Revista RE´TAKVN

Facultad de Ingeniería - Universidad del Magdalena

PREPARACIÓN Y SEGUIMIENTO DE LA ESTABILIDAD DE EXTRACTO ÁCIDO DE

HOJA PRETRATADA DE Stevia Rebaudiana Bertoni FRENTE A
ALMACENAMIENTO Y SU APLICACIÓN DIRECTA EN UN ALIMENTO
A. Amadeus Castro V.
Ingeniero Químico, Candidato a Doctor en Ciencias
Departamento de Química, Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá
aacastrov@unal.edu.co

Carlos F. Novoa C.
Zootecnista, Magíster en Química
ICTA, Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá
cfnovoac@unal.edu.co

Fecha de Recepción: 24/08/2008

Fecha de Publicación: 15/12/2008

RESUMEN

En este trabajo se evaluó la estabilidad de sustancias y metabolitos disueltos en un extracto de hoja de Stevia
Rebaudiana Bertoni pretratada con un solvente orgánico, durante su almacenamiento en envases de vidrio, en
períodos de 15, 30 y 60 días. Se modificó un proceso de extracción previamente publicado, con el propósito de
aplicar un extracto de hoja de Stevia de forma directa sobre un producto alimenticio como edulcorante
sucedáneo del azúcar de caña.

Palabras claves: Stevia, pH, proteínas, grados Brix.

ABSTRACT

In this rehearsal stability of metabolites and soluble substances was seek under 15, 30 and 60 days in a pre-
treated-solvent Stevia extract. A previous experimental procedure was modified looking for apply a low-treatment
Stevia extract into a sweet food.

Keywords: Stevia, pH, protein, Brix (ºBx).

INTRODUCCIÓN cromatografía de adsorción (Itagaki e Itou, 1979). Se

Los principales procedimientos para la
transformación de las hojas de Stevia iniciaron su
desarrollo en Japón (Starratt y Gijzen, 2003). Existen
varios ejemplos de estos procesos recopilados por
Kinghorn y Soejarto (1985). La evolución de estos
métodos puede esbozarse como sigue: uso exclusivo
de solventes para realizar la extracción de sustancias
endulzantes presentes en la hoja (Haga et al., 1976),
seguido de operaciones de separación como
intercambio iónico (Uenishi et al., 1977) y
propuso también la decoloración del extracto
obtenido con tales solventes (Ogawa, 1980) y
realizar desde este medio la precipitación selectiva
de glucósidos individuales (Matsushita y Kitahara,
1981). Métodos basados en ultrafiltración buscan
retirar el conjunto de steviósidos desde el extracto
(por solvente) sin recurrir a las operaciones
mencionadas (Tan y Ueki, 1994), sin embargo, el
proceso predominante desde la década de 1980
consta casi exclusivamente de las etapas de
extracción con solvente (comúnmente agua),

