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!

UNIVERSIDAD TCNICA PARTICULAR DE LOJA


La universidad catlica de Loja

ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA
MODALIDAD PRESENCIAL

Evaluacin del efecto del inculo
Micorrzico arbuscular en el crecimiento de
Cinchona pubescens y Cinchona officinalis
en condiciones de vivero


Trabajo de fin de carrera previa
a la obtencin del ttulo de:
Bioqumico Farmacutico

Autoras:
Guachn Medina Tania Cecilia
Prado Vivar Mara Beln

Director:
Ing. Lucero Mosquera Hernn Patricio
Loja Ecuador
2012



##


CESIN DE DERECHOS

Nosotras, Tania Cecilia Guachn Medina y Mara Beln Prado Vivar,
declaramos conocer y aceptar la disposicin del Art. 67 del Estatuto
Orgnico de la Universidad Tcnica Particular de Loja que en su parte
pertinente textualmente dice: Forman parte del patrimonio de la
Universidad la propiedad intelectual de investigaciones, trabajos cientficos
o tcnicos y tesis de grado que se realicen a travs o con el apoyo
financiero, acadmico o institucional (operativo) de la Universidad.

Loja, enero de 2012


Tania Cecilia Guachn Medina Mara Beln Prado Vivar
AUTORA AUTORA



Ing. Hernn Patricio Lucero Mosquera.
DIRECTOR DE TESIS



###



CERTIFICACIN

Ing.
Hernn Lucero Mosquera.
DIRECTOR DE TESIS

C E R T I F I C O:

Una vez revisado el trabajo de investigacin realizado por las alumnas
Tania Cecilia Guachn Medina y Mara Beln Prado Vivar, previo a la
obtencin del ttulo de BIOQUMICO FARMACUTICO, se autoriza su
presentacin final para la evaluacin correspondiente.


Loja, enero de 2012




Ing. Hernn Lucero Mosquera.
DIRECTOR DE TESIS



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AUTORA

Los conceptos, ideas y resultados vertidos en el desarrollo del
presente trabajo de investigacin son de absoluta responsabilidad
de sus autoras.





Tania Cecilia Guachn Medina Mara Beln Prado Vivar
AUTORA AUTORA



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DEDICATORIA


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AGRADECIMIENTO

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CONTENIDO
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CESIN DE DERECHOS ii
CERTIFICACIN iii
AUTORA iv
DEDICATORA v
AGRADECIMIENTO vi
CONTENIDO vii
RESUMEN xi

ABREVIATURAS xxii
FIN, PROPSITO Y COMPONENTES DEL PROYECTO xxiii



1. INTRODUCCION Y ANTECEDENTES:

1.1 Micorrizas:
1.1.1 Definicin 1
1.1.2 Clasificacin Morfolgica de Micorrizas 1

1.2 Micorrizas Arbusculares:


1.2.1 Descripcin de HMA 3
1.2.2 Arquitectura de la micorriza Arbuscular 4
1.2.2.1 Hifas 4
1.2.2.1.1 Hifas intercelulares 4
1.2.2.1.2 Hifa intracelular 4
1.2.2.1.3 Hifa extraradicular 4
1.2.2.2 Apresorios 5
1.2.2.3 Vesculas 5
1.2.2.4 Arbsculos 5
1.2.2.5 Clulas Auxiliares 5
1.2.3 Clasificacin de los HMA 6

1.3 Simbiosis HMA-Planta hospedera:

1.3.1 Multiplicacin de inculo Micorrzico 7
1.3.2 Plantas hospederas 8
1.3.3 Sustrato 9
1.4 Ciclo simbitico de HMA 9

1.5 Generalidades de Cinchona





1.5.1 Etimologa 11
1.5.2 Generalidades y Uso 11
1.5.3 Cinchona officinalis L. 12
1.5.3.1 Descripcin taxonmica 12
1.5.3.2 Ubicacin geogrfica en el Ecuador 12
1.5.3.3 Descripcin 13
1.5.4 Cinchona pubescens L. 13
1.5.4.1 Descripcin taxonmica 14
1.5.4.2 Ubicacin geogrfica en el Ecuador 14
1.5.4.3 Descripcin 14

1.6 Cultivo in vitro de Hongos Micorrzicos Arbusculares

1.6.1 Cultivo monoxnico 14
1.6.2 Races Hospederas transformadas 15
1.7 Rol ecolgico e Importancia de los HMA en la restauracin de ecosistemas degradados 15

1.8 Efectividad e infectividad de los HMA 16

2. METODOLOGA
2.1 Sitio de estudio y muestreo 18
2.2 Multiplicacin in vivo del inculo de HMA aislados desde Cinchona pubescens en plantas
trampa de Lolium perenne
18
2.3 Determinacin del porcentaje de colonizacin de races micorrizadas de las plantas trampa 19
2.4 Condiciones del Ensayo 19
2.5 Parmetros evaluados 21
2.5.1 Determinacin del porcentaje de colonizacin de las plantas Cinchona officinalis y
Cinchona pubescens:

21
2.6 Aislamiento in vitro de HMA 22
2.6.1 METODO 1: Obtencin de cultivos monospricos de HMA in vitro 22
2.6.1.1 Obtencin de los propgulos 22
2.6.1.2 Seleccin de los propgulos de HMA 22
2.6.1.3 Extraccin, desinfeccin y siembra de las esporas 22
2.6.2 METODO 2: Obtencin de cultivos de races de HMA in vitro. 23
2.7 Anlisis estadstico 24

3. RESULTADOS Y ANALISIS
3.1 Evaluacin de la colonizacin de las plantas trampa. 25
3.2 Resultado del ensayo prueba. 25
3.3 Evaluacin de las plantas de Cinchona officinalis y Cinchona pubescens 26
3.3.1 Mortalidad de las plantas 27
3.3.2 Resultados de las variables respuesta 28
3.3.2.1 Altura 28




3.3.2.2 Nmero de Hojas 29
3.3.2.3 Dimetro de tallo 30
3.3.2.4 Tamao de la raz 31
3.3.2.5 Tamao total 32
3.3.2.6 Peso areo 33
3.3.2.7 Peso radicular 33
3.3.2.8 Peso seco areo 34
3.3.2.9 Peso seco radicular 35
3.3.3 Evaluacin del porcentaje de colonizacin 37
3.3.3.1 Anlisis estadstico del porcentaje de colonizacin. 37
3.3.3.1.1 Frecuencia de Micorrizacin %F 38
3.3.3.1.2 Abundancia Arbuscular en el sistema radicular %A 39
3.4 Resultados de los cultivos in vitro de HMA 41
3.4.1 Resultados del cultivo monosprico de HMA 41
3.4.2 Resultados del cultivo de races de HMA in vitro 42

4. CONCLUSIONES 45

5. PERSPECTIVAS A FUTURO
47

6. BIBLIOGRAFA
48

5. ANEXOS 53



LISTA DE TABLAS



Pg.
Tabla 1:
Clasificacin de los hongos micorrzicos arbusculares. 7
Tabla 2: Tratamientos utilizados para el establecimiento del ensayo. 20
Tabla 3: Porcentaje de mortalidad y supervivencia de las plantas. 27



LISTA DE FIGURAS


Pg.
Figura 1:
Principales estructuras de los tipos de micorrizas.
3
Figura 2:
Representacin de un hongo Micorrzico Arbuscular.
4
Figura 3:
Estructura de los Hongos Micorrzicos.
6
Figura 4:
Ciclo de vida de los HMA durante el establecimiento de la simbiosis funcional.
10
Figura 5:
Foto del rbol de Cinchona officinalis.
12
Figura 6:
Foto del rbol de Cinchona pubescens.
13




Figura 7:
Plantas en el invernadero.
20
Figura 8:
Cultivo monosprico de Scutellospora savanicola.
23
Figura 9:
Segmentos de raz con Glomus sp en cultivo in vitro.
24
Figura 10:
Estructuras micorrzicas encontradas en las plantas trampa de Lolium perenne.
25
Figura 11:
"Ensayo prueba" con plantas de Cinchona officinalis inoculadas con MUCL41883.
26
Figura 12:
Evaluacin de las variables respuesta de las planta.
26
Figura 13:
Evaluacin de la colonizacin de las plantas de Cinchona en estudio.
37
Figura 14:
Germinacin de Scutellospora savanicola sobre medio MSR.
42
Figura 15:
Cultivo de races con Glomus sp.
42



LISTA DE GRAFICAS


Pg.
Grfica 1: Altura de las plantas 29
Grfica 2: Nmero de Hojas de las plantas 30
Grfica 3: Dimetro de tallo de plantas 30
Grfica 4: Tamao de raz de las plantas 31
Grfica 5: Tamao Total de las plantas 32
Grfica 6: Peso areo de las plantas 33
Grfica 7: Peso radicular de las plantas 34
Grfica 8: Peso seco areo de las plantas 34
Grfica 9: Peso seco radicular de las plantas 35
Grfica 10: Porcentaje de Frecuencia de Micorrizacin 38
Grfica 11: Porcentaje de Abundancia Arbuscular 39


LISTA DE ANEXOS


Pg.
Anexo 1: Datos generales de la planta hospedera (Lolium perenne) 53
Anexo 2: Modificacin del Mtodo tincin de Phillips y Hayman (1974). 54
Anexo 3: Distribucin de las plantas en el invernadero 55
Anexo 4: Fotos del ensayo 56
Anexo 5: Estimacin de la micorrizacin 60
Anexo 6: Mtodo de tamizado hmedo y decantacin para la separacin de esporas del suelo 61









RESUMEN

Los hongos micorrzicos arbusculares (HMA) son organismos que viven
simbiticamente con la mayora de plantas. Por el papel clave que juegan
en el desarrollo de plantas invasoras frente a especies nativas; el presente
trabajo estableci un ensayo con 288 plantas entre Cinchona officinalis y
pubescens, bajo un diseo basado en cuatro tratamientos: inculo
Galpagos, inculo MUCL41883, fertilizante y testigo. Evaluamos
parmetros: altura, nmero de hojas, dimetro de tallo, tamao radicular y
total, peso fresco y seco, y porcentaje de colonizacin. Los resultados
mostraron efectos positivos en tratamientos con HMA, la mayor tasa de
mortalidad se dio con fertilizante. La asociacin Cinchona pubescens
MUCL41833 demostr mayor porcentaje de colonizacin (92.64%).

Tambin realizamos cultivos in vitro de HMA con esporas de Scutellospora
savanicola y segmentos de races colonizadas con Glomus sp.
germinadas sobre medio MSR, para luego establecer simbiosis en races
transformadas de Medicago truncatula. Los resultados mostraron que el
cultivo de esporas form una masa enredada de hifas con distribucin
limitada, no as el cultivo de races en donde no se evidenci germinacin
alguna.



Palabras Clave: micorrzica, inculo, Cinchona, monoxnico.

.








SUMARY

Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are soil organisms that live
symbiotically with most plants. On the key role they play in growth and
development of invasive plant versus native species, the present work
established a study of 288 plants from Cinchona officinalis and pubescens,
under an experimental design based on four treatments: Galapagos
inoculum, MUCL41883 inoculum, fertilizer and a control. The parameters
evaluated were: height, leaf number, stems diameter, root size, total fresh
and dry weight, and percentage of colonization. The results showed positive
effects in treatment with AMF, but not with fertilizer, which showed higher
mortality rate. Mycorrhizal colonization, the association Cinchona
pubescens - MUCL41833 showed better results (92.64%).
Also, we realized cultivation in vitro of AMF spores of Scutellospora
savanicola and root segments colonized by Glomus sp. germinated on
MSR medium, and then establish symbiosis in Medicago truncatula roots
transformed. The results indicate that the cultivation of spores showed no
intraradical colonization only the formation of a tangled mass of hyphae with
limited distribution, while root crops failed because there was no evidence
of germination any time.

Key words: mycorrhiza, inoculum, Cinchona, monoxenic.











EVALUATION OF THE EFFECT OF ARBUSCULAR MYCORRHIZAL INOCULUM IN THE
GROWTH OF Cinchona officinali AND Cinchona pubescens UNDER GREENHOUSE
CONDITIONS.
Mara B. Prado
1
, Tania C. Guachn
1
, Hernn P. Lucero
2
, Paul D. Lojn
2

1
Biochemistry and Pharmacy School~Technical University of Loja,
San Cayetano Alto s/n, Postal Code 11-01-608, Loja, Ecuador
e-mail: mbprado@utpl.edu.ec; tcguachon@utpl.edu.ec

2
Center of Molecular and Cell Biology~ Technical University of Loja,
San Cayetano Alto s/n, Postal Code 11-01-608, Loja, Ecuador
e-mail: hplucero@utpl.edu.ec; paulojanarmijos@gmail.com


ABSTRACT
Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are soil organisms that live symbiotically with most plants. On the key
role they play in growth and development of invasive plant versus native species, the present work
established a study of 288 plants from Cinchona officinalis and pubescens, under an experimental design
based on four treatments: Galapagos inoculum, MUCL41883 inoculum, fertilizer and a control. The
parameters evaluated were: height, leaf number, stems diameter, root size, total fresh and dry weight, and
percentage of colonization. The results showed positive effects in treatment with AMF, but not with
fertilizer, which showed higher mortality rate. Mycorrhizal colonization, the association Cinchona
pubescens - MUCL41833 showed better results (92.64%).
Also, we realized cultivation in vitro of AMF spores of Scutellospora savanicola and root segments
colonized by Glomus sp. germinated on MSR medium, and then establish symbiosis in Medicago
truncatula roots transformed. The results indicate that the cultivation of spores showed no intraradical
colonization only the formation of a tangled mass of hyphae with limited distribution, while root crops failed
because there was no evidence of germination any time.
Key words: Arbuscular mycorrhizal fungi, Inoculum, species of Cinchona, monoxenic cultures.

INTRODUCTION:
The term mycorrhizal derives from the Greek:
myco (fungal) and rhyza (root), it is a symbiosis
between the roots of most plants and certain soil
fungi (Hernandez et al. 2001), (Read, 1999).
Within the type endomycorrhizae find arbuscular
mycorrhizal fungi (AMF), whose name derives
from the characteristics that these fungal
structures present the arbuscules and vesicles
(Gonzales, et al. 2005).
This association benefits the plant in terms of
absorption of nutrients, especially of those little
mobile as phosphorus (Holguin, et al. 1996), and
thanks to the greater volume of soil explored by
the extraradical hyphae, the intake of water by the
plant increases, improving tolerance to water
stress and stimulate root and air growth (Smith
and Read, 1997). This is an environmentally
friendly alternative that will reduce the pollution
problems caused by over use of chemical
fertilizers (Martinez, et al. 2007).
Nowadays, it has been shown that AMF may
facilitate the development of invasive plants
increasing their competitive advantage over native
species (Martinez and Pugnaire, 2009), this is the
case of Cinchona pubescens, a species that has
been introduced to a number of tropical areas
around the world including the Galapagos Islands




where it has demonstrated severe invasive
characteristics. Unlike this species, we find
Cinchona officinalis, a species native to southern
Ecuador and considered of great importance for
its antimalarial action, but it is threatened and is
considered a priority species for conservation and
study (Loaiza and Sanchez, 2006), because in
natural conditions shows low germination, rate
found only in small and remote places.
The aim of our study is based on checking the
effect of AMF communities associated with C.
pubescens on the island of Santa Cruz -
Galapagos on the growth of plants of C.
pubescens and C. officinalis in greenhouse
conditions. Also using and applying methods for
the isolation of HMA, by using monoxenic
cultures, a technique that has managed to
produce in vitro culture of roots which have been
inoculated with spores of AMF previously
disinfected on synthetic media previously.

