glomus sp 1 Glomus sp 2 Glomus sp 3 Rhizophagus aff. intraradices Acaulospora delicata Acaulospora mellea Ambispora leptoticha Pascispora sp Gigaspora decipiens Racocetra gregaria Morfotipo 1 (naranja lisa) Morfotipo 2 (caf oscura rugosa) Morfotipo 3 (amarillo cremosa) Total de especies/sitio Especies nicas X X X X X X X X X X X X X X X X

RANCHO EL PUERTO

X X X

X X X X X X X 9 4 X 7 2

5 2

6 2

Cuadro 2. Riqueza de especies encontradas en los cuatro sitios de muestreo. Sin embargo la riqueza encontrada en las cuatro zonas es baja si se considera que trabajos previos sealan que la variedad de 101

especies presentes en suelos en buenas condiciones o en ecosistemas naturales poco perturbados vara de 15 a 20 en promedio (Brcenas et al., 2007), lo que parece indicar que los cambios en el uso de suelo a que han sido sometidos los sitios estudiados ha trado como consecuencia la modificacin de factores como el pH, composicin qumica, cubierta vegetal y dinmica en la microbiota, en la que se incluyen los HMA. Se ha demostrado que las prcticas de manejo del cultivo afectan la presencia de los HMA, debido a la destruccin de las hifas, no obstante los efectos de la alteracin del suelo sobre el establecimiento del hongo en las races de las plantas (infectividad) no es claro y parece depender ms de la especificidad de la asociacin planta-hongo (Sanders et al., 1998). La cantidad de morfoespecies encontrada corresponde a lo reportado en trabajos previos que sealan que bajo condiciones de cultivo en campo se han encontrado entre 6 y 15 especies (Brundrett, 1991), pero inferior a lo reportado para huertas de aguacate en el Estado que mencionan la presencia de 16 a 22 morfoespecies (Brcenas et al., 2007; Gmez-Dorantes, 2009). De las 15 especies y/o morfotipos extrados nicamente 5 son compartidas por 2 o ms de las zonas analizadas, 6 son especies nicas para la huerta Huitzichio y 4 son nicas para El Puerto (Cuadro 2). La presencia y ausencia de algunas de estas especies puede estar relacionada principalmente con el ciclo de vida de los diferentes HMA que en ocasiones pueden estar presentes en el suelo sin esporular, as como a las condiciones del suelo generadas por el manejo de la huerta e incluso la historia del suelo del sitio (Gmez-Dorantes, 2009), el cual antes de ser transformado en huertas de aguacate corresponda a bosque de pino. Las especies que comparten los sitios analizados corresponden a los gneros Glomus, Sclerocystis y Funnelifomis, antes incluidas en el gnero Glomus. Sclerocystis rubiformis (antes Glomus rubiforme), Funneliformis geosporum (antes Glomus geosporum) y Glomus sp. 3 se presentaron en las cuatro zonas analizadas, seguidas por Glomus sp. 1 presente en tres sitios. Las dos primeras son especies que han sido reportadas asociadas a plantas de aguacate con mayor abundancia que otras especies junto con Acaulospora laevis y consideradas como especies dominantes (Lara, 2004; GonzlezCorts, 2005; Gmez-Dorantes, 2009), esto es un punto importante a considerar si se pretende elaborar inoculantes con especies nativas para ser utilizado en huertas de aguacate ya que en este trabajo al igual que en investigaciones anteriores la presencia de estas 3 102

especies es consistente, aunque en este caso no se aisl Acaulospora laevis. Los resultados tambin corroboran lo mencionado por otros trabajos referente a que el gnero Glomus es el ms abundante y con mayor nmero de especies en los ecosistemas (Varela y Trejo, 2001) ya que en el presente estudio se aislaron 3 especies y si se considera la clasificacin anterior que incluira a R. aff. intraradices, F. geosporum y S. rubiformis, el nmero aumentara a 6. Adems, los tres morfotipos no identificados presentan caractersticas morfolgicas que los hace afines a este mismo gnero. De los dems gneros encontrados se identificaron 2 especies para Acaulospora y una especie para los otros gneros reportados. En la actualidad los estudios moleculares estn reubicando a los organismos incluidos en este y otros gneros de Glomeromycota (Schler y Walker 2010) y por lo tanto se tendr que analizar si Glomus realmente predomina en las diferentes regiones geogrficas o cual es en realidad el gnero predominante si es que existe alguno. De las especies encontradas en las huertas analizadas todas han sido reportadas asociadas al cultivo de aguacate en trabajos previos realizados en la misma regin de estudio (Lara, 2004; Brcenas et al., 2007; Gonzlez-Corts, 2005; Gmez-Dorantes, 2009).

Propagacin en cultivos mono especficos de los HMA ms abundantes encontrados en los sitios, mediante sistema de minirizotrn Para la propagacin y obtencin de cultivos mono especficos se seleccionaron 11 de las especies o morfotipos encontradas en mayor abundancia en las cuatro zonas muestreadas, incluidas las 4 especies presentes en todos o en 3 de los sitios analizados y A. mellea, que aunque su presencia fue escasa se consider importante repropagar ya que como se mencion anteriormente las especies de este gnero han sido reportadas como abundantes en muchos estudios previos en huertas de aguacate. La seleccin se bas en lo mencionado por otros investigadores que sealan que para la elaboracin de inculos es preferible utilizar endfitos provenientes del mismo ecosistema y con alta afinidad por el hospedero ya que se ha visto que de esta manera se promueven mejores efectos que cuando se introducen especies provenientes de otras regiones (Alarcn y Ferrera-Cerrato, 1999).

103

La cantidad de rplicas de cada una las especies vario dependiendo de la abundancia y cantidad de esporas en buenas condiciones que se lograron aislar. Despus de tres meses de mantenido el sistema se encontr que de las 11 especies colocadas en sistema de minirizotrn nicamente se tuvo xito en la colonizacin en la raz de la planta hospedera y repropagacin de 3 de ellas que fueron R. aff. intraradices, S. rubifomis y Glomus sp. 1, lo que corresponde al 27.2 % del total de especies seleccionadas (Cuadro 3).

Repeticiones

Sclerocystis rubiformis Funneliformis geosporum Glomus sp1 Glomus sp 3 Rhizophagus aff. intraradices Acaulospora delicata Acaulospora mellea Pascispora sp Morfotipo 1 (naranja lisa) Morfotipo 2 (caf oscura rugosa) Morfotipo 3 (amarillo cremosa)

16 13 10 10 13 Caja de Petri 9 X 1.5 cm 1 1 5 1 1 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Brachiaria decumbens Var. Seal

Cuadro 3. Nmero de rplicas y xito de repropagacin despus de 2 a 3 meses en sistema de minirizotrn. 104

Colonizacin
3 cajas X 1 caja X 1 caja X X X X X X

Fotobionte

Microbionte

Produccin de esporas

Mtodo de cultivo

Esto corrobora lo que se ha observado en trabajos previos en los que se menciona que existe un xito muy bajo en la obtencin de cultivos monospricos de HMA, sin embargo estos trabajos utilizaron tcnicas de propagacin diferentes a la utilizada en este estudio obteniendo un porcentaje de xito por especie menor al 10% (OrtegaLarrocea et al., 2008), mientras que con el mtodo de minirizotrn se pudo constatar un aumento en este porcentaje. Esto tal vez pudiera explicarse si se considera que con este sistema se evita la prdida de las esporas inoculadas al momento del riego, que el aumento de CO2 debido al crecimiento de la raz favorece la formacin de hifas al estimular la germinacin de las esporas (Becard y Fortin, 1988) y que se pueden controlar mejor factores externos que pudieran afectar la colonizacin del HMA. Otra ventaja de utilizar este tipo de sistema es que se evitan los riesgos de invasin de otros microorganismos que terminan convirtiendo el cultivo monoaxnico original en un microcosmos multiaxnico (Williams, 1985). Sin embargo al analizar el xito en la repropagacin considerando la cantidad de rplicas por especie el porcentaje fue de 18.75% para S. rubiformis, 10% para Glomus sp. 1 y 7.7 % para R. aff. intraradices, lo que se asemeja a los valores reportados para otros mtodos. Esto se explica si consideramos que este trabajo prob la repropagacin de todas las especies de HMA con una sola especie de planta (Brachiaria decumbens Var. Seal) en esta primer etapa con sistema de minirizotrn y tomando en cuenta que la riqueza y abundancia de HMA en el medio ambiente est relacionada con el grado de micotrofa y fenologa de la planta, con las condiciones ambientales que pueden o no favorecer la colonizacin y con la especificidad en la asociacin (Hernndez-Cuevas et al., 2008). Se puede asumir que el xito en la repropagacin de cultivos mono especficos mediante el sistema utilizado se podra incrementar si se utilizan diversas plantas de crecimiento rpido, ciclos cortos y con alto grado de micotrofa. En otros trabajos se han utilizados especies de plantas como Plantago lanceolatum, Allium cepa, Lycopersicum sculentum, Zea mays y diferentes tipo de pastos, reportando colonizacin en la raz que van del 20 al 90% (Ortega-Larrocea et al., 2008; Lpez, 2009). Al hacer el anlisis de races se observ que el tiempo para que se diera la colonizacin de la raz vari dependiendo de la especie de hongo, de manera que especies como R. aff. intraradices que se ha documentado como altamente infectiva y dominante en los ecosistemas naturales requiri un periodo ms corto para el establecimiento de la colonizacin que otras de las especies 105

seleccionadas y puestas en el sistema, lo que coincide con lo reportado por otros investigadores que sealan que mientras que algunas especies repropagadas en este tipo de sistema la esporulacin an no se daba, en otras apenas iniciaba o ya haba finalizado (OrtegaLarrocea et al., 2008). Por lo que es aconsejable el tomar submuestras de algunas de las cajas antes de ser transplantadas en la segunda fase para verificar colonizacin radical, presencia de micelio y formacin de esporas.

Repropagacin en maceta trampa de los HMA obtenidos por propagacin en sistema minirizotrn y cuantificacin de colonizacin micorrzica en plantas trampa y nmero de esporas en el sustrato Las tres especies que resultaron positivas en la fase 1 de propagacin al analizar colonizacin en races se trasladaron para su repropagacin bajo condiciones de invernadero en maceta trampa utilizando como planta hospedera Licopersicum sculentum y Brachiaria decumbens Var. Seal. Debido al bajo xito en la propagacin en cuanto a nmero de contenedores por especie propagada exitosamente en minirizotrn (3 cajas de S. rubiformis, 1 de Glomus sp. 1 y 1 de R. aff. intraradices) se decidi que en la repropagacin en maceta se unieran Glomus sp. 1 y R. aff. intraradices formando un consorcio y dejando como cultivo mono especfico a S. rubiformis. Cumplidos 2 meses de mantenimiento en este sistema se procedi a analizar porcentajes de colonizacin en base a observacin de las estructuras tpicas, abundancia de esporas y corroboracin de la identidad de las esporas en los dos cultivos obtenidos. Los resultados mostraron que el consorcio de Glomus sp. y R. aff. intraradices tuvieron mayor xito en la colonizacin logrando infectar a la planta con porcentajes de colonizacin del 75.3% desde las primeras etapas y alcanzando el 95 % al final del experimento en comparacin con el cultivo puro de S. rubiformis que mostr porcentajes inferiores al 12 % durante las primeras etapas y al final del experimento en donde los porcentajes obtenidos fueron del 58.4 % (P 0.05 Tukey) (Figura 10).

106

b a

Figura 10. Porcentajes de colonizacin obtenidos en dos tiempos de colecta de las especies repropagadas. Letras diferentes indican diferencias significativas (P 0.05, Tukey).

Trabajos preliminares sealan que la presencia de ms de una especie de HMA en la rizosfera de las plantas resulta ms benfico ya que puede favorecer la asociacin micorrzica dado que no todas las asociaciones entre HMA-planta son compatibles y por lo tanto en un cultivo mixto algunos hongos pueden colonizar de manera ms efectiva y beneficiar en mayor grado a un hospedero adems de adaptarse mejor a las condiciones edficas (Castillo et al., 2008). En el caso de este experimento aunque el consorcio utilizado est conformado nicamente por dos especies, una de ellas es R. aff. intraradices descrita como una especie altamente infectiva y adaptada a suelos agrcolas (Barrer, 2009) que est siendo utilizada ampliamente en la actualidad para la produccin de inoculantes porque adems se asocia con una gran variedad de familias de plantas y por esta razn la colonizacin del consorcio pudo verse favorecida en comparacin con la infectividad mostrada por S. rubiformis. Otras investigaciones mencionan que cultivos mixtos de G. claroideum y R. aff. intraradices (antes Glomus intraradices) promueven una mayor absorcin de fsforo por la planta que cuando se propaga cada especie por separado (Jansa et al., 2008). El xito en la repropagacin de S. rubiformis es importante si toma en cuenta que es una especie que ha sido reportada asociada al cultivo de aguacate, sobre todo en suelos con algn grado de perturbacin por cambios en su composicin o tipo de manejo, en donde su abundancia es alta y es una especie dominante, por lo que puede ser una especie potencialmente utilizable como inculo para el 107

cultivo del aguacate (Gonzlez-Corts, 2005). Sin embargo, dado que los porcentajes de colonizacin fueron ms bajos que los mostrados por las especies en consorcio analizadas en este trabajo se sugiere realizar pruebas de infectividad y efectividad de S. rubiformis tanto de manera aislada como en consorcio con otras especies y utilizando como plata hospedara al aguacate para saber si se promueve la colonizacin antes de sugerirlo como inculo para este tipo de cultivo. Es importante mencionar que especies como F. geosporum que se han encontrado asociadas a las clulas corticales de las raz de las plantas de aguacate a partir de anlisis moleculares (Gmez-Dorantes, 2009) no lograron propagarse en el presente experimento, por lo que se recomienda intentar su cultivo utilizando otro tipo de plantas hospederas bajo el sistema de minirizotrn o bien con plantas de aguacate en cultivo de maceta-trampa, toda vez que se ha probado su presencia en el interior de esta planta y que en el presente trabajo se report su presencia en los cuatro sitios de muestreo y por lo tanto tambin podra ser una especie con potencial para ser utilizado como inoculante en el cultivo de aguacate. En cuanto a la abundancia de esporas al final del experimento de las especies propagadas se encontr que en el consorcio de Glomus sp1 y R. aff. intraradices se contaron 21 esporas/g de suelo en promedio de las tres repeticiones realizadas mientras que en el cultivo de S. rubiformis se contaron 74 esporocarpos/g de suelo, es decir, en contraste con los valores obtenidos para la colonizacin la especie con mayor esporulacin fue S. rubiformis. Algunos autores sealan que las especies de Glomus se adaptan casi a cualquier tipo de suelo y que el nivel de pH afecta el nmero de esporas en el suelo de manera que una disminucin favorece la esporulacin y las diferentes especies de HMA responden con diferentes estrategias de manera que estas respuestas especficas podran estar reflejando diferencias en las estrategias ecolgicas de los HMA y en la tasa de esporulacin estacional que puede estar relacionada con el status fisiolgico del hongo y en los patrones de colonizacin (Smith y Read, 1997; Santos et al. 2007; Barrer, 2009). En ecosistemas naturales la temporada estacional clida o fra influye en la esporulacin de las especies de HMA causando que determinada especie sea fisiolgicamente activa en una temporada estacional y no en la otra, donde otra especie va a ser fisiolgicamente activa (Pringle y Bever, 2002). Para el caso de S. rubiformis, Gonzlez-Corts (2005) seala una mayor abundancia y dominancia de esporas para la poca de lluvias y si consideramos que en el presente experimento el riego fue constante manteniendo cierto

108

nivel de humedad en el sustrato lo que simulara la poca de lluvia, se explicara la esporulacin encontrada. Para probar la identidad de los HMA repropagados al final del experimento se realizaron montajes de esporas provenientes del cultivo puro para su identificacin y comparacin con los ejemplares provenientes de suelo directo a partir de los cuales se inici el cultivo, toda vez que investigaciones previas sealan que en ocasiones puede existir contaminacin por otros microorganismos o invasin de otros HMA que pueden ser transferidos de contenedores vecinos durante el riego (Ortega-Larrocea et al., 2008) a estos sistemas puros. En el caso de este experimento se encontr una pureza del 80 al 90% en los dos cultivos obtenidos, por lo que no se puede hablar de cultivos mono especficos en el sentido estricto de la palabra, sin embargo se puede considerar exitoso toda vez que en repropagaciones subsiguientes se puede alcanzar la pureza deseada.

Resguardo de los HMA propagados en el (Subsistema de Recursos Genticos Microbianos).

SUBNARGEM

Una vez corroborada su identidad, se procedi al reguardo del material obtenido y sustrato de repropagacin de manera que al final se etiquetaron y almacenaron preparaciones fijas de cada una de las especies identificadas al principio del experimento provenientes de suelo directo y de esporas provenientes de los cultivos puros de las tres especies repropagadas, contando con un total de 30 laminillas que se sellaron y almacenaron en cajas para portaobjetos. Los sustratos de repropagacin con los propgulos infectivos se colocaron en bolsas de plstico, se sellaron y etiquetaron de acuerdo a los criterios establecidos por el INVAM y se almacenaron a 4C para posteriormente realizar pruebas de infectividad y efectividad, as como para futuras repropagaciones, quedando resguardas 2 bolsas con 100 gr de suelo de cada una aproximadamente.

