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H.

Pylori IgG, IgM, IgA


96 Pruebas
INTENCION DE USO
La determinacin cuantitativa de Anticuerpos especficos de AntiH.Pylori de tipo IgG, IgM o IgA en suero humano o plasma en un anlisis con microplato de Quimioluminiscencia (CLIA).

Cdigo: 9001601 9001602 9001603

Ensayo de quimioluminiscencia inmuno absorbente para la deteccin cuantitativa de H. Pylori IgG, IgM, IgA en suero o plasma
Una vez mezclado el antgeno biotinilado y un suero que contiene el anticuerpo, resulta una reaccin entre el antgeno y el anticuerpo para formar un complejo inmune. La interaccin es ilustrada por la siguiente ecuacin:

RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA


El Helicobacter pylori ha sido mostrado como un bacilo curvo indefinido que fue observado por Warren1 y Marshall2 en contacto cercano con el epitelio gstrico en estudios de biopsias en pacientes que sufren de gastritis crnica. A pesar de que la fuente del H. pylori es desconocida, la evidencia es muy convincente que el bacilo causa una gastritis aguda y puede caer en gastritis crnica. Sethi et al5 ha reportado que el H. pylori se present en noventa y un 91% de pacientes con gastritis crnica superficial. Marshall5 determino que el H. pylori se present en 90% de ulcera duodenal y setenta por ciento de pacientes con lcera gstrica. El uso de pruebas serolgicas para comprobar el anticuerpo producido inmunolgicamente por la infeccin de H. pylori se ha sugerido como el mtodo de eleccin para el monitoreo en grandes poblaciones. Las mediciones de los anticuerpos de H. pylori se ha hecho por hemaglutinacin la fijacin del suero de complemento y aglutinacin bacterial. Estas pruebas no tienen la sensitividad de la enzima por inmunoensayo y son limitadas por interpretacin subjetiva. Este procedimiento, con la sensitividad mejorada de la ELISA, permite una fcil deteccin de anticuerpos para el H. pylori. En adicin, los resultados son cuantificados por un espectrofotmetro, el cual elimina la interpretacin subjetiva. La metodologa de inmunoensayo de enzima por microplato, provee al tcnico con una sensitividad ptima as como tambin requiere de muy pocas manipulaciones tcnicas. En este mtodo, el suero de referencia, el espcimen diluido del paciente, o control es primero agregado a un pozo de microplato. Se aade el H,pylori Biotinilado, y entonces se mezclan los reactivos. Una reaccin resulta entre los auto anticuerpos del H.pylori y el H pylori Biotinilado para formar un complejo inmune, el cual es depositado sobre la superficie de los pozos cubiertos con streptavidin a travs de la alta afinidad de la reaccin de biotin y streptavidin. Despus de completado el perodo de incubacin requerido, los reactivos son separados por la aspiracin o decantacin los cuales no quedaron adheridos a los pozos. Una enzima anti-humana IgG, M o A conjugada es entonces aadida para permitir la cuantificacin de la reaccin a travs de la interaccin con complejos inmunes humanos IgG, IgM e IgA. Despus de lavar, la actividad de la enzima determinada por la reaccin con el sustrato para producir luz. El empleo de varias referencias de suero con la actividad de anticuerpos conocidos permite la construccin de un grfico de la actividad de la enzima y anticuerpo. De la comparacin de la curva de la reaccin a cierta dosis, la actividad de un espcimen desconocido se puede correlacionar con el nivel de anticuerpo auto inmune.

Simultneamente, el complejo es depositado en el pozo a travs de la reaccin de lata afinidad de streptavidin y antgeno biotinilado. Esta interaccin se ilustra abajo:

Despus del perodo de incubacin, el pozo se lava para separar los componentes desatados por la aspiracin o la decantacin. La enzima ligada al anticuerpo especies-especfico (anti-h-IgG, M o A) se agrega entonces al pozo. Este conjugado ata al complejo inmune que form.

La enzima conjugada de anti-h-IgG, IgM o IgA que se ata al complejo inmune en una segunda incubacin es separada del material sin reaccin por un paso de lavado. La actividad de la enzima en esta fraccin es directamente proporcional a la concentracin de anticuerpo en el espcimen. Al utilizar diferentes referencias de suero de actividad de anticuerpo conocida, una curva de referencia puede ser generada de la cual la actividad del anticuerpo para un desconocido puede ser comprobada.