Consequently, the use of these microsymbionts
could be taken into account in the design of any
system of agricultural production, because they
are considered as biological substitutes of mineral
fertilizers (Castillo, et al. 2009).

MATERIALS AND METHODS

For this research we used two types of fungal
material: one from Santa Cruz Island - Galapagos
(S 0.66226, 90.3248 W; from a C. pubescens
forest of the Charles Darwin Foundation donated
by Heinke Jager) and one strain MUCL41833 of
Rhizophagus irregulare, from the Micoteca
Catholic University of Leuven.
The multiplication of the Galapagos inoculum was
conducted in pots and in duplicate in 10 host
plants of Lolium perenne, and were kept in bags
Sun Bags for about 4 months. After this time,
several roots were extracted at randomly and
using the staining method of Phillips and Hayman
(1970), and also with the help of the microscope
we determined which plants had a higher
percentage of colonization, this would be of great
importance for our study
1. Experimental design:

Before starting our study, we realized a "trial test",
which consisted of ten plants of Cinchona
officinalis which were inoculated with MUCL41883
for two months, then evaluated their mycorrhizal
colonization by staining and verifying the success
of the symbiosis. This was the basis for future
studies.
For the main essay (trial), seeds of Cinchona
pubescens and Cinchona officinalis were
germinated previously in vitro for two months and
then were transplanted to pots in the greenhouse.
When the plants showed an appropriate size our
assay (trial) began. A total of 144 plants of C.
pubescens and 144 of C. officinalis were divided
into three blocks, four replications, three replicates
by treatment and four treatments, which were: T1=
Galapagos inoculum, T2= MUCL41883 inoculum,
T3= fertilizer and T4=control.
During the months of May to August, they were
under greenhouse conditions for their growth.
After this time we proceeded to analyze, the
response variables evaluated were: mortality,
plant height, leaves number, fresh weight, dry
weight and percentage of colonization.
Parameters evaluated:

Variables such as height, root size, were taken
with the aid of a millimeter rule, the diameter of
the stem with a vernier caliper, the leaves were
counted, the fresh and dry weight were taken with
the help of an analytical balance, while the
percentage of colonization was realized by
staining the roots of plants by the method of
Phillips and Hayman (1970), and with the help of a
standard microscope Axioplan, at 100X and 400X
of magnification, were observed different
structures as vesicles, arbuscules and hyphae.
The levels of colonization of the plants were
determined according to the estimate of
mycorrhization by Trouvelot, et al. (1986), the data
was analyzed in the software "Mycocalc" and then
calculated the parameters % F: Frequency of
mycorrhiza roots and % A: arbuscular abundance
in the root system.




2. Isolation in vitro of HMA:

Because in our culture no spores were found to
implement these methods, the propagules were
selected: Scutellospora savanicolla cultures
(1455-2), from roots of Cedrela montana
(Mycorrhiza for Reforestation Project) and roots
isolation of Glomus sp. (E2-GLO1), from a potato
culture of Saraguro (VALORAM Project).
2.1 AMF spore culture in vitro:

S. savanicolla spores were obtained by applying
the method of sieving and decanted of
Gerdermann and Nicolson (1963), and extracted
under a stereoscope, before being subjected to a
desinfection process based on the protocol of
Cranenbrouck, et al. (2005).

Disinfected spores were captured using a
micropipette and sterile tips and deposited in the
Modified Strullu Romand Medium (MSR), and
incubated in the shade at 27 C. Once it was
verified the germination of spores were inoculated
on Medicago truncatula transformed roots on
MSR medium alike.

2.2. Culture roots with AMF in vitro:

Roots isolation of Glomus sp. (E2-GLO1) were
washed with tap water to remove every particle of
soil.
The disinfection of the root was made based on
Cranenbrouck, et al. (2005), with the help of a
sonicator and using solutions such as
demineralized water, Calcium Hypochlorite,
chloramine T solution at 2% and washed with
antibiotic solution, and finally fragments of
approximately 0.5 cm were selected at random in
laminar flow chamber, and with the help of a
sterile scapler and forceps five pieces each were
placed in Petri plate filled with MSR and incubated
at 27 C
3. Statistical Analysis:
Data was analyzed with the method of analysis of
variance and mean comparison test (Tukey, P
<0.05) using the program Statistical Analysis
System (SAS).
RESULTS AND DISCUSSION
Ten plants were evaluated Lolium perenne trap
through their roots staining using the method of
Phillips and Hayman (1970). Under the
microscope it was observed that seven of them
had great presence of mycorrhizal structures
(Fig.1), confirming the multiplication of the
Galapagos inoculum, suitable for our trial.

Figure 1: Mycorrhizal structures found in plants to trap
Lolium perenne) arbuscules, b) c) vesicles and hyphae.

Assay results:

Two months after inoculation of C. officinalis
plants with MUCL41883, we found that there are
plant symbiosis - AMF by staining roots under the
method of Phillips and Hayman (1970). This
subsequently allowed us to start our test with
greater security (Fig. 2).


Figure 2: a) Assay with Cinchona officinalis plants
inoculated with MUCL41883, b1) and b2) Extraction of
roots for staining, c1) Plates stained roots under the
method of Phillips and Hayman (1970), c2) Plate view
with a microscope, note the presence of spores and
hyphae.





After three months of growth under green- house
conditions, we began to evaluate all of the
proposed parameters.


Table 1. Mortality rate of C. pubescens and C.
officinalis, with all treatments


Of the 288 plants studied, 133 plants died
(46.18%). Also, 36 of the plants used for
treatment, presented higher mortality rate in T3,
with C. pubescens (88.8%) and C. officinalis
(63.8%) plants, (Table 1).

The highest rate of mortality was due to using very
high doses of fertilizers, since its excess causes
symptoms similar to the excess of water, also
keep in mind that the finer is the root, the greater
must be the dilution of fertilizers (Silva, F., 1999).It
is also necessary to know the conditions that each
plant needs, Morton and Benny (1990) explain
that some plant species decrease in number or
disappear when attempting to multiply in pots.

Response variables evaluated

Height

Graph 1. Height plant of C. pubescens and C. officinalis in the
four treatments. T1: Inoculum Galapagos, T2: MUCL41833
Inoculum, T3: Fertilizer, T4: Witness. Vertical lines indicate
standard deviations. Different letters show significant
differences (p ! 0.05).

The species tested showed no significant
difference (p = 0.44) between them. While no
significant difference between treatments (p =
0.02). In the Graphic 1 we see that T1 - C.
officinalis gave better results in height (3.1 cm),
while T3 - C. pubescens was the lowest result was
that (0.1cm).

The growth rates of plants are related to the
association with AMF (Smith and Read, 1997).
Most soil exploration have their aerial hyphae
increase the absorption of nutrients by taking
them to the host plant. (Harrison, 1997), thus
increasing the physiological changes in plant
growth.

Number of leaves

Graph 2: Number of leaves of plants of C. pubescens and C.
officinalis in the four treatments. T1: Inoculum Galapagos, T2:
Inoculum MUCL41833, T3: Fertilizer, T4: Witness. Vertical
(
!
)
*
+
,
-
T1 T2 T3 T4
!
"
#
$
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(
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+


,-".&*"/&0
Height
./ 012345364
./ 785#69:#4 a
ab
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c
(/((
)/((
+/((
-/((
;/((
!(/((
!)/((
<! <) <* <+
1
2
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3
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-

4
5

6
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.
7
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0

,-".&*"/&0
12*3"- 45 6".7"0
./ 012345364
./ 785#69:#4
MORTALITY RATE
Specie Treatment Dead Living

C
i
n
c
h
o
n
a


P
u
b
e
s
c
e
n
s

Galpagos inoculum T1 61.11 % 38.88%
MUCL41833 inoculum T2 27.77 % 72.22 %
Fertilizer T3 88.88 % 11.11 %
Control T4 61.11 % 38.88 %

C
i
n
c
h
o
n
a

O
f
f
i
c
i
n
a
l
i
s

Galpagos inoculum T1 13.88 % 86.11 %
MUCL41833 inoculum T2 8.33 % 91.66 %
Fertilizer T3 63.88 % 36.11 %
Control T4 44.44 % 55.55 %
TOTAL 46.18 % 53.81 %
cd
d
a
ab




lines indicate standard deviations. Different letters show
significant differences (p ! 0.05).

Statistically evaluated species showed no
significant difference (p = 0.77) between them.
Significant difference between treatments (p =
0.0013). The graph 2, indicates that T1 and T2
with C. officinalis gave better results (7 leaves).
The lowest score: T3 with C. pubescens was (1
leave).

Stem Diameter


Graph 3: Stem Diameter of C. pubescens and C. officinalis
plants in the four treatments: T1: Galapagos inoculum, T2:
MUCL41833 inoculum, T3: Fertilizer, T4: Control. Vertical lines
Indicate standard deviations. Different letters show significant
Differences (p ! 0.05).


The results show that the species tested showed
no significant difference (p = 0.94), not was there
between treatments (p = 0.20). It is clear to see in
Graphic 3, that T1 - C. officinalis gave better
results in terms of stem diameter (0.26 cm). While
the T3 - C. officinalis was the lowest result that
was obtained (0.041 cm).


Hernandez and Chialloux, (2001)., mentioned that
the physiological effects that cause the AMF in
terms of uptake of moisture and nutrients to
appreciate a greater force of the stem and leaf
area of plants.



Size of root

Graph 4: Size of plant root C. pubescens and C. officinalis in
the four treatments. T1: Galapagos Inoculum, T2: MUCL41833
Inoculum, T3: Fertilizer, T4: Control. Vertical lines indicate
standard deviations. Different letters show significant
differences (p ! 0.05).

These results show that the species tested
showed significant difference (p = 0.048).
Between treatments was not significant
difference (p = 0.11). The best result was with T1 -
C. officinalis (4.075 cm). While the T3 - C.
pubescens was the lowest result (0.84 cm).
(Graph 4).

Total size


Graph 5: Total size of the plants of C. pubescens and C.
officinalis in the four treatments. T1: Galapagos Inoculum, T2:
MUCL41833 Inoculum, T3: Fertilizer, T4: Control. Vertical lines
indicate standard deviations. Different letters show significant
differences (p ! 0.05).

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a

b
c
d




Statistically significant difference was observed
between species (p = 0.0006) and between
treatments (p = 0.0133). Best we see with T1 - C.
officinalis with a total size average of 7.40 cm,
compared to T3 - C. pubescens was the lowest
with an average of 0.47 cm. (Graph. 5)

Rivera and Fernndez, (1997), indicate that the
plants colonized by AMF stimulate root
development and plants show better growth than
non-mycorrhizal, an issue that is related to the
above mencionado and as to the further
exploration of the root system.

Aerial Weight


Graph 6: Weight aerial plants of C. pubescens and C.
officinalis in the four treatments. T1: Galapagos Inoculum, T2:
MUCL41833 Inoculum, T3: Fertilizer, T4: Control. Vertical lines
indicate standard deviations. Different letters show significant
differences (p ! 0.05).


The results show that the species tested showed
no significant difference (p = 0.05) between them.
Not is there between treatments (p = 0.058). ).
The graph 6 indicates better result by combining
T2 - C. pubescens (0.170 g). The lowest result
was seen with T3 - C. pubescens (0.0036 g).

Root Weight

Graph 7: Root weight Plant of C. pubescens and
C. officinalis in the four treatments. T1: Galapagos
Inoculum, T2: MUCL41833 Inoculum, T3:
Fertilizer, T4: Control. Vertical lines indicate
standard deviations. Different letters show
significant differences (p ! 0.05).

The species tested showed no significant
difference (p = 0.46) between treatments were not
(p = 0.73). The graph 7 indicates better result by
combining T1 - C. officinalis (0.042 g). The lowest
result was seen with T3 - C. pubescens (0.0091
g).

Air Dry Weight

Graph 8: Air dry weight of plants of C. pubescens and C.
officinalis in the four treatments. T1: Galapagos Inoculum, T2:
MUCL41833 Inoculum, T3: Fertilizer, T4: Control. Vertical lines
indicate standard deviations. Different letters show significant
differences (p ! 0.05).

The species tested showed no significant
difference (p = 0.60) nor treatment (p = 0.50). The
best result was obtained with T2 - C. pubescens
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T1 T2 T3 T4
A
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r
y

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i
g
h
t

(
g
)

Treatments
Air dry weight
C. pubescens
C. officinalis
a
a
a
a




(0.021 g) and C. officinalis (0.019 g). The lowest
result was seen with T3 - C. pubescens (0.0006
g). (Graph 8)

Root Dry weight


Graph 9: Root dry weight of plants of C. pubescens and C.
officinalis in the four treatments. T1: Galapagos Inoculum, T2:
MUCL41833 Inoculum, T3: Fertilizer, T4:Control. Vertical lines
indicate standard deviations. Different letters show significant
differences (p ! 0.05).

The species tested showed no significant
difference (p = 0.47) each, or between treatments
(p = 0.10).The graph 9, indicates better result by
combining T2 - C. pubescens (0.0059 g). The
lowest result was seen with T3 - C. pubescens
(0.0001 g).

The literature mentions that the presence of AMF
increase biomass, since the plant's vascular
system becomes more and rapid availability of
nutrients, accelerating their photosynthetic activity
thus can maintain its physiological equilibirio
increased biomass production. (Alinhhoff, et al.
2009).

We were able to realize that the parameters
evaluated were significantly higher in mycorrhizal
plants than in the non-mycorrhizal. Smith, et al.
(2004), explains that the formation and function of
AMF isolates varies between different species and
even between isolates of the same species.
Therefore, our results support the fact that some
plants inoculated with MUCL41833 inoculum or
Galapagos showed better responses in growth
parameters raised with respect to the other
treatments. Although statistical analysis showed a
"no significance" between treatments, we can see
a better effect on mycorrhizal plants over non-
mycorrhizal in the greenhouse.

PERCENTAGE OF COLONIZATION
ASSESSMENT

After discussing the roots stained mycorrhizal
structures could be found who reported
colonization. Some of the observed structures are
presented in Figure 3.

Figure 3: a). Arbuscules, b) c). Colonizing the root
vesicles, d). Hyphae, structures found in both plant
species Cinchona, evaluated after three months of
inoculation.

Statistical analysis of the percentage of
colonization:

For the statistical analysis of the percentaje of
colonization, we considered only the data of T1
and T2, because the other two did not reveal any
mycorrhizal colonization.

Frequency of mycorrhization F%:

Graph 10: Percentage of Frequency of mycorrhization %F in
C. pubescens and C. officinalis plantas with treatments: T1:
Galapagos Inoculum, T2: MUCL41833 Inoculum. Vertical lines
indicate standard deviations.
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120
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%
F

Treatments
Frequency of mycorrhization %F
C. pubescens
C. officinalis
a
a
a
a





Percentage in the Frequency of mycorrhization %
F no statistical significance between species (p =
0.60), whereas if there was between treatments (p
= 0.0509). Better results were obtained with T2
(MUCL41833). in both species, C. pubescens with
an average of 92.64 % F, and C. officinalis with a
80.72 %F. The T1 is observed that both species
responded to a lesser percentage than T2. Since
their % F was 66.76 and 67.22 in C. officinalis and
C. pubescens respectively. (Graph 10).