4. CONCLUSIONES La diversidad de especies de HMA encontradas en el presente trabajo coincide con los valores reportados para suelos que presentan perturbacin y debido a que las cuatro zonas analizadas han sufrido procesos de cambios en el uso de suelo de bosque a huertas y que el establecimiento del tipo de manejo orgnico es muy reciente no se encontraron evidencias contundentes que indiquen que el tipo de 109

manejo ha influido sobre el aumento o prdida de esta diversidad, sin embargo se pudo observar que en las zona de manejo orgnico Huitzichio con una mayor cobertura vegetal debido a la siembra de hortalizas y presencia de vegetacin secundaria la cantidad de especies aumento en comparacin con las dems zonas analizadas, lo que indica que la presencia de una mayor diversidad de plantas favorece la presencia de mayor diversidad de HMA. Las 3 especies que lograron propagarse en el sistema de minirizotrn (Glomus sp 1, S. rubiformis y R. aff. intraradices) son especies presentes en todos los sitios de muestreo y de las encontradas en mayor abundancia en los suelos colectados, lo que indica que junto con F. geosporum son las especies dominantes en las dos huertas y por lo tanto especies potenciales para ser probadas y utilizadas como inoculantes ya que en trabajos previos se han reportado estas mismas especies asociadas al aguacate. El sistema de minirizotrn utilizado prob ser ms efectivo que otros mtodos empleados para la propagacin de cultivos mono especficos o monospricos, toda vez que los porcentajes de xito en la repropagacin fueron mayores y adems se controlaron agentes de contaminacin externos. Sin embargo no todas las especies de HMA probadas lograron establecer la colonizacin debido probablemente al tipo de planta trampa utilizado, entre otros factores, por lo que se recomienda experimentar con otras especies hospederas. El xito en el establecimiento de las Glomus sp 1, R. aff. intraradices y S. rubiformis en comparacin con las dems especies tambin pudo estar relacionado con la cantidad de rplicas que aumento las probabilidades de xito de estas tres especies. Las especies Glomus sp 1 y R. aff. intraradices repropagadas en consorcio resultaron altamente infectivas con porcentajes de colonizacin cercanos al 100% y S. rubiformis tambin mostro ser infectiva con valores de colonizacin cercanos al 60% aunque requiri de un mayor tiempo para el establecimiento de la colonizacin. Sin embargo en la esporulacin fue esta ultima la que mostr una mayor abundancia en el sustrato lo que podra estar indicando diferentes estrategias adaptativas en las especies dependiendo de las condiciones en el medio externo y del tipo de hospedero. La repropagacin en contenedores de mayor tamao que las cajas bajo el sistema de minirizotrn permite la obtencin de una mayor cantidad de inoculo y de la utilizacin de hospederos con 110

sistemas de raz ms desarrollados o de plantas de mayor tamao, sin embargo se deben de tomar medidas que impidan la contaminacin por otro tipo de microorganismos. A pesar del cuidado que se tuvo con el manejo del material, al final del experimento no se obtuvieron cultivos estrictamente puros ya que se observ la presencia de un 1 al 2% de esporas diferentes a las inoculadas porque es importante que el manejo, almacenamiento y reguardo del material obtenido sea el adecuado para evitar contaminacin y deterioro ya que se trata de organismos vivos.

REFERENCIAS
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UNA APROXIMACIN AL CONOCIMIENTO DE LOS HONGOS MICORRZICOS EN ORQUDEAS TERRESTRES

1

Mara de los ngeles Beltrn Nambo, Rafael Salgado Garciglia, Pilar 1 Ortega Larrocea y Yazmn Carren Abud
2

Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo Laboratorio de Microcosmos, Facultad de Geologa. UNAM.

RESUMEN
Muchas orqudeas son consideradas en la actualidad en riesgo de extincin debido a la destruccin o alteracin de sus hbitats naturales. Se puede asumir que las especies raras presentan preferencias de hbitat ms especficas que las especies comunes y esta especificidad parece ser consecuencia de la distribucin de sus hongos micorrizicos, entre otros factores. La micorriza orquideoide difiere de otros tipos de micorrizas en su morfologa, en que es indispensable para la germinacin de la semilla, puede presentarse en el protocormo adems de la raz y el hongo puede recolonizar clulas viejas. La mayora de los hongos endofticos que se conoce que forman micorrizas orquideoides son Basidiomicetes incluidos dentro del gnero-forma Rhizoctonia. Este gnero incluye hongos saprfitos, patgenos y simbiontes que son fundamentalmente diferentes a los hongos con alto grado de especializacin que se presentan en otros tipos de micorrizas. Existen diferentes opiniones sobre el grado de especificidad que se presenta en esta asociacin y que puede variar con la especie de orqudea, tipo de hbitat, edad de la planta y tipo nutricional. Se cuenta con poca informacin sobre la fenologa de los hongos asociados con orqudeas o sobre el impacto que las variaciones en las condiciones ambientales puedan tener sobre el desarrollo del micelio externo y este tipo de informacin es esencial para la reintroduccin exitosa a largo plazo de especies terrestres en peligro de extincin.

1.INTRODUCCIN
Las orqudeas son un grupo con gran diversidad de plantas de origen relativamente reciente que pertenecen a la familia Orchidaceae, considerada como la ms amplia en el mundo ya que incluye casi el 116

10% de las plantas con flor (Dressler, 1981) con un aproximado de 25 000 especies (Jones, 2006) y de las cuales al menos mil se encuentran distribuidas en diferentes estados de la Repblica Mexicana, entre los que se incluye Michoacn en donde se mencionan alrededor de 200 especies, algunas consideradas de distribucin escasa o rara (Instituto de Ecologa, Ptzcuaro 2008). Las micorrizas de orqudeas son interacciones entre hongos y plantas de la familia Orchidaceae y difieren de otros tipos de micorrizas por sus caractersticas distintivas. Son consideradas una asociacin benfica y un factor que ha influenciado en la forma, funcin y adaptacin de esta familia (Zettler et al., 2004). La mayora de las especies de orqudeas en el mundo son fotosintticas, otras constituyen un nmero pequeo de especies que son mico-heterotrficas a lo largo de su ciclo de vida y en investigaciones recientes se determin un nuevo tipo de orqudeas que son las mixtrofas, en donde las orqudeas fotosintticas suplementan parte de su carbono fijado fotosintticamente con el carbono que deriva de un hongo micorrzico (Dearnaley, 2007). Una combinacin de fototropa y micotrofa es importante para la supervivencia y competicin de las orqudeas, sobre todo de las terrestres (Rasmussen y Whigham, 2002). La colonizacin micorrzica tiene una marcada influencia en el crecimiento y desarrollo de estas plantas (Siddique y Raghuvanshi, 1993), ya que sin importar el tipo de hbitat en el que se desarrollen requieren de la estimulacin de un hongo para la germinacin de la semilla y/o el rpido desarrollo del protocormo en condiciones naturales. Algunas orqudeas requieren hongos endfitos e intracelulares en uno o ms de sus rganos tales como races y cormo en algn periodo de su ciclo de vida hasta la etapa adulta (Mukerji et al., 2002). Los estudios de identificacin morfolgica y molecular de hongos asociados a orqudeas indican que existe un amplio rango de hongos que actan como micobiontes pero que presentan taxa comunes, con lo que se apoya que estas plantas presentan interacciones fngicas especficas. Estudios ms recientes indican una situacin ms compleja ya que algunas orqudeas fotosintticas aun cuando muestran un amplio rango de asociacin, tienen un nico hongo micorrzico dominante (Dearnaley, 2007), por lo que resulta importante estudiarlas en diferentes hbitats.

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En Mxico, las orqudeas terrestres tienen como gneros ms representativos a Bletia, Govenia, Habenaria y Malaxis. El centro de diversificacin para el gnero Bletia se encuentra en este pas con un aproximado de 50 especies distribuidas en diferentes estados de la Repblica. Govenia es un gnero de amplia distribucin en Amrica y en Mxico, se reportan 12 especies, cinco de las cuales son endmicas (Garca-Cruz y Sosa, 2006). Habenaria comprende alrededor de 600 taxa de distribucin cosmopolita y existen aun varas especies no descritas (Garca-Cruz et al., 2000) y para Malaxis se reportan 42 especies en el pas (Salazar, 1997). Sin embargo, debido a la prdida de sus hbitats, principalmente por cambios en el uso de suelo, deforestacin y erosin, las poblaciones de estas orqudeas han disminuido a travs del tiempo, de manera que resulta importante la conservacin de las mismas mediante programas de recuperacin de hbitats y de las especies que normalmente se desarrollan en ellos. Muchos proyectos de conservacin utilizan tcnicas simbiticas para la propagacin de estas plantas, utilizando bancos de semillas y cultivos de hongos, y adems evalan sitios de crecimiento natural. Las especies de orqudeas consideradas raras o amenazadas se han estado propagando simbiticamente con el propsito de conservacin ex situ o reintroduccin (Rasmussen, 2002). Se ha demostrado tambin que en las orqudeas terrestres existen distintos grados de especificidad por sus endfitos micorrzicos (especificidad taxonmica), la que puede variar a lo largo de la vida de una orqudea (especificidad fenolgica). Este fenmeno ha sido poco estudiado en las orqudeas mexicanas, as como el patrn de colonizacin que presentan en condiciones naturales considerando la micotrofa casi obligada que presentan la mayor parte de las orqudeas terrestres. Por lo anterior, resulta importante conocer la dinmica de su asociacin micorrzica para que se puedan proponer proyectos de reintroduccin simbitica, dada la importancia del hongo en las etapas tempranas de desarrollo de estas plantas. A nivel mundial la reintroduccin simbitica ya es una prctica comn para el rescate y conservacin de especies amenazadas y para recuperacin de funciones ecolgicas, sin embargo, en nuestro pas los programas de reintroduccin de orqudeas a sus hbitats naturales no ha considerado a los hongos simbiontes (Ortega-Larrocea y Gonzlez, 2008).

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2. ESTADO DEL ARTE

Las orqudeas tienen tres principales hbitats de crecimiento: suelo (terrestres), sobre otras plantas (epifitas) y sobre superficies rocosas (litofiticas) (Dearnaley, 2007). Como las semillas de las orqudeas son microscpicas y contienen pocas sustancias de reserva, la colonizacin por hongos compatibles es esencial para la germinacin y el desarrollo inicial de la semilla sobre el sustrato (Smith y Read, 1997). En la interaccin las hifas fngicas crecen en los tejidos de las orqudeas y desarrollan estructuras helicoidales dentro de las clulas corticales llamadas pelotones. Como se ha establecido, la mayora de las orqudeas son fotosintticas en la madurez (Leake, 2005), pero algunas requieren de hongos para complementar sus requerimientos de carbono y otros nutrimentos. Las orqudeas son econmicamente importantes. Por ejemplo, la vainilla es utilizada como saborizante en comidas y bebidas, los tejidos de Gastrodia son importantes en la medicina natural y adems las orqudeas son un grupo muy representado en la horticultura, dejando una derrama econmica de millones de dlares anualmente (Griesbach, 2002).

Importancia del hongo en la germinacin de la semilla El pequeo tamao de la semilla de las orqudeas limita considerablemente el tamao del embrin, que se presenta como una estructura muy diminuta e indiferenciada, es decir, no presenta rganos incipientes como los que presentan los embriones de otras plantas, ya que consiste slo en una masa de clulas. La semilla carece de reservas nutricionales y para poder germinar requiere de la asociacin del embrin con ciertos hongos que lo proveen de nutrientes. De tal forma, que al menos durante la germinacin la mayora de las orqudeas son micohetertrofas obligadas (Batty et al., 2002). Si despus de que es liberada del fruto, la semilla llega a un lugar con condiciones fisicoqumicas adecuadas y en donde el hongo apropiado est presente, el embrin absorbe agua e incrementa su tamao rompiendo la cubierta de la semilla. La hifa del hongo normalmente penetra la semilla a travs de un poro en uno de sus extremos e infecta el embrin. La infeccin no se da de manera indiscriminada sino que permanece restringida en una zona en la porcin baja del embrin en crecimiento, el cual como resultado de divisiones celulares, forma un cuerpo de mayor volumen denominado 119

protocormo (Hgsater et al., 2005). El crecimiento del hongo dentro del protocormo es controlado por medio de substancias reguladoras producidas por las clulas de la orqudea conocidas como fitoalexinas (Arditti, 1992). La hifa crece formando enrollamientos que subsecuentemente son digeridos de la misma manera en que sucede en las races con micorriza. En algn momento, las clulas del protocormo comienzan a diferenciarse para dar origen a tallos, hojas y races (o rizoides) y entonces es capaz, al menos potencialmente, de vivir de forma autnoma. Sin embargo, la infeccin del hongo puede migrar a las races jvenes y convertirse en micorriza en el sentido estricto (Hgsater et al., 2005).

Especificidad orqudea-hongo Se han realizado diferentes estudios sobre la especificidad entre la orqudea y sus hongos asociados encontrando diferentes modelos, razn por la cual algunos consideran que la especificidad est correlacionada con los patrones de distribucin de los hongos en el ecosistema y variaciones en el hbitat, sobre todo en orqudeas micoheterotrficas. Adems de que algunas evidencias indican que las orqudeas pueden cambiar de hongos asociados durante su ciclo de vida (Van der Heijden y Sanders, 2003). De tal manera que en ocasiones la germinacin no se lleva a cabo con micobiontes extrados del adulto, por lo que es importante analizar y determinar las micorrizas asociadas tanto en semillas como en plantas adultas ya que si el adulto y la semilla requieren diferentes micobiontes, resulta esencial que ambos sean aislados y conservados durante cualquier programa de recuperacin (Dearnaley, 2007; Rasmussen, 2002). En comparacin con otros tipos de micorrizas, se han realizado muy pocos estudios sobre las micorrizas de orqudeas y son muchas las especies de orqudeas que se encuentran al lmite de la extincin y que requieren urgentemente de estudios ecolgicos y fisiolgicos. Muchas orqudeas terrestres (tanto fotosintticas como micoheterotrficas) aun no han sido cultivadas y algunas se encuentran amenazadas debido principalmente a la prdida de sus hbitats (Dearnaley, 2007). A nivel internacional existen algunas investigaciones sobre micorrizas en orqudeas que han determinado la especificidad en esta asociacin. En una revisin realizada por Van der Heijden y Sanders 120

(2003) se seala que los patrones de especificidad han sido correlacionados con patrones de distribucin y diversidad de hbitats de los hongos en muchas orqudeas mico-heterotrficas, las cuales son altamente especficas. Mientras que otros estudios muestran expresin de especificidad aun cuando diversos hongos coexisten con la planta. Actualmente la especificidad del hongo en orqudeas ha sido estudiada utilizando dos mtodos: el primero consiste en el anlisis de la germinacin y desarrollo de la semilla con varias cepas de hongos bajo condiciones controladas en medios de cultivo monoxnicos en laboratorio, mientras que el segundo mtodo incluye una descripcin morfolgica y/o aislamiento del hongo de plantas adultas desarrolladas en estado silvestre. La gran mayora de las aportaciones frecuentemente sugieren baja especificidad, al menos en especies fotosintticas (Rasmussen, 2002). Sin embargo, estudios realizados con tcnicas moleculares permiten conocer ms la variabilidad de los endfitos que morfolgicamente es muy similar (Dearnaley, 2007; McCormick et al., 2006) y sugieren una especificidad significante cuando se transfieren pelotones individuales a medios de cultivo puros. La especificidad en la asociacin micorrzica observada en algunas orqudeas fotosintticas posiblemente ayuda a mejorar las tasas de germinacin de la semilla y les proporciona una eficiencia fisiolgica mayor. En orqudeas con prolongados periodos de latencia o especies confinadas a hbitats con poca penetracin de luz, existe quiz una mayor dependencia hacia los hongos para obtencin de carbono y nitrgeno (Gebauer y Meyer, 2003; Cameron et al., 2006; Dearnaley, 2007). La mayora de las orqudeas terrestres fotosintticas estudiadas se asocian con hongos saprofitos, muchas de ellas se asocian con el mismo hongo en la fase juvenil y en la adulta (aunque la especie de hongo puede variar dependiendo del hbitat) y algunas especies forman asociaciones con taxa muy especficos de hongos, algunas veces con una sola especie (McCormick et al., 2004). De tal manera que si esta especie no est presente, la orqudea no se asocia con ningn otro hongo. Por otro lado, se ha observado que en ocasiones una sola orqudea puede asociarse con mltiples hongos a la vez (oligfagas) o con un solo hongo por vez, pasando de uno a otro (monfagas), ambas 121

estrategias pueden ser adaptaciones que aseguran la sobrevivencia de las plantas (McCormick et al. 2006; Rasmussen y Rasmussen, 2007). Las orqudeas de climas templados (norte o sur) han mostrado ser ms dependientes de su hongo asociado que aquellas de climas clidos. Esto considerando que muchas orqudeas tropicales y sus hbridos son actualmente propagadas utilizando tcnicas con cultivos de tejido que no requieren la germinacin simbitica. Muchas especies de orqudeas de climas templados son frecuentemente difciles de propagar por mtodos no simbiticos e incluso sus poblaciones naturales estn declinando rpidamente debido a las actividades antropognicas. La germinacin en general es estimulada o acelerada en presencia del hongo micorrzico, pero el efecto es menos aparente en especies tropicales, que germinan mucho ms rpido que sus contrapartes de climas templados del Norte (Vij et al., 2002; Arditti, 1992). La especificidad orqudea-hongo tambin se ha visto que es ms limitada. La mayora de las orqudeas fotosintticas se asocian con hongos anamrficos del gnero forma Rhizoctonia y tambin se ha observado que la mayora de las simbiosis micorrzicas durante la germinacin de la semilla se da con hongos de este grupo (Vij et al., 2002). Rasmussen (2002) sugiri que las orqudeas fotosintticas se asocian con un amplio rango de micobiontes mientras que en especies micoheterorficas el rango es ms estrecho. Sin embargo, algunas de estas orqudeas aun cuando se asocian con un amplio rango, presentan un slo tipo de hongo micorrzico predominante y estas asociaciones tan especficas, generalmente se dan con miembros de Tulasnellaceae y Ceratobasidiaceae. Recientemente se han corroborado otros gneros de hongos micorrzicos de orqudeas como Thanatheporus. Estos micobiontes pudieron ser identificados mediante el uso de tcnicas moleculares (Dearnaley, 2007). Entre las especies de orqudeas auttrofas que muestran especificidad se encuentran los gneros Cypripedium y Spiranthes, siendo los micobiontes predominantes miembros de las taxas Tulasnellaceae, Russulaceae y Ceratobacidiaceae (Van der Heijden y Sanders, 2003; Dearnaley, 2007).

122

Algunos miembros del gnero Corallorhiza sp., que es micoheterotrfico, se asocian con hongos de los Telephoraceae y Russulaceae (Van der Heijden y Sanders, 2003). Algunos otros grupos de hongos que se han encontrado formando asociaciones con orqudeas son Sebacinaceae, Pyronemataceae, Coprinaceae y Tricholomataceae (Dearnaley, 2007). En estudios moleculares realizados en orqudeas terrestres de Europa y Norteamrica, as como en orqudeas tropicales de Asia (Kristiansen et al., 2001) y Puerto Rico, se aislaron hongos del grupo Rhizoctonia, todos relacionados a Ceratobasidium sp. de regiones templadas (Otero et al., 2002). Rangel-Villafranco y Ortega-Larrocea (2004) sealaron que las especies del gnero Bletia se desarrollan rpidamente a plntula con hongos aislados provenientes del mismo gnero, mientras que especies como Dichromanthus aurantiacus y D. cinnabarinus presentan un desarrollo ms dependiente y especfico de la simbiosis. Adems, sealan cierto grado de especificidad a nivel de gnero, ya que plantas adultas de algunas especies de Bletia se asocian en medios ambientes naturales con hongos del gnero Epulorhiza, mientras que especies como Dichromantus aurantiacus se asocian con hongos del gnero Cerathoriza. (Ortega-Larrocea y Rangel-Villafranco 2007).