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intercambio iónico y/o precipitación de glucósidos, y
secado final de los cristales (Phillips, 1989). Se han
propuesto modificaciones intermedias a esta
estructura básica de proceso; por ejemplo,
coagulación en reemplazo de la precipitación (Lisitsin
y Khakimov, 2003), pero el procedimiento general
siempre se ha mantenido (Kitazume y Katabami,
2003), el cual puede resumirse aún más como:
extracción y separación de sustancias extraídas
indeseadas.
Castro y colaboradores (2004) obtuvieron un
sucedáneo de la miel de abejas por medio de la
modificación reológica y sensorial de un extracto
parcialmente purificado de Stevia Rebaudiana
Bertoni, el cual tuvo aplicación directa como
endulzante en bebidas y jugos de fruta. El
seguimiento posterior del producto evidenció
inestabilidad del extracto de Stevia durante un
periodo de almacenamiento superior a 60 días,
evidenciado en precipitación de ‘lodos’. Este hecho
motivó la idea de un procedimiento alterno a la
tendencia tradicional descrita en el párrafo anterior:
Eliminar parcialmente sustancias solubles en un
solvente orgánico (p. ej. clorofilas, aceites
esenciales) y evitar que lixivien de la hoja algún
conjunto de sustancias indeseadas, de forma que la
extracción acuosa sea enriquecida en steviosidos y
posea menor proporción de solutos indeseados que
son la motivación de las operaciones de separación y
purificación. Este extracto puede ser aplicado
directamente como endulzante en un producto
alimenticio sin que se aprecie alguna diferencia
organoléptica frente al elaborado con steviósido
comercial obtenido por un procedimiento tradicional
METODOLOGÍA
Hoja de Stevia Rebaudiana Bertoni proveniente de
cultivos de los llanos orientales colombianos fue
limpiada por medio de un ciclón, con el fin de retirar
material fino y particulado. Se troceó la hoja en un
molino de cuchillas evitando que la reducción de
tamaño produjera nuevos materiales finos. Se
procedió a realizar una extracción según las mejores
condiciones encontradas por Castro y otros (2004)
para dos condiciones: hoja troceada y hoja troceada
pre-extraída con etanol azeotrópico.
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Se evaluó el color de los extractos y se aproximó su
contenido de steviósidos por medio de una
correlación realizada a un conjunto de steviósidos
comercial (SteviaFarma Industrial) y su valor de
índice de refracción y grados Brix (ºBx). Los extractos
acuosos se obtuvieron para agua con pH neutro y
pH ácido (<4), entre estos, se permitió el
envejecimiento hasta observar inestabilidad
(suspensión y precipitación de sustancias) y su
naturaleza se determinó por medio de análisis
infrarrojo. La estabilidad y contenido aproximado de
steviósidos se confrontó con los resultados
publicados para solubilidad de éstos en solución
acuosa (Goto y Clemente; 1998. Vanĕk, Nepovım y
Valıček; 2001).
RESULTADOS Y ANÁLISIS
Hoja de Stevia fue extraída bajo las condiciones
propuestas por Castro y colaboradores (2004),
durante este procedimiento se censó la variación del
valor pH con el propósito de verificar que no se logra
un descenso suficiente para provocar inestabilidad
del conjunto de steviósidos, cuya solubilidad ha sido
establecida parcial frente a condiciones de pH inferior
a 3 en 72 horas (Zhuhai, 2005), de igual forma, la
acidulación del extracto para separar metabolitos que
pudieran flocular antes de 24 horas a un pH entre 3 y
4 fue monitoreada. Este precipitado es de color
marrón y no presenta sabor dulce, de forma que no
fue objeto de identificación. En las figuras 1 y 2 se
muestran el seguimiento del extracto acuoso para la
acidulación natural y artificial anteriormente
expuesta.
7
6
pH
5
60ºC
4
0 10 20 30 40 50
Tiempo de extraccción (min)
Figura 1. Seguimiento del valor pH de un extracto acuoso de
Stevia durante 50 minutos
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6,0 pH teórico (cítrico) mitad del valor de grados Brix observado en el

pH teórico (ascórbico) procedimiento de extracción realizado a 60ºC (figura
5,5 pH medido (cítr. USP ácido 6) 3), el cual coincide con la proporción de steviósidos
pH medido (cítr. básico 11)
encontrada en extractos secados (Fuente:
5,0
www.return2eden.com, 2005).
pH
4,5

4,0 12 grados Brix

Límite de completa solubilidad
3,5 10 Exp 60ºC
ºBx = 0,9573(%peso) - 0,3757

Grados Brix (ºBx)