Arbuscular abundance in the root system A%:

Graph 11: Arbuscular Abundace in the root system %A of C.
pubescens and C. officinalis plants in treatmenst: T1:
Galapagos Inoculum, T2: MUCL41833 Inoculum. Vertical lines
indicate standard deviations.


It was determined that the percentage of
abundance Arbuscular %A was statistically
significant between species (p <0.0001) and
between treatments (p <0.0001). The best results
were obtained with T2 (MUCL41833) and C.
pubescens with an average of% A 12.28. In other
results was negligible presence of arbuscules.
(Graph 11).

The arbuscules have a very short life span, when
it dies is replaced by a younger provided that the
exchange of nutrients is active. When this stops
the arbuscules die and there are only internal
colonization vesicles (Rocha, et al. 2009). When
viewed under a microscope that was founded,
because in both species the presence of vesicles
was abundant.

The benefits of early inoculation with AMF
contribute to improving the adaptability of plants.
Plenchette, et al. (1983), describes the benefits of
AMF are: nutrition and increased plant growth,
increased defense against pathogens and ability
to overcome situations of biotic and abiotic
stresses. This was evident with both T1 and T2,
where the mortality rate was lower and growth
was higher in relation to the other two treatments
T3 and T4.

Native species of AMF isolated from soil C.
pubescens in the Galapagos Islands, showed a
high infectivity for both species, making sure that
the fungal material is useful. According to Hass
and Krikum (1985), it is important to note that an
inoculum with roots colonized as infective
propagules is of excellent quality as long as you
use immediately, because without the living plant,
the mycelium colonizing dies in a few weeks still
stored under freezing conditions..

Solis, et al. (2009), revealed that placed in direct
contact the root system of the plant fungal
propagules allows for faster colonization of the
root. When the inoculation began the roots of C.
pubescens had more size and better root system
than C. officinalis, allowing more contact with the
inoculum seeing reflected in the higher
percentage of colonization obtained.

On the other hand the successful invasion of
quinine (Cinchona pubescens) in the Galapagos
Islands may be provided by native mycorrhizae
(Schmidt and Scow, 1986), which make than an
exotic species makes became more competitive
than natives ones.

In terms of species Cinchona officinalis, is
answered positively with both AM inocula. The
beneficial effects of the artificial introduction of a
mycorrhizal inoculum are more evident in soils
where native AMF populations do not exist or
have been eliminated by use of unfavorable
agricultural practices for their development as soil
fumigation and intensive cultivation (Rivera, et al.
1997). We know that more research is needed to
explain the benefits that Cinchona plant with AMF
inoculation, the results of this study suggest that
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
T1 T2
%
A

Treatments
Arbuscular Abundance %A
C. pubescens
C. officinalis




these fungi could be used as an agricultural
management strategy to improve the growth of
this species in danger of extinction. This will be
promoting sustainable agriculture and minimizing
dependence on agricultural inputs, especially
chemical fertilizers with the consequent reduction
in environmental damage.

In vitro culture of AMF:

AMF spore culture:

Of the 50 Scutellospora savanicola spores that
were disinfected to germinate on MSR medium,
only 15 showed successful germination at two
weeks. This is where contact was established
hypha germinating spores of S. savanicola in
Medicago truncatula roots transformed.

The evaluation of the presence of S. savanicola in
the epidermal cells of the roots was made with the
help of a stereoscope. After 42 days of
inoculation, we could not see a typical colonization
intrarradical, more if we could detect a marked
and localized development of hyphae in the
culture medium, which spread in a radius of 2-3
cm from the spore inoculated. (Figure. 4)


Figure 4: Germination of Scutellospora savanicola about MSR
medium.

AMF roots culture in vitro:

The cultivation of root segments infected with
Glomus sp, gave no tangible result, after growing
segments for more than a month on MSR
medium, they showed no positive germination.
(Fig. 5)

Figure 5: a) Growing AMF colonized roots in the MSR medium
b) Germination root segment, notice how no germination
occurs even after and 40 days of incubation

It is not yet clear whether the major differences
occur at higher taxonomic levels (genus,
suborder). (INVAM, 1993). To date, the literature
mentions that only 8% of the known species are
used in this type of culture in vitro for the rest not
yet know the conditions in which they develop
(Cranenbrouck, et al. 2005).

Abbott, et al. (1994) showed that mycorrhizal root
segments functioned as effective propagules
Glomus and Acaulospora but not for isolates of
Scutellospora. Likewise, Brundrett, et al. (1999),
determined that the spores were useful for the
establishment of most species of Acaulospora,
Gigaspora and Scutellospora, while presenting
little success with root fragments.

Germination time should also be considered for
such crops as for raicesgeneralmente fragments
is between 2-15 days (Declerck, et al. 2001), but
in our assessment that did not happen, since
before being placed in the middle crop
colonization were not found, which could be a
cause of failure of this trial.

In contrast, the spore germination often occurs in
a period ranging between 2 and 30 days after
disinfection, yet studies of De Souza and Declerck
(2009), with S. reticulata show that for a
successful partnership and production of new
generations of spores in monoxenic cultures
would take eight months.





Another key factor as Becard and Fortin, (1998),
is to get the nutrients necessary for the
establishment of AMF and also indicates that
some sugars such as sucrose may be inhibitory to
mycorrhizal colonization. The above could be one
of the causes of the colonization of roots
transformed spores of M. truncatula was not
favored, since our medium containing sucrose
MSR.

Finally we believe that the species should be
considered root transformed to be used, since
transformed carrot roots are categorized as one of
the most suitable species to date for the
cultivation of AMF, due to its ease of propagation
and maintenance (Declerck, et al. 2001).

ACKNOWLEDGMENTS

Wed like to thank CBCM Centro de Biologa
Celular y Molecular for their financial support and
all the whole team working within the Area of
Mycorrhizae, especially to Ing. Hernn Lucero and
Ing. Paul Lojn for their invaluable assistance on
the project.

REFERENCES

ABBOTT L., ROBSON A., GAZEY C., (1994). Selection
of inoculant vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi. In:
NORRIS J., READ D., VARMA A., (eds). Techniques
for mycorrhizal research. Academic. San Diego.
ALINHOFF C., CACERES A., LUGO L., (2009),
Cambios en la biomasa de races y micorrizas
arbusculares en cultivos itinerantes del Amazonas
Venezolano. INCI, 34(8):571-576.
BCARD G. and FORTIN J., (1988). Early events of
vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA
transformed roots. New phytologist 108: 211-218
BRUNDRETT M., BOUGHER N., DELL B., GROVE T.,,
MALAJCZUK N., (1996). Working with mycorrhiza in
forestry and agriculture, first edition, Aciar Moniograph
publisher, Australia, 185 pp.
CASTILLO R., SOTOMAYOR L., ORTIZ O., BORIE F.,
RUBIO R., (2009). Effect of Arbuscular Mycorrhizal
Fungi on an Ecological Crop of Chili Peppers
(Capsicum annuum L.), Chilean J. Agric. Res, .69:79-
87
CRANENBROUCK S., VOETS L., BIVORT C.,
RENARD L., DECLERCK S., (2005). Methodologies for
in Vitro Cultivation Of Arbuscular Mycorrhizal Fungi
With Root Organs, In: DECLERCK S., STRULLU S.,
Fortin J., (Eds.), In Vitro Culture of Mycorrhizas,
Belgium, 396 pp.
DE SOUZA F., DECLERCK S., (2003). Mycelium
development and architecture, and spore production of
Scutellospora reticulata in monoxenic culture with Ri T-
DNA transformed carrot roots, Mycologia, 95(6):1004
1012.
DECLERCK S., CRANENBROUCK S., LE BOULENG
E., (2001). Modeling the sporulation dynamics of
arbuscular mycorrhizal fungi in monoxenic culture.
Mycorrhiza 11:225230
GEDERMANN J., NICOLSON H., (1963). Spore of
micorrhizal endogone species extracted from soil by wet
sieving and decanting. Transactions of the Brithish of
Mycological society. 46:235-244.
GONZLEZ C., MONROY A., GARCA E., OROZCO
M., (2005). Influencia de hongos micorrizgenos
arbusculares (hma) en el desarrollo de plntulas de
Opuntia streptacantha Lem. sometidas a sequa en
condiciones de invernadero , Revista Especializada en
Ciencias Qumico-Biolgicas, 8(1):5-10.
HARRISON J., (1997). The arbuscular mycorrhizal
simbiosis: AN underground association. Review
Elsevier Trends Journal, 2(2): 54-60
HASS J., KRIKUM J., (1985). Efficacy of
endomycorrhizal-fungus isolates and inoculums
quantities required for growth response. New Phytol.
100(4): 613-621
HERNNDEZ M. and CHIALLOUX M., (2001). La
nutricin mineral y la biofertilizacin en el cultivo del
tomate (Licopersicon esculentum Mill). Temas de
Ciencia y Tecnologa. 5 (13):11
HOLGUIN G., BASHAN Y., FERRERA-CERRATO R.,
(1996), Interactions between Plants and Beneficial
Microorganims. Ed. Terra, 14:2
International Culture Collection of Arbuscular &
Vesicular- Arbuscular Mycorrhizal Fungi (INVAM),
searched 2011, http: www.invam.caf.wvu.edu.
LOAIZA T., SNCHEZ E., (2006). La corteza de Loja,
Revista Ecuador Tierra Incgnita, ECU-10:1-4
MARTINEZ B., PUGNAIRE F., (2009). Interacciones
entre las comunidades de hongos formadores de
micorrizas arbusculares y de plantas. Algunos ejemplso
en los ecosistemas semiridos. Ecositemas 18(2): 44-
54.




MATNEZ V., Lpez M., DIBUT-LVAREZ B., PARRA
Z. y RODRGUEZ J., (2007). La fijacin biolgica de
nitrgeno atmosfrico en condiciones tropicales.
Ministerio del Poder Popular para la Agricultura. 172 p.
MORTON J., BENNY G., (1990). Revised classification
of Arbuscular mycorhizal fungi (Zygomycetes): a new
order, Glomales, two new suborders, Glominae and
Gigasporineae, ando two familes, Acaulosporaceae and
Gigasporaceae, with an emendation of Glomaceae,
Mycotaxon, 37:471-491.
PHILLPS J. and HAYMAN D., (1970). Improve
procedure for clearing roots and stainin parasitic and
vesicular arbuscular mycorrhizal fungi for rapid
asesment of infection. Trans. Br. Mycol. Soc. 55: 158-
161.
PLENCHETTE C., (2000). Receptiveness of some
tropical soils from banana fields in Martinique to the
arbuscular fungus Glomus intraradices. Appl. Soil Ecol.
15: 253-260.
READ D., (1999), Mycorhiza: the state of the art.,
Second Edition. Varma & Hock Publisher. Berlin, pp 3-
34.
RIVERA R., FERNNDEZ F., SNCHEZ C.,
BUSTAMANTE C., HERRERA R. y OCHOA M., (1997).
Efecto de la inoculacin con hongos Micorrizgenos VA
y bacterias rizosfricas sobre el crecimiento de
posturas de cafeto (Coffeea arabica L.) Cultivos
Tropicales 18 (3). 15-23
ROCHA L., RAMOS C., ROSALES C., (2009),
Multiplicacin de Hongos Micorrzicos arbusculares MA
nativos de cultivos de cacao (Theobroma cacao), en
Maiz (Zea mays), bajo distintos tratamientos
agronmicos, Tesis- Universidad Popular del Cesar,
Valledupar.
SCHMIDT S. and SCOW K., (1986). Mycorrhizal fungi
on the Galapagos Islands. Biotropica, 18, 236-240.
SILVA F., (1999). Manual de anlisis qumicos de
suelos, plantas y fertilizantes, Embrapa informtica
Agropecuaria, Brasilia, 370pp.
SMITH S., SMITH F., JAKOBSEN I., (2004). Functional
diversity in arbuscular mycorrhizal (AM) symbioses: the
contribution of the mycorrhizal P uptake pathway is not
correlated with mycorrhizal responses in growth or total
P uptake. New Phytol 162:511-524.
SMITH S., READ D., (1997). Mycorrhizal Symbiosis.,
2da edicin, Academic Press publisher , London. 605
pp.
SOLIS G., CARDENAS F., (2009) Efecto de los hongos
micorrisgenos arbusculares (glomus fasciculatum) en
el crecimiento y desarrollo del cultivo de tomate de
mesa (solanum lycopersicum) variedades alambra y
fortuna en la zona urcuqu provincia de imbabura. Tesis
Doctoral.
TROUVELOT A., KOUGH J. and GIANINAZZI-
PEARSON V., (1986). Mesure du taux de mycorhization
va dun systme radiculaire. Recherche de mthodes
destimation ayant une signification fonctionnelle. In:
Physiological and genetical aspects of mycorrhizae, V.
Gianinazzi-Pearson and s. Gianinazzi (eds.). Inra press
Paris, pp. 217-221.




??##


ABREVIATURAS



Nomenclatura
Hongo Micorrzico Arbuscular HMA
Micorriza Arbuscular MA
Hifas hif.
Vesculas ves.
Arbsculos arb.
Tratamiento: Inculo de Galpagos T1
Tratamiento: Inculo MUCL41883 T2
Tratamiento: Fertilizante T3
Tratamiento: Testigo T4








FIN, PROPSITO Y COMPONENTES DEL PROYECTO
Universidad Tcnica Particular de Loja
??###


FIN, PROPSITO Y COMPONENTES DEL PROYECTO

Fin del Proyecto (objetivos de desarrollo):

! Dilucidar el efecto de las comunidades de HMA asociados a C. pubescens
provenientes de la isla de Santa Cruz Galpagos sobre el crecimiento de plntulas
de C. pubescens y officinalis en etapa de vivero.
! Aportar informacin para desarrollar, utilizar y aplicar tcnicas y/o mtodos para el
aislamiento de HMA con el fin de incentivar su uso en el campo agrcola como
biofertilizantes de primera eleccin.

Propsito del Proyecto (objetivo inmediato)
! Aislar HMA (Hongos Micorrzico arbusculares) que se encuentren asociados a
Cinchona pubescens de Isla Santa Cruz, Galpagos.
! Determinar los porcentajes de colonizacin por HMA, probadas en plantas de
Cinchona pubescens y officinalis en Loja.
! Fortalecer los estudios ya realizados en la Universidad, dentro del CBCM en el campo
de las micorrizas.

Componentes del Proyecto (productos)
Con este estudio, y en base a nuestros objetivos propuestos esperamos obtener:
! Cultivos de HMA asociados a C. pubescens provenientes de la Isla Santa Cruz,
Galpagos.
! Multiplicacin de HMA en plantas hospederas micotrficas de Lolium perenne.
! Mejorar el crecimiento y supervivencia de las plantas micorrizadas de Cinchona, con
respecto a sus homlogas en cuanto a la masa seca total, el nmero de tallos, la tasa
fotosinttica, la eficiencia en el uso del agua y el rendimiento.


INTRODUCCIN Y ANTECEDENTES
Universidad Tcnica Particular de Loja


!