Caractersticas de los principales grupos de hongos asociados Los hongos superiores con frecuencia tienen dos nombres basados en dos grupos de caractersticas diferentes: los nombres anamrficos se apoyan en caractersticas vegetativas tales como morfologa de las hifas y de las esporas asexuales, mientras que los nombres teleomrficos estn basados en las caractersticas de las estructuras de reproduccin sexual, como son las caractersticas micro y macroscpicas de los esporocarpos. Las estructuras sexuales generalmente proporcionan ms informacin para la taxonoma y sistemtica que las estructuras vegetativas. Sin embargo, los hongos que se incluyen en el gnero-forma Rhizoctonia rara vez revelan sus basidiocarpos y por eso muchas veces se identifican por sus anamorfos. La sistemtica de estos hongos ha sido estudiada utilizando tanto caractersticas morfolgicas como moleculares. Una de las 123

caractersticas morfolgicas que ha ayudado en la clasificacin del grupo Rhizoctonia es el nmero de ncleos presentes en las clulas jvenes, observndose clulas multi, bi y uninucleadas, por lo que la determinacin del nmero de ncleos es un proceso importante para su clasificacin (Sneh et al., 1991). La produccin de cadenas de clulas monilioides (propgulos de resistencia asexuales) es otra caracterstica de ste gnero (Van der Heijden y Sanders, 2003). Las clulas monilioides pueden presentar cadenas simples o ramificadas con una relacin longitud ancho de 1-3:1 (Figura 1). Estas clulas pueden ser hialinas o cafs y varan en forma (lobuladas, piriformes, irregular o en forma de barril); su tamao vara de 10 x 20 a 25 x 40 m y pueden formar esclerocios aunque en ocasiones stos pueden no formar clulas monilioides y estar constituidos por hifas indiferenciadas (Sneh et al., 1991).

Figura 1. Clulas monilioides formando cadenas. Fotos A. Beltrn.

El color de las colonias y las tasas de crecimiento son tambin caractersticas a considerar, ya que nos permiten diferenciar entre especies de ste grupo. Se ha observado, por ejemplo, que algunas especies de Epulorhiza presentan tasas de crecimiento muy lentas mientras que en especies de Ceratorhiza las tasas de crecimiento son muy rpidas (Currah et al., 1997). Otra caracterstica de este gnero es la reaccin que presentan a la polifenol oxidasa, de tal manera que Epulorhiza es consistentemente negativa mientras que por ejemplo Ceratorhiza

124

reacciona positivamente oxidando el medio de cultivo (Currah et al., 1997). Rhizoctonia solani Khn (teleomorfico Thanatephorus cucumeris (Frank Donk) es el anamorfo mas estudiado de este gnero y posee las siguientes caractersticas : ramificaciones cerca del septo distal de las clulas en las hifas jvenes en ngulos cercanos a los 90, constriccin de la hifa y formacin de un septo a corta distancia del punto de origen de los brazos hifales, septo doliporo y clulas multinucleadas en las hifas vegetativas jvenes, manchas con pigmentacin caf de las hifas (Figura. 2). Las caractersticas morfolgicas que nunca presenta incluyen : conexiones unidas, conidios, esclerocios diferenciados en corteza y mdula, rizomorfos y otra pigmentacin que no sea caf. Las primeras 3 caractersticas se elevaron a nivel de gnero (Sneh et al., 1991).

a)

b)

c)

Figura 2. Caractersticas de Rhizoctonia. a) Clulas multinucleadas; b) Ramificaciones en ngulos cercanos a 90 y septos cerca al punto de ramificacin; c) septos doliporos. Fotos a y b tomadas por A. Beltrn; c tomada de http://www.biologia.edu.ar/fung.

El grupo de hongos conocidos como Rhizoctonia incluye los gneros anamrficos (asexuales) Ceratorhiza, Epulorhiza, Rhizoctonia y Opadorhiza (Moore, 1987) de una variedad de hongos teleomrficos (etapas sexuales de Ceratobasidium, Tulasnella, Thanatephorus y Sebacina). Algunos de estos hongos son bien conocidos como patgenos de plantas de una gran variedad de granos y tubrculos. 125

Debido a que todos los hongos asociados a las orqudeas exhiben caractersticas muy similares, es difcil reconocer aislados individuales y ms aun identificarlos. Sin embrago, se considera que la mayora de las orqudeas son colonizadas por hongos de la subdivisin Basidiomycotina, clase Himenomicetos (subclase Holobasidiomycetidae), excepto por Sebacina sp. (subclase Phragmobasidiomycetidae). Pero en algunas especies del gnero Epipactis se han encontrado hongos Ascomicetes formando micorrizas, principalmente de los gneros Tuber sp., Wilcoxina sp. y Phialophora sp., aunque falta que sea corroborada su funcin micorrzica (Dearnaley, 2007; Sneh et al, 1991).

Patrones de colonizacin La mayora de las orqudeas tienen races adventicias, fibrosas y a veces tuberosas y presentan una capa de tejido esponjoso que las recubre, llamada velamen. Esta estructura resulta importante dadas sus funciones de absorcin, almacenamiento de agua y sales minerales, as como en los procesos de simbiosis micorrzica (Figura 3c) (Arditti, 1992). Las races de algunas orqudeas adems cumplen funciones fotosintticas, sobre todo en especies de crecimiento monopodial que carecen de pseudobulbos y crecen a partir de un solo pice vegetativo, de manera vertical. En stas no existen hojas y por lo tanto la raz debe cumplir esta funcin, a diferencia de las especies de crecimiento simpodial que son aquellas que mantienen un crecimiento lineal y siempre cuentan con pseudobulbos, mismos que dan lugar a las hojas que son las que realizan la fotosntesis (Fanfani, 1990) (Figuras 3a y b). Sin embargo, todas estas races albergan hongos micorrzicos durante una o ms etapas de crecimiento. En algunas especies el crtex de las races es colonizado extensivamente, mientras que en otras orqudeas las masas fngicas pueden encontrarse slo a lo largo de la periferia. La colonizacin se desplaza de una clula a otra (Arditti, 1992).

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Clulas Endodrmicas

Figura 3. Formas de crecimiento en las orqudeas y estructura de la raz. a) simpodial; b) monopodial; c) corte transversal de la raz; d) vista longitudinal de la raz. Tomadas de http:/orquidea.biologa.com.

El hongo micorrzico es capaz de existir en el suelo, ya sea como esclerocios o como micelio activo y penetra en la planta generalmente a travs de los pelos radicales o menos comnmente por penetracin directa en la epidermis radical. Las orqudeas son colonizadas por medio de hifas solitarias que pasan a travs de la pared celular por simple penetracin, usualmente mediante una delgada constriccin de la hifa (Rasmussen, 1995). La penetracin por los pelos radicales es la forma ms comn, sin embargo, en especies de algunos gneros como Cypripedium, Eria y Orchis, la colonizacin puede ocurrir directamente por el velamen. El sitio y extensin de la penetracin del hongo vara con la especie. En la mayora de las races el velamen es separado del crtex por una capa exodrmica de clulas 127

de pared gruesa que puede estar interrumpida por algunas clulas con actividad metablica de pared delgada, denominadas clulas de pasaje (Figuras 3c y d). La hifa puede o no proliferar en las clulas del velamen/epiblema ya que las clulas exodrmicas de pared gruesa pueden resistir la penetracin del hongo, mientras que las clulas de pasaje sirven como punto de penetracin (Vij et al., 2002). Los enrollamientos hifales se forman en la parte media del crtex en la mayora de las clulas. Durante la primera fase el hongo invade tejidos vivos, durante la segunda fase el micelio formado es destruido. Las clulas de digestin de la planta pueden sufrir un mximo de tres invasiones sucesivas durante su etapa de crecimiento activo y se ha visto que el proceso desde la colonizacin hasta la degradacin se lleva a cabo ms rpidamente en estas recolonizaciones secundarias, en periodos de slo tres o cuatro semanas. Los primeros pelotones pueden no ser digeridos por completo y sus remanentes se pueden observar como cuerpos espirales, alrededor de los cuales los nuevos pelotones se organizan (Burges, 1966; Arditti, 1992; Vij et al., 2002). En muchas orqudeas la raz presenta en el crtex una capa de clulas adyacentes a la epidermis que funcionan como clulas hospederas y dos capas que funcionan como clulas de digestin, de tal manera que el hongo micorrzico puede permanecer vivo en las clulas hospederas y ser digerido posteriormente en las clulas de digestin (Arditti, 1992). Este fenmeno es llamado tolipofagia y se presenta en casi todas las orqudeas (Figura 4a). Las hifas que forman pelotones estn normalmente en paquetes compactos y rodeados por una capa muy delgada de clulas del citoplasma del hospedero lo que genera una interface entre la orqudea y el hongo que es denominada matriz interfacial (Peterson y Massicotte, 2004). La composicin de esta matriz depende de la edad del pelotn y se ha encontrado que en los primeros procesos de colonizacin la matriz carece de pectinas, celulosa y -1,3-glucanos, mientras que estos componentes de la pared estn presentes cuando hay pelotones en proceso de senescencia y se encuentran rodeando las hifas en degeneracin (Peterson et al., 1996).

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Figura 4. a) Tolipofagia; b) Ptiofagia. Modificado de Arditti (1992) por A. Beltrn.

Un fenmeno menos comn es la ptiofagia que involucra el colapso de hifas individuales ms que de grupos de hifas en una capa de clulas fagocticas que se localizan en el crtex por debajo de dos capas de clulas de pasaje. En estas clulas, la hifa desintegrada de la punta libera citoplasma y la pared celular queda formando masas, el tiosoma, que es digerido (Figura 4b). Durante la invasin de las races es posible distinguir dos fases de resistencia: la primera denominada resistencia mecnica y la segunda resistencia protoplasmtica. En la resistencia mecnica las paredes de la planta invadidas por las hifas pueden permanecer sin cambio, en ciertas orqudeas sin embargo, se observan cambios marcados en las paredes, como cierta distorsin por la presin de las hifas que crecen y pasan entre las clulas. Se puede observar tambin cierto espesamiento y las paredes adquieren una coloracin amarillenta. Cuando esto pasa, la apariencia general es la de una pequea lesin. Las clulas corticales adyacentes a las hifas muestran un espesamiento similar pero no tan pronunciado como las clulas en donde se lleva a cabo la penetracin (Burges, 1966; Vij et al., 2002). Una vez que las hifas han sobrepasado las barreras epidrmicas o del velamen, se establece en el crtex formando los ovillos. Es aqu cuando sucede la resistencia protoplasmtica donde 129

se observan cambios histolgicos en la hifa, debido a que en esta fase se lleva a cabo una degradacin activa de stas. Las primeras etapas de digestin de las hifas son acompaadas por cambios notables en la coloracin del citoplasma del hongo. Durante la colonizacin de las clulas las hifas estn llenas de protoplasma y usualmente contienen grnulos de glicgeno y otros materiales que le dan cierta coloracin griscea; durante las primeras etapas de digestin el dimetro de las hifas se incrementa y las vacuolas, que primero incrementaron su nmero, desaparecen. El protoplasma cambia a un color amarillento debido a que ya no hay protoplasto y quedan slo las paredes vegetales. En un hongo antes de la digestin los ncleos son pequeos y espirales con nuclolos de coloracin fuerte, cuando ocurren los cambios en el citoplasma el ncleo se retrae, encoge y se vuelve irregular. Hay un incremento del material proteico en las hifas y la degradacin del protoplasma contina hasta que la hifa queda vaca, las paredes de la hifa se arrugan y colapsan. Eventualmente las hifas son concentradas en el centro de la clula y forman la masa amarillenta denominada cuerpo de degeneracin (Figura 5) (Burges, 1966).

Figura 5. Pelotones en diferente estado de digestin y formacin del cuerpo de degeneracin (flechas). Fotos de A. Beltrn y fotos con flechas tomadas de (Lee, 2002). Durante estos cambios el hongo pierde su capacidad regenerativa dentro de la raz, algunas hifas por ejemplo pierden su capacidad de crecimiento y otras generalmente en la parte externa del crtex de nuevas races colonizadas, son poco activas. Entre estos dos

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extremos hay numerosas etapas en las cuales la hifa puede tener o no actividad. La desintegracin de las hifas en la raz es probablemente el fenmeno ms relevante asociado con la colonizacin micorrzica y es responsable en gran medida de la diferencia entre este tipo de colonizacin y las formas ms usuales de invasin parastica de otros hongos hacia las plantas. Esta degradacin se da por la presencia de enzimas proteolticas en la raz. Esto representa una ganancia en materiales orgnicos para la planta superior, o por otro lado, es quiz slo el retorno del material tomado de la planta durante la fase parasitaria (Burges, 1966; Vij et al., 2002). Los pelotones usualmente persisten por un tiempo limitado, eventualmente colapsan y degeneran. No obstante, la degeneracin de los pelotones ocurre principalmente en los tejidos profundos mientras que en los tejidos ms superficiales permanecen aparentemente intactos y sin lisis por un tiempo considerable, lo que sugiere un fenmeno intermedio entre ptiofagia y ptolipofagia. La hifa probablemente se desliza por la superficie de los rganos colonizados a travs del suelo de los alrededores (McKendrick et al., 2000). Los patrones de colonizacin fngica son variables, observando que en orqudeas terrestres algunas races pueden encontrarse densamente colonizadas y otras no presentar colonizacin incluso en una misma planta (Hadley y Williamson, 1972; Katiyar et al., 1986; Cruz-Blas, 2007). El crtex de la raz en la mayora de las especies de climas templados se encuentra muy colonizado, mientras que en orqudeas de climas tropicales la colonizacin puede variar con la especie y el hbitat (Hadley, 1982; Vij y Sharma, 1983). Se ha observado tambin que las plantas crecidas en invernadero presentan una colonizacin pobre en comparacin con las que se desarrollan en estado silvestre, lo que sugiere una correlacin directa entre la intensidad de colonizacin y hbitat (Vij et al., 2002). Otros investigadores correlacionan la distribucin localizada del hongo con la extensin de contacto de la raz con el sustrato, la relacin de especificidad hongo-planta y mecanismos de defensa de la planta (Hayman, 1983). Las races maduras estn generalmente ms colonizadas que las races jvenes (Hadley y Williamson, 1971; Benzing, 1982).

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Fenologa de la colonizacin Existen pocos datos sobre la fenologa de los hongos asociados con las orqudeas o sobre el impacto que pueden tener las variaciones en la temperatura estacional en la actividad del micelio externo (Rasmussen, 1995; Batty et al., 2002). En climas estacionales, los hongos saprfitos tienen su desarrollo ptimo en el otoo cuando la cantidad de materia orgnica aumenta con la cada de las hojas (Rasmussen, 1995). Su actividad es mxima durante los meses fros de invierno, mientras que esta actividad es limitada durante los meses secos del verano (Sivasithamparam, 1993). Si se asume que los hongos simbiontes de orqudeas se comportan de manera similar a otros hongos entonces slo existen cortos periodos estacionales en los cuales las condiciones del suelo y la actividad del hongo son adecuadas para ayudar a la germinacin de la semilla (Batty et al., 2000) y en los cuales la actividad de la raz y el hongo no se ven limitados por temperaturas extremas o por sequas o anegamiento del suelo (Batty et al, 2002). Tambin se ha observado que en hbitats con estaciones secas la sobrevivencia puede resultar difcil para estos hongos, dado que Rhizoctonia rara vez forma esporas resistentes a la sequa y por esta razn se ha sugerido que la penetracin a los tejidos de las plantas durante los periodos desfavorables podra ser el nico beneficio real que el hongo obtiene de la simbiosis de la planta (Burgeff, 1943; Rasmussen, 1995). Mientras que las orqudeas que mezclan fototrofa y micotrofa pueden alargar la poca de crecimiento o bien tener ms de una poca anual de crecimiento, muchas orqudeas terrestres persisten slo como rizoma o tubrculos durante las estaciones secas pero sus races y tallos permanecen en el suelo actuando como reservorios de inculo fngico asegurando as una pronta colonizacin como sucede con otros tipos de micorrizas (Brundrett y Abbott, 1995). Sin embargo, aun se requiere determinar con precisin la estrategia que utilizan los hongos micorrzicos de orqudeas para persistir en el suelo (Batty et al., 2002).

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3. CONCLUSIONES Los hongos micorrzicos de orqudeas son indispensables para la germinacin de la semilla de estas plantas dada la escasez de nutrientes que presentan por su tamao diminuto. Por lo que es importante considerar el establecimiento de la asociacin previo a la introduccin de plntulas al medio ambiente en programas de conservacin para as garantizar un mayor xito en la adaptacin y sobrevivencia de estas plantas, considerando adems las interacciones que presentan las orqudeas y estos hongos con otros organismos en el medio ambiente. Es importante contar con bancos de germoplasma de los hongos asociados a races y semillas de las orqudeas de diversas especies y de diferentes regiones debido a que los componentes de esta asociacin pueden variar dependiendo del hbitat. Resulta importante adems realizar estudios morfolgicos y moleculares encaminados a la identificacin del integrante fngico en diferentes etapas del ciclo de vida de la planta. El conocimiento sobre la fenologa de la colonizacin fngica es poca conocida por lo que se requieren estudios sobre el impacto que las variaciones del medio ambiente pueden tener sobre el hongo y sus procesos de colonizacin. En Mxico existe muy poco conocimiento sobre la identidad de los socios fngicos y sobre el grado de dependencia que presentan las orqudeas terrestres a esta asociacin, sin embargo muchas especies de estas plantas se encuentran en peligro de extincin debido a la prdida de sus hbitats y de los organismos que interaccionan con ellas por lo que se debe tomar un mayor inters en el conocimiento y rescate no slo de las orqudeas sino tambin de stos.