3,0
8

2,5
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
% peso
Figura 2. Seguimiento del valor pH de un extracto acuoso de
Stevia durante su acidulación con ácido cítrico a partir de la
condición inicial de extracción y de un valor alcalino (pre-
tratamiento con CaOH)
Motivado por el hecho de observar inestabilidad en el
extracto acuoso “neutro” (pH~6) y acidulado (pH<6)
tras almacenamiento prolongado (t > 72h), se
reeleaboró el procedimiento de extracción
adcionando una etapa de pre-extracción con etanol
azeotrópico (el extracto obtenido es de color verde
oscuro) y secado de las hojas en lecho fluidizado con
temperatura de 40±5ºC. Este material se maceró
con agua acidulada (pH~4, T=60ºC) y agitación
constante durante 50 minutos, las hojas se retiraron
por medio de un tamiz y el extracto se limpio por
filtrado en papel filtro de tipo cualitativo. El extracto
obtenido es de color ambar claro y traslúcido, con
sabor dulce característico y sin aroma herbal. El
contenido de steviósidos se apróximo por medio de
comparación con una correlación realizada a
steviósido comercial respecto de su índice de
refracción y grados Brix (ºBx). En la figura 3 se
muestra la correlación mencionada y su comparación
con dos extracciones experimentales. Un extracto
acuoso de stevia contiene aproximadamente 45% de
esteviósidos, de forma que para el extracto puede
ser factible inferir un 50% del valor leído como
grados Brix como el valor aproximado de steviósidos.
Experimentalmente, se observó una variación de la
solubilidad de steviósido comercial en agua de 1.53 a
2.18% para el intervalo 25-70ºC, el límite inferior de
solubilidad corresponde de forma aproximada a la
6
0,9 1,0
4
2
0
0 2 4 6 8 10 12
1 2
% peso (steviosidos /observado )
Figura 3. Correlación de grados Brix respecto del contenido de
steviósidos en agua y comparación con un procedimiento de
extracción de hojas.
Tres (3) Extractos obtenidos subsecuentemente de
una misma masa de hojas de Stevia en las
condiciones señaladas por Castro y colaboradores
(2004) y sendas muestras de hoja pre-extraída se
envasaron de forma ascéptica y se dejaron en perído
de almacenamiento durante 60 días, únicamente los
extractos obtenidos sin pre-extracción presentaron
inestabilidad, visualizada como aparición de
turbiedad o alguna forma de precipitado durante
almacenamiento prolongado. El extracto que
presentó precipitado se dejo envejecer 60 días y se
decantó. El precipitado se lavó tres veces con agua
destilada y se secó. Acontinuación se encapsuló para
obtener su espectro infrarrojo (figura 4) y compararlo
con los espectros del steviósidos comercial (figura 5)
y patrones de Steviósido puro y Rebaudósido A
(figura 6). Los patrones de steviósido y Rebaudósido
A fueron provistos por Waco Pure Chemical y su
espectro infrarrojo lo fue obtenido por Habeych,
Giraldo y Marìn (2005).

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Figura 3. Espectro Infrarrojo de cristales de steviósidos

Figura 4. Espectro Infrarrojo del precipitado obtenido en extracto comerciales (SteviaFarma Industrial)
acuoso de Stevia almacenado (t > 72 horas).
100
El espectro infrarrojo obtenido del extracto 90
inestabilizado se interpretó como una sal metálica de 80
algún tipo de o conjunto de aminas, quizá como 70
producto de degradación de proteínas lixiviadas
60
hacia el extracto acuoso que reaccionó con iones %T
metálicos presentes en el agua (Ca++, Mg++). La
50
1076
40
comparación de este espectro con los de steviósidos Steviósido
30
comercial y patrones permite apreciar que no existe
relación o similitud, lo cual soporta la inferencia de no 20

presencia de steviósidos en el precipitado, y que por 10

3433

medio del procedimiento modificado utilizado (pre- 0

3650
38 37 36 353000
34 33 32 31 3029 282000
27 26 2524 23 22 211500
20 1918 17 16 15 141000
13 12 11 10 9080 70 60450
50
extracción-extracción ácida) se obtiene un extracto -1
cm00 00 00 0000 00 00 00 0000 00 00 00 0 0 0 0 0
00 00 00 0000 00 00 00 0000 00 00 00 0000 00
estable durante almacenamiento prolongado. Este
100
resultado permite postular su uso como aditivo
90
endulzante en medios ácidos poco viscosos y/o que
80
puedan enmascarar naturalmente el color ámbar del 1725
70
extracto. 656

60
%T
El precipitado obtenido no presenta las bandas 50
2924
características del ácido cítrico (figura anexo 2), el 40
Rebaudósido A
cual fue el agente acidulante empleado en la 30

extracción. Si se presentan las bandas 20

correspondientes a una estructura isoprenoide 10
ubicadas entre 1500 y 1600 cm-1 (para comparación
3337
1176
0
ver anexo 3). 3650
3450,00 3000 2000
2450,00
-1
1500 1450,00 1000 450
450,00
cm

Figura 5. Espectro IR de Patrones de Rebaudósido A (abajo) y

Extracto de Hojas de Stevia obtenidos por el
de Steviósido. (Waco Pure Chemical, Japón)
procedimiento modificado se empleó como Fuente: Normalizado a partir de Habeych, Giraldo y Marín, 2005.
endulzante de uso directo en un alimento.