1. INTRODUCCIN Y ANTECEDENTES:
1.1 MICORRIZAS:

1.1.1 Definicin:
El trmino micorriza proviene del griego: myco, (hongo), y rhyza, (raz), este trmino fue
acuado por A.B. Frank en 1885, para describir las asociaciones simbiticas entre races
vegetales y hongos del suelo.
1
Casi todas las especies vegetales son susceptibles de formar
simbiosis con micorrizas porque estas se encuentran en la mayora de los hbitats naturales,
(ms del 90% de todas las especies vegetales conocidas presentan al menos un tipo de
micorriza).
2


Algunos de los beneficios que obtiene la planta con esta asociacin son en el aumento del
crecimiento areo y radicular gracias a la mayor absorcin de nutrientes del suelo,
especialmente de aquellos poco mviles como por ejemplo el fsforo, magnesio, calcio,
potasio, azufre, hierro, cobre, boro y manganeso;
3
adems debido al mayor volumen de suelo
explorado por las hifas, se incrementa la captacin de agua a la planta, mejorando la
tolerancia al estrs hdrico.
4


La diversidad funcional de los hongos micorrzicos provee la oportunidad de seleccionar un
hongo adaptado especficamente al hospedero, medio ambiente y condiciones de suelo que
optimiza el crecimiento de las plantaciones.
5


1.1.2 Clasificacin Morfolgica de Micorrizas:

Se pueden distinguir tres grupos fundamentales segn la estructura de la micorriza formada
6
:


1
FRANK A. B., (1885), On the root symbiosis depending nutrition through hypogeous fungi of certain trees. Proc. Amer. Conf. Myc, 6:18-25.
2
HERNNDEZ M., (2000), Las micorrizas arbusculares y las bacterias rizsfericas como complemento de la nutricin mineral de tomate
(lycospersicon esculentm mill), Tesis de Maestra, Inca.
3
HOLGUIN G., BASHAN Y., FERRERA-CERRATO R., (1996), Interactions between Plants and Beneficial Microorganims. Ed. Terra, 14:2
4
SMITH S., READ D., (1997). Mycorrhizal Symbiosis., 2da edicin, Academic Press publisher , London. 605 pp.
5
BRUNDRETT M., BOUGHER N., DELL B., GROVE T.,, MALAJCZUK N., (1996) Working with mycorrhiza in forestry and agriculture, first
edition, Aciar Moniograph publisher, Australia, 185 pp.
6
READ D., (1999), Mycorhiza: The state of the art, second edition, A. Varma & B. Hock publisher, Berlin, pp 3-34.


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)

Ectomicorrizas: Este grupo de micorrizas se caracteriza por tener un manto compacto de
hifas que cubre las races cortas con una red micelial, la cual crece entre las clulas corticales
por lo que se la conoce como Red de Harting.
7
(Fig. 1a).

Ectendomicorriza: Tienen caractersticas intermedias entre las Ectomicorrizas y las
Endomicorrizas,
6
pues presentan un manto muy reducido pero la red de Harting est bien
desarrollada, adems existe una ligera penetracin de las hifas al interior de las clulas de la
corteza radical, no existen vesculas ni arbsculos.
8
(Fig. 1b)

Endomicorrizas: Este grupo se caracteriza por no formar manto y las hifas penetran en las
clulas de la epidermis y del crtex de la raz.
9
Por lo que una especie puede infectar a un
gran nmero de especies vegetales, lo que las hace poco especficas. Son mucho menos
sensibles a las agresiones externas que las ectomicorrizas debido a que sus esporas
germinan con facilidad alejadas de races vivas y pueden crecer considerablemente sin
contacto con ninguna raz
10
. Este grupo se subdivide en:

Ericoides: estos hongos carecen de vesculas y arbsculos, sin embargo cuentan con
estructuras intracelulares las cuales semejan a espirales que son estructuras tpicas de
estos hongos.
8
(Fig. 1c)
Orquidoides: Son micorrizas de orqudeas, tras penetrar en la clulas de la raz forma
ovillos dentro de la clula hospedera, as como agregados poco organizados de hifas
(pelotones) que liberan los nutrientes cuando degeneran.
5
(Fig. 1d)
Arbusculares: Se caracterizan por la penetracin de las hifas del hongo en las clulas
de la epidermis y crtex de la raz y por la ausencia de manto sobre la superficie de la
misma
5
. (Fig. 1e)


7
FERRERA-CERRATO R., GONZLEZ-CHVEZ M., (1998). La simbiosis micorrzica en el manejo de vivero de los ctricos. Textos
Universitarios, Universidad Veracruzana, Mxico pp. 37-63.
8
YU T., EGGER K.,, PETERSON R., (2001), Ectendomycorrhizal associations characteristics and functions, Mycorrhiza 11: 167-177.
9
GONZLEZ C., MONROY A., GARCA E., OROZCO M., (2005) Influencia de hongos micorrizgenos arbusculares (hma) en el desarrollo
de plntulas de Opuntia streptacantha Lem. sometidas a sequa en condiciones de invernadero , Revista Especializada en Ciencias Qumico-
Biolgicas, 8(1):5-10,
10
ROCHA L., RAMOS C., ROSALES C., (2009), Multiplicacin de Hongos Micorrzicos arbusculares MA nativos de cultivos de cacao
(Theobroma cacao), en Maiz (Zea mays), bajo distintos tratamientos agronmicos, Tesis- Universidad Popular del Cesar, Valledupar.


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*


Fig. 1. Principales estructuras de los tipos de micorrizas (Figura tomada de Selosse y Le Tacon F. 1998)
11

1.2 MICORRIZAS ARBUSCULARES

1.2.1 Descripcin de los HMA

Los hongos micorrzicos arbusculares se asocian con las races de la mayora de las especies
vegetales y les proporcionan mltiples beneficios: mayor captacin de nutrientes, resistencia a
las condiciones de estrs provocadas por patgenos de hbitos radicales, salinidad, sequa,
acidez y elementos txicos.
3
Tambin son responsables de influenciar en la diversidad vegetal
y la productividad en ecosistemas naturales.
12
Estos hongos presentan un crecimiento intra e

11
SELOSSE M., LE TACON F., (1998), The land flora: a phototroph fugus partnership, Tree, 13 (1): 15-20
12
VAN DERHEIJDEN M., (1998), Different arbuscular mycorrhizal fungal species are potential determinants of plant community structure,
Ecology, 79(6): 2082-2091.


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+

intercelular en la corteza de la raz de la planta, una caracterstica especfica es la formacin
de estructuras intraradicales denominadas arbsculos que consisten en ramificaciones
dicotmicas repetidas de un hifa, hasta dar una estructura similar a un rbol muy ramificado
(Fig. 2). Los HMA son simbiontes obligados, de esta manera, esta simbiosis permite a las
plantas captar fotosintatos que favorecen su desarrollo y propagacin.


Fig. 2: Representacin de un hongo Micorrzico Arbuscular: (Figura tomada de Moore-Landecker B. 1996)
13


1.2.2 Arquitectura de la micorriza Arbuscular

1.2.2.1 Hifas
Las hifas son estructuras filamentosas que en conjunto forman un micelio.
Existen tres tipos de hifas: las intercelulares, intracelulares y las extraradicales.
1.2.2.1.1 Hifas intercelulares:
Son aquellas que crecen dentro de la pared de las clulas de la raz (Fig. 3a).
1.2.2.1.2 Hifas intracelular:
Son aquellas que crecen entre la pared de las clulas de la raz (Fig. 3b.)
1.2.2.1.3 Hifas extraradicular: (Fig. 3c.)

13
MOORE-LANDECKER B., (1996), Fundamentals at the Fungi, First Edition, Prentice Hall publisher, U.S.A. 574 pp


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,

Este tipo de hifas se clasifican en tres subtipos segn su morfologa y las funciones que
llevan a cabo: hifas infectivas, son las que inician los puntos de colonizacin en una o
varias races; hifas absorbentes son las que se encargan de explorar el suelo para la
extraccin de nutrientes y las hifas frtiles son las que llevan las esporas.
14


1.2.2.2. Apresorios
Son apndices, que se forman cuando una hifa hace contacto con la superficie de una clula
epidrmica de la raz
15
, esta estructura facilita la penetracin del hongo.
16
(Fig. 3d.)

1.2.2.3. Vesculas
Son rganos de paredes delgadas que almacenan lpidos y glicolpidos se forman a partir del
hinchamiento de una hifa terminal.
3
Las vesculas pueden ser inter o intracelulares y pueden
ser encontradas tanto en el interior como en las capas externas del parnquima cortical. Estas
no estn presentes en todos los gneros de HMA.
17
(Fig. 3e.)

1.2.2.4 Arbsculos
Son minsculas ramificaciones dicotmicas, sirven como sitio de intercambio nutrimental
entre el hongo y el hospedero. Son de corta duracin 9 a 15 das, al cabo de lo cual colapsan
o son digeridos por la clula hospedera, despus de un gran perodo de actividad
metablica.
18
(Fig. 3f.)

1.2.2.5. Clulas auxiliares
Son estructuras abultadas de paredes delgadas, que se agrupan en las hifas extraradicales.
Puede presentar una superficie espinosa o lisa y son caractersticos de Scutellospora y
Gigaspora, son abundantes durante la colonizacin temprana, pero disminuyen durante la
esporulacin. Al parecer no funcionan como propgulos.
19



14
GUZMN S., FARAS J., (2005), Biologa y regulacin molecular de la micorriza Arbuscular, Avances en Investigacin Agropecuaria, 9:17-
31.
15
LEON D., (2006), Evaluacin y Caracterizacin de Micorrizas Arbusculares asociadas a Yuca (Manihot esculenta sp) en dos regiones de la
amazonia colombiana. Trabajo de tesis para el titulo de microbilogo, Pontificia Universidad Javeriana, Bogot.
16
GARCIA J., OCAMPO J., (2002), Regulation of the plant defence response in arbuscular mycorrhizal simbiosis, J.Exp. Bot., 53:1377-1386
17
MOSSE B., (1981). Vesicular micorrizas arbusculares, Investigacin de Agricultura Tropical, Universidad de Hawai, Hawai.
18
REQUENA N., (1996), Exploracin de la biodiversidad microbiana (hongos de las micorrizas arbuscula-Rhizobium-Rizobacterias) en un
ecosistema mediterrneo desertificado dirigida a una estrategia de revegetacin, Tesis doctoral de la Universidad de Granada.
19
BLASZKOWSKI J., (2003), Arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota) species deposited in the Department of Plant Pathology,
University of Agriculture in Szczecin, Poland


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-



















Fig. 3.: Estructura de los Hongos Micorrzicos Arbusculares (Figura tomada de .@16'A %/ )((,+

1.2.3 Clasificacin de los HMA

Tradicionalmente la espora ha sido la estructura ms usada para la identificacin de HMA en
los primeros estudios de taxonoma. Actualmente se han venido usando estudios moleculares
para el esclarecimiento de las relaciones filogenticas entre hongos, que revela un gran
nmero de nuevas especies.
4


En la siguiente tabla se detalla la clasificacin ms actualizada:
Phylum: Glomeromycota
Class: Glomeromyces
Orden Familia Genero
Glomerales Glomeraceae Glomus
Funneliformis
Rhizophagus


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=

Sclerocystis
Claroideoglomeraceae Claroideoglomus
Diversisporales Gigasporaceae Gigaspora
Scutellospora
Racocetra
Acaulosporaceae Acaulospora
Entrophosporaceae Entrophospora
Pacisporaceae Pacispora
Diversisporaceae Diversispora
Otospora
Paraglomerales Paraglomeraceae Paraglomus
Archaeosporales Geosiphoaceae Geosiphon
Ambisporaceae Ambispora
Archaeosporaceae Archaeospora
Tabla 1: Clasificacin de los hongos micorrizicos arbusculares
(en base a la clasificacin de Schler and Walker 2010)

1.3 SIMBIOSIS HMA-PLANTA HOSPEDERA

1.3.1 Multiplicacin de inculo Micorrzico:
El carcter de simbionte obligado de los HMA conlleva al uso de plantas hospederas para que
pueda completar su ciclo de vida.
20


Los ecosistemas naturales ofrecen comunidades de hongos micorrzicos nativos que
frecuentemente son usados como fuente de inculo. Estos propgulos fngicos estn
constituidos por trozos de races colonizadas, esporas y segmentos de hifas que por lo
general se encuentran concentrados en los primeros centmetros del suelo.
21



20
USUGA C., CASTAEDA D., FRANCO A., (2008) Multiplicacin de hongos micorriza arbuscular (H.M.A) y efecto de la micorrizacin en
plantas micropropagadas de banano, Revista Facultad Nacional de Agronoma 61:4279-4290.
21
BELLGARD S., (1993). The topsoil as the major store of propagules of vesicular-arbuscular fungi in southeast Australian sandstone soil,
Mycorrhiza 3:19-24.


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;

Las muestras de suelo generalmente son tomadas de porciones cercanas a la raz, stas,
pueden contener diferentes tipos de propgulos, pero son las esporas que por sus
caractersticas morfolgicas permiten la identificacin de las especies.
5
Sin embargo las
esporas provenientes de estas porciones de suelo pueden no estar en buenas condiciones
para su identificacin, por lo que el inculo tiene que multiplicarse en plantas hospederas
micotrficas cultivadas en sustratos o suelo estril. Este sistema conocido como cultivo
trampa permite multiplicar las especies nativas colectadas del campo.
22


No todas las asociaciones entre HMA-planta son compatibles, pudiendo en algunos casos
beneficiar en mayor grado a un hospedero y adaptarse a determinadas condiciones
edafoclimticas evidenciando marcadas diferencias no slo estructurales sino tambin
funcionales entre especies.
23


1.3.2 Plantas hospederas:
Se ha demostrado que la asociacin de HMA y plantas no es especfica, puesto que
cualquiera de los HMA puede colonizar a cualquiera de las plantas susceptibles de formar
simbiosis.
5
Algunos hongos muestran un mejor grado de efectividad que beneficia el
establecimiento de la micorriza bajo determinadas condiciones.
24


Las principales condiciones que se deben tomar en cuenta para la eleccin de una panta
hospedera ptima son: ser mictrofa obligada y no selectiva a las diferentes especies de
hongos micorrzicos arbusculares; adaptarse a un rango amplio de condiciones de suelo y
clima; rstica para que su mantenimiento no requiera mucho espacio ni cuidados en el
invernadero o en condiciones de vivero; con semillas con un alto porcentaje de germinacin;
no debe tener enfermedades radicales en comn con los cultivos en los cuales se utilizara el
inoculo.
23



22
SIEVERDING E., (1991) Vesicular-arbuscular mycorrhiza management in tropical agrosystems, Academic Press, Great Britain 605pp.
23
LINDERMAN R., DAVIS E., (2004), Varied response of marigold (Tagetes spp.) genotypes to inoculation with different arbuscular
mycorrhizal fungi. Sci. Hort. 99:67-78
24
POZO M., (1999), Induccin de enzimas hidrolticas en races de tomate (Lycopersicon esculentum) como respuesta a la formacin de MA y
su implicacin en el control biolgico de Phythophtora parastica. Tesis de doctorado, Universidad de Granada, Espaa.


