AO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA

UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONIA

UNIA
FACULTAD DE INGENIERA Y CIENCIAS AMBIENTALES MICROBIOLOGA AGROINDUSTRIAL
PRACTICA N 5
TEMA: OBSERVACIN DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS DOCENTE: BILOGA. CASTILLO LLANOS DIANA ALUMNO: DE LA CRUZ OCHOA WILLIAM ESPECIALIDAD: INGENIERA AGROINDUSTRIAL CICLO:

YARINACOCHA PER

2013

I.-

GENERALIDADES:

Las bacterias son organismos procariotas, que miden uno o varios micrmetros, las podemos diferencias en dos grandes grupos: Las bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. En trminos generales, las capas que rodean a la clula bacteriana, se conoce como envoltura celular o pared celular. La estructura y organizacin de sta difieren en las bacterias Gram positivas y Gram negativas. El componente qumico comn en ambas es el pptidoglucano o murena, que es el responsable de la forma y consistencia de la pared celular. La cantidad de pptidoglucano de la pared de las clulas bacterianas vara desde el 90% en la pared de algunas bacterias Gram-positivas hasta menos del 10% en las bacterias Gram-negativas. La pared celular de las bacterias Gram-positivas contiene pequeas cantidades de protenas y polisacridos, a menudo tambin cidos teicoicos (polmeros de ribitolfosfato o glicerol-fosfato unidos mediante enlaces fosfodister) o de cidos teicurnicos. Estos cidos estn unidos al pptido-glucano por los fosfatos. En las proteobacterias, Gram-negativas, la capa interna de la pared celular es pobre en pptidoglucano y la capa externa rica en lipoprotenas y lipopolisacridos, los cuales constituyen ms del 80% del peso seco de la pared. El espacio entre la membrana externa y la capa de pptidoglucano, llamado periplsmico, contiene un gran nmero de protenas enzimticas (Carrillo, 2005). A travs de la coloracin de Gram, podemos diferencias ambos grupos bacteriano; el fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram postivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al colorante slo en las Gram negativas, mientras que en las Gram postivas el colorante queda retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram negativas se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse. (Jawest, 2005). Objetivos Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: II. 2.1 2.2 Manipular adecuadamente la tincin diferencial de Gram Diferenciar frente al microscopio las bacterias Gram postivas y Gram negativas MATERIALES Material biolgico: Cultivo purificado de Escherichia y Bacillus Yogurt natural Material de vidrio: Lminas porta objeto Lminas cubre objeto Gotero Pasteur Mechero

2.3 2.4 2.5

Reactivos: Violeta de genciana Safranina Lugol Alcohol acetona Agua destilada Aceite de cedro Equipos: Microscopio compuesto Otros: Mondadientes estriles PROCEDIMIENTO Coloracin diferencial de Gram

III. 3.1 -

Con un mondadientes picar una colonia de Escherichia coli y Bacillus, y colocarlo sobre una lmina porta objeto. Dejar secar y fijar por calor Colocarlo sobre un soporte y cubrirlo con una solucin de violeta de genciana, esperar por 2 minutos Desechar el exceso del colorante y agregar lugol, esperar por 1 minuto. Desechar el exceso de colorante y agregar etanol-acetona para decolorar, esperar 20 segundos. Lavar con agua Aadir safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto Lavar con agua Esperar que seque y observar con objetivo de inmersin. Esquematizar.

3.2 -

Tincin de corpsculos metacromticos

Tomar una muestra de un yogurt con el asa de siembra y colocar en un portaobjetos.

Teir con azul de metileno (descrito en coloracin Gram), esperar 2 minutos En esta preparacin se observan dos microorganismos: Lactobacillus (con los corpsculos

metacromticos en su interior) y Streptococcus (forman cadenas).

IV RESULTADOS

Muestra:sarro dental Observacin: gran negativo Colorante: safranina, violeta, lugol Aumento: 100 Preparado: en fresco

Muestra: sarro dental Observacin: color rojizo (Gran Negativa) Colorante: safranina, violeta, lugol Aumento: 400 Preparado: en fresco

DISCUSIN: La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmtica y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmtica mediante molculas de cido. La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas est compuesta por una membrana citoplasmtica (membrana interna), una pared celular delgada de peptidoglicano, que rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la pared celular de estas bacterias.