REACTIVOS Y MATERIAL PROVEEIDO


A. Calibradores Anti-H.Pylori -- 1ml/vial - Iconos A-E Cinco frascos de referencia para anti-H.Pylori en los niveles de 0(A), 10(B), 25(C), 50(D) y 100(E) U/ml* del tipo IgG, IgM e IgA. Almacene entre 2-8C. Se ha agregado un preservativo. *Valor de referencia del fabricante. B. REACTIVO BIOTIN de H.Pylori - 13ml/vial - Icono Un frasco de H.Pylori biotinilado inactivo (IgG, IgM o IgA) en una matriz de suero. Un preservativo se ha agregado. Almacnese entre 2-8C. C. REACTIVO TRAZADOR de H.Pylori - 13ml/- frasco del icono Un frasco de conjugado de Peroxidasa Horseradish anti-humano IgG, IgM o IgA en una matriz de suero. Se ha agregado un preservativo. Almacene entre 2-8C. D. POZOS DE REACCIN A LA LUZ - 96 pozos - icono Un microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado en una bolsa de aluminio con un agente deshidratado. Almacnese a 2-8C. E. Diluyente de Suero - - 20 ml Un frasco con diluyente de suero que contiene solucin salina y un tinte. Almacnese entre 2-8C.

PRINCIPIO
Mtodo Secuencial de CLIA (Tipo 1): Los reactivos esenciales requeridos por un anlisis secuencial de CLIA incluido el antgeno inmovilizado, el anticuerpo circulante y el anticuerpo de enzima-ligada especies-especficos. En este procedimiento, la inmovilizacin toma lugar durante el ensayo de la superficie del pozo en el microplato a travs de la interaccin del streptavidin cubierto sobre el pozo y el antgeno de H. pylori biotinilado exogenous agregado.

F. SOLUCION CONCENTRADA LAVADORA--20ml - icono Un frasco que contiene un surfactante en solucin salina. Un preservativo ha sido agregado. Almacnese entre 2-30C. G. REACTIVO SUSTRATO A -- 7ml/frasco icono SA Un frasco que contiene luminol en solucin. Almacn entre 2-8C. (Vea la Seccin de Preparacin de reactivos.) H. REACTIVO SUSTRATO B --7ml/frasco icono SB Un frasco que contiene el perxido de hidrgeno (HO) en solucin. Almacnese entre 2-8C. I. SOLUCION STOP- 8ml/vial Icon Una botella que contiene un cido fuerte (1 N HCl). Almacenar a 2-30 C J.Instrucciones del producto. Nota 1: No utilice los reactivos ms all de la fecha de vencimiento del kit. Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta das cuando estn almacenados entre 2-8C. Nota 3: reactivos anteriores son para una sola microplaca de 96

3. SOLUCIN DE TRABAJO SUSTRATO. Determine la cantidad de reactivo necesario y prepare mezclando porciones iguales del reactivo sustrato A y sustrato B en un contener limpio. Por ejemplo, agregue 1ml de A y 1ml de B por dos tiras de 8 pozos (Se crea un exceso pequeo de solucin). Deseche la porcin sin usar si no se usa dentro de las 36 horas siguientes despus de ser mezclado. Si la utilizacin de los reactivos se completa anticipadamente, dentro del tiempo, vierta los contenidos del Reactivo de Seal B dentro del Reactivo de Seal A y etiquete adecuadamente. 4. Dilucin de la Muestra del Paciente (1/100) Dispense 0.010ml (10l) de cada espcimen del paciente en 1 ml del suero diluido. Cubra y mezcle por inversin. Guarde entre 2-8C. hasta por cuarenta y ocho horas.