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>

El sistema radicular posee una de las condiciones ms importantes, ya que se ha visto que
en plantas con races finas existe una mejor esporulacin de HMA y aquellas plantas con
rpido desarrollo del sistema de fibras radiculares son consideradas como un cultivo trampa
ideal para la produccin de esporas de HMA.
25


1.3.3 Sustrato
Los sustratos que se emplean en el cultivo de especies de HMA de mayor uso es la arena,
este debe poseer un buen nivel de porosidad y una baja densidad en la distribucin de sus
partculas; adems debe tener caractersticas qumicas similares a las del suelo de donde el
hongo proviene.
26


1.4 CICLO SIMBITICO DE HMA:
Los hongos micorrzicos arbusculares (HMA) son simbiontes biotrficos obligados; estos
cuentan con un ciclo de vida dividido en dos etapas, la primera etapa, son los estados de
reposo y reproductivo que son independientes de la planta y en el que es frecuente observar
esporas, esporocarpos y algunas vesculas. Y la segunda etapa, los estados vegetativos,
representadas por las hifas, arbsculos y vesculas dentro de las raz, implicadas en las
interacciones donde ocurre el reconocimiento, la colonizacin y el intercambio de nutrientes
entre hongo-planta.
15


El proceso de infeccin de la planta, est relacionada con la actividad de los propgulos
infectivos presentes en el suelo y que circunda la raz, los cuales pueden ser esporas o
micelios fngicos que provienen de raicillas de plantas vivas o segmentos de races
infectadas.
27

La manera como el hongo Micorrzico Arbuscular penetra a las clulas de la planta hospedera
sin causarle ningn dao, se da por la invaginacin de las paredes del plasmalema a travs de

25
CHAURASIA B., KHARE K., (2005), Hordeum vulgare: A suitable host for mass production of Arbuscular mycorrhizal fungi from natural soil.
Applied Ecology and Environmental Research 4:45-53
26
INVAM (International Culture Collection of Arbuscular & Vesicular- Arbuscular Mycorrhizal Fungi), 2011, http://
invam.caf.wvu.edu/methods/cultures/GINCO.pdf)
27
ROCHA L., RAMOS C., ROSALES C., (2009), Multiplicacin de Hongos Micorrzicos arbusculares MA nativos de cultivos de cacao
(Theobroma cacao), en Maiz (Zea mays), bajo distintos tratamientos agronmicos, Tesis- Universidad Popular del Cesar, Valledupar.


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!(

una serie de procesos mecnicos y enzimticos controlados, esta es la primera indicacin de
una alta compatibilidad entre el hongo y la planta.
28


Los estados morfolgicos del desarrollo son variables y dependen tambin, de la especie de la
planta implicada, pero habitualmente, las esporas del suelo van a germinar y la hifa fngica va
a crecer desde la espora hasta la superficie de las clulas epidrmicas de la raz,
29
este
contacto, va a formar un abultamiento denominado apresorio, que originar seguidamente la
hifa colonizadora que penetrar en dicha clula o atravesar el espacio intercelular
16
. La
unidad de colonizacin avanza mediante el crecimiento de las hifas que se extienden entre las
clulas corticales y que generan estructuras caractersticas como los arbsculos y las
vesculas.
28
Semanas despus, y sobre la red tridimensional de las hifas se forman las
esporas que al madurar completan el ciclo del hongo.
16
(Fig. 4)


Fig. 4: Diagrama del ciclo de vida de los HMA durante el establecimiento de la simbiosis funcional
(Tomada de Giovannetti, 2000)
30



1.5 Generalidades de la Cinchona


28
SIQUEIRA J., CAMEIRO M., CURI N., ROSADO S., DAVIDE, (1988), Mycorrhizal colonization and mycotrophic growth of native woody
species as related to successional groups in Southeastem Brazil. Forest Ecology and Management, 107:241-252
29
GUZMN S., LARIOS F., (2005), Biologa y regulacin molecular de la micorriza arbuscular. Avances en Investigacin Agropecuaria 9:17-
31.
30
GIOVANNETTI M., (2000), Spore Germination and Pre-Symbiotic Micelial Growth. In: Kapulnik, Y., Douds D., Arbuscular mycorrhizas:
Physiology and Function, Chapter 3. pp: 47 - 68.


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!!

1.5.1 Etimologa
Gnero dedicado a Ana Osorio, esposa de Luis J. Fernndez de Cabrera y Bobadilla, conde
de Chinchn, que logro curarse gracias a la corteza de quina o cascarilla de la fiebre paldica
que padeca en 1632.
31
De la corteza se obtiene la quinina el ms antiguo remedio de la
malaria.
1.5.2 Generalidades y usos
La Cinchona tambin conocida como cascarilla o rbol de quina, pertenece a la familia
Rubiaceae. Generalmente son rboles de tamao mediano a pequeo o tambin arbustos con
corteza amarga
32
. (Fig. 5). Se encuentra ampliamente distribuida desde Costa Rica hasta
Bolivia con ms de 40 especies. Son de color verde con pequeas flores, productoras de
semillas y pueden alcanzar una altura que puede llegar los 25 metros o un poco mas.
32

Las plantas de Cinchona producen un metabolito conocido como quinina, que ha
demostrado propiedades antimalricas para combatir fiebres especialmente en el paludismo,
adems se le atribuye su uso para, estimular el apetito, tonificar el organismo, para casos de
estrs psquico y fsico y en convalecencias, arritmias cardiacas, estimular el crecimiento del
cabello y evitar su cada
32
; por lo tanto es de gran importancia dentro de la industria
farmacutica.
33











31
LOAIZA T., SNCHEZ E., (2006), La corteza de Loja, Revista Ecuador Tierra Incgnita, ECU-10:1-4
32
GARMENDIA A., (2005). El rbol de la quina (cinchona spp), Distribucin, caracterizacin de su hbitat y arquitectura, U.T.P.L.
33
MAHECHA G., OVALLE A., CAMELO D., ROZO A., BARRERO D. (2004), Vegetacin del territorio: 450 especies de sus llanuras y
montaas, Colombia 871pp


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!)

1.5.3 Cinchona officinalis L.

Fig. 5: rbol de Cinchona officinalis Foto: Banco de germoplasma UTPL

1.5.3.1 Descripcin taxonmica
Grupo: Euasterids I
Orden: Gentianales
Familia: Rubiaceae
Gnero: Cinchona
Nombre cientfico: Cinchona officinalis
Nombre comn: Cinchona, cascarilla, quina

1.5.3.2 Ubicacin geogrfica en el Ecuador
Es conocido como un rbol o arbusto nativo de los Andes que se encuentra entre los 1000 a
3500 m.s.n.m. En el Ecuador se encuentra ampliamente distribuido en las provincias de
Bolvar, Chimborazo, Caar, Azuay, Morona, Zamora y Loja
34
. Segn estudios realizados por
Garmendia (2005), la especie Cinchona officinalis es una especie endmica de la regin sur
del Ecuador especficamente del valle de Loja.

34
JORGENSEN P., LEN M., (1999). Catalogue of the vascular plants of Ecuador. Syst. Bot. Missouri Bot. Gard. 75:11182.


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!*

1.5.3.3 Descripcin
Cinchona officinalis es un rbol de 11 a 15 m de alto, de 30 a 40 centmetros de dimetro de
tallo; ramificacin simpodial; con copa globosa irregular, bastante densa.
La corteza externa es de color marrn oscuro, ligeramente fisurada y desprende pequeas
placas en forma irregular. La forma de la hoja vara de casi orbicular o lanceolada a elptico-
ovalada, de 8 a 27 cm de largo y 7 a 18 cm de ancho.

Las flores se encuentran en panculas terminales de 20 a 25 cm de longitud, son
hermafroditas, actinomorfas; la corola es blanca-roja. Los frutos son cpsulas de color marrn
oscuro, de forma elipsoide.
El desarrollo particularmente en los primeros aos es rpido, los rboles de 6 a 8 aos de
edad pueden alcanzar 12 m de altura. Las ramas principales parten del tronco a una altura de
ms o menos 6 m, puesto que las ramas bajas son desechadas continuamente
33
.

1.5.4 Cinchona pubescens


Fig. 6: rbol de Cinchona pubescens
foto web:http://www.botany.hawaii.edu/faculty/carr/images/cin_pub_hab.jpg




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!+

1.5.4.1 Descripcin taxonmica
Grupo: Euasterids I
Orden: Gentianales
Familia: Rubiaceae
Gnero: Cinchona
Nombre cientfico: Cinchona pubescens
Nombre comn: rbol de quinina, rbol rojo.

1.5.4.2 Ubicacin geogrfica en el Ecuador
Es nativa de las montaas de los Andes del Ecuador. En este pas, el rbol puede
encontrarse habitando las altitudes de 3000-3900 m.s.n.m., aunque tambin se la encuentra
en las Islas Galpagos como una especie introducida.
35
(Fig. 6) Se menciona que tambin
existe crecimiento en pases como Bolivia, Colombia, Costa Rica, Panam, Per y
Venezuela
36
.

1.5.4.3 Descripcin
rbol que alcanza los 20 m de altura, y 40 cm de dimetro en su tronco. Hojas de 15 cm de
largo por 12 cm de ancho de color rojo cuando maduran, enteras, simples, opuestas,
nerviacin de color rojo, y con pelitos en el envs. Frutos de 2 cm de largo por 3 mm de
ancho, en flor de globo, corola rosada, numerosas semillas
33
.

1.6 CULTIVO IN VITRO DE HONGOS MICORRZICOS ARBUSCULARES

1.6.1 Cultivo monoxnico:
El cultivo monoxnico, es una tcnica que ha logrado producir cultivo in vitro de races, a las
cuales se les ha inoculado esporas de hongos MA previamente desinfectadas, de tal forma
que se la asociacin micorrzica in vitro sin la necesidad de contar con una planta hospedera
completa.
37



35
STARR F., STARR K., LOOPE Ll., (2003), Cinchona pubescens-Quinine tree Rubiaceae. Geological Survey Biological, USA.
36
ANDERSSON L.,(1998), A revision of the genus Cinchona (Rubiaceae-Cinchoneae), Bot. Gard. 80:175
37
BAGO B., SHACHAR H., PFEFFER P., (2000), El micelio externo de la micorriza Arbuscular como puente simbitico entre la raz y su
entorno, En: Alarcon A., Ferrera R., Ecologa, Fisiologa y Biotecnologa de la micorriza Arbuscular, Mundi Prensa, Mxico pp 78-92.


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!,

Esta tcnica ofrece propgulos puros, estriles, libre de contaminantes, que hasta ahora no ha
sido posible lograrlo utilizando los modos convencionales de cultivo en macetas Otra ventaja
que ofrece es el aumento en la produccin de esporas/propgulos el cual se logra en menos
tiempo y espacio.
38


La produccin en masa de hongos MA se ha logrado con varias especies, pero
G. intraradices sigue siendo el ms indicado por el aumento de la produccin de esporas
obtenidos en cultivos de primeras investigaciones hasta la actualidad
39
. Sin embargo,
recientes estudios han demostrado el cultivo de Scutellospora reticulata y Acaulospora rehmii,
mediante esta tcnica
40


1.6.2 Races Hospederas transformadas:
Agrobacterium rhizogenes es una bacteria gram negativa del suelo que induce un fenotipo
particular denominado "raz pilosa" en plantas dicotiledneas. En las races transformadas
con esta bacteria, un segmento de ADN de la bacteria, llamada la regin T (ADN transferido)
del plsmido Ri (induccin de la raz) se incorpora a las clulas de la planta hospedera
41
. La
integracin y la expresin de este ADN en el genoma de la planta provocar el desarrollo del
fenotipo raz peluda y la sntesis de un compuesto de bajo peso molecular llamada opina.
42


1.7 ROL ECOLGICO E IMPORTANCIA DE LOS HMA EN LA RESTAURACIN DE
ECOSISTEMAS DEGRADADOS.

Los ecosistemas naturales presentan una serie de caractersticas estructurales y funcionales
que permiten su preservacin, pero dentro de esto es necesario destacar las relaciones
interespecficas, refirindonos a la interaccin que presentan los HMA con la plantas. Las

38
FORTIN J., BCARD G., DECLERCK S., DALP Y., COUGHLAN A., PICH Y., (2002), Arbuscular mycorrhiza on root-organ cultures.
Can J Bot 80:120
39
DIOP T., PLENCHETTE C., STRULLU D., (1994) Dual axenic culture of sheared-root inocula of Vesicular arbuscula rmycorrhizal fungi
associated with tomato roots, Mycorrhiza 5:1722
40
DALP Y., DECLERCK S., (2002), Development of Acaulospora rehmii spore and hyphal swellings under root-organ culture, Mycologia,
94:850855.
41
CHILTON M., TEPFER D., PETIT A., DAVID C., TEMP J., (1982) Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of host plant
root cells. Nature, 295:432434
42
TEPFER D., (1989), Ri T-DNA from Agrobacterium rhizogenes: a source of genes having applications in rhizosphere biology and plant
development, ecology and evolution. In: Kousugg T., Nester E., (eds), Plant microbe interactions: Molecular and genetic perspectives. Mc
Graw-Hill, New York, pp 294342


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!-

micorrizas arbusculares cumplen un rol importante dentro de procesos ecolgicos, es por ello
que actualmente la utilizacin y/o aplicacin correcta de estos microorganismos permite reducir
el uso de energa, la degradacin del agroecosistema y las prdidas de nutrientes de los suelos
agrcolas
2
, lo que da lugar a su uso dentro de la agricultura con la finalidad de reducir el uso de
fertilizantes y preservar el medio ambiente.

As tambin sabemos que generan una amplia gama de beneficios cuando se trata de
recuperar suelos que se encuentran degradados o infrtiles.
43

La simbiosis micorrzica es clave para la diversidad y productividad de los ecosistemas
vegetales naturales en el marco de una agricultura sostenible. Los beneficios que las plantas
obtienen al formar estructuras micorrzicas hace que se presenten ventajas tales como mayor
absorcin de agua y de nutrientes como el N, P, K, Na, debido al aumento del rea del suelo
que est en contacto con la estructura micorrzica; mayor tolerancia a la salinidad y a las
condiciones adversas, disminucin de la toxicidad de ciertos metales como el Al, Cu o Zn,
debido al incremento de la actividad biolgica de la rizsfera, acelerando los procesos de
mineralizacin y reciclaje de nutrientes
44
; inhibe las poblaciones de organismos fitopatgenos
de habito radical ya que el manto de hifas se comporta como una barrera fsica que cubre el
meristemo radicular y crtex; y de igual manera incrementa la microbiota benfica
45
.
Consecuentemente, la utilizacin de estos micosimbiontes podran ser tomados en cuenta para
el diseo de cualquier sistema de produccin agrcola, y por ser componentes inseparables de
los agroecosistemas y ejecutar una serie de funciones en la asociacin con las plantas son
considerados como sustitutos biolgicos de los fertilizantes minerales
46
.