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PROPAGACIN DE RBOLES FORESTALES

Eduardo Mendoza Maya y Miguel Martnez Trujillo
Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo

RESUMEN
Las especies forestales se pueden propagar sexual y asexualmente. La propagacin sexual se realiza mediante semillas; la asexual o clonal se divide en macropropagacin, que se realiza mediante injertos o enraizamiento de estacas, y micropropagacin, que incluye dos sistemas de cultivo in vitro: la organognesis y la embriognesis somtica. Todas presentan ventajas o desventajas segn los objetivos del programa a implementar. Respecto a la necesidad del incremento en la productividad de las plantaciones forestales el uso de la propagacin clonal presenta varias ventajas sobre la propagacin sexual. Adicionalmente, dentro de la propagacin clonal, la micropropagacin tiene ventajas potenciales sobre la macropropagacin y dentro de la micropropagacin la embriognesis somtica tiene varias ventajas sobre la organognesis. En esta revisin se describen aspectos especficos de la propagacin de rboles forestales.

1.

INTRODUCCIN

Los ecosistemas forestales son de los sistemas naturales de ms importancia en el planeta, tanto porque albergan ms del 60 % de la diversidad biolgica terrestre, como por invaluables servicios ambientales que proveen y la gran cantidad de recursos benficos que el hombre extrae de ellos. Y ahora, la sobreexplotacin causada por el acelerado crecimiento de nuestra poblacin est amenazando seriamente la funcionalidad de estos ecosistemas y por tanto el papel ecolgico que desempean en nuestro planeta. En la actualidad estn en marcha diversas estrategias cuya finalidad es la conservacin de estos ecosistemas. Existen estrategias que pretenden encontrar la manera de usar los recursos forestales de manera sustentable, otras con las que se protegen reas especiales para su conservacin, 139

programas que intentan restaurar los sistemas que ya han sido modificados, as como estrategias en las que se pretende sustituir a los bosques naturales como fuente de abastecimiento de diversos recursos: las plantaciones forestales. Dentro de la actividad forestal los bosques plantados y el desarrollo de la tecnologa forestal han recibido la mayora de las inversiones en los ltimos aos (FAO, 2009). La investigacin tiene como objetivo principal mejorar la productividad mediante mayores tasas de crecimiento, mejorar la calidad de la madera y la capacidad de los bosques plantados de hacer frente a condiciones ambientales adversas, como plagas y enfermedades (FAO, 2009), es decir, se pretende el desarrollo de rboles mejorados o lite. Los rboles mejorados se pueden obtener mediante el mejoramiento gentico forestal, al seleccionar la mejor descendencia en generaciones sucesivas, o mediante la ingeniera gentica, transfirindoles genes de inters provenientes de cualquier otro grupo taxonmico, generando rboles genticamente modificados. Independientemente del mtodo de obtencin de los rboles con genotipos superiores, es crucial contar con un sistema de propagacin de tales genotipos a gran escala de manera eficiente, pues esto puede permitir mayores avances en los programas de mejoramiento gentico y el despliegue masivo de estos genotipos para fines de reforestacin o el establecimiento de plantaciones forestales. Partiendo del supuesto de que todas las clulas de una planta (a excepcin de las clulas gamticas) contienen la misma informacin gentica y que, por tanto, cada una de las clulas puede regenerar una planta completa, la embriognesis somtica es la tecnologa con ms potencial en cuanto a la eficiencia de propagacin, debido a que utiliza tejido indiferenciado (que contiene miles de clulas) para propagar los rboles, existiendo el potencial de obtener gran cantidad de clones a partir de un solo individuo. Si bien con esta tecnologa an no se ha logrado obtener la eficiencia necesaria para la produccin a gran escala (Gupta y Pullman, 1991), se han logrado muchos avances desde su descubrimiento en suspensiones celulares de Daucus carota en 1958 y se ha probado su potencial de aplicacin para un amplio rango de sistemas de cultivo de tejidos en plantas, teniendo la posibilidad de aplicacin para probablemente todas las especies vegetales (Von Arnold, 2008). Por otra parte, en lo que respecta a riqueza forestal, nuestro pas es el centro primario de diversidad de los gneros Quercus y Pinus, 140

(Challenger, 1998) y constituye un importantsimo centro mundial de recursos genticos de Pinus (Bermejo y Pontones, 2000), el gnero de rboles ecolgica y econmicamente ms importante en el mundo (Richardson y Rundel, 2000) con 38 especies, 10 variedades y 16 formas (Martnez, 1953; Challenger, 1998) de las 111 especies totales (Richardson y Rundel, 2000). Pero a pesar de esta gran riqueza gentica, los pinos de nuestra regin han sido pobremente estudiados (Perry et al., 2000). En lo que respecta a las tecnologas de propagacin mediante el cultivo de tejidos, no es diferente; la gran mayora de los trabajos se ha realizado en otros pases y, a excepcin de Pinus patula, con especies ajenas a nuestra regin. La mayor diversidad biolgica de nuestro pas se encuentra en los bosques (Challenger, 1998) y la tasa de deforestacin de aproximadamente 608 000 ha/ao (FAO, 2009) es un peligro preocupante para esta biodiversidad, as como para los servicios ambientales que proporcionan estos ecosistemas.

2. LA PROPAGACIN FORESTALES

DE

LOS

RBOLES

El principal objetivo de los programas de mejoramiento gentico forestal, tradicional o por ingeniera gentica, es la identificacin o el desarrollo de rboles o poblaciones de rboles con caractersticas deseadas, generalmente desde el punto de vista productivo: ya sea rboles de mejor calidad de madera, de fustes ms rectos, de mayores alturas, de ms resistencia a enfermedades o patgenos o de crecimiento ms rpido y por tanto de mayor productividad por rea de superficie (MagallanesCedeo, 2004), as como el establecimiento de poblaciones que sirvan como fuente de germoplasma (Marc, 2005). Por otra parte, los objetivos de las plantaciones forestales y de la reforestacin, se basan en utilizar preferentemente estos rboles desarrollados-identificados con el mejoramiento gentico. De tal forma que para el implemento de programas de reforestacin o plantaciones forestales (en los que se requieren grandes cantidades de rboles), as como para los propios fines del mejoramiento gentico, se han desarrollado sistemas de propagacin tanto sexual como asexual que permiten la produccin masiva de los rboles mejorados, siendo los objetivos del programa, as como la conveniencia, los factores que determinan el mtodo de propagacin a utilizar. La figura 1 muestra la alternancia entre estos ciclos de reproduccin sexual y asexual. 141

Figura 1. Reproduccin de los rboles forestales por medio de los ciclos sexual y asexual. El ciclo sexual slo se puede llevar a cabo por medio de semillas. Comienza con la unin de las clulas germinales de ambos parentales y el subsecuente desarrollo de un embrin que alcanza la etapa reproductora y produce clulas germinales, repitiendo el ciclo y propagndose slo la mitad de la informacin gentica de ambos parentales. En el ciclo asexual se regeneran rboles a partir de varias partes de un rbol madre, propagndose toda la informacin gentica de este. Existen dos sistemas que permiten la propagacin vegetativa, la macropropagacin y la micropropagacin; en la primera se agrupan los injertos y el enraizamiento de estacas, en la segunda la organognesis y la embriognesis somtica (ES). Los clones pueden entrar tanto al ciclo sexual como al asexual para su propagacin. Figura modificada de PNUMA (2004).

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La propagacin sexual Esta va de propagacin slo se puede llevar a cabo por medio de semillas. Por cuestiones econmicas y de tiempo, esta ha sido la ms utilizada para la propagacin de los rboles forestales (Celestino et al., 2005; PNUMA, 2004), hacindose uso de semillas provenientes de rodales naturales o huertos semilleros (con rboles madre de genotipos superiores) o colectadas a granel (de genotipos desconocidos). Sin embargo, pueden presentarse inconvenientes que hacen que el uso de semillas no siempre sea el medio ms adecuado para la propagacin. Por ejemplo, los estudios que se realizan para la identificacin de los genotipos que permitan obtener mayores ganancias genticas en la siguiente generacin con respecto a alguna caracterstica dan como resultado que muy pocos individuos sean aptos para la propagacin, como consecuencia de la alta heterocigicidad y el alto componente gentico de tipo no aditivo (Zobel y Talbert, 1984). Por un lado, la alta heterocigocidad implica que un gran porcentaje de los individuos dentro de una poblacin llevan consigo un alelo dominante y uno recesivo para un determinado carcter, por otro, el alto componente gentico de tipo no aditivo implica que muchas de sus caractersticas fenotpicas de inters estn determinadas por genes individuales. Por lo tanto, gran parte de las caractersticas de inters en sus buenos valores, son determinadas por genes con accin no aditiva y adems recesivos, pues la alta heterocigocidad sugiere que la mayora de los individuos de la poblacin (3 de cada 4; 2 heterocigotos y un homocigoto dominante) expresan el alelo dominante que origina valores bajos para la caracterstica de inters. Por lo tanto, slo unos pocos individuos (1 de cada 4) que llevan consigo el gen en su carcter de homocigoto recesivo y que adems presenten la variable de inters (disminuyendo an ms la proporcin dentro de la poblacin), expresarn la caracterstica en sus valores deseables y sern los adecuados para la propagacin si en la siguiente generacin se quiere obtener un valor promedio superior al de la poblacin base. Si el objetivo es el mejoramiento, la desventaja de la propagacin sexual (con polinizacin abierta), es que los valores promedio para las caractersticas de inters sern similares en las generaciones siguientes, pues la probabilidad implicada en el proceso de reproduccin sexual establece que los homocigotos recesivos aparecen en la descendencia en la proporcin 1:3 (Ledig, 2004). Aunado a este inconveniente de la estabilizacin de las ganancias genticas, est la poca disponibilidad de semilla as 143

como sus propias caractersticas (con germinaciones inferiores al 100 %), cuando se opta por propagar los pocos individuos con las caractersticas deseadas. El principal inconveniente de la propagacin sexual son los tiempos de espera desde fases juveniles (que es cuando se realizan los ensayos genticos encaminados a la identificacin o el desarrollo de los mejores individuos para la reproduccin) hasta la produccin de semilla, que en gimnospermas van de 15 a 20 aos (Villalobos y Thorpe, 1991), lo que hace difcil la continuidad de los programas de mejoramiento a largo plazo (Magallanes-Cedeo, 2004). Otro inconveniente es el que se deriva de la ecuacin P = G + A + GA (Fenotipo es igual a Genotipo + Ambiente + interaccin Genotipo Ambiente), cuando se necesita propagar los rboles mejorados. Dicho inconveniente se debe a que en la propagacin por semillas no se propaga el genotipo completo de los rboles madre, sino slo la mitad, pues en la semilla se encuentra un embrin diploide que contiene un juego de cromosomas provenientes del rbol madre y otro juego proveniente de otro rbol, por lo tanto, a menos que la polinizacin sea controlada, se corre el riesgo de que ciertas familias de rboles no respondan de la manera esperada en los sitios (ambientes) de inters, o dicho de otra manera, el fenotipo de la descendencia puede diferir del fenotipo del rbol madre, corriendo el riesgo de perderse las ganancias genticas logradas en el rbol madre si este fue polinizado por otro individuo sin las caractersticas deseadas (Gupta y Pullman, 1991).

La propagacin clonal Cuando la propagacin por medio de semillas se dificulta o es menos conveniente, se puede recurrir a las tcnicas de propagacin vegetativa o clonal, en las que a diferencia de la propagacin sexual se replican genotipos completos. La propagacin clonal se realiza mediante macropropagacin o mediante micropropagacin. En la primera se agrupan mtodos convencionales como el enraizamiento de estacas y los injertos (de esquejes, pas o brotes); la segunda se realiza mediante dos sistemas de cultivo in vitro: la organognesis y la embriognesis somtica (MagallanesCedeo, 2004) (Figura 2). Actualmente se reconoce que los clones ofrecen ventajas potenciales sobre los rboles propagados sexualmente, al permitir informacin ms 144

precisa sobre los candidatos y pruebas genticas y seleccin en trminos de espacio y tiempo mucho ms eficientes (Figura 3) (Haapanen, 2009). Es as que, mediante el empleo de la propagacin clonal se han logrado mayores avances en los programas de mejoramiento gentico (Ford et al., 2005; Magallanes Cedeo, 2004). Las ventajas de la propagacin clonal se pueden resumir de la siguiente manera (MagallanesCedeo, 2004; Haapanen, 2009): a) Un potencial incremento en el rendimiento de una generacin durante un programa de mejoramiento, b) Se pueden seleccionar y multiplicar caracteres derivados de genes con accin aditiva y no aditiva, c) Los propgulos clonales pueden someterse a condiciones de estrs y varios tipos de mediciones destructivas para obtener informacin de multicaracteres sobre los candidatos, posibilitando la seleccin y el mejoramiento simultaneo de varios caracteres d) Los clones seleccionados se pueden mantener como bancos de germoplasma para posteriormente recombinarse mediante polinizacin controlada, e) Los clones seleccionados se pueden emplear en plantaciones comerciales, f) Los progenitores genticamente uniformes se pueden multiplicar en gran escala, g) El tiempo desde la siembra hasta el corte de los rboles se reduce con la propagacin clonal. Dentro de la macropropagacin, el enraizamiento de estacas ha sido el mtodo ms utilizado para la mayora de las especies forestales. Permite multiplicar un rbol hasta 1000 veces en un perodo de dos aos sin alterar sus genotipos (Aparicio-Rentera et al., 2006). La figura 4 muestra a grandes rasgos los pasos de esta tcnica. Una de las desventajas es que el xito del enraizamiento y la tasa de crecimiento de las estacas enraizadas disminuyen a medida que aumenta la edad del rbol de origen (Magallanes-Cedeo, 2004; Olmos et al., 2004; Aparicio-Rentera et al., 2006) y se pueden presentar problemas de plagiotropismo (Wigmore y Woods, 2000; Aparicio-Rentera et al., 2006). Por lo tanto, si en un ensayo de procedencias o de progenies se han identificado rboles con buenas caractersticas, se tiene un perodo de tiempo muy corto antes de que ya no sea posible la propagacin por esta va, de otra forma, como se mencion antes, es muy largo el perodo de espera para la produccin de semilla y progenie que sirva como fuente de propagacin. El enraizamiento de estacas en leosas como Cryptomeria japonica (kiri), Populus (lamo) y Salix (sauce) se ha practicado durante siglos en Asia y Europa (Olmos et al., 2004). A la fecha, P. radiata es la nica 145

especie de pino en la que se ha pasado a la fase operacional usando este mtodo (AparicioRentera et al., 2006).

Figura 2. La propagacin clonal permite mayores ganancias genticas que la propagacin por medios sexuales. En la figura se muestra la relacin entre la exactitud de la seleccin (indicada como la correlacin entre el valor de cruzamiento real y la media de la familia) y el tamao de la familia, aplicando propgulos vegetativos o progenies de polinizacin abierta de un candidato en una prueba gentica. Conforme aumenta el tamao de la familia, la exactitud de seleccin se incrementa tanto en los individuos de propagacin sexual como en los clones, sin embargo, en estos ltimos los valores son superiores, lo que indica que al haber mayor exactitud en la seleccin de los candidatos, habr, por tanto, mayores ganancias genticas para las variables de inters en la generacin siguiente. (Figura modificada de Haapanen, 2009).

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Figura 3. Duracin aproximada de los ciclos de reproduccin en cuatro estrategias de mejoramiento alternativas. Todas las estrategias comienzan con rboles adultos previamente seleccionados (candidatos) de una poblacin base y finalizan con la seleccin de los 147

mejores individuos. En las primeras tres estrategias se utilizan rboles propagados por semilla, en la cuarta se utilizan propgulos clonales (de la fase de vivero en adelante). En la seleccin fenotpica los rboles se seleccionan slo por su apariencia y para llevarla a cabo se requieren aproximadamente 20 aos: 6 aos para el cruzamiento de los candidatos y la produccin de semilla + 1 ao para el crecimiento de la progenie en vivero + 13 aos para la seleccin fenotpica (en campo o en vivero). En las pruebas de progenies los rboles se seleccionan tomando en cuenta el rendimiento de sus progenies, el ciclo dura 30 aos: 6 para el cruzamiento de los candidatos y la produccin de semilla + 1 para el crecimiento y evaluacin de la progenie en vivero + 10 para el raleo de la poblacin base y el cruzamiento y produccin de semilla de los candidatos cuyas progenies dieron mejores rendimientos + 13 para las pruebas de progenies de los mejores candidatos. La tercera estrategia combina la seleccin fenotpica con la prueba de progenies y tiene una duracin mayor que cualquier otra estrategia, 41 aos. La prueba de clones dura aproximadamente 25 aos: toma 6 aos cruzar a los candidatos de la poblacin base y la produccin de semilla de estos + 6 aos para la clonacin de la descendencia y crecimiento de los clones en vivero + 13 aos para las pruebas de los clones en campo. En la grfica, la eficiencia en la seleccin aumenta de izquierda a derecha. De las tres estrategias que utilizan la reproduccin sexual, es ms exacta la que combina la seleccin fenotpica y la prueba de progenies. Si bien la prueba de clones dura 5 aos ms que la seleccin fenotpica, hay ms eficiencia en la seleccin que en la combinacin de la seleccin fenotpica y la prueba de progenies y en menos tiempo (16 aos menos). (Figura modificada de Haapanen, 2009).

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Figura 4. Propagacin por enraizamiento de estacas. Si los rboles con buenas caractersticas se identifican a edad temprana, se puede asumir que los mismos patrones de desarrollo se mantendrn en el rbol adulto (correlacin gentica entre edades juvenil-adulta) y se puede recurrir directamente a la propagacin por estacas. De otra manera se puede esperar a que el rbol llegue a la fase reproductiva, hacer cruzamientos controlados y utilizar su descendencia para la propagacin. Ya sea si se utiliza la descendencia o el parental para la propagacin, se hacen cortes de ramitas de 2 a 8 cm preferentemente de la parte inferior del rbol madre cuando este no sobrepasa los 5 aos de edad y se sumergen durante corto tiempo en soluciones que contienen hormonas como el IBA (cido indolbutrico), o este en combinacin con NAA (cido naftalenactico), para inducir la formacin de races adventicias, despus se transfieren a sustratos especficos (peat moss, perlita, agrolita o combinaciones) bajo condiciones de invernadero. Una vez enraizados los cortes se transfieren a huertos para su posterior crecimiento y evaluacin (Figura modificada de Wigmore y Woods, 2000).