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Antes de proceder con el anlisis, tenga todos los reactivos, referencias del suero y controles a la temperatura ambiente (20 - 27C.). 1. Ajuste el formato de los pozos de las micro placas para que cada referencia del suero, control y espcimen del paciente sean analizados en duplicado. Guarde los micropozos nuevamente dentro del bolso de aluminio, sllela y almacnela a 2-8C. 2. Mida con una pipeta 0.025 ml (25l) de la referencia, del control o del espcimen apropiado del suero en el pozo asignado para la determinacin de IgG. Para IgM o IgA pipetear 0.50ml (50l) del suero de referencia apropiado, control o espcimen diluido de paciente en el pozo asignado. 3. Agregue 0.100 ml (100l) del reactivo Biotin de H.Pylori. Es muy importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del pozo. 4. Remolinar el micro placa suavemente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir. 5. Incube 60 minutos en la temperatura ambiente. 6. Deseche el contenido del micro placa por decantacin o la aspiracin. Si decanta, golpee ligeramente y borre la placa seca con el papel absorbente. 7. Agregue 350 l de la solucin lavadora (vase la seccin de la preparacin del reactivo), decntelo (golpee y borre) o asprelo. Repita cuatro veces adicionales para un total de cinco lavadas. Una lavadora automtica o manual de la placa puede ser utilizada. Siga las instrucciones del fabricante para el uso apropiado. Si se emplea una botella de apretn, llene cada uno bien presionando el envase (evite burbujas de aire) para dispensar la lavada. Decante la lavada y repita cuatro veces adicionales. 8. Agregue 0.100ml (100l) de Anti-Ig (x-IgG, IgM o IgA) Reactivo Trazador de a cada pozo. 9. Remolinar el micro placa suavemente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir e incube por 30 minutos a temperatura ambiente. 10. Repita los pasos (6 & 7) como se explico arriba. 11. Agregue 0.100 ml (100l) del reactivo de la solucin de trabajo a todos los pozos (vase la seccin de la preparacin el reactivo). Agregue siempre los reactivos en el mismo orden para reducir al mnimo diferencias de tiempo de reaccin entre los pozos. 12. Incube a temperatura ambiente en la oscuridad por cinco minutos. 13. Agregue 0.050 ml (50 l) de la solucin de parada a cada pocillo y agitar la microplaca suavemente por 15-20 segundos para mezclar. Agregue siempre los reactivos en el mismo orden para minimizar las diferencias de tiempo de reaccin entre los pozos. 14. Leer la absorbancia en cada pocillo a 450 nm (utilizando una longitud de onda de referencia de 620-630nm para minimizar imperfecciones del pozo) en un lector de microplacas. Los resultados deben ser ledos dentro de los treinta (30) minutos de agregar la solucin de parada. Nota: Para el re anlisis las muestras con concentraciones superiores a 100 U / ml, diluir la muestra 1:05 un adicional o 1:10 usando el material diluido original en el diluyente de suero. Multiplicar por el factor de dilucin para obtener la concentracin de la muestra

MATERIAL REQUERIDO PROPORCIONADO

PERO

NO

1. Pipeta capaz de entregar los volmenes 10, 25 y 50l con una precisin mejor de 1.5%. 2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volmenes 0.100ml y 0.350ml con una precisin de mejor de 1.5%. 3. Lavador de Micro placas o una botella de apretn (opcional). 4. Luminmetro de micro placas. 5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la microplaca. 6. Plstico envolvente o tapa para la microplaca para los pasos de la incubacin. 7. Aspirador de vaco (opcional) para los pasos de lavado. 8. Contador de tiempo. 9. Materiales del control de calidad

PRECAUCIONES
Para el Uso De Diagnstico In Vitro No Para el Uso Interno o Externo en Seres Humanos o Animales Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser no-reactivos para el antgeno superficial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH 1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba sabida puede ofrecer termine el aseguramiento que los agentes infecciosos estn ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los buenos procedimientos del laboratorio para manejar productos de la sangre se pueden encontrar en el Centro para el Control de Enfermedad/el Instituto Nacional de la Salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiolgicos y biomdicos," 2da Edicin, 1988, publicacin No. (CDC) 88-8395 de HHS.

RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION


Los especmenes deben ser sangre, suero o plasma en tipo y tener las precauciones generales en la coleccin de muestras del veni-puntura. Para la comparacin exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno del suero de la maana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubo liso de venipuntura de tapn rojo sin aadidos o anticoagulantes. Permita que la sangre coagule. Centrifugue el espcimen para separar el suero de las clulas. Las muestras se pueden refrigerar entre 2-8C. por un perodo mximo de cinco das. Si el espcimen no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra se puede almacenar en las temperaturas de -20C. por hasta 30 das. Evite congelar y deshelar. Cuando analice en duplicado, se requiere 0.100 ml IgM % IgA) o 0.050ml (IgG) se requiere del espcimen diluido.

PREPARACION DE LOS REACTIVOS


1. DILUYENTE DE SUERO Diluya el suero, diluyendo a 200ml en un contenedor adecuado con agua destilada o desionizada. Almacnese entre 2-8C. 2. SOLUCION LAVADORA. Diluir el contenido del concentrado lavador a 1000ml con agua destilada o desionizada en un contenedor adecuado. Almacnese a temperatura ambiente entre los 20-27C.

CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe tener controles de ensayo en bajo, medio y alto rango de la curva de la reaccin para monitorear el buen funcionamiento del ensayo. Estos controles deben ser tratados como desconocidos y determinar los valores en cada mtodo de prueba realizada. Las tablas de control de Calidad deben de mantenerse para seguir el funcionamiento de los reactivos provedos. Los mtodos estadsticos pertinentes deben ser empleados para comprobar las tendencias. Desviaciones significativas del funcionamiento establecido pueden indicar un cambio experimental en las condiciones o degradacin del kit de reactivos. Se deben usar reactivos frescos para determinar la razn de las variaciones.

CALCULO DE RESULTADOS
Una curva de referencia se utiliza para determinar la concentracin de anticuerpos anti - H . Pylori en las muestras desconocidas. 1 . Registre la absorbencia obtenida del listado del lector de microplacas tal como se describe en el Ejemplo 1. 2 . Trace la absorbencia para cada referencia duplicada del suero frente a la actividad anti- H.Pylori correspondiente en U / ml en el papel milimetrado (no promedie los duplicados de las referencias del suero antes de trazar ) . 3 . Dibuje la mejor curva a travs de los puntos trazados. 4 . Para determinar el nivel de actividad anti - H.Pylori para un desconocido , localizar la absorbancia promedio de los duplicados para cada desconocido en el eje vertical de la grfica , encontrar el punto de interseccin en la curva , y lea la concentracin ( en U / ml ) desde el eje horizontal del grfico ( los duplicados del desconocido se pueden promediar como se indica ) . En el siguiendo el ejemplo de la absorbancia promedio de 1,603 corta a la curva de respuesta de dosis a 64,0 U / ml de concentracin de anti- H.Pylori ( Ver Figura 1 ) . *

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO


A. Funcionamiento 1. Es importante que el tiempo de reaccin en cada pocillo se lleva a cabo constante para lograr resultados reproducibles. 2. El pipeteo de las muestras no debe extender ms all de diez ( 10 ) minutos para evitar la deriva del anlisis . 3. Altamente lipmicas , hemolizadas o ampliamente contaminadas espcimen ( s ) no debe ser utilizado . 4. Si se utiliza ms de una ( 1 ) placa , se recomienda repetir la curva de respuesta a la dosis . 5. La adicin de solucin de sustrato inicia una reaccin cintica, que se termina por la adicin de la solucin de parada. Por lo tanto, hay que aadir el sustrato y solucin de paro en la misma secuencia para eliminar cualquier desviacin de tiempo durante reaccin. 6. Lectores de la placa miden verticalmente. No toque la parte inferior del los pozos. 7. Si no se retira solucin adherirse adecuadamente en el aspiracin o decantacin etapa de lavado ( s ) podra resultar en un replicacin y resultados espurios . 8. Use componentes del mismo lote. No mezcle los reactivos de diferentes lotes. 9. Muy alta concentracin de anticuerpos anti - H.Pylori en las muestras de pacientes pueden contaminar las muestras inmediatamente despus de estos niveles extremos. Bad duplicados son indicativos de cruz contaminacin. Repita cualquier muestra, que sigue a cualquier paciente espcimen con ms de 3,0 unidades de absorbancia. 10. Las muestras, que estn contaminadas microbiolgicamente, en caso de no se utilizarn. 11. Pipeteado exacto y preciso, as como despus de la exacta requisitos de tiempo y temperatura prescritos son esenciales. Cualquier desviacin de IFU de Monobind puede producir inexacta resultados. 12. Todas las normas nacionales aplicables, los reglamentos y las leyes incluyendo, pero no limitado a , los buenos procedimientos de laboratorio , debe ser estrictamente seguido para asegurar el cumplimiento y la correcta el uso del dispositivo . 13. Es importante calibrar todo el equipo por ejemplo, Pipetas, Lectores, Lavadoras y / o de los instrumentos automatizados utilizados con este dispositivo, y realizar preventivo de rutina mantenimiento. 14. Anlisis de Riesgos, como requerido por la marca CE IVD Directiva 98/79/CE - Para este y otros dispositivos, hechos por Monobind , puede ser deseados a travs de correo electrnico de Monobind@monobind.com . B. Interpretacin 1. Los resultados de laboratorio son slo un aspecto de la determinacin la atencin al paciente y no debe ser la nica base para la terapia, sobre todo si el conflicto con los resultados de otros determinantes. 2. Para obtener resultados vlidos, los controles adecuados y otros parmetros debe estar dentro de los rangos indicados y los requisitos de ensayo. 3. Si se alteran los kits de prueba, tales como por partes de mezcla de diferentes kits, lo que podra producir resultados falsos de las pruebas , o si los resultados son interpretado incorrectamente , Monobind no tendr ninguna responsabilidad . 4. Si se utiliza la reduccin de datos controlada por ordenador para interpretar la resultados de la prueba, es imperativo que los valores predichos para los calibradores caigan dentro del 10% de las concentraciones asignadas . 5. La importancia clnica del resultado se debe utilizar en la evaluacin de la posible presencia de enfermedad gastrointestinal. Sin embargo, las inferencias clnicas no deben basarse exclusivamente en esta prueba , sino ms bien como un complemento a la clnica las manifestaciones de las pruebas pertinentes a los pacientes y otros tales como Histologa , ureasa y Cultura. Un resultado positivo no indicar una enfermedad gastrointestinal y no distingue entre la colonizacin y la infeccin de H.Pylori . Del mismo modo , una resultado negativo no elimina la ausencia de H.Pylori infeccin, sino ms bien un muy bajo ttulo de anticuerpos que pueden ser relacionado con las primeras etapas de la colonizacin .