1.8. Efectividad e infectividad de los HMA:

El grado de efectividad de los HMA, puede verse afectado por muchos factores que influyen en
el establecimiento y funcin de los mismos. Algunos estudios mencionan que las esporas de

43
AZCN G., BAREA J., (1980), Micorrizas, Investigacin y Ciencias (Espaa), 47:8- 16
44
FERRERA-CERRATO R., y PREZ J., (1995), Agromicrobiologa, elemento til en la agricultura sustentable. Colegio de Postgraduados en
Ciencias Agrcolas, Montecillo-Mxico, pp: 36-50.
45
JOHANSSON F., FINLAY R., (2004), Microbial interactions in the mycorrhizosphere and their significance for sustainable agriculture.
FEMS Microbiology Ecology, 48: 1-13.
46
CASTILLO R., SOTOMAYOR L., ORTIZ O., BORIE F., RUBIO R., (2009), Effect of Arbuscular Mycorrhizal Fungi on an Ecological Crop of
Chili Peppers (Capsicum annuum L.), Chilean J. Agric. Res, .69:79-87


INTRODUCCIN Y ANTECEDENTES
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!=

HMA inhiben su germinacin bajo presin hdrica
22
, as mismo la profundidad del suelo
determina la supervivencia de estos endfitos, ya que a menor profundidad existe una mayor
abundancia, y a mayor profundidad el grado de colonizacin de las races es menor
47
.
Particularmente al momento de seleccionar un potencial y apropiado inculo se deben
considerar el pH, el contenido de materia orgnica, as como el de fsforo del suelo ya que son
parmetros que determinan en gran parte el desarrollo, las relaciones de los HMA y por ende
su efectividad en las plantas hospederas
48
.

Existen datos de que comunidades de HMA disminuyen en suelos perturbados por la labranza
y el manejo tecnificado.
49
Para la restauracin de un ecosistema degradado, los HMA utilizados
deben ser apropiados para las condiciones edafoclimticas, y para la produccin de hongos
nativos locales se requiere material de la zona.
50
Sin embargo, en ocasiones la micorrizacin
nativa puede presentarse en bajo nmero, o puede no ser tan efectiva para aumentar el
crecimiento
51
. Por lo que es necesaria la inoculacin incorporando HMA (nativos o no) con el fin
de aumentar el crecimiento de las plantas. En el caso de que la inoculacin se realice con HMA
no nativos, debe considerarse que los suelos difieren en su receptividad a los microorganismos
a ser introducidos.
52
En este contexto la receptividad es un factor clave en la efectividad de los
HMA no nativo que se lo define como la capacidad de un suelo para favorecer el desarrollo de
la simbiosis luego de la inoculacin.
53


Es importante conocer las diferencias estructurales y funcionales existentes entre las especies,
con vista a seleccionar el hongo adecuado para cada interaccin, lo cual permitira tener
resultados satisfactorios.
54
.

47
TAPIA J., (2003), Identificacin de hongos micorrzicos Arbusculares aislados de suelos salinos y su eficiencia e plantas de lechuga. Tesis
Doctoral, Universidad de Colima. Mxico
48
WILLIAMS S., VESTBERG M., UOSUKAINEN M., DOD J., (1992). Effects of fertilizer and arbuscular mycorrhizal fungi on the post-vitro
growth of micropropagated strawberry. Agron, 12: 851-857.
49
JANSA J., MOZAFART A., ANKEN T., (2002), Diversity and strucuture of AMF comunities as affected by tillage in a temperate soil.
Mycorrhiza 12: 225-234.
50
RILLIG M., (2004). Arbuscular Mycorrhizae and Terrestrial Ecosystem Processes. Ecology Letters 7:740-754.
51
HAMEL C., (1996), Prospects and problems pertaining to the manage-ment of arbuscular mycorrhizae in agriculture. Agric. Ecos. Env.
60:197-210.
52
COVACEVICH F., ECHEVERRIA H., (2008), Receptivity of an Argentinean pampas soil to arbuscular mycorrhizal Glomus and Acaulospora strains. World J.
Agric. Sc. 4:688-698.
53
PLENCHETTE C., (2000). Receptiveness of some tropical soils from banana fields in Martinique to the arbuscular fungus Glomus intraradices. Appl. Soil Ecol.
15: 253-260.
54
RODRIGUES Y., DEL ANOVAL B., FERNANDEZ F., RODRIGUEZ P., (2004). Estudio comparativo del comportamiento de seis cepas de hongos micorrzicos
arbusculares en la interaccin en el tomate (Licopersicon esculentum). Ecologa aplicada 3:162-171.


METODOLOGA
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!;

2. METODOLOGA

2.1 SITIO DE ESTUDIO Y MUESTREO

Las muestras fngicas utilizadas en este estudio provinieron de dos sitios: en Galpagos, se
recolectaron muestras de suelo de rizsfera de Cinchona pubescens de la Isla Santa Cruz (S
0.66226 W 90.32485); y la otra fuente de inculo fue la cepa MUCL41833 proveniente de la
Micoteca de la Universidad Catlica de Lovaina, se trata de una cepa de Rhizophagus
irregulare proveniente de las Islas Canarias, la cual tiene un buen comportamiento in vitro.
El ensayo se realiz en los laboratorios de la UTPL y en el invernadero del Proyecto
VALORAM cuyas condiciones de trabajo fueron: Temperatura 17 y 22C, Humedad relativa
entre 50 y 60%.

2.2 MULTIPLICACIN IN VIVO DEL INCULO DE HMA AISLADOS DESDE Cinchona
pubescens en planta trampa de Lolium perenne.

Sustrato utilizado:
El Sustrato utilizado fue una mezcla de arena y tierra negra en proporcin 3:1, esta mezcla se
autoclav por tres ocasiones durante 20 minutos a 120C, dejando descansar el sustrato por un
periodo de 24 horas entre autoclavado. Por ltimo se dej reposar por tres das a la sombra
hasta que el contenido de humedad se evapore completamente.

Planta trampa:
La hospedera utilizada fue Lolium perenne (Ray grass) (ANEXO 1) planta que ha demostrado
ser apropiada para la multiplicacin de HMA.
55
Adicionalmente, esta planta es de rpido
crecimiento y desarrolla una abundante raz.

Multiplicacin del inculo en las plantas trampa:
Se recolectaron muestras de suelo cerca de la rizsfera y races de 10 individuos adultos de C.
pubescens de Galpagos y se procedi a inocular por duplicado en plantas trampa de Lolium

55
MOLINA M., MEDINA M., RESTREPO L., (2006), Evaluacin de sustratos y cultivos trampa bajo condiciones controladas para la obtencin
de hongos micorrzogenos de Aliso (Alnus acuminata H.B.K.). Livestock Research for Rural Development. 18(2):26


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!>

perenne, con el fin de concentrar las poblaciones de HMA asociadas a C. pubescens. Las
plantas fueron mantenidas en bolsas Sun Bags con el propsito de mantener una humedad
constante y evitar la contaminacin cruzada.

Las plantas se mantuvieron por un periodo de 4 meses, luego de lo cual el sustrato fue
cosechado.

2.3. DETERMINACIN DEL PORCENTAJE DE COLONIZACIN DE RACES
MICORRIZADAS DE LAS PLANTAS TRAMPA.

A los cuatro meses se cortaron las plantas de las macetas y se extrajeron varias races al azar.
Se realiz la tincin de las races usando el mtodo de Phillips y Hayman, (1970)
56
(ANEXO 2),
y posteriormente se realiz una observacin al microscopio a 100X y 400X de magnificacin.
Los resultados obtenidos luego de observar al microscopio, permitieron elegir las plantas con
una mayor presencia de hifas y vesculas intraradicales, las cuales sirvieron para el posterior
establecimiento del ensayo.

2.4. CONDICIONES DEL ENSAYO:
Antes de iniciar nuestro ensayo, realizamos un ensayo prueba para comprobar si exista
afinidad simbitica entre los HMA del inculo de MUCL41883 y plantas de Cinchona officinalis.
Diez plantas de Cinchona officinalis fueron probadas por dos meses, luego de esto se evalu
su micorrizacin mediante el mtodo de Phillips y Hayman, (1970)
56
, y una vez comprobado el
xito de este ensayo, iniciamos nuestro experimento principal.
Se hicieron germinar semillas de C. pubescens y C.officinalis en condiciones in vitro por dos
meses, pasado este tiempo las plantas fueron trasplantadas a macetas en condiciones de
invernadero y mantenidas en Sun bags. Transcurrido tres meses las plantas mostraron un
tamao de alrededor de 0.5 a 1.5 cm, pudiendo dar ya inicio a nuestro ensayo.

56
PHILLPS J. and HAYMAN D., (1970) Improve procedure for clearing roots and stainin parasitic and vesicular arbuscular mycorrhizal fungi
for rapid asesment of infection. Trans. Br. Mycol. Soc. 55: 158-161.



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)(

Un total de 144 plantas de Cinchona pubescens y 144 de Cinchona officinalis, fueron repartidas
en tres bloques, cuatro repeticiones por bloque, tres muestras por repeticin y una replica de
los cuatro tratamientos (ANEXO 3). Los cuatro tratamientos se resumen en el siguiente cuadro:
Tabla 2: Tratamientos utilizados para el establecimiento del ensayo
Las plantas tuvieron un periodo de 3 meses de crecimiento, antes de proceder a su evaluacin
(Fig. 7).


Fig. 7 Plantas en el invernadero: a) Disposicin de las plantas en el invernadero b). Planta de Cinchona
officinalis c). Planta de Cinchona pubescens d). Repeticin de una muestra de Cinchona pubescens.


Tratamiento
T1 Inculo
MUCL41883
Con cepa de Rhizophagus irregulare como control positivo.
T2 Inculo
Galpagos
Sustrato y races lavadas y cortadas de las plantas trampa que mostraron una
colonizacin exitosa y que se lo obtuvo mediante la tcnica de tamizado.
T3 Fertilizante Abono Enrikecidas. Composicn: N=12%, P=12%, K=17% y micronutrientes.
T4 Testigo Planta solo con sustrato.


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)!

2.5 PARMETROS EVALUADOS:

Al final del ensayo evaluamos mortalidad y variables morfolgicas tales como altura, tamao de
raz, fueron tomadas con la ayuda de una regla milimetrada; dimetro del tallo con un
Calibrador Vernier; las hojas fueron contadas; el peso fresco se lo obtuvo con la ayuda de una
balanza analtica, para el peso seco se colocaron las muestras dentro de bolsas de papel y se
las mantuvo a 60C en la estufa por 72 horas, por ltimo fueron pesadas y niveles de
colonizacin que se detalla a continuacin:

2.5.1. Determinacin del porcentaje de colonizacin de las plantas Cinchona officinalis y
Cinchona pubescens:

Las races de las plantas obtenidas se limpiaron con agua de grifo eliminando as todas las
impurezas, se seleccionaron las races ms jvenes y finas, se cortaron en piezas de 1.5 cm
de longitud y se los coloc en tubos Eppendorf de 1.5 cm. Posteriormente se realizo la tincin
usando el mtodo de Phillips y Hayman (1970)
56
y con la ayuda de un microscopio ZEISS
estndar Axioplan, a 100X y 400X de magnificacin se observ las diferentes estructuras como
vesculas, arbsculos e hifas. (ANEXO 4).

Los niveles de colonizacin de las plantas se determinaron de acuerdo a la estimacin de la
micorrizacin segn Trouvelot et al (1986)
57
, en la que se le asigna una clase, tomando en
cuenta las diferentes estructuras micorrzicas de cada fragmento de raz y la abundancia de
arbsculos (Anexo 5).
Las clases obtenidas fueron colocadas en el programa informtico Mycocalc para calcular los
parmetros (%F): Frecuencia de las micorrizas en las races y (%A): Abundancia arbuscular en
el sistema radicular.



57
TROUVELOT A., KOUGH j., GIANINAZZI V., (1986). Mesure du taux de mycorhization va dun systme radiculaire. Recherche de mthodes
destimation ayant une signification fonctionnelle. In :GIANINAZZI V and GIANINAZZI S. (eds.)., Physiological and genetical aspects of
mycorrhizae, Inra press, Paris, pp. 217-221.


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))

2.6. AISLAMIENTO IN VITRO DE HMA

2.6.1. MTODO 1: Obtencin de cultivos monospricos de Hongos Micorrzicos
Arbusculares in vitro.

2.6.1.1. Obtencin de los propgulos

Las esporas se obtuvieron aplicando el mtodo de tamizado y decantado de Gerdermann y
Nicolson, (1963)
58
. (Anexo 6).

2.6.1.2 Seleccin de los propgulos de HMA

Debido a que en nuestro ensayo no obtuvimos esporas para el desarrollo de este mtodo, las
esporas seleccionadas provinieron de cultivos in vivo de Scutellospora savanicola asociados a
P. lanceolata. La cepa original provino de races de Cedrela montana (Proyecto micorrizas
DFG-UTPL, 2007).

!"#"$"%" '()*+,,-./0 123-/42,,-./ 5 3-267*+ 12 8+3 239:*+3
Las esporas fueron extradas bajo un estereoscopio y sometidas a un proceso de desinfeccin
basndonos en el protocolo de Cranenbrouck et al (2005)
59
, modificado ya que utilizamos papel
filtro en lugar de filtro Millipore en el equipo de filtracin: se realizaron 3 enjuagues con agua
estril para eliminar impurezas, se coloc la solucin de ChloramineT al 6%, el tiempo de
contacto con la solucin depende del tamao de la espora, mientras mas grande la espora
mayor es el tiempo de contacto con las soluciones (para Glomus sp. por 5 minutos y para
Scutellospora por 8 minutos). Finalmente se coloc una solucin de antibiticos previamente
filtrada.
Las esporas desinfectadas se capturaron con ayuda de una micropipeta con puntas estriles y
se depositaron en medio Modified Strullu Romand (MSR), y se incubaron a la sombra a 27C.

58
GEDERMANN J., NICOLSON H., (1963). Spore of micorrhizal endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting.
Transactions of the Brithish of Mycological society. 46:235-244.
59
CRANENBROUCK S., VOETS L., BIVORT C., RENARD L., DECLERCK S., (2005), Methodologies for in Vitro Cultivation Of Arbuscular
Mycorrhizal Fungi With Root Organs, In: DECLERCK S., STRULLU S., FORTIN J., (Eds.), In Vitro Culture of Mycorrhizas, Belgium, 396 pp.



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)*

Una vez que se comprob la germinacin de las esporas se procedi a inocularlas en races
transformadas de Medicago truncatula sobre medio MSR. (Fig. 8)

Fig.8: Cultivo monosprico de Scutellospora savanicola a). y b). Esporas de Scutellospora savanicola
germinadas, observadas bajo estereoscopio; c. Seleccin de esporas germinadas y colocadas sobre medio
MSR, d). Races transformada de Medicago truncatula; e). Inoculacin de esporas en races transformadas.


2.6.2. MTODO 2: Obtencin de cultivos de races de Hongos Micorrzicos Arbusculares
in vitro.

Se utiliz un aislamiento in vivo de Glomus sp., en P.lanceolata, el cual fue obtenido a partir de
un cultivo de papa del cantn Saraguro (Proyecto VALORAM). Se utilizaron segmentos de
races de aproximadamente 1 cm de longitud, los cuales fueron lavados con agua de grifo para
remover toda partcula de suelo adherida.

La desinfeccin de la races se la realiz utilizando la metodologa propuesta por Cranenbrouck
et al, (2005)
57
, con la ayuda de un sonicador y usando soluciones como agua desmineralizada,
Hipoclorito de Calcio, solucin de Chloramine T al 2% y finalmente un lavado con solucin de
antibiticos previamente filtrada; por ultimo y con la ayuda de una pinza y un bistur estril se
seleccionaron fragmentos de aproximadamente 0.5 cm al azar en la cmara de flujo laminar, se
colocaron cinco fragmentos por cada caja en medio MSR y se incub a 27C (Fig. 9).