VI

CONCLUSIN: En la presente prctica se logr manipular adecuadamente la tincin diferencial del Gram mediante el microscopio logrando diferenciar sus caractersticas fsicas entre la positiva y la negativa, dando como resultado un Gram negativa como se vee en los resultados.

VII -

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: Carrillo L. 2005. Manula de microbiologa Agrcola. Universidad Nacional de Jujuy.176p. Brooks G. 2005. Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 896p.

CUESTIONARIO 1. A QUE SE LLAMA COLORACIN GRAM Y QUIEN PROPUSO ESTA COLORACIN? Al procedimiento que consiste en teir las paredes con un colorante bsico reforzado por un mordiente y que permite diferenciar los dos grandes grupos bacterianos. Y quien propuso esta coloracin fue el mdico dans Christian Gram en 1884.

2. DIFERENCIA DE GRAM POSITIVO Y GRAM NEGATIVO (4) DIFERESNCIAS GRAM POSITIVAS

Pared celular con grueso peptidoglicano que retiene un colorante especfico. No tienen membrana externa. aparecen en color prpura presentan slo una membrana lipdica y la pared de peptiglicano es mucho ms gruesa se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram: de aqu el nombre de "Grampositivas" o tambin "grampositivas".

GRAM NEGATIVAS
pared celular compleja, con membrana externa y un espacio entre membrana interna y externa presentan color rojo El peptidoglicano es fino, por lo que no retienen el colorante. causan enfermedades. Los cocos Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), meningitis (Neisseria meningitidis) y sntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros.

Prctica Nro. 6 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO I.GENERALIDADES:

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne, peptona y/o triptona a la que se aadirn otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos.(Madigan, 2004) Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en: Lquidos, Semislidos, Slidos. Y por su uso en: Medios de cultivos bsicos y Medios de cultivos especiales como: mejorados, selectivos, diferenciales, de transporte.(Madigan, 2004) Objetivos: Elaborar medios de cultivo slido y lquido para el crecimiento de microorganismos II. 2.1 2.2 MATERIALES Insumos: Papa amarilla Sacarosa Material de vidrio: Matrz de 250 mL Probeta de 100 mL Vaso de precipitacin de 250 mL Placas petri

2.3 2.4 2.5

Reactivos: Triptona Extracto de levadura NaCl Agar Agar Mac Conkey Agar Plate Count Agua destilada NaOH 10N HCl 0.1N. Equipos: Agitador magntico Barra magntica Balanza analtica Cocina elctrica Autoclave Campana de flujo laminar Potencimetro Otros: Papel aluminio Esptula Tela de nailon Papel craff parafilm PROCEDIMIENTO Medio medio Luria Bertani (LB) (slido)

III. 3.1

Reactivos para medio Luria Bertani (LB) Triptona Extracto de levadura NaCl Agar Agua destilada pH 1g. 0.5g. 1g. 1.5 g 100 mL 7.0

Con un mondadientes picar una colonia Medir 50 mL de agua destilada en probeta graduada y vaciarlo al matraz. Adherir al matraz los reactivos del medio LB (previamente pesados), excepto el agar Disolver los reactivos mediante agitacin en el agitador magntico Ya homognea la solucin vaciarlo a la probeta y aforar hasta 98 mL

Medir y corregir el pH hasta 7.0 con NaOH 10N, o HCl 0.1N. Ya corregido el pH, aforar nuevamente en la probeta hasta 100 mL Vaciar el medio al matraz, incluyendo el agar. Tapar el matraz y autoclavear a 15 lb/plg2, 120C durante 15 min. Vaciar en medio en placas petri dentro de la Cmara de flujo Laminar.