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Se reconoce que la prueba de clones en los programas de mejoramiento puede conducir a una seleccin ligeramente distorsionada debido a los efectos de genes no aditivos y a los efectos no genticos de la propagacin (problemas de enraizamiento, plagiotropismo) que pueden producir estimaciones parciales de los valores aditivos de reproduccin. Tales efectos son, sin embargo, usualmente asumidos como minsculos en comparacin con los beneficios de los materiales de prueba reproducidos vegetativamente (Haapanen, 2009). Olmos et al. (2004) mencionan que si bien los clones generan al menos un 10 % ms de incremento en ganancia gentica que la reproduccin sexual, el empleo conjunto de propagacin sexual y asexual puede generar an ms ganancia: por un lado, la reproduccin sexual es importante para la introduccin de genes nuevos, prevenir los efectos de la endogamia y el mejoramiento de caractersticas controladas por efectos aditivos de genes; la reproduccin asexual, por otro lado, permite la multiplicacin de las variables generadas con la reproduccin sexual, determinadas por genes aditivos y no aditivos. Como se mencion antes, el uso de cualquier mtodo de propagacin se determina por los objetivos del programa a implementar. As, en los programas de reforestacin donde se pretende la restauracin ecolgica, es decir, la recuperacin de las caractersticas de un ecosistema natural (como la variabilidad gentica), el uso de muy pocos genotipos como son los clones, no es la mejor opcin. Por el contrario, en la silvicultura en donde el inters es la alta produccin, el uso de clones es ms adecuado siempre y cuando se foreste con una variedad de genotipos mnima, que depende del tamao efectivo de la poblacin (Wigmore y Woods, 2000) y de especies, que permitan emular las caractersticas de las comunidades naturales en las que existe diversidad tanto inter como intraespecfica (Carnus et al., 2003).

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3. EL CULTIVO MICROPROPAGACIN FORESTALES

DE DE

TEJIDOS LAS

Y LA ESPECIES

A fin de sobrepasar las dificultades que se presentan en la propagacin sexual por semillas o en la propagacin clonal por enraizamiento de estacas (Villalobos y Thorpe, 1991) se han desarrollado sistemas de propagacin basados en las tcnicas del cultivo de tejidos vegetales in vitro. Tericamente estos sistemas tienen ventajas sobre los sistemas de macropropagacin, pero a pesar de su gran potencial an no se ha logrado pasar a la fase operacional en la gran mayora de las especies forestales (Bomal y Tremblay, 1999; Wigmore y Woods, 2000), por lo que en la actualidad el establecimiento y estandarizacin de sistemas de cultivo in vitro en especies leosas se considera fundamental tanto para su micropropagacin masiva como para su transformacin gentica (Ocampo y ManuelNez, 2007) y por tanto, para el avance en los programas de mejoramiento. El concepto de cultivo de tejidos vegetales abarca tanto el cultivo asptico de tejidos como el de clulas y rganos, dentro de un grupo de tcnicas que se fundamentan en dos principios principales (Villalobos y Thorpe, 1991): la totipotencialidad celular y la hiptesis del balance hormonal. As, las clulas somticas de cualquier tejido vegetal podran regenerar una planta completa de acuerdo con la competencia que posean y al estmulo que reciban (Olmos et al., 2004). El cultivo de tejidos vegetales consiste en cultivar aspticamente diferentes explantes constituidos por fracciones de un tejido u rgano que se extrae de una planta; la micropropagacin es prcticamente una multiplicacin masiva in vitro (Villalobos y Thorpe, 1991). Villalobos y Thorpe (1991) mencionan las siguientes ventajas de la micropropagacin sobre los sistemas convencionales de propagacin: a) Incremento acelerado del nmero de plantas derivadas por genotipo, b) Reduccin del tiempo de multiplicacin, c) Posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una superficie reducida, a bajos costos y en tiempos econmicamente costeables, d) Mayor control sobre la sanidad del material que se propaga, e) Facilidad para transportar el material in vitro de un pas a otro con 151

menos restricciones aduaneras, f) Posibilidad de multiplicar rpidamente una variedad de la cual slo existan pocos individuos. La micropropagacin de conferas, especialmente el caso de pinos, se puede hacer mediante los mencionados sistemas de cultivo in vitro, organognesis y embriognesis somtica. Entre ambos sistemas existe una diferencia principal: en la organognesis se obtienen rganos unipolares como brotes o races adventicias a partir de grupos de clulas que tienen conexiones vasculares con el explante o el tejido circundante, mientras que en la embriognesis somtica se originan embriones bipolares a partir de clulas individuales o grupos de clulas que no tienen conexiones vasculares con el tejido circundante (Olmos et al., 2004; Litz y Jarret, 1991; Radice, 2004; Gahan y George, 2008). En angiospermas, los embriones y rganos se pueden obtener directamente del explante o indirectamente pasando por una fase de callo como respuesta a un determinado estmulo generado por el tipo, combinacin y concentracin de los reguladores del crecimiento vegetal (Hicks, 1980; citado por Radice, 2004; Litz y Jarret, 1991), lo mismo ocurre en Pinus, a excepcin de la embriognesis directa (Figura 5). La micropropagacin comprende 4 fases generales (Murashige, 1974; Debergh y Maene, 1981; Olmos et al., 2004; Villalobos y Thorpe, 1991) que pueden variar dependiendo de la ruta de micropropagacin (George y Debergh, 2008): Etapa 0: Eleccin del material vegetal. Debe asegurarse la eleccin de explantes libres de patgenos o contaminantes y que respondan al cultivo in vitro. Se toma en cuenta el estado sanitario general de la planta donante, el tipo de rgano que se usar, el tamao, la edad ontognica y fisiolgica del mismo y la estacin en la cual se colecta. Generalmente la planta madre se selecciona de acuerdo a las caractersticas agronmicas deseables y los rganos jvenes que dan mejor respuesta al cultivo in vitro.

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Figura 5. Micropropagacin en Pinus. La micropropagacin se inicia colocando diversos explantes previamente desinfectados, en medios semislidos con cierta composicin nutritiva y hormonal. En tales explantes, se puede inducir la formacin de rganos o embriones somticos directa (lneas continuas) e indirectamente pasando por una fase de callo (lneas discontinuas). Los megagametofitos y las acculas jvenes la mayor parte de las veces originan callos de tejido indiferenciado; los embriones cigticos maduros, o partes de ellos, tambin pueden generar callos de tejido indiferenciado, o bien se puede inducir la formacin directa de brotes adventicios. No se ha reportado la embriognesis directa en este gnero (lnea continua verde). Una vez que se obtiene el callo de tejido indiferenciado, puede pasarse a medios lquidos para acelerar su proliferacin e inducir la formacin de embriones somticos, o bien se puede dejar en los medios semislidos para inducir la formacin tanto de brotes como de embriones somticos. A su vez, los brotes directos e indirectos y los embriones somticos pueden generar tejido indiferenciado. La micropropagacin termina con el enraizamiento de los brotes o embriones en medios semislidos, finalmente regenerndose rboles completos. 153

Etapa 1: Establecimiento del cultivo asptico. El objetivo es establecer cultivos viables y axnicos. El aislamiento y la desinfeccin de los explantes son los procesos a controlar, pues en el medio de cultivo pueden crecer bacterias u hongos que competirn ventajosamente con el explante. Para esto se hace uso de campanas de flujo laminar y materiales estriles que aseguran la asepsia en el proceso. La desinfeccin incluye el uso de compuestos como el hipoclorito de sodio y de calcio, el perxido de hidrgeno, el nitrato de plata y el alcohol a diferentes concentraciones. La seleccin y concentracin de los desinfectantes, as como los tiempos de aplicacin, se realizan por ensayos de prueba y error. Un mtodo eficiente consiste en el uso alterno de hipoclorito de sodio (de 0.5 a 1.5% de cloro activo) adicionado con unas gotas de tensoactivos que favorezcan su penetracin y actividad (como el Tween 20 o el Tritn ), pasando a alcohol al 70% y finalizando con 3 a 5 enjuagues con agua destilada estril. Etapa 2: Multiplicacin. En esta etapa, el explante (o sus clulas) se multiplica con la formacin de callos o sin ella, segn las condiciones de cultivo. El objetivo es mantener y aumentar la cantidad del tejido indiferenciado o de brotes para los nuevos ciclos de multiplicacin sucesivos, as como la induccin de rganos o embriones que se puedan destinar a la siguiente etapa de micropropagacin. Para esto se hacen subcultivos regulares de los tejidos hacia medios de cultivo frescos. En esta etapa ocurren los procesos celulares que conducen a la formacin de una nueva planta, por lo que los medios de cultivo, el balance hormonal y las condiciones de crecimiento juegan un papel crtico. Cuando la va de propagacin es la organognesis, esta etapa se subdivide en dos subetapas: la induccin y la multiplicacin, la primera implica la desdiferenciacin celular con el empleo de concentraciones elevadas de reguladores del crecimiento (de auxinas ms que de citocininas); la segunda requiere de un balance hormonal que favorezca los procesos de diferenciacin y multiplicacin celular (citocininas) para la induccin y formacin de los rganos. Cuando la embriognesis somtica es la va, se agregan dos subetapas ms: la maduracin y la germinacin, y la subetapa de multiplicacin se denomina proliferacin. En esta etapa se pueden utilizar distintos medios de cultivo, cada cual con diferentes componentes y concentraciones de los mismos. Generalmente se emplea el medio MS (Murashige y Skoog, 154

1962) a su concentracin completa, sin embargo, en gimnospermas, el uso de medios con baja concentracin de sales minerales y de nitrgeno resulta ms conveniente. Etapa 3: Enraizamiento y aclimatacin. En esta etapa se produce la formacin de races adventicias, para lo cual se requiere el trasplante de los brotes o embriones obtenidos a un medio de cultivo que las induzca, o bien este enraizamiento se puede realizar ex vitro en el caso de los brotes, no as para los embriones somticos. In vitro, cuando la va es la embriognesis, se emplean medios de cultivo desprovistos de reguladores del crecimiento para permitir la germinacin de los embriones somticos. Cuando la va es la organognesis, los medios con baja concentracin salina (50 o 25% de la concentracin original) han dado resultados positivos en diferentes especies, por ejemplo el medio Murashige et al. (1962) diluido al 50%; adems la fuente de carbono se reduce a una concentracin final de 12%. Tambin se requiere cambiar el balance hormonal: disminuir las citocininas y aumentar las auxinas exgenas o utilizar slo auxinas. En general, los brotes de buen tamao se colocan durante perodos cortos (unas pocas horas) en soluciones con concentraciones elevadas de auxinas, de las cuales la ms utilizada es el cido 3indolbutrico (IBA) a concentraciones de 1 a 10 M. Alternativamente, se pueden utilizar niveles ms bajos de auxinas (0.1 a 1 M), pero durante un perodo de tiempo ms prolongado (3 a 7 das). Tang et al. (1998, 1999 y 2001) han usado el medio TE y la combinacin de cido indolbutrico (0.5 mg/L), cido giberlico (0.5 mg/L) y bencilaminopurina (1 mg/L) en Pinus taeda con buenos resultados. Luego los brotes se transfieren a un medio de cultivo desprovisto de reguladores del crecimiento para permitir el desarrollo de las races. El empleo de medios de cultivo solidificados con cualquier gelificante presenta ventajas y desventajas sobre el enraizamiento. Por un lado se favorece un enraizamiento ms sincrnico, pero las races son delgadas o muy anchas y no se forman races cabellera con subsecuentes desventajas de anclaje y absorcin. Adems, el empleo de medios solidificados y auxinas puede conducir a la formacin de callo en la base de los brotes, lo que resulta en conexiones vasculares interrumpidas entre races y brotes.

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Ex vitro, el enraizamiento se realiza en sustratos esterilizados como la agrolita, vermiculita, mezclas de tierra y arena y/o abonos en cmaras que permitan el control de la temperatura y humedad relativas. Este mtodo permite que el enraizamiento y la aclimatacin se logren simultneamente y que no se forme callo en la base de los brotes, asegurndose una conexin vascular continua entre el vstago y la raz. No obstante, el estrs asociado a la evapotranspiracin durante las etapas iniciales del trasplante puede reducir la tasa de sobrevivencia. Si el sistema radical fue diferenciado in vitro, las plantas no pueden trasplantarse directamente a las condiciones de invernadero sin una paulatina adaptacin (perodo de endurecimiento). Para esto, las plantas se lavan tratando de eliminar todos los residuos de agar que puedan ser una fuente de contaminacin, despus se pasan a recipientes con suelo estril y se cubren con bolsas de polietileno, que se van perforando gradualmente hasta que se retiran en un perodo de 15 a 20 das.

4. FACTORES QUE AFECTAN EL PROCESO DE MICROPROPAGACIN

Son varios los factores que tienen influencia en el xito o fracaso del proceso de micropropagacin. A continuacin se mencionan estos factores y se da una breve descripcin de su influencia sobre la micropropagacin: El rbol que dona el explante Los tejidos del explante como fuente de material para inducir la formacin de embriones somticos u rganos adventicios son muy diversos, dependiendo principalmente de la especie en estudio. Hay plantas muy responsivas, tal como la zanahoria, en las cuales casi cualquier parte de la planta puede ser usada para establecer cultivos embriognicos y otras ms recalcitrantes, en las cuales slo explantes muy especficos, usualmente juveniles, son responsivos (Jimnez, 2005). Este es el caso de la mayora de los cereales y las conferas (Bhaskaran y Smith, 1990, citados por Jimnez, 2005; Stasolla et al., 2002). En conferas, en general el rbol madre debe ser sano, vigoroso y debe tener las caractersticas agronmicas deseadas. Tambin debe 156

considerarse la estacin del ao en la cual se toman los explantes. Explantes tomados del mismo rbol en diferentes momentos del ao pueden dar resultados no reproducibles. Esto puede deberse a la variacin en los niveles de contaminantes externos o a cambios estacionales en los niveles endgenos de los reguladores del crecimiento en el rbol madre (George, 2008). En Pinus, los mejores explantes son los embriones cigticos en fases tempranas de desarrollo, por lo cual se debe tomar en cuenta la fenologa de la especie en cuestin para saber la poca en la cual se deben hacer las colectas de conos que contengan semillas con embriones en la fase ptima de desarrollo, para mejores respuestas al cultivo in vitro. Actualmente uno de los principales factores que impiden el avance en los programas de mejoramiento gentico forestal mediante la propagacin clonal es el hecho de que no todos los genotipos de inters pueden propagarse por esta va, tanto por medio de enraizamiento de estacas como por cultivo de tejidos.

El explante Virtualmente todos los tejidos vegetales tienen la capacidad para formar tejido indiferenciado in vitro, sin embargo, pocos explantes tienen la capacidad para producir callos embriognicos u organognicos. El potencial embriognico de un explante es inversamente proporcional a su edad fisiolgica (Alleveldt et al., 1962, citado por Litz y Jarret, 1991). Hoy da, an cuando se han logrado adelantos importantes en el cultivo in vitro de las especies arbreas, sobre todo en conferas, un principio bsico prevalece: mientras ms joven es el tejido utilizado y se encuentre en crecimiento activo, mejores resultados se obtendrn en el proceso de diferenciacin de rganos o embriones, pues los tejidos y rganos maduros son poco sensibles a las condiciones in vitro (Magallanes-Cedeo, 2004). Esto puede deberse a que los tejidos maduros estn constituidos por clulas altamente diferenciadas que no pueden cambiar ya su estado de diferenciacin (Gahan y George, 2008), a diferencia de los tejidos jvenes que poseen un alto grado de actividad meristemtica, por lo que tienden a tener ms plasticidad in vitro (Litz y Jarret, 1991). Se puede observar variacin en la capacidad regenerativa entre explantes de diferentes rganos entre los mismos tipo de explantes provenientes de distintos rboles con genotipos relacionados lejana y cercanamente y tambin dentro de tejidos dentro del mismo explante (Tang et al., 157

2001). El tamao del explante tambin puede determinar la respuesta in vitro (Okazawa et al., 1967; Gukasyan et al., 1977, citados por Litz y Jarret, 1991). Los explantes grandes son ms difciles de esterilizar que los pequeos, pero generalmente los primeros poseen un potencial regenerador considerablemente mayor; la viabilidad y la capacidad de explantes muy pequeos tiende a ser baja, adems stos tienden a ser daados ms fcilmente (Litz y Jarret, 1991). Sin embargo, se han utilizado explantes pequeos con xito en varios sistemas in vitro, como el caso de cotiledones e hipocoyilos de Pinus taeda (Tang y Guo, 2001). Otro factor es la posicin del explante sobre el medio de cultivo; se ha observado que los embriones cigticos responden mejor al cultivo in vitro cuando el eje embrionario est en contacto con el medio de cultivo (Litz y Jarret, 2001), cuando este ltimo es semislido. En Pinus el explante ms utilizado para la embriognesis somtica ha sido el embrin cigtico, maduro o inmaduro. Sin embargo tambin se han utilizado cotiledones, pices caulinares y hojas jvenes (Lelu et al., 1994a; Attree et al., 1990; Mo y von Arnold, 1991; Salajov y Salaj, 2001, citados por Klimaszewska y Cyr, 2002; Malabadi y Nataraja, 2007). Para la organognesis el ms utilizado ha sido el cotiledn de embriones recin germinados. En la embriognesis somtica el estadio de desarrollo del embrin cigtico es un factor muy importante. Lelu et al. (1999) mencionan una de los estadios de desarrollo embrionario como sigue: 1) estadio de cuatro clulas; 2) divisin en poliembriones (cuatro en pinos); 3) embrin cigtico dominante y 4) embrin cigtico de precotiledonario a cotiledonario tardo. En la gran mayora de los estudios de embriognesis somtica en Pinus se han obtenido mejores resultados con la fase temprana del cuarto estadio, es decir, en la fase precotiledonaria, previo al desarrollo del primordio cotiledonario. No obstante, puede ser ms ventajoso obtener tejido indiferenciado con capacidad regenerativa a partir de embriones somticos maduros, pues no es necesario estar supeditado a la fenologa de la especie de inters.

El medio de cultivo Este factor ha sido el ms estudiado, pues el balance conjunto de todos sus componentes en las diferentes etapas de micropropagacin favorece o desfavorece todos los procesos celulares que conducen a la 158

regeneracin de una planta. El medio de cultivo suministra los nutrientes necesarios para el crecimiento de las clulas o tejidos en cultivo as como el balance hormonal que induce cualquiera de las dos vas de micropropagacin, segn la especie. La tasa ms alta de micropropagacin a menudo puede depender no slo de la eleccin del explante ms apropiado, sino tambin en el descubrimiento de la combinacin correcta de los reguladores del crecimiento y/o la mejor composicin nutricional para ese explante (Mathews, 1987, citado por Gahan y George, 2008).

5.

COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

In vivo, el crecimiento y desarrollo de una planta depende de la luz, el agua, la temperatura, los minerales del suelo y de la interaccin de numerosos factores internos, entre los que se encuentran las hormonas vegetales (Curtis y Barnes, 2003). En la micropropagacin los medios para el cultivo in vitro se disean para emular estas condiciones in vivo con la pretensin de mejorar la eficiencia en la produccin. En general el medio de cultivo lleva los siguientes componentes:

Macro y micronutrientes In vivo las plantas toman del suelo nutrientes minerales para complementar su desarrollo. Estos nutrientes son esenciales para muchas funciones diferentes. Curtis y Barnes (2003) mencionan las siguientes: la regulacin del balance de agua, el mantenimiento del balance de cargas en el interior de las clulas, algunos elementos son componentes esenciales de molculas biolgicas fundamentales (como el magnesio en la molcula de clorofila, el fsforo en la molcula de ATP o en el ADN o el nitrgeno en las protenas y el ADN), otros son componentes estructurales de las membranas celulares y/o controlan su permeabilidad, algunos son componentes indispensables de una variedad de sistemas enzimticos y suministran un ambiente inico adecuado para las reacciones enzimticas, algunos 159

desempean papeles importantes en la transduccin de seales y otros controlan los movimientos de las plantas. Los nutrientes minerales se agrupan en dos categoras segn su concentracin habitual en los tejidos vegetales: macronutrientes y micronutrientes. Nitrgeno, potasio, calcio, fsforo, magnesio y azufre se encuentran en mayores proporciones en los tejidos de las plantas y se agrupan entre de los macronutrientes; hierro, cloro, cobre, manganeso, zinc, boro, molibdeno, cobalto y sodio se agrupan dentro de los micronutrientes, debido a su menor proporcin en los tejidos vegetales. El medio de cultivo debe incluir estos elementos para permitir el funcionamiento de las clulas de los tejidos del explante. La ausencia o el nivel de alguno pueden traer efectos sobre el crecimiento de los cultivos (George y de Klerk, 2008). Al igual que en condiciones in vivo, los macronutrientes se suministran en proporciones mayores a las de los micronutrientes y todos se agregan al medio en formas asimilables para las clulas, es decir, en forma de sales.

Fuente de carbono Adems de agua y minerales, las clulas vegetales tambin necesitan una fuente de carbono para su crecimiento y suministro de energa. Esta fuente de carbono la suministran los carbohidratos o azcares. En el medio de cultivo, los azcares tambin se desempean como agentes osmticos, lo que implica cambios en la cantidad de agua al interior de las clulas. Los azcares son por mucho responsables del potencial osmtico de un medio de cultivo. Por ejemplo, Thorpe et al. (2008) mencionan que la adicin de sacarosa al 3% (w/v) es responsable para ms de 80% del total del potencial osmtico del medio White (1954), 60 % para el medio de Schenk y Hidelbrandt (1972) y para ms de la mitad del medio MS. Adems, al ser parte de un sistema ancestral de ajuste celular a condiciones crticas de disponibilidad de nutrientes, influyen en la modulacin de la expresin gentica, sin embargo, hasta ahora no se ha relacionado esta funcin de los carbohidratos sobre el crecimiento y el desarrollo organizado de las clulas en cultivo (Thorpe et al., 2008).

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In vivo, la sacarosa es el azcar ms utilizado por las plantas y generalmente es muy utilizable por los tejidos en cultivo in vitro, por lo tanto, es la fuente de carbono ms usada en los medios de cultivo. Sin embargo, se han usado diversas fuentes de carbono alternas que en algunos casos pueden igualar o superar los efectos de la sacarosa. Los azcares ms utilizados son la glucosa, fructosa, galactosa, manosa, arabinosa, ribosa, xilosa, sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa, lactosa y rafinosa. De los azcares anteriores, la glucosa, maltosa y rafinosa siguen a la sacarosa como la mejor fuente de carbono, los restantes azcares son menos efectivos: En la embriognesis somtica en Pinus se ha usado la glucosa, fructosa, maltosa y sacarosa, siendo la sacarosa la de uso ms comn. Sin embargo, en P. nigra la maltosa proporciona mejores resultados en la tasa de iniciacin que la sacarosa, la glucosa o la fructosa (Salajov y Salaj, 2005). Por otro lado, Pullman et al. (2003a) alternan las fuentes de carbono en las diferentes fases de la embriognesis somtica de Pinus taeda, utilizando la maltosa para la induccin, la sacarosa para la proliferacin y la maltosa para la maduracin. O bien, se ha usado la maltosa durante todas las fases del cultivo (Malabadi et al., 2005). Debido a la variacin observada en la respuesta a la fuente de carbono por parte de los explantes, es importante determinar cul es la fuente de carbono ms adecuada para un sistema de cultivo en particular.

Reguladores del crecimiento vegetal (RCV) Los agentes qumicos que ocurren naturalmente dentro de los tejidos vegetales) y que tienen un papel regulador en lugar de nutricional en el crecimiento y desarrollo, se denominan hormonas vegetales. Tales agentes qumicos generalmente son activos a muy bajas concentraciones y ejercen su funcin especfica en tejidos diferentes a los tejidos en los que fueron producidos (Machakova et al., 2008; Curtis y Barnes, 2003). Existen compuestos qumicos sintticos con actividades fisiolgicas similares a las hormonas vegetales, los cuales se conocen como reguladores del crecimiento vegetal (Machakova et al., 2008; Jimnez, 2005). Adems, algunas de las hormonas vegetales naturales se sintetizan artificialmente y cuando stas se agregan a los medios de cultivo, se nombran como reguladores del crecimiento vegetal para indicar que se han aplicado 161

fuera de los tejidos (exgenamente) (Jimnez, 2005; Machakova et al., 2008). Se reconocen cinco tipos principales de hormonas vegetales: auxinas, citoquininas, giberelinas, etileno y cido abcsico (Curtis y Barnes, 2003). Las auxinas y citocininas son por mucho las ms importantes para la regulacin del crecimiento y la morfognesis en el cultivo de tejidos. En estos grupos, se han descubierto reguladores sintticos con una actividad biolgica que es igual o superior a la de las equivalentes hormonas vegetales naturales (Machakova et al., 2008). Los RCV, como ya se mencion, representan uno de los principales fundamentos de la micropropagacin. Estos pueden promover la morfognesis an cuando la concentracin salina no sea la adecuada (Radice, 2004). Al igual que con los nutrientes minerales y la fuente de carbono, los tipos de RCV, sus combinaciones y concentraciones deben ser optimizados para cada especie, genotipo, explante y fase de multiplicacin especfica (Olmos et al., 2004). En condiciones ptimas de cultivo, los RCV pueden incrementar significativamente las tasas de micropropagacion (Radice, 2004). Los RCV ms utilizados y sus rangos de concentracin se muestran en la tabla 1. Ms recientemente se ha implementado el uso de una nueva generacin de reguladores del crecimiento tales como el jasmonato, oligosacridos, poliamidas y brasinosteroides, los cuales han probado ser tiles para inducir la embriognesis somtica en muchas especies vegetales (Von Arnold, 2008; Machakova et al., 2008). La respuesta a la induccin de tejido indiferenciado, mediada por los RCV es muy variable entre las diferentes especies del gnero Pinus. Incluso en algunos casos, como el de Pinus sylvertris, Pinus pinaster (Lelu et al., 1999) y Pinus nigra (Salajov y Salaj, 2005), no se necesitan RCVs para inducir la formacin de este tejido. En gimnospermas, particularmente en especies de Picea y Pinus, la combinacin de RCV ms utilizada es la del 2,4-D con BAP en el rango de concentraciones que se muestran en la tabla 1, siendo la estndar para el 2,4-D 9.5 M y 4.5 M para BAP (Klimaszewska et al., 2001). Tambin se ha utilizado el NAA, solo o en combinacin con el BAP. En Pinus taeda se ha combinado el BAP, NAA y KIN excluyendo al 2,4-D (Gupta y Pullman, 1991; Pullman y Johnson, 2002; Pullman et al., 2003a) con buenos resultados. En P. strobus y P. monticola la combinacin de 2,4-D y BAP en concentraciones menores a la 162

estndar, incrementa las tasas de iniciacin (Klimaszewska et al., 2001; Klimaszewska y Cyr, 2002). En Pinus nigra el NAA solo o las combinaciones de 2,4-D con BAP o NAA con BAP (todos a concentraciones bajas) resultan en tasas de iniciacin (TI) similares en promedio (Slajov y Salaj, 2005). Por otra parte, en Pinus pinaster la TI se incrementa en un medio con 2,4-D a concentraciones ms altas que la estndar y la mitad de la concentracin estndar de BAP (Klimaszewska y Cyr, 2002). Adems, en algunas familias de Pinus taeda la TI se incrementa en un medio con 2,4-D, BAP y ABA (40 M) (Klimaszewska y Cyr, 2002); en otros casos la TI se incrementa con NAA, BAP, KIN y ABA (3.7 M) en esta misma especie (Pullman et al., 2003b). Cabe sealar que estas combinaciones y concentraciones de RCV se han utilizado medios basales diferentes.

Vitaminas Las vitaminas son sustancias orgnicas esenciales para el crecimiento y la funcin normal de las clulas ya que se desempean como intermediarios o catalizadores metablicos (Curtis y Barnes, 2003; Thorpe et al., 2008). Usualmente se requieren en cantidades pequeas. Si bien en condiciones naturales una planta puede suplirse sus requerimientos vitamnicos, las clulas y tejidos vegetales en cultivo pueden volverse deficientes en algunas vitaminas, as que el crecimiento y sobrevivencia se mejora mediante la adicin de estas sustancias al medio de cultivo. Las vitaminas ms usadas en el cultivo de tejidos vegetales son la tiamina (B1), el cido nicotnico (niacina), la piridoxina y el myo-inositol (Thorpe et al., 2008). Aunque generalmente se acepta que nicamente la tiamina es esencial para el crecimiento continuo in vitro, como medida de precaucin se han usado mezclas de varias vitaminas, que en algunos casos pueden ser benficas (Litz y Jarret, 1991).

Aminocidos Los aminocidos son las unidades estructurales de las protenas. Pero debido a que la mayora de las plantas pueden sintetizar casi la totalidad de los aminocidos de sus protenas, la adicin de stos al medio de cultivo se hace para proporcionar una fuente de nitrgeno reducida utilizable por las clulas en cultivo. Si 163

bien, un apropiado ajuste de nitrato y amonio puede ser suficiente para suplir las necesidades de nitrgeno, en algunos casos la adicin de aminocidos (formas L) al medio de cultivo puede producir mejores resultados que en su ausencia. En algunos sistemas de micropropagacin, se generan mejores resultados con la adicin de protenas hidrolizadas, de las cuales la casena es la ms utilizada. (George y de Klerk, 2008). CONCENTRACIN (M) 0.140 136 0.12 140 110 120 0.118.6 110 15 0.011 525 0.581.5 20120 2-10

TIPO DE RVC

NOMBRE cido 3indolbutrico cido 2,4diclorofenoxiacti co cido 3indolactico cido naftalenactico Picloram N-6bencilaminopurina Cinetina Zeatina Isopentiladenina Tidiazuron N-bencil-9-(2tetrahidropiranil) adenina cido giberlico cido abcsico Triacontanol

ABREVIACIN IBA 2,4-D AIA NAA --BAP KIN ZEA iP TDZ BPA GA3 ABA TRIA

Auxinas

Citicininas

Giberelinas cido abcsico Triacontanol

Tabla 1. Principales RCV utilizados en el cultivo de tejidos. (Basado en Olmos et al., 2004).

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Agente gelificante Los gelificantes ms utilizados son el agar, la agarosa y el gellan gum. Estos proporcionan matrices de apoyo para los explantes y tienen efectos sobre el potencial osmtico del medio de cultivo. En algunos casos, como el del agar, pueden colaborar con macro y microelementos como el calcio, sodio, potasio y fosfato, carbohidratos, aminocidos y vitaminas, que tambin tienen efectos sobre el potencial osmtico y las caractersticas nutritivas del medio de cultivo (Thorpe et al., 2008). Las concentraciones del agente gelificante pueden considerarse inadecuadas si no sostienen a los explantes y se produce hierhidricidad. Por otro lado, la hiperhidricidad disminuye cuando se aumenta la concentracin del gelificante pero puede reducirse la tasa de crecimiento (Thorpe et al., 2008). En algunos estudios se han encontrado grandes diferencias en la embriognesis somtica y la organognesis acorde con el agente gelificante utilizado. Esto se debe principalmente al efecto que ejercen sobre el potencial osmtico del medio de cultivo, es decir, en la disponibilidad de agua por parte de los tejidos en cultivo. Cuando las concentraciones de los diferentes agentes gelificante se ajustan a modo de permitir el mismo potencial osmtico del medio, los resultados en la micropropagacin son similares (Owens y Wozniak, 1991). Algunos otros gelficantes son los alginatos, el almidn, la Kappa-carragina, el sago y el isubgon, los cuales en algunos casos mejoran los resultados obtenidos con los gelificantes ms utilizados (Thorpe et al., 2008).

Agentes absorbentes de sustancias txicas El estrs al que se someten los explantes durante el cultivo in vitro induce la excrecin de compuestos fenlicos que son muy lbiles y fcilmente oxidables y que pueden inhibir el crecimiento de los tejidos en cultivo (Olmos et al., 2004; Litz y Jarret, 1991; Radice, 2004). Para minimizar al mximo el efecto de estos compuestos, se pueden agregar sustancias como el carbn activado y la polivinilpirrolidona (Olmos et al., 2004). De ambos, el carbn activado es el ms ampliamente utilizado. Moshkov et al. (2008) menciona que tambin se utiliza para prevenir el crecimiento no deseado de callo, para promover la morfognesis (particularmente embriognesis), para promover la formacin de races y para actuar como reservorio de los metabolitos 165

vegetales secundarios. En cuanto a la inhibicin del crecimiento del callo, cabe mencionarse que tal efecto se debe a que el carbn activado absorbe las auxinas y citocininas del medio de cultivo (Weatherhead et al., 1978; citado por Litz y Jarret, 1991), por lo que su adicin al medio de multiplicacin debe evitarse. Adems, este efecto del carbn activado, en la reduccin de los niveles de auxinas y citocininas, es muy importante para etapas como la maduracin de los embriones somticos en la embriognesis. Se sabe que las auxinas promueven la proliferacin de los callos pero inhiben la formacin de embriones somticos (Litz y Jarret, 1991; Komamine et al., 1992). Por lo tanto, la adicin de carbn activado al medio de maduracin en la embriognesis somtica, puede evitar los efectos desfavorables de las auxinas remanentes en los tejidos que se han transferido a medios de induccin y maduracin de embriones somticos. De igual forma, el carbn activado ha favorecido la germinacin de los embriones somticos (Litz et al., 1980; Fridborg et al., 1975; citados por Litz y Jarret, 1991).

Los factores fsicos Varios factores fsicos tienen efectos sobre la micropropagacin. Se pueden mencionar la forma fsica del medio, la temperatura de cultivo, la luz, el pH, el potencial osmtico as como el recipiente de cultivo, el cual tiene efecto sobre el intercambio gaseoso con el medio externo as como en la humedad relativa interna (Olmos et al., 2004; Villalobos y Thorpe, 1991; Radice, 2004; Litz y Jarret, 2001). La forma fsica del medio de cultivo puede ser lquida o parcialmente solidificada con un agente gelificante. El empleo de una u otra forma depende del sistema de cultivo y sus objetivos (George, 2008). Los medios semislidos son ampliamente usados en la etapa de establecimiento; en estos, los cultivos se mantienen estticos y se sostienen por encima del medio, por lo que no se requieren tcnicas especiales de aireacin (George y Davies, 2008). En los medio semislidos slo la superficie inferior del explante entra en contacto con el medio, de modo que cuando comienza el crecimiento de las clulas responsivas del explante, puede haber gradientes de nutrientes, de reguladores del crecimiento y de desechos del metabolismo entre el medio y el tejido (George, 2008; George y 166