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)+


Fig. 9: Segmentos de raz con Glomus sp en cultivo in vitro

2.7. ANLISIS ESTADSTICO:
Los datos se analizaron con el procedimiento de anlisis de varianza y prueba de comparacin
de medias (Tukey, P < 0.05) usando el programa Statistical Analysis System (SAS 2007).




RESULTADOS Y ANLISIS
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),

3. RESULTADOS Y ANLISIS

3.1 EVALUACIN DE LA COLONIZACIN DE LAS PLANTAS TRAMPA:
Por medio de la tincin de races usando el mtodo de Phillips y Hayman (1970)
56
y con la
ayuda del microscopio, se evaluaron las 10 plantas trampa de Lolium perenne, y se encontr
que siete de ellas tenan mayor presencia de estructuras micorrzicas (Fig.10), Una vez
confirmada la multiplicacin del inculo de Galpagos, lo usamos en nuestro ensayo.

Fig.10: Estructuras micorrzicas encontradas en las plantas trampa de Lolium perenne a) arbsculos, b) c) vesculas
e hifas.
3.2. RESULTADOS DEL ENSAYO PRUEBA:
A los dos meses de haber inoculado las 10 plantas de Cinchona officinalis con MUCL41883, se
procedi a evaluar las races mediante tincin usando el mtodo de Phillips y Hayman (1970)
56

y se comprob que se estableci la simbiosis entre planta HMA. Esto nos permiti
posteriormente iniciar nuestro ensayo con mayor seguridad. (Fig. 11).



RESULTADOS Y ANLISIS
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)-


Fig. 11: a). Ensayo prueba con plantas de Cinchona officinalis inoculadas con MUCL41883, b) y c).
Extraccin de races para tincin, d). Placas de las races teidas bajo el mtodo de Phillips y Hayman
(1970)
56
, e). Placa vista con un microscopio, ntese la presencia de esporas e hifas.
3.3 EVALUACION DE LAS PLANTAS DE Cinchona Officinalis y Cinchona pubescens:
Pasado tres meses de crecimiento y bajo condiciones de invernadero, se comenz a evaluar
los parmetros propuestos en C officinalis y C. pubescens. (Fig. 12)

Fig. 12: Evaluacin de las variables respuesta de las planta: a). Evaluacin de altura y dimetro, b).
Nmero de hojas, c). Peso fresco de la planta, d). Mortalidad de plantas, e). Peso seco de plantas evaluadas





RESULTADOS Y ANLISIS
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)=

3.3.1. Mortalidad de las plantas:








Tabla 3: Porcentaje de mortalidad y supervivencia de las 36 plantas/tratamiento.
Al analizar la tasa de mortalidad de las plntulas de nuestro ensayo se observ que de las 144
plantas de Cinchona pubescens estudiadas, 86 plantas murieron, lo que equivale al 59.72%;
mientras que de las 144 plantas de Cinchona officinalis, un total de 47 plantas murieron lo que
corresponde a un 32.63%.
Mayor tasa de mortalidad se presento en el T3 (Fertilizante) con Cinchona pubescens en un
88.8% y con Cinchona officinalis en un 63.8%. Mientras que la mejor tasa de supervivencia
mostr fue el T2 (MUCL41833) con Cinchona pubescens en un 72.22 % y con Cinchona
officinalis en un 91.66%.
Una de las causas que pudieron provocar la alta tasa de mortalidad de las plantas en el
tratamiento con fertilizantes fue usar una dosis muy alta, ya que el exceso puede quemar las
races provocando sntomas similares al exceso de agua y adems se debi considerar que
mientras mas fino sea el sistema radicular mayor debe ser la dilucin del fertilizante.
60


60
SILVA F., (1999). Manual de anlisis qumicas de suelos, plantas y fertilizantes. Embrapa Informtica agropecuaria. Brasilia.370 pp


MORTALIDAD

Tratamiento Muertas Vivas

C
i
n
c
h
o
n
a


p
u
b
e
s
c
e
n
s

Inculo Galpagos 61.11 % 38.88%
Inculo MUCL41833 27.77 % 72.22 %
Fertilizante 88.88 % 11.11 %
Blanco 61.11 % 38.88 %


C
i
n
c
h
o
n
a

o
f
f
i
c
i
n
a
l
i
s
Inculo Galpagos 13.88 % 86.11 %
Inculo MUCL41833 8.33 % 91.66 %
Fertilizante 63.88 % 36.11 %
Blanco 44.44 % 55.55 %

TOTAL 46.18 % 53.81 %


RESULTADOS Y ANLISIS
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);

Ahora bien se debe tomar en cuenta las condiciones que cada planta necesita para crecer, ya
que algunas especies vegetales pueden disminuir su nmero o incluso desaparecer cuando se
les intenta multiplicar en macetas de propagacin, debido a factores ambientales desconocidos
o a las condiciones del invernadero, otras especies raras o aparentemente inexistentes pueden
en cambio incrementar su nmero.
61

Es necesario preguntarse por qu una planta extica puede resultar ser ms competitiva que
una planta nativa. Existe una vasta literatura sobre las invasiones de plantas que dejan en claro
que no existe un mecanismo nico que pueda explicar la invasin, pero una de las razones, es
el hecho de estar asociadas a HMA, responsables del crecimiento acelerado de las plantas y de
mejorar su adaptacin al medio ambiente sin importar si son o no especies nativas
62
.
3.3.2. Resultados de las variables morfolgicas de las plantas:
Es necesario mencionar que al analizar estadsticamente nuestros datos, pudimos darnos
cuenta que no existi diferencia significativa entre las dos especies en la mayora de las
variables analizadas, es por ello que agrupamos ambas especies para establecer las
diferencias estadsticamente significativas entre tratamientos segn Tuckey, como se podr
observar en las grficas.
3.3.2.1 Altura

61
MORTON J., BENNY G., (1990). Revised classification of Arbuscular mycorhizal fungi (Zygomycetes): a new order, Glomales, two new
suborders, Glominae and Gigasporineae, and two new families, Acaulosporaceae and Gigasporaceae, with an emendation of Glomacea.
Mycotaxon. 37: 471 491.
62
BAYNES M. (2011). Endophytic Fungal Communities Of Bromus Tectorum: Mutualisms, Community Assemblagesand Implications For
Invasion. Thesis of master of science with a Major in Environmental Science. University of Idaho. Moscow.


RESULTADOS Y ANLISIS
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)>


Graf. 1. Promedio + Desviacin estndar de la variable Altura de las plantas de C. pubescens y C. officinalis en los
cuatro tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833, T3: Fertilizante, T4: Testigo. Las lneas verticales indican
desviaciones estndar. Las letras diferentes, muestran diferencias significativas (p ! 0.05).

Los resultados muestran que las especies evaluadas no presentaron diferencia significativa (p=
0,44) entre ellas. Mientras que entre tratamientos existi diferencia significativa (p= 0.02).
Podemos visualizar en el grfico, que T1 y C. officinalis dieron un mejor resultado en cuanto a la
altura (3.1 cm), seguido de T2 donde ambas especies C. pubescens (2.4cm) y C. officinalis
(2.5cm) responden de igual manera. Mientras que el T3 con C. pubescens fue el que mas bajo
resultado obtuvo (0.1cm).

En varias investigaciones experimentales se manifiesta la relacin que existe entre la formacin
de la MA y el ritmo de crecimiento de las plantas
4
, el efecto benfico que los HMA tienen, es la
mayor exploracin del volumen del suelo porque sus hifas aumentan el area de absorcin,
aumentando la afinidad por el fsforo y otros nutrientes presentes en la solucin del suelo hacia
la planta hospedera
63
, esto conlleva a cambios fisiolgicos que en mayor o menor grado
pueden contribuir al incremento del crecimiento.

3.3.2.2 Nmero de hojas:


63
HARRISON J., (1997). The arbuscular mycorrhizal simbiosis: AN underground association. Review Elsevier Trends Journal, 2(2): 54-60
(
!
)
*
+
,
-
T1 T2 T3 T4
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2
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.

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ALTURA
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RESULTADOS Y ANLISIS
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*(


Graf. 2: Promedio + Desviacin estndar de la variable nmero de hojas de las plantas de C. pubescens y C. officinalis
en los cuatro tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833, T3: Fertilizante, T4: Testigo. Las lneas verticales
indican desviaciones estndar. Las letras diferentes, muestran diferencias significativas (p ! 0.05).

Los resultados muestran que las especies evaluadas no presentaron diferencia significativa (p=
0,77) entre ellas. Mientras que entre tratamientos existi diferencia significativa (p= 0.0013).
Podemos visualizar en el grfico, que T1 y T2 con C. officinalis dieron un mejor resultado en
cuanto a nmero de hojas (7 hojas), seguido de T4 con C. officinalis (3 hojas). Mientras que el
T3 con C. pubescens fue el que mas bajo resultado obtuvo (1 hoja).

3.3.2.3. Dimetro de tallo:

Graf. 3: Promedio + Desviacin estndar de la variable dimetro del tallo de las plantas de C. pubescens y C. officinalis
en los cuatro tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833, T3: Fertilizante, T4: Testigo. Las lneas verticales
indican desviaciones estndar. Las letras diferentes, muestran diferencias significativas (p ! 0.05).
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RESULTADOS Y ANLISIS
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*!

Los resultados muestran que las especies evaluadas no presentaron diferencia significativa (p=
0,94) entre ellas. Tampoco hubo entre tratamientos diferencia significativa (p= 0.20).
Podemos visualizar en el grfico, que T1 con C. officinalis dieron un mejor resultado en cuanto
al dimetro del tallo (0.26 cm), seguido de T2 con C. officinalis (0.08 cm) y C. pubescens
(0.09 cm). Mientras que el T3 con C. officinalis fue el que mas bajo resultado obtuvo (0.041 cm).
Tambin se pude visualizar una alta desviacin estndar con T1 y C. officinalis, pues aqu se
evidenci una alta dispersin de los datos que pudo deberse al poco tiempo que tuvieron las
plantas para crecer. Sin embargo es necesario mencionar que al trabajar con materiales
biolgicos casi nunca va a existir una homogeneidad, puesto que cada organismo se comporta
de forma diferente.

Rocha et al. (2009) ,
10
mencionan que los efectos fisiolgicos que originan los HMA en cuanto a
la captacin de humedad y nutrientes permite apreciar un mayor vigor del tallo y rea foliar de
las plantas, incrementando esos parmetros entre un 15 y 50%.

3.3.3.4. Tamao de la Raz


Graf. 4: Promedio + Desviacin estndar de la variable tamao radicular de las plantas de C. pubescens y C. officinalis
en los cuatro tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833, T3: Fertilizante, T4: Testigo. Las lneas verticales
indican desviaciones estndar. Las letras diferentes, muestran diferencias significativas (p ! 0.05).

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RESULTADOS Y ANLISIS
Universidad Tcnica Particular de Loja


*)

En estos resultados se muestra que las especies evaluadas si presentaron diferencia
significativa (p= 0,048). No se mostr entre tratamientos diferencia significativa (p= 0.11).

Podemos visualizar en el grfico, que T1 con C. officinalis dieron un mejor resultado en cuanto
a tamao radicular o (4.075 cm), seguido de T2 con C. officinalis (3.85 cm), mientras que el T3
con C. pubescens fue el que mas bajo resultado obtuvo (0.84 cm).

3.3.2.5 Tamao total


Graf. 5: Promedio + Desviacin estndar de la variable tamao total de las plantas de C. pubescens y C. officinalis en los
cuatro tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833, T3: Fertilizante, T4: Testigo. Las lneas verticales indican
desviaciones estndar. Las letras diferentes, muestran diferencias significativas (p ! 0.05).

Las especies evaluadas presentaron diferencia significativa (p= 0.0006) entre ellas. As mismo
entre tratamientos se mostr diferencia significativa (p= 0.0133).
Podemos visualizar en el grfico, que T1 con C. officinalis dieron un mejor resultado en cuanto
al tamao total de la planta (7.40 cm), seguido de T2 con C. officinalis (6.96 cm). T3 con C.
pubescens fue el que mas bajo resultado obtuvo (0.47 cm).

En el desarrollo vegetal, se observ un incremento de tamao de las plantas, as como tambin
de su sistema radicular en los tratamientos con inoculacin de HMA. Al respecto
investigaciones sealan que las plantas colonizadas por HMA estimulan el desarrollo radical de
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b
c
d


RESULTADOS Y ANLISIS
Universidad Tcnica Particular de Loja


**

las plantas y muestran un mejor crecimiento que las no micorrizadas, cuestin que est
relacionada con la mayor exploracin del sistema radical para la obtencin de nutrientes.
64


3.3.2.6. Peso areo



Graf. 6: Promedio + Desviacin estndar de la variable peso areo de las plantas de C. pubescens y C. officinalis en los
cuatro tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833, T3: Fertilizante, T4: Testigo. Las lneas verticales indican
desviaciones estndar. Las letras diferentes, muestran diferencias significativas (p ! 0.05).

Los resultados muestran que las especies evaluadas no presentaron diferencia significativa (p=
0,05) entre ellas. Tampoco hubo entre tratamientos diferencia significativa (p= 0.058).
Podemos visualizar en el grfico, que T2 con C. pubescens dieron un mejor resultado en cuanto
al peso fresco areo de la planta (0.170 g), seguido de T1 con C. officinalis (0.13 g). Mientras
que el T3 con C. pubescens fue el que mas bajo resultado obtuvo (0.0036 g).
.

3.3.2.7. Peso Radicular


64
RIVERA R., FERNNDEZ F., SNCHEZ C., BUSTAMANTE C., HERRERA R. y OCHOA M. (1997). Efecto de la inoculacin con hongos
Micorrizgenos VA y bacterias rizosfricas sobre el crecimiento de posturas de cafeto (Coffeea arabica L.) Cultivos Tropicales 18 (3):15-23
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b
b


RESULTADOS Y ANLISIS
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*+


Graf. 7: Promedio + Desviacin estndar de la variable peso radicular de las plantas de C. pubescens y C. officinalis en
los cuatro tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833, T3: Fertilizante, T4: Testigo. Las lneas verticales
indican desviaciones estndar. Las letras diferentes, muestran diferencias significativas (p ! 0.05).

Los resultados muestran que las especies evaluadas no presentaron diferencia significativa (p=
0.46) entre ellas. Tampoco hubo entre tratamientos diferencia significativa (p= 0.73).
Podemos visualizar en el grfico, que T1 con C. officinalis dieron un mejor resultado en cuanto
al peso fresco radicular de la planta (0.042 g), seguido de T2 con C. pubescens (0.033 g).
Mientras que el T3 con C. pubescens fue el que mas bajo resultado obtuvo (0.0091 g).

3.3.2.8. Peso seco areo


Graf. 8: Promedio + Desviacin estndar de la variable peso seco areo de las plantas de C. pubescens y C. officinalis
en los cuatro tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833, T3: Fertilizante, T4: Testigo. Las lneas verticales
indican desviaciones estndar. Las letras diferentes, muestran diferencias significativas (p ! 0.05).
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P
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o
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Tratamientos
Peso seco areo
C. pubescens
C. officinalis
a
a
a
a


RESULTADOS Y ANLISIS
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*,

Los resultados muestran que las especies evaluadas no presentaron diferencia significativa (p=
0.60) entre ellas. Tampoco hubo entre tratamientos diferencia significativa (p= 0.50).
Podemos visualizar en el grfico, que T2 con C. pubescens (0.021 g) y C. officinalis (0.019 g)
dieron un mejor resultado en cuanto al peso seco areo de la planta, seguido de T1 con C.
officinalis (0.017 g). Mientras que el T3 con C. pubescens fue el que mas bajo resultado obtuvo
(0.0006 g).

3.3.2.9. Peso seco raz:


Graf. 9: Promedio + Desviacin estndar de la variable peso seco radicular de las plantas de C. pubescens y C.
officinalis en los cuatro tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833, T3: Fertilizante, T4: Testigo. Las lneas
verticales indican desviaciones estndar. Las letras diferentes, muestran diferencias significativas (p ! 0.05).

Los resultados muestran que las especies evaluadas no presentaron diferencia significativa
(p= 0.47) entre ellas. Tampoco hubo entre tratamientos diferencia significativa (p= 0.10).
En el grfico se observa, que T2 con C. pubescens (0.0059 g) dieron un mejor resultado en
cuanto al peso seco radicular, seguido de T1 con C. officinalis (0.0036 g). Mientras que el T3
con C. pubescens fue el que mas bajo resultado obtuvo (0.0001 g).

Por lo tanto no es raro que las variables peso fresco y seco respondan de mejor manera con
los HMA, tanto con el MUCL41833 inculo que ya ha demostrado ser efectivo como tambin
con el de Galpagos; pues la literatura menciona, que la presencia de HMA produce un
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.
.
.


RESULTADOS Y ANLISIS
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*-

aumento de biomasa dada la mayor y mas rpida disponibilidad de nutrientes en el sistema
vascular de la planta, lo cual acelera su actividad fotosinttica y resulta en un aumento
considerable de su produccin de biomasa fresca y seca.
65

Tambin se puede observar que las desviaciones estndar se presentan mayor en la grfica 6
(peso areo), con T2 y C. pubescens; en la grfica 7 (peso radicular) con T1 y C. officinalis y T2
con C. pubescens; en la grfica 8 (peso areo seco) con T2 y C. pubescens y en la grfica 9
(peso seco radicular) con T2 y C. pubescens, debido asimismo a la alta dispersin de los datos
y al hecho de que ningn organismo responde de igual forma que otro durante un experimento.

Luego de haber evaluado todas las variables queda claro que las plantas micorrizadas
presentaron mejores resultados que las no micorrizadas; es as, que los hongos micorrzicos
arbusculares contribuyeron a mejorar el estado fisiolgico y el crecimiento de las plantas
estudiadas en ambas especies.
Los diferentes resultados obtenidos de todas las variables, nos hace pensar que la capacidad
de crecimiento y desarrollo de una planta viene determinada en gran medida por las
caractersticas ambientales del ecosistema receptor, as mismo de la especificidad de los HMA
y cmo responden las plantas a ellos. Segn lo dicen Klironomos, et al. (2000)
66
y Munkvold et
al. (2004)
67
, a pesar que los HMA carecen de especificidad en su capacidad de infectar plantas
hospederas, una misma especie de hongo no tiene el mismo efecto sobre todas las plantas,
indicando que diferentes especies difieren funcionalmente. Por lo tanto nuestros resultados
apoyan el hecho que algunas plantas inoculadas con MUCL41833 o con Inculo de Galpagos,
presentaron mejores respuestas en los parmetros de crecimiento planteados con respecto a
los otros tratamientos evaluados. Igualmente se ha demostraron que la formacin y funcin de
las micorrizas arbusculares suele ser bastante variable entre aislados de diferentes especies e
incluso, entre aislados de la misma especie
22
. De modo que las plantas responden de manera
diferente a la micorrizacin y que en funcin de su grado de dependencia se puede considerar

65
ALINHOFF C., CACERES A., LUGO L., (2009), Cambios en la biomasa de races y micorrizas arbusculares en cultivos itinerantes del
Amazonas Venezolano. INCI, 34(8):571-576.
66
KLIRONOMOS J., MCCUNE M., NEVILLE J., (2000), The influence of arbuscular mycorrhizae on the relationship between plant diversity
and productivity. Ecol. Letters 3:137-141.
67
MUNKVOLD L., KJOLLER R., VESTBERG S., JAKOBSEN I. (2004). High functional diversity within species of arbuscular mycorrhizal
fungi. New Phytol 164:357-364


RESULTADOS Y ANLISIS
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*=

cmo las especies de HMA y su abundancia influirn en la estructura de las plantas, en el
funcionamiento de los ecosistemas y en la diversidad de las comunidades vegetales donde se
desarrollen
10
.

3.3.3 Evaluacin del Porcentaje de colonizacin:

Tras analizar las races teidas, se pudo encontrar estructuras micorrzicas que confirmaban la
colonizacin. Algunas de las estructuras que se observaron se presentan en la Fig. 13


Fig. 13: Evaluacin de la colonizacin de las plantas de C. officinalis y C. pubescens en estudio: a). Arbsculos, b).
c). Vesculas colonizando la raz, d). Hifas; estructuras encontradas en las dos especies de plantas de Cinchona,
evaluadas despus de tres meses desde su inoculacin.

3.3.3.1 Anlisis estadstico del Porcentaje de colonizacin:
Para el anlisis estadstico de la colonizacin, tomamos en cuenta nicamente a los datos de
los Tratamientos T1 y T2, debido a que en los otros dos no se evidenci colonizacin
micorrzica alguna.






RESULTADOS Y ANLISIS
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*;


3.3.3.1.1 Frecuencia de Micorrizacin %F:


Graf. 10: Promedio + Desviacin estndar de Porcentaje de Frecuencia de Micorrizacin %F de las plantas de C.
pubescens y C. officinalis en los tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833. Las lneas verticales indican
desviaciones estndar.
En el porcentaje de Frecuencia de micorrizacin (%F) no hubo significancia estadstica entre
especie (p=0.60), mientras que si lo hubo entre tratamientos (p= 0.0509).
Segn lo muestra el grfico, los mejores resultados se obtuvieron con T2 (MUCL41833) en
ambas especies, C. pubescens con un %F promedio de 92.64, y C. officinalis con un %F de
80.72. Vemos tambin que con T1 ambas especies responden a este inculo, aunque en menor
porcentaje que con T2., puesto que su %F fue de 66.76 y 67.22 en C. officinalis y C. pubescens
respectivamente.





0
20
40
60
80
100
120
T1 T2
%
F

Tratamientos
Frecuencia de Micorrizacin %F
C. pubescens
C. officinalis


RESULTADOS Y ANLISIS
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*>

3.3.3.1.2. Abundancia Arbuscular en el sistema radical %A:

Graf. 11: Promedio + Desviacin estndar de Abundancia Arbuscular %A de las plantas de C. pubescens y C. officinalis
en los tratamientos. T1: Inculo Galpagos, T2: Inculo MUCL41833. Las lneas verticales indican desviaciones estndar.
Se determin que el porcentaje de Abundancia Arbuscular %A tuvo significancia estadstica
entre especie (p<0.0001), y tambin entre tratamientos (p<0.0001). Los mejores resultados se
obtuvieron con T2 (MUCL41833) y C. pubescens con un %A promedio de 12.28. En los dems
resultados fue casi nula la presencia de arbsculos.
Los arbsculos tienen un periodo de vida muy corto, cuando un arbsculo muere es
remplazado por otro ms joven siempre y cuando el intercambio de nutrientes est activo.
Cuando ste cesa los arbsculos mueren y de la colonizacin interna solo quedan las
vesculas, que son las estructuras de reserva de nutrientes del hongo
10
. Al observar bajo el
microscopio las placas teidas se lo constat, pues para ambas especies la presencia de
vesculas fue abundante.
Si bien nuestro control positivo MUCL41883 mostr mejores resultados de colonizacin (%F y
%A), podemos finiquitar este estudio mencionando que las especies nativas de hongos
micorrzicos arbusculares aisladas de suelos con Cinchona pubescens de la islas Galpagos,
tambin demostr tener capacidad infectiva en ambas especies para ser utilizado como material
fngico til. Es importante resaltar que un inculo con races colonizadas como propgulos
infectivos es de excelente calidad siempre y cuando se utilice de inmediato, porque sin la
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
T1 T2
%
A

Tratamientos
Abundancia Arbuscular %A
C. pubescens
C. officinalis


RESULTADOS Y ANLISIS
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+(

planta viva, el micelio colonizador muere en pocas semanas an almacenado en un ambiente
fresco
15
; es por esto que nuestro Inculo de Galpagos fue usado de inmediato sobre las
plantas de ambas especies que se encontraban aptas para su inoculacin, con lo cual
aseguramos la asociacin hongo-planta.
Solis G. et al (2009)
68
, pone de manifiesto que el contacto directo del sistema radicular de la
planta con los propgulos del hongo permite una ms rpida colonizacin de la raz. Este factor
puede ser una de las razones por las que Cinchona pubescens present mayor porcentaje de
colonizacin que Cinchona officinalis, ya que cuando se dio inicio a la inoculacin las primeras
tenan mayor tamao y mejor sistema radicular que las Cinchona officinalis, permitiendo un
mayor contacto con el inculo.
As mismo explica que los beneficios de la inoculacin temprana con hongos formadores de
micorriza arbuscular, contribuyen a mejorar la adaptabilidad de las plantas
68
. Tambin se
describe que dentro de estos beneficios esta un incremento de la nutricin y crecimiento de la
planta, aumento de la defensa contra patgenos y capacidad para superar situaciones de estrs
bitico y abitico
53
. Esto se puso en evidencia con los dos tratamientos T1 y T2, en los cuales
la tasa de mortalidad fue menor y la de crecimiento fue mayor en relacin a los otros dos
tratamientos T3 y T4.
Segn Schmidt y Scow (1986)
69
, la invasin exitosa de la quinina (Cinchona pubescens) en las
Islas Galpagos puede haber sido facilitada por micorrizas nativas. Es claro analizar segn los
resultados y en base a como respondieron satisfactoriamente estas plantas a los dos
inculos, que una razn por la que esta especie sea invasiva pueda deberse al
aprovechamiento de la asociacin con los HMA, hacindola una especie extica ms
competitiva que las especies nativas.
Segn el estudio de Garmendia (2005), las Cinchonas tienes condiciones bastante especficas
para crecer, y por eso actualmente slo las encontramos en poblaciones remanentes o
aisladas.

68
SOLIS G., CARDENAS F., (2009). Efecto de los hongos micorrisgenos arbusculares (glomus fasciculatum) en el crecimiento y desarrollo
del cultivo de tomate de mesa (solanum lycopersicum) variedades alambra y fortuna en la zona urcuqu provincia de imbabura. Tesis Doctoral.
69
SCHMIDT S. and SCOW, K., (1986). Mycorrhizal fungi on the Galapagos Islands. Biotropica, 18:236-240.


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+!

En cuanto a la especie Cinchona officinalis, podemos darnos cuenta que esta especie responde
positivamente al ser inoculadas con HMA, independientemente del tipo. Los efectos
beneficiosos de la introduccin artificial de un inculo micorrzico, resultan ms evidentes en
suelos donde las poblaciones de hongos MA nativos no existen, o han sido eliminadas por
empleo de prcticas agrcolas desfavorables para su desarrollo como la fumigacin del suelo y
el cultivo intensivo
64
. Sabemos que se requieren ms investigaciones para poder explicar el
beneficio que le proporciona la inoculacin de las plantas de Cinchona con HMA, los resultados
del presente estudio sugieren que estos hongos podran ser utilizados como una estrategia de
manejo agrcola en planes de reforestacin, a fin de mejorar el crecimiento de esta especie en
peligro de extincin. Con ello se estara promoviendo la agricultura sustentable y se minimizara
la dependencia de insumos agrcolas, especialmente fertilizantes qumicos con su consecuente
reduccin en el dao al ambiente.

3.4 RESULTADOS DE LOS CULTIVOS IN VITRO DE HMA:
3.4.1 Resultados del Cultivo monsporico de HMA:
Aproximadamente 50 esporas de Scutellospora savanicola desinfectadas se pusieron a
germinar sobre medio MSR, de las cuales solo 15 mostraron una germinacin exitosa.
El contacto de las hifas germinativas de las esporas de Scutellospora savanicola en las races
transformadas de Medicago truncatula, se estableci a las dos semanas despus de inocular
las esporas. La evaluacin de la presencia de Scutellospora savanicola en las clulas
epidrmicas de las races se lo realiz con la ayuda de un estereoscopio.
Pasado 42 das desde la inoculacin, no se pudo apreciar una colonizacin tpica intrarradical,
ms si se pudo detectar un marcado y localizado desarrollo de hifas en el medio de cultivo, que
se extendi en un radio de 2-3 cm a partir de la espora inoculada. (Fig.14).






RESULTADOS Y ANLISIS
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+)










Fig. 14: Germinacin de Scutellospora savanicola sobre medio MSR.
Pese a los resultados se demuestra la capacidad del hongo para mantener su crecimiento hifal
aun sin establecer exitosamente la simbiosis como tal, lo que indica la habilidad de este hongo
para desarrollarse a partir de sus propias reservas de carbono durante su fase asimbitica
70
.
3.4.2. Resultados del Cultivo de races de HMA in vitro:
El cultivo de segmentos de races infectadas con Glomus sp, no dio ningn resultado tangible,
tras cultivar los segmentos por mas de un mes sobre medio de cultivo MSR, stos no
presentaron ninguna germinacin (Fig. 15).






70
BAGO B., PFEFFER F., SHACHAR Y., (2000).. Carbon metabolism and transport in arbuscular mycorrhizas. Plant. Mundi Prensa. Mxico,
pp78-99.


RESULTADOS Y ANLISIS
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+*

Fig.15: Cultivo de races con Glomus sp : a) Cultivo de races colonizadas de HMA en medio MSR b) Segmento de
raz germinacin, ntese como no se presenta germinacin aun transcurrido ya 40 das de incubacin.
En general, estudios previamente publicados apuntan a diferentes estrategias de colonizacin
entre las especies de la HMA. Sin embargo, todava no est claro si las diferencias ms
importantes se producen en los niveles taxonmicos superiores (gnero, suborden).
26
Hasta la
actualidad la literatura menciona que solo el 8% de las especies conocidas son usadas en este
tipo de cultivos in vitro para el resto aun no se conocen las condiciones en las que se
desarrollaran.
59

En particular, parece que para estos tipos de cultivos la hifa podra ser ms efectiva para las
especies de Glomus, mientras que las esporas pueden ser ms importantes en otras especies
como Scutellopora y Gigaspora. Ensayos con cultivo in vitro demostraron que segmentos de
races micorrizadas funcionaban como propgulos eficaces para Glomus y Acaulospora pero no
para aislamientos de Scutellospora.
71

As mismo, estudios han determinado que las esporas son tiles para el establecimiento de la
mayora de las especies de Acaulospora, Gigaspora y Scutellospora, mientras presentan poco
xito con fragmentos de races.
72

El tiempo de germinacin tambin debe ser considerado para este tipo de cultivos ya que
para los fragmentos de races micorrizadas, el re-crecimiento de las hifas en los extremos de
los segmentos se observa generalmente entre 2-15 das,
73
pero en nuestra evaluacin esto no
ocurri. Esto nos hace pensar que el material fngico no era apto para este establecimiento in
vitro, puesto que antes de iniciarlo no se confirm la presencia de HMA en el sistema radicular,