3.2

Medio medio Luria Bertani (LB) (lquido) Reactivos para medio Luria Bertani (LB) Triptona Extracto de levadura NaCl Agua destilada pH 1g. 0.5g. 1g. 100 mL 7.0

Medir 50 mL de agua destilada en probeta graduada y vaciarlo al matraz. Adherir al matraz los reactivos del medio LB (previamente pesados), excepto el agar Disolver los reactivos mediante agitacin en el agitador magntico Ya homognea la solucin vaciarlo a la probeta y aforar hasta 98 mL Medir y corregir el pH hasta 7.0 con NaOH 10N, o HCl 0.1N. Ya corregido el pH, aforar nuevamente en la probeta hasta 100 mL Vaciar el medio al matraz, no incluir el agar. Cubrir el matraz y autoclavear a 15 lb, 120C durante 15 min.

3.3

Medio Agar Papa Reactivos para medio Agar Papa Papa Sacarosa Agar Agua destilada pH 150g. 20g. 7.5g. 50 mL 6.8

Se cocinan las papas (peladas, pesadas previamente y cortadas en pedacitos) en 25 mL de agua destilada hasta que se muestren cocidas. Colar el extracto de papa a travs de varias capas de tela El filtrado mezclar con los dems ingredientes(sacarosa) ya disueltos en los 25 mL de agua destilada restantes (excepto el agar) Corregir el pH hasta 6.8 con NaOH 10N, o HCl 0.1N. Disolver en caliente el agar Vaciar a viales de vidrio y cubrirlos con papel aluminio Envolver los viales en paquetes de 6 con papel craff. Esterilizar en autoclave a 15 lb, 120C durante 15 min.

3.4

Medio Agar Plate Count Reactivos para medio Agar Plate Count

Triptona 5 gr Extracto de levadura 2.5gr Dextrina 1 gr agar 15 gr agua destilada. 1000 mL pH 7.0
Para la preparacin de medio Agar Plate Count, se procede de la misma forma que se prepar medio LB, sin embargo por ser un medio de cultivo comercial, ya lo podemos obtener todos los reactivos mezclados a manera de polvo, dentro de un frasco con las indicaciones como prepararlo descritos. Para ese caso se proceder de la siguiente manera (siguiendo las instrucciones de la etiqueta del frasco): Pesar 23.5 g. de agar Plate count Diluirlo en 1 L de agua destilada dentro del matraz Corregir pH a con NaOH 10N, o HCl 0.1N. Aforar hasta volumen definitivo Cubrir el matraz con tapn de algodn y autoclavear a 15 lb, 120C durante 15 min. Vaciar en placas petri dentro de campana de flujo laminar

3.5

Medio Agar Mac Conkey Reactivos para medio Agar Mac Conkey Cristal Violeta Extracto de levadura en polvo 3 g Rojo neutro Sales biliares Lactosa NaCl Peptona Glucosa Agar Agua destilada pH 0.002 mg 30 mg 1.5 g 10 g 5g 7g 10 g 13 g 1000 mL 7.1

Al igual que el medio Agar Plate Count, es usual que el medio Agar Mac Conkey, ya se adquiera comercialmente todos los reactivos mezclados, entonces se deber seguir las indicaciones descritas en la etiqueta del frasco: 3.6 Pesar 51.5 g. de agar Mac Conkey Diluirlo en 1 L de agua destilada dentro del matraz Corregir pH a con NaOH 10N, o HCl 0.1N. Aforar hasta volumen definitivo Cubrir el matraz con tapn de algodn y autoclavear a 15 lb, 120C durante 15 min. Vaciar en placas petri dentro de campana de flujo laminar Solucin Salina Peptonada (SSP) Reactivos para SSP

Peptona NaCl agua destilada. pH

IV. RESULTADOS

1 gr 8.5gr 1000 mL 7.0

A. A continuacin, el estudiante deber esquematizar, graficando y coloreando, el medio de cultivo que le correspondi preparar, indicando ordenadamente paso a paso como lo obtuvo. B. As mismo detallar las principales aplicaciones de todos los medios de cultivo preparados en clase, haciendo nfasis si es un medio de cultivo bsico o selectivo de acuerdo a sus propiedades qumicas.