Davies, 2008). La difusin gaseosa hacia adentro y afuera de las clulas tambin puede restringirse en los medios semislidos. Los medios lquidos son esenciales para los cultivos en suspensin y se prefieren para experimentos crticos sobre nutricin, crecimiento y diferenciacin celular en callos de tejido indiferenciado (George, 2008), debido a que una gran rea de superficie del explante entra en contacto con el medio proporcionndose un abastecimiento ms homogneo de nutrientes y reguladores del crecimiento. Adems, en los medios lquidos los metabolitos txicos que pueden acumularse en la vecindad de los tejidos son efectivamente dispersados (George y Davies, 2008). En Pinus, el empleo de esto tipos de medios de cultivo difiere en los dos sistemas de micropropagacin. Por una parte, en la organognesis a diferencia de algunos sistemas de cultivo de tejidos en angiospermas (White, 1939, citado por Litz y Jarret, 1991; George, 2008), todas las fases del proceso se realizan en medios slidos (Tang et al., 1998, 1999, 2001; Scaltsoyiannes et al., 1994; Calixto y Pais, 1997; Alonso et al., 2006; Kalia et al., 2007). En estos medios, retoos y races adventicios crecen en una manera ms ordenada, a diferencia de los medios lquidos en donde el crecimiento es desorientado, fracasando la conversin de brotes adventicios en retoos (George y Davies, 2008). Por otra parte, en la embriognesis somtica se puede alternar el uso de ambos medios (Pullman et al., 2003a; Salajov et al., 2005; Ford et al., 2005; Gupta y Pullman, 1991) o bien, al igual que en la organognesis, se puede llevar a cabo todo el proceso en medios slidos (Klimaszewska et al., 2001; Lelu et al., 1999). Cuando se alternan los medios slidos y lquidos en la embriognesis somtica, la fase de establecimiento se realiza en medios slidos, en algunos casos se realiza en medio lquido (Pullman y Skryabina, 2007), la multiplicaci/proliferacin y la maduracin se ha realizado ampliamente en ambos y la germinacin se termina en medios slidos. Respecto a la produccin de embriones somticos, los medios lquidos tienen ms eficiencia que los medios slidos, sin embargo, la manipulacin se dificulta con los primeros. Actualmente los medios lquidos junto con la criopreservacin y la superioridad en la produccin de embriones somticos en comparacin con los medios slidos, se consideran los factores ms importantes que perfilan a la embriognesis somtica como la mejor va de propagacin masiva de los rboles forestales, debido al potencial que representan estos medios para la mecanizacin del proceso de propagacin en bioreactores (Gupta y Timmings, 2005), lo cual reducira los elevados 167

costos actuales de la propagacin mediante esta va (Celestino et al., 2005). La tasa de crecimiento de un cultivo puede depender del rgimen de temperatura adoptado (George, 2008) pues este factor ejerce influencia sobre otros factores fsicos y qumicos del medio de cultivo (Thorpe et al., 2008) y en general en el crecimiento ptimo de las clulas o tejidos en cultivo. Si bien en condiciones naturales de crecimiento los rboles experimentan cambios continuos de temperatura durante el da y la noche, la temperatura en el cultivo in vitro debe mantenerse estable (Radice, 2004; George y Davies, 2008). En cuanto ms se asemejen las condiciones trmicas in vitro a las ptimas de crecimiento in vivo de la especie estudiada, mayor ser la respuesta de los cultivos (Radice, 2004). Por ejemplo, en la micropropagacin de especies tropicales se utilizan temperaturas de cultivo ligeramente ms altas que en especies templadas (George y Davies, 2008). El rango de incubacin de los cultivos va de 18 a 28 C (Litz y Jarret, 2004), en gimnospermas, especialmente en Pinus y Picea., la incubacin se realiza preferentemente a 23 1 C. La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad y perodo de suministro (Villalobos y Thorpe, 1991; Radice, 2004). La respuesta morfognica de un explante puede variar segn se le proporcione luz o no. La oscuridad se prefiere para estimular la formacin de callo y para disminuir el efecto adverso de los fenoles sobre los cultivos, adems puede estimular la formacin de embriones somticos. El suministro de luz favorece la diferenciacin de rganos (Radice, 2004, Olmos et al., 2004) y tambin se ha utilizado para la maduracin de embriones somticos. En la micropropagacin de Pinus, cuando la va es la embriognesis somtica, se prefiere la oscuridad para la desdiferenciacin y la multiplicacin celular, la maduracin puede realizarse con luz u obscuridad y la germinacin se realiza con luz (Klimaszewska et al., 2001; Salajov y Salaj; 2005). Cuando la va es la organognesis, la luz es fundamental; se ha observado que en cultivos de Pinus radiata la luz interacciona con una citocinina durante la diferenciacin de los brotes adventicios y que la morfognesis no ocurre cuando falta uno de esos componentes (Villalobos et al., 1984, citados por Villalobos y Thorpe, 1991). Los procesos de fotosntesis y fotomorfognesis (George y Davies, 2008), necesarios para el buen crecimiento y desarrollo de las 168

plantas, dependen de la luz, por lo que el suministro de sta durante el enraizamiento es crucial para la aclimatacin ex vitro. Generalmente se utilizan lmparas de luz incandescente, de diferente intensidad lumnica y reguladas para el suministro mecnico durante determinados lapsos de tiempo (generalmente de 12 a 16 horas de fotoperiodo). El potencial de hidrgeno (pH) del medio de cultivo es otro factor crtico. ste influye en la regulacin de la actividad enzimtica de las clulas, ya que una enzima depende entre otros factores, de la atraccin y la repulsin entre los aminocidos con carga negativa (cidos) y los de carga positiva (bsicos) para mantener su conformacin. Cambios en el pH alteran estas cargas y con ello la configuracin de la enzima hasta que se altera tan drsticamente que ya no es funcional. Los cambios en el pH tambin influyen en el cambio de las cargas del sitio activo y el sustrato, resultando afectada su capacidad de unin (Curtis y Barnes, 2003). Tambin influye en la disponibilidad de los nutrientes del medio, ya que puede cambiar las propiedades qumicas de algunos elementos minerales volvindolos inaccesibles para los tejidos o clulas en cultivo. Adems, influye en el efecto de los reguladores del crecimiento (George y Davies, 2008), por lo que la desdiferenciacin celular y la morfognesis dependen del pH. En general el pH de la mayora de los medios de cultivo es de 5.7 o 5.8. Sin embargo, debe tomarse en cuenta que el pH del medio de cultivo disminuye despus del proceso de esterilizacin con altas temperaturas, tal como el autoclaveado, y disminuye an ms con el tiempo de almacenamiento. Por ejemplo, Skirvin et al. (1986) (citado por Torpe et al., 2008) encontr que el medio MS autoclaveado tenda a hacerse ms cido despus de 6 semanas de almacenamiento; un pH 5.7 inicial disminua a 4.6 despus del autoclaveado y a 4.1 despus de 6 semanas de almacenamiento. Se ha recomendado almacenar el medio de cultivo en la oscuridad a 4 C para minimizar los cambios en el pH. El potencial osmtico del medio de cultivo tambin afecta el crecimiento y la morfognesis in vitro. Como ya se mencion, ste tiene efectos sobre los niveles de agua al interior de las clulas, un factor muy importante que se aprovecha para inducir diversos estmulos a lo largo de las fases de la micropropagacin. Normalmente el potencial osmtico del medio es menor que el de las clulas as que el agua fluye hacia stas (Kirkham y Holder, 1981), por lo tanto, se 169

espera que tenga influencia sobre la tasa de la divisin celular o el xito de la morfognesis. La disminucin en el potencial osmtico del medio de cultivo puede producir hiperhidricidad si el medio es muy hipotnico, por otro lado, aumentos del potencial osmtico en el medio de cultivo provocan desecacin en las clulas, lo que puede inhibir el crecimiento de los tejidos (Thorpe et al., 2008). Durante el establecimiento de los cultivos es necesario disminuir al mnimo el estrs al que se someten los tejidos del explante, de modo que el medio de cultivo debe ser lo ms isotnico posible en relacin con el interior de las clulas del explante para favorecer un establecimiento normal con altos porcentajes de sobrevivencia. De igual forma, durante la induccin de la competencia o desdiferenciacin celular, fase que sigue inmediatamente al establecimiento, el medio de cultivo debe ser lo ms isotnico, a modo de permitir que el estrs causado por las concentraciones artificiales de los componentes del medio sea el nico factor que ejerza influencia sobre las clulas del explante, y permitir un medio en el que estas puedan dar una respuesta. Cuando las clulas se han vuelto competentes, en el caso de la organognesis y embriognesis somtica indirectas, stas pueden ser inducidas para diferenciarse en una cierta direccin, es decir, se determinan para formar ya sea embriones u rganos, segn los reguladores del crecimiento y los estmulos fsicos que se induzcan. Si bien la desecacin puede ser desfavorable en ciertas fases del proceso de micropropagacin, como la desdiferenciacin y la multiplicacin de los tejidos indiferenciados, puede ser favorable en fases como la induccin de la determinacin al aumentar el potencial osmtico del medio de cultivo (Klimaszewska y Smith, 1997; Kim y Mon, 2007; Klimaszewska et al., 2000; Ramarosandratana et al., 2001). Adems de la fuente de carbono, el agente gelificante, los macronutrimentos y el polietilenglicol tambin son agentes osmticos La forma y el tamao del contenedor puede afectar la tasa de crecimiento de los cultivos y la morfognesis in vitro. Se utilizan cajas de Petri (de plstico o de cristal), matraces Erlenmeyer o frascos de vidrio. El uso de uno u otro as como la forma de sellado afecta la aireacin y con ello la humedad relativa interna y el intercambio gaseoso entre el interior y el exterior, por lo que se originan diferentes concentraciones de gases como el oxgeno, el dixido de carbono, el etileno y otros compuestos voltiles dentro del espacio areo del contenedor (George y Davies, 2008). Para el sellado se pueden usar tapaderas de plstico (en el caso de los frascos de vidrio), films de 170

polietileno extensible o papel parafilm (en el caso de las cajas de Petri), papel aluminio o algodn (en los matraces Erlenmeyer). En cuanto al intercambio gaseoso se refiere, se recomienda una tasa ptima de intercambio entre los ambientes interno y externo del recipiente para permitir la entrada de O2 y evitar la acumulacin de CO2 y de etileno que pueden tener efectos adversos sobre los cultivos. Por lo tanto, el sellado del recipiente es importante; el intercambio gaseoso se limita ms con el empleo de una tapa de plstico que con un film de polietileno extensible (Olmos et al., 2004). La humedad relativa (HR) tambin depende del sello o cobertura del envase empleado. Si el cierre es hermtico la humedad interior ser del 100 %. Si el sellado del recipiente permite la aireacin, la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Grandes descensos del contenido de HR se relacionan con una rpida prdida de agua del medio de cultivo, lo que acarrea una variacin en la concentracin de sus compuestos hasta llegar a niveles txicos (Radice, 2004). La mejor talla y forma del recipiente puede variar de una especie a otra y puede depender de factores como el material del que est hecho, el tipo de sellado, el volumen del medio y la densidad de la inoculacin (George y Davies, 2008). El tiempo entre cada subcultivo. Se ha encontrado que en Picea y Pinus los callos pierden su potencial regenerador cuando se dejan durante largos perodos en el mismo recipiente y medio de cultivo (Salajov y Salaj, 2005; Salajov et al., 2005). Adems el potencial regenerador tambin declina cuando el tejido se mantiene en cultivo durante perodos prolongados, sin importar que los subcultivos se realicen en lapsos adecuados (Klimaszewska et al., 2009). A diferencia de gneros como Eucaliptus en donde los subcultivos se pueden hacer cada cuatro semanas y durante nueve aos sin perder el potencial regenerador (Jain, 2006), en Pinus y Abies se recomienda subcultivar el tejido indiferenciado cada dos o tres semanas as como hacer uso de tejido indiferenciado que no supere los 6 meses de cultivo (Klimaszewska et al., 2000; Klimaszewska et al., 2005; Jain, 2006). Alternativamente, el tejido se puede criopreservar.

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ESTUDIO DE LAS ENTEROBACTERIAS DEL RO LERMA EN EL MEANDRO DE LA PIEDAD, MICHOACN Y SANTA ANA PACUECO, GUANAJUATO
Consuelo Vargas Jurez, Alejandra Huramo Ochoa, Mara de los ngeles Beltrn Nambo, Yazmn Carren Abud y Miguel Martnez Trujillo
Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo

RESUMEN
El presente trabajo consisti en un estudio de las bacterias del agua del ro Lerma, en el tramo que corresponde al Meandro de las ciudades de La Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato. Form parte de un estudio ms general financiado por el gobierno estatal y federal, que se enfoc a dar propuestas de solucin al saneamiento de la zona y a su incorporacin a la zona urbana. Se establecieron 8 sitios de muestreo y se realizaron colectas en 4 ocasiones durante el ao 2009. Las muestras de agua se procesaron para la obtencin de colonias puras, las cuales fueron analizadas mediante pruebas bioqumicas con el sistema de galeras API20E. Con este sistema se identificaron 12 especies de la familia Enterobacteriaceae, entre las que se encuentran patgenas como Klebsiella pneumoniae y algunas patgenas oportunistas. Escherichia coli siempre estuvo presente en los sitios de muestreo, lo que refleja la contaminacin constante de origen fecal. Con los resultados obtenidos se recomendar a la poblacin de las ciudades que rodean la zona estudiada a travs de las autoridades municipales, a que no establezcan contacto directo con el agua y que cuando se utilice el agua para riego de plantas que se consumen de manera fresca, es necesario que se tomen las medidas sanitarias pertinentes.

1. INTRODUCCIN
Una de las cuencas ms afectadas por la contaminacin de desechos orgnicos es la del ro Lerma, en el tramo de Abasolo, Guanajuato a La Piedad, Michoacn. En esta cuenca se cuentan 300 granjas con casi 1.5 millones de cerdos que generan 3000 toneladas

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de estircol diarias y que equivalen a la contaminacin producida por 3.7 millones de habitantes (Domnguez, 1993). En esta rea una gran cantidad de agua es contaminada diariamente (entre 40 y 400 l/hab/da en el consumo humano diario y entre uno y diez litros de agua por producto fabricado en el medio industrial). Estas aguas residuales han sido, en su mayor parte, vertidas en el cauce del Ro Lerma sin ningn tratamiento y en su conjunto los desechos tienen como destino final los suelos y los cuerpos de agua. Varias especies de bacterias han sido estudiadas para evaluar su idoneidad como organismos indicadores. Entre los organismos estudiados, Escherichia coli y otras bacterias coliformes cumplen casi en su totalidad los requerimientos de un organismo indicador ideal y se consideran como los indicadores de ms confianza de una contaminacin fecal (Leclerc et al., 2001). En el estado de Michoacn se han realizado varios estudios de cuerpos de agua utilizando a las bacterias coliformes como indicadoras de contaminacin. Valads en 1993, hace un estudio de la calidad del agua residual del distrito 020 en el Valle Morelia-Querndaro para uso de riego, encontrando que en los meses de Septiembre a Noviembre se registraron los valores ms bajos tanto de coliformes totales como fecales y en los meses de enero a marzo se presentan los valores ms altos, lo cual es un indicador de que la precipitacin es un factor muy importante en la dilucin de contaminantes del agua. Beltrn en 1993, realiza un estudio de contaminacin fecal de la subcuenca este del lago de Cuitzeo, donde encontr que el mayor promedio de fecales se localizaban en la orilla del lago. Martnez en 1994, hace una evaluacin fsico-qumica y bacteriolgica (del grupo coliforme) del tratamiento de aguas residuales en las lagunas aireadas de INPAMEX, en Uruapan, Mich., en donde los valores obtenidos inicialmente son muy elevados, dadas las condiciones primarias del tratamiento en lagunas aireadas. Santos en 1995, reporta que las caractersticas fsico-qumicas, as como los anlisis bacteriolgicos demuestran que el lago de Zirahun no presenta una contaminacin importante de origen orgnico, excepto slo en ciertos meses y en algunas estaciones de muestreo que se

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encuentran cerca de los poblados ms grandes, mostrando con esto que el lago tiene capacidad de depuracin. Ferreira (1995) hace un estudio en la presa la Mintzita y el Ro Grande de Morelia, donde observa claramente cmo la contaminacin de origen fecal del ro en la parte cercana de su nacimiento es menor, siendo ms severa al recibir la descarga de CEPAMISA y las descargas de aguas residuales de otras industrias, as como el material fecal que proviene de la ciudad de Morelia. Miranda (1995) realiz un estudio la Laguna de Naranja de Tapia, en el municipio de Zacapu, Michoacn, donde se cuantificaron las bacterias coliformes totales y fecales; esta laguna se encontr en buenas condiciones y no presentaba gran contaminacin de origen orgnico. Corts (1996) realiza un estudio en la laguna de Zacapu, en donde los anlisis bacteriolgicos muestran que la mayor cantidad de bacterias totales coinciden con zonas cercanas a descargas de aguas residuales y materia orgnica, debido al aporte de nutrientes que stas proporcionan. Servn (1996) estudi la contaminacin de origen fecal de la presa Sabaneta, la cual presentaba un mnimo de contaminacin, debido a que se considera un cuerpo de agua joven que est ubicado en la cuenca alta o cabecera de la subcuenca del ro Tuxpan. Armenta-Medina (2007) hace un anlisis del agua de riego de los cultivos de la poblacin de Urutaro, Michoacn y determina los usos que se le debe dar al agua de riego. Sin embargo, es necesario en ocasiones hacer identificaciones para determinar si existen bacterias patgenas, sobre todo si el cuerpo de agua est en contacto estrecho con la poblacin humana. La familia Enterobacteriaceae o bacterias entricas son Gram negativas, anaerobias facultativas, con forma de bacilos rectos. Esta familia contiene 44 gneros y contiene algunos de los patgenos ms devastadores de animales y humanos, incluyendo Escherichia coli, Salmonella enterica y especies de los gneros Yersinia y Shigella. Aunque el nombre de la familia sugiere que son bacterias asociadas

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exclusivamente con animales, sin embargo, incluyen varios patgenos de plantas. La familia Enterobacteriaceae puede ser dividida en dos grupos con base en sus productos de fermentacin: la mayora como Escherichia, Proteus, Salmonella y Shigella, llevan a cabo fermentacin mixta y el cido pirvico puede producir principalmente lactato, acetato, succinato, formato y etanol. En contraste, Enterobacter, Serratia, Erwinia y Klebsiella son fermentadores de butanodiol, cuyos productos principales de fermentacin son butanodiol, etanol y bixido de carbono. Otros gneros de la Familia Enterobacteriaceae son los siguientes: Arsenophonus, Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Edwardsiella, Ewingella, Hafnia, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pragia, Providencia, Rahnella, Tatumella, Xenorhabdus, Yersinia y Yokenella. (Willey et al., 2008; Holt et al., 1994; Leclerc et al., 2001) Este trabajo se enfoc a identificar los principales gneros y especies de bacterias de la familia Enterobacteriaceae presentes en el agua del ro Lerma en la Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato y determinar los riesgos potenciales de enfermedades causadas por las enterobacterias del agua.

2. MATERIALES Y MTODOS
Descripcin del rea de estudio El municipio de La Piedad Michoacn se localiza al norte del Estado, en las coordenadas 20 21 de latitud norte y 102 02 de longitud oeste, a una altura de 1,680 metros sobre el nivel del mar; limita al norte con los Estados de Jalisco y Guanajuato, al este con Numarn, al sur con Zinparo, Churintzio y Ecuandureo, y al oeste con Yurcuaro. (Figura 1).

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Figura 1. Localizacin del rea de estudio.

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Sitios de muestreo Para definir los sitios de muestreo en el meandro que atraviesa las ciudades de La Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato, en el tramo del ro Lerma (meandro) y en el Dren artificial, se realiz un recorrido inicial por la zona. Con base en la accesibilidad, descargas residuales principales y consideracin de las reas representativas, se definieron 8 estaciones de muestreo (Figura 2).

Figura 2. Fotografa area del ro Lerma en su tramo que atraviesa las ciudades de La Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato. Tomada de Googleearth. Los sitios de muestreo se representan con tringulos. Los sitios se denominaron 1) Arroyo Zinparo, 2) Cuatro Milpas, 3) Puente Grande (Casto Saldaa), 4) Zaragoza, 5) Dren, 6) Planta de tratamiento, 7) El Malecn, 8) La Pursima.

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Se realizaron cuatro muestreos para cubrir las diferentes condiciones del ao. Las muestras de agua se tomaron en frascos de vidrio estriles de 100 ml, a una profundidad de 10 cm y posteriormente fueron colocados en hielo para evitar el crecimiento bacteriano. Se trasladaron las muestras al laboratorio para su anlisis.