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Para este ensayo se utilizó como sustrato una
mezcla para gelatina elaborada a partir de gelatina
en polvo comercial, sabor artificial (fresa, Químicos
JG) y color natural (betaína). El color rojo para el
producto se obtuvo por maceración de 1 g de pulpa
de remolacha en 100 ml de agua pasteurizada. El
saborizado se hizo de acuerdo a la ficha técnica del
proveedor del sabor artificial y la proporción de
extracto necesario para alcanzar un endulzado
“característico” se estimó por medio de análisis
sensorial. El alimento también se endulzó con
cristales de steviósidos comercial y se comparó con
el obtenido a partir de extracto.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
La correlación obtenida para el contenido en peso de
steviósidos en agua frente a su valor de índice de
refracción y grados Brix resulta una aproximación
satisfactoria para estimar la concentración de
steviósidos en un extracto obtenido por el
procedimiento modificado bajo la consideración de
que en éste hay una concentración cercana a 50%
de sustancias diferentes de steviósidos. Las
correlaciones completas para steviósidos comercial
se muestran en la figura anexo 1.
Cada extracción obtenida bajo el procedimiento
modificado proporciona un contenido seco de
steviósidos aproximado de 1.53% en solución, que
corresponde al 9.18% del peso de las hojas
utilizadas. Este valor es inferior al máximo
encontrado (~15%) en hojas de Stevia (Starratt y
Gijzen, 2003), pero satisfactorio para un
procedimiento comercial (Anzola, 2005)
La aplicación del extracto estable sobre un alimento y
su comparación con el endulzado con cristales de
steviósido comercial no permitió apreciar una
diferencia significativa, Esta situación permite
recomendar su uso directo como endulzante en
alimentos ácidos o acidulados, y se puede prescindir
de subsecuentes etapas de purificación y secado.
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AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a SteviaFarma Industrial de
Brasil por facilitar muestras de steviósidos comercial.
Al Ingeniero Químico José Anzola quien patrocinó
económicamente parte de esta investigación y
proveyó la Hoja de Stevia Rebaudiana Bertoni y a la
Ingeniera de Procesos Catalina Giraldo por su
valiosa discusión.
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ANEXOS

1,352 20
índice de refracción
1,349 18
grados Brix
Índice de refracción (n)

16

Grados Brix (ºBx)

1,346
14
1,343 12
1,340 10
1,337 8
6
1,334
4
ºBx = 0,9573(%peso) - 0,3757
1,331 2
n = 0,0015(%peso) + 1,3313 Anexo 4. Espectro Infrarrojo de glucósidos precipitados de un
1,328 0 extracto de Stevia Rebaudiana Bertoni obtenidos tras reacción
0 2 4 6 8 10 12 con enzima alfa-glucosil-transferasa (fuente: Miyake, United
% peso steviosidos
States Patent 4,219,571, agosto 26 de 1980)
Anexo 1. Correlación entre contenido en peso de steviósidos
(SteviaFarma Industrial) y el valor de índice de refracción (25ºC)
y grados Brix de la mezcla.

Anexo 2. Espectro Infrarrojo de ácido cítrico Anexo 5. Espectro Infrarrojo de steviósidos precipitados de un
(fuente:http://www.aist.go.jp/RIOBD/SDBS/cgi- extracto sobresaturado de hojas de Stevia Rebaudiana Bertoni
bin/direct_frame_top.cgi?lang=eng/menu-e.html) (fuente: Miyake y colaboradores, United States Patent
4,557,927, diciembre 10 de 1985)

Anexo 3. Espectro Infrarrojo de isopreno

(fuente:http://www.aist.go.jp/RIOBD/SDBS/cgi-
bin/direct_frame_top.cgi?lang=eng/menu-e.html)

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