Nota: Los datos presentados en el Ejemplo 1 y la Figura 1 es slo para ilustracin y no se deben utilizar en lugar de una curva estndar preparada con cada ensayo

Las informaciones presentadas en el Ejemplo 1 y figura 1 son ilustrativas solamente no deben usarse para basarse en la curva preparada con cada ensayo. En adicin, los RLUs de los calibradores deben ser normalizados a 100,000 RLUs para el calibrador F (mayor salida de luz). Esta conversin minimiza las diferencias causadas por la eficiencia de la variedad de instrumentos que pueden ser usados para medir la salida de luz.

RANGOS ESPERADOS DE VALORES


Un estudio de poblacin aparentemente saludable (n=118) y pacientes sufriendo anormalidades gstricas (n=154) fueron tomadas para determinar los valores esperados para el sistema de pruebas de H. pylori Acculite de CLIA. Basados sobre la siguiente informacin puntos de niveles de corte fueron establecidos. La presencia de anticuerpos IgG e IgA de H.Pylori est confirmada cuando los niveles de suero excedan los 20U/ml. La presencia de anticuerpos IgM de H.pylori est confirmada cuando los niveles de suero excedan los 40U/ml.

PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD


Maximum Absorbancia (100 U/ml calibrator) = > 1.3

Es importante tener presente que el establecimiento de una gama de los valores que se pueden esperar ser encontrado por un mtodo dado para una poblacin de personas normal es dependiente sobre una multiplicidad de factores: la especificidad del mtodo, de la poblacin probada y de la precisin del mtodo en las manos del analista. Por estas razones cada laboratorio debe depender de la gama de valores esperados establecidos por el fabricante solamente hasta que una lata interna de la gama determinada por los analistas usando el mtodo con una poblacin indgena al rea en la cual el laboratorio est situado. CARACTERISTICAS DE ACTUACIN A. Precisin Anti-H. pylori - IgG La precisin en y entre la precisin del anlisis del procedimiento de AntiH.Pylori (IgG) por microplaca de CLIA Acculite fue determinada por anlisis en dos diversos niveles de los sueros del control. El nmero (N), el valor medio(X), la desviacin de estndar ( ) y el coeficiente de variacin (C.V.) para cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 1 y la tabla 2

REFERENCIAS

B. Precisin Anti-H. Pylori IgM La precisin en y entre la precisin del anlisis del procedimiento de Anti-H.Pylori (IgM) por microplaca de CLIA Acculite fue determinada por anlisis en dos diversos niveles de los sueros del control. El nmero (N), el valor medio(X), la desviacin de estndar ( ) y el coeficiente de variacin (C.V.) para cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 3 y la tabla 4.

C. Precisin Anti-H. Pylori IgA La precisin en y entre la precisin del anlisis del procedimiento de Anti-H.Pylori (IgA) por microplaca de CLIA Acculite fue determinada por anlisis en dos diversos niveles de los sueros del control. El nmero (N), el valor medio(X), la desviacin de estndar ( ) y el coeficiente de variacin (C.V.) para cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 5 y la tabla 6*.