Temperatura y pH del agua La temperatura se determin con un termmetro de mercurio 0 marca Brennan, con precisin de 1 C. Para determinar el pH se tom la muestra de agua (50 ml) y se coloc en hielo, para trasladarse al laboratorio, donde se utiliz un potencimetro Conductronic pH20. Las concentraciones de oxgeno disuelto, demanda bioqumica de oxgeno, nitratos y nitrgeno amoniacal, fueron solicitadas al subproyecto de Calidad del Agua. Aislamiento de colonias en Agar Nutritivo Las muestras con diferentes diluciones del agua se dispersaron sobre cajas de Agar Nutritivo slido utilizando una varilla de vidrio estril, pasada por alcohol y flameada. Las cajas se incubaron a 37C por 24 h y las colonias bacterianas diferentes en morfologa y color fueron resembradas en cajas individuales del mismo medio. Prueba de Gram Esta tincin clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. La tcnica incluye tincin primaria, decoloracin y tincin de contraste: a) Se tie el espcimen con el primer colorante, cristal violeta. b) Se aade el mordiente, yodo. c) Se aplica el agente decolorante, normalmente una solucin de alcohol-acetona. En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tincin violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante. e) Se adiciona safranina durante un minuto. f) Se retira el colorante con agua destilada y se observa al microscopio.

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Prueba de oxidasa (citocromo oxidasa) La prueba de citocromo oxidasa permite detectar la actividad de la enzima citocromo oxidasa de la cadena transportadora de electrones y por consiguiente separa a las Enterobacterias, que son todas oxidasas negativas, de otros Gram negativos, principalmente no fermentadores. Se sigui el protocolo de placa directa: a) Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. b) Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

Preparacin de la solucin salina 0.85% para suspensin bacteriana de API 20 E a) Pesar 8.5 gr de NaCl. b) Aforar a un litro con agua destilada o de preferencia tridestilada. c) Colocar en tubos de 7 ml con tapn de rosca, muestras de 4 ml. 0 d) Esterilizar a 120 C por 20 minutos.

Identificacin de gneros y especies de bacterias de la familia Enterobacteriaceae La galera API20E consta de 20 microtubos que contienen medios deshidratados. Las galeras se inocularon con una suspensin bacteriana en la solucin salina. El metabolismo de los microorganismos produce cambios de color en el medio, ya sea directamente o tras adicin de reactivos. Tras 18-24 horas a 35-37C se hizo la lectura de la galera segn la tabla proporcionada en el kit. Las galeras tienen diferentes pruebas que se describen a continuacin: ONPG, Es produccin de -galactosidasa, el sustrato utilizado es onitrofenil--D-galactsido. El medio es incoloro; pero si la reaccin resultara positiva cambiar a amarillo.

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ADH, Es la produccin de arginina dihidrolasa, el sustrato que se utiliza es arginina. Posterior a las 24 horas de incubacin se le aade una gota de reactivo TDA (3.4 g percloruro frrico + 100 ml de agua destilada). El medio es de color amarillo y una reaccin positiva lo har cambiar a marrn. LDC, Es la produccin de lisina decarboxilasa, se utiliza lisina como sustrato. El medio es de color amarillo y vira al naranja cuando la prueba es positiva. ODC, Es la produccin de ornitina decarboxilasa utilizando como sustrato ornitina. El medio es amarillo y una reaccin positiva lo hace virar hacia el naranja-rojo. CIT, Utilizacin de citrato. Cuando la prueba resulta positiva el medio vira del amarillo al verde. H2S, Produccin de sulfuro de dihidrgeno utilizando como sustrato tiosulfato de sodio. El medio es incoloro-grisceo y cuando la prueba es positiva se forma un depsito negro. URE, Produccin de ureasa. El sustrato es urea, y si la reaccin es positiva el medio de color amarillo vira al naranja-rojo. TDA, Produccin de triptfano desaminasa, utilizando como sustrato triptfano. El medio es amarillo y cuando la prueba es positiva se puede apreciar un viraje al marrn. IND, El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del pdimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano.

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VP, Prueba de Voges Proskauer. En sta se determina la va de fermentacin del butanodiol descrita en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. ste se revela en presencia de alfanaftol dando un color rojo-fucsia. GEL, Produccin de proteasas El medio contiene gelatina y tinta china. Si la bacteria estudiada produce proteasas capaces de hidrolizar el sustrato, la tinta china difunde, obtenindose una prueba positiva. En caso contrario la reaccin es negativa. Se cre una anaerobiosis con aceite de parafina en los ensayos: ADH, LDC, ODC, H2S y URE. Fermentacin de azcares. Los medios son de color azul verdoso; una reaccin positiva viene dada por una coloracin amarilla. Las pruebas especficas se describen en la tabla 1.

Tabla 1. Pruebas de azcares de las galeras API20E GLU MAN INO: SOR RHA SAC MEL AMY ARA fermentacin/oxidacin de glucosa fermentacin/oxidacin de manosa Fermentacin/oxidacin de inositol Fermentacin/oxidacin de sorbitol Fermentacin/oxidacin de ramnosa Fermentacin/oxidacin de sacarosa Fermentacin/oxidacin de melobiosa Fermentacin/oxidacin de amigdalina Fermentacin/oxidacin de arabinosa

3. RESULTADOS
En este trabajo se llev a cabo el estudio microbiolgico del meandro del Rio Lerma en La Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato, identificando a las Enterobacterias, ya que en estas localidades algunas de sus zonas agrcolas utilizan el ro como

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sistema de riego para sus plantas, que son utilizadas tanto para alimento humano como para el ganado. Adems, parte de la poblacin urbana se encuentra en contacto directo con el ro. El anlisis se realiz en 4 muestreos determinados. Las fechas de los muestreos fueron: Muestreo 1: 3 de febrero de 2009 Muestreo 2: 19 de mayo de 2009 Muestreo 3: 18 de agosto de 2009 Muestreo 4: 24 de noviembre de 2009 Identificacin de las Enterobacterias Las pruebas que permitieron identificar a las especies de Enterobacteriaceae fueron el aislamiento en medio EMB, la tincin de Gram para aislar a las Gram negativas y las pruebas bioqumicas mediante el Sistema de galeras de API20E. Las bacterias fueron aislados en cajas de petri y verificadas para comprobar que estaban puras en sus dos modalidades cocos y bacilos, as como en la tincin de Gram (Figura 3). de los sitios

Figura 3. Ejemplos de tinciones de Gram de colonias puras. Gram negativas (izquierda) y Gram positivas (derecha). Se realizaron las pruebas bioqumicas para cada una de las colonias puras Gram negativas recuperadas. En la figura 4 se presentan ejemplos de las coloraciones obtenidas con las pruebas realizadas.

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Figura 4. Aspecto de 4 galeras API20E despus de ser inoculadas por colonias puras aisladas en agar nutritivo, gram negativas, oxidasa negativas.

Los resultados obtenidos de las coloraciones de las galeras API20E y la prueba de oxidasa fueron capturados en el software ApiWeb, mediante las instrucciones de la empresa.

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En la tabla 2 se resumen las especies encontradas por sitio de muestreo, pero debe resaltarse que aunque las especies identificadas corresponden a colonias de un sitio de muestreo, no necesariamente se encontraban slo en ese lugar, ya que previamente por morfologa se seleccionaba una colonia de cada tipo aunque estuviera representada en varias estaciones. Por lo anterior, se asume que la distribucin de las especies de Enterobacterias fue ms amplia para las diferentes estaciones de muestreo.

Parmetros fsico-qumicos de los sitios muestreados Los parmetros fsico-qumicos que se determinaron fueron temperatura, pH y oxgeno disuelto. La demanda bioqumica de oxgeno (DBO), nitratos y nitrgeno amoniacal fueron solicitados al subproyecto de Calidad del Agua. En las tablas 3, 4, 5 y 6 se presentan los resultados obtenidos. Las temperaturas ms bajas se tuvieron en el primer muestreo y las ms altas en el tercer muestreo, aunque no se observ una correlacin con los otros factores. El pH fue ligeramente alcalino, entre 7.5 hasta 9.5, pero no se observ un patrn para cada sitio de muestreo. El oxgeno disuelto no fue detectable en la estacin 8 en los cuatro muestreos realizados, aunque no se correlacion con la demanda bioqumica de oxgeno, por lo que otros factores de naturaleza no biolgica estn influyendo en el agotamiento del oxgeno. En el muestreo 2 en las estaciones del Malecn (S7) y el Puente Grande (S3) los valores de DBO rebasaron las 100 unidades, aunque slo en el sitio 3 el oxgeno disuelto se encontr con un valor muy bajo, de 1.4 mg/L.

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Tabla 2. Sitios de muestreo de donde se aislaron las colonias puras para la identificacin MUESTREOS Muestreo 1 Muestreo 1 Muestreo 1 Muestreo 1 Muestreo 1 Muestreo 1 Muestreo 1 Muestreo 1 Muestreo 2 Muestreo 2 Muestreo 2 Muestreo 2 Muestreo 2 Muestreo 2 Muestreo 2 Muestreo 2 Muestreo 3 Muestreo 3 Muestreo 3 Muestreo 3 Muestreo 4 Muestreo 4 Muestreo 4 Muestreo 4 Muestreo 4 ESPECIES Serratia liquefaciens Pseudomonas oryzihabitans Pseudomonas luteolas Serratia rubidaea Klebsiella pneumoniae ssp ozaenae Pseudomonas oryzihabitans Enterobacter aerogenes Serratia plymuthica Serratia liquefaciens Serratia plymuthica Serratia rubidaea Pseudomonas oryzihabitans Pseudomonas luteolas Pantoea spp 3 Pseudomonas luteola Ewingella americana Serratia plymuthica Serratia liquefaciens Serratia rubidaea Serratia marcenscens Aeromonas hydrophila/caviea/sobria2 Stenotrophomonas maltophilia Ewingella americana Burkhoideria cepacia Serratia marcenscens SITIOS Sitio 1 Sitio 8 Sitio 7 Sitio 3 Sitio 6 Sitio 7 Sitio 3 Sitio 1 Sitio 5 Sitio 6 Sitio 6 Sitio 8 Sitio 2 Sitio 5 Sitio 4 Sitio 4 Sitio 8 Sitio 6 Sitio 1 Sitio 7 Sitio 8 Sitio 8 Sitio 4 Sitio 8 Sitio 3

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Tabla 3. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el muestreo 1 Temperatura C pH Oxgeno Disuelto mg/L Demanda Bioqumica de Oxgeno mg/L 21.16 28.6 23.02 26.04 22.32 33.48 22.32 37.2 Nitrgeno Nitratos mg/L Amoniacal mg/L

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8

17.9 19 18 21 19 20 20 19.5

8.1 8.1 7.9 8.2 8.3 8.3 7.6 8.4

3.9 5.7 1.7 6.3 3.9 Medio hipxico 8.6 6.2

0.67915 1.29 5.5825 0.5175 1.866 0.705 1.1605 nd

2.2615 2.225 3.1035 0.7115 1.546 2.8045 2.688 nd

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8

Tabla 4. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el Muestreo 2 Temperatura pH Oxgeno Demanda Nitrgeno C Disuelto Bioqumica Nitratos Amoniacal mg/L de mg/L mg/L Oxgeno mg/L 21.6 8.5 2.5 73 1.0833 1.2 23.4 9.2 1.60 48.6 1.76 2.19 22.2 9.35 1.41 105.4 10.56 1.8 26.3 9.55 1.80 20.4 0.66 0.999 26.4 9.08 3.5 28.8 0.933 0.38 27.9 8.98 3.79 34.5 0.77 0.75 28.6 9.27 5.7 101.34 1.6 4.1 28.4 9.22 Nd 61 Nd Nd

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Tabla 5. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el muestreo 3 Temperatura C pH Oxgeno Disuelto mg/L Demanda Bioqumica de Oxgeno mg/L 43.2 75 37.8 10.8 32.4 43.2 75.6 64.8 Nitratos mg/L Nitrgeno Amoniacal mg/L

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8

21.6 23.4 22.2 26.3 26.4 27.9 28.6 28.4

8.5 9.2 9.35 9.55 9.08 8.98 9.27 9.22

2.5 1.60 1.41 1.8 3.15 3.79 5.7 Nd

1.3 2.35 1.025 0.375 3.1 0.85 0.725 1.3

1.13 3.61 0.352 0.424 2.712 1.58 2.066 0.824

Tabla 6. Parmetros Fisicoqumicos obtenidos en el muestreo 4 Temperatura pH Oxgeno Demanda Nitrgeno C Disuelto Bioqumica Nitratos Amoniacal mg/L de mg/L mg/L Oxgeno mg/L S1 21.5 7.64 0.14 38.98 0.275 3.393 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 22.3 22.6 23.1 22.5 24.1 22.0 19.7 8.29 8.29 8.09 8.84 8.6 8.66 9.16 4.08 0.58 1.39 1.47 3.17 0.03 Nd 46.6 27.2 54.6 54.4 54.36 66 52.2 0.23 0.605 0.646 0.632 0.56 0.721 0.91 2.26 4.407 2.025 1.582 4.859 1.276 2.52

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Importancia ambiental y mdica de algunos gneros y especies de Enterobacterias identificadas La informacin fue obtenida de Holt et al. (1994), Leclerc et al. (2001), Willey et al. (2008), Koneman (1998). Klebsiella pneumoniae. Se producen en las heces humanas y las muestras clnicas, el suelo, el agua, granos y verduras. Puede causar bacteriemia, neumona y otras infecciones en seres humanos. Son causa frecuente de infecciones nosocomiales en urologa, en la atencin neonatal intensiva y en los pacientes geritricos. Ewingella. Frecuentemente aisladas de clnicas de humanos, de esputo ms a menudo, las heridas y la sangre. Es un patgeno oportunista frecuente. Enterobacter. Son patgenos oportunistas. Causan infecciones en quemaduras, heridas, zonas urinarias y ocasionalmente septicemia y meningitis. Pantoea. Aisladas en la superficies de plantas, semillas, suelo y agua. Tambin aisladas de animales y humanos, en sangre y orina. Son patgenos oportunistas. Pseudomonas. Muy distribuidas en la naturaleza. Algunas especies son patgenas de humanos, animales o plantas. Aeromonas. Se encuentra en agua dulce y semillas. Algunas son patgenas de ranas, pescados y humanos. Usuales en enfermedades en humanos, como diarrea o bacteremia. Escherichia. Se producen como flora normal en la parte inferior del intestino de animales de sangre caliente y en el caso de E. blattae en las cucarachas. Hay cepas de E. coli que contienen enterotoxinas y otros factores de virulencia, incluyendo los factores de invasin y colonizacin y pueden ser la causa de enfermedades diarreicas. E. coli es tambin una especie importante de las infecciones del tracto urinario e infeccin nosocomial e infecciones como la septicemia y la meningitis. Stenotrophomonas maltophilia. Esta bacteria se encuentra en varios ambientes, tales como el agua, suelo, plantas, alimentos y hospitales. Es cada vez ms comn como una causa importante de

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hospitalizacin. Quienes adquirieron la infeccin normalmente estn gravemente debilitados o inmunodeprimidos, como los que recibieron a largo plazo la terapia antimicrobiana y las personas con catteres venosos centrales. Las infecciones resultantes son amplias, en el tracto respiratorio, tejidos blandos y en la piel, son las ms frecuentemente implicados. Aunque el patgeno se considera que es una causa poco frecuente de meningitis, se ha convertido en un foco de inters no slo debido al aumento de reconocimiento de su potencial patgeno, sino tambin por su resistencia a los antibiticos.

4. DISCUSIN
En este trabajo se llev a cabo el estudio microbiolgico del meandro del Rio Lerma en La Piedad, Michoacn y Santa Ana Pacueco, Guanajuato, para determinar los gneros y especies de Enterobacterias presentes, para establecer los posibles riesgos de la poblacin humana de contraer infecciones. En estas localidades algunas de sus zonas agrcolas utilizan el ro como sistema de riego para sus plantas, que son utilizadas tanto para alimento humano como para el ganado. Adems, debido a que parte de la zona urbana se encuentra a un lado del ro Lerma, existe un contacto directo de los pobladores con el agua y un riesgo potencial de interaccionar con las bacterias. El anlisis se realiz en 8 sitios (Figura 2), los cuales se muestrearon en cuatro ocasiones para cubrir un ciclo anual. Las pruebas que permitieron identificar a las especies de Enterobacteriaceae fueron el aislamiento en medio EMB, la tincin de Gram y las pruebas bioqumicas mediante el Sistema de galeras de API20. Este sistema result ser muy confiable, sin embargo, el costo de cada muestra no permiti analizar mayor cantidad de muestras, por lo que primeramente se tomaban las colonias bacterianas con base en su morfologa y color, para su posterior aislamiento y anlisis. Esto indica que la distribucin de las especies encontradas en cada uno de los sitios muestreados en cada una de las temporadas, est subestimado. Los resultados obtenidos indican un alto porcentaje de contaminacin ya que se encontraron 12 diferentes especies en los sitios muestreados. Entre las especies de bacterias encontradas

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existen patgenas de humanos, comunes y oportunistas. Klebsiella pneumoniae, una patgena de humanos, se aisl de un sitio pero pudo estar presente en otros, considerando que no se analizaron todas las colonias diferentes de cada estacin en cada muestreo. Con respecto a los riesgos que puede tener la poblacin humana al exponerse al agua del ro Lerma en el tramo estudiado, si bien en todos los sitios y pocas del ao hay contaminacin fecal y bacterias patgenas oportunistas, se debe evitar el contacto directo con el agua, particularmente en los sitios cercanos a la zona urbana de La Piedad (La Pursima y El Malecn) en las pocas en que el cauce del ro es menor, que usualmente ocurre en los periodos de sequa o cuando se interrumpe el flujo de agua para desviarla hacia el Dren. No fue posible establecer una relacin directa entre la variacin de parmetros fsico-qumicos y la presencia de enterobacterias, ya que siempre estuvieron presentes, por lo que las condiciones reportadas son adecuadas para el crecimiento de este tipo de organismos. Aunque el oxgeno lleg a niveles muy bajos y no detectables, la caracterstica de estas bacterias de ser anaerobias facultativas, les permite sobrevivir cuando est ausente este elemento.

5. CONCLUSIONES
El sistema API20E es confiable para identificar enterobacterias del agua, previo aislamiento en EMB. El sistema de galeras es costoso y no permite analizar nmeros grandes de colonias, como es el caso de los estudios ecolgicos y por lo tanto se subestima la presencia de especies bacterianas. Las especies encontradas, 12 en total, permiten alertar a la poblacin de evitar contacto directo con el agua del ro. El riego de cultivos con el agua del ro Lerma se realiza de manera normal, por lo que es conveniente que los productos vegetales sean desinfectados previamente, como es el caso del consumo de verduras frescas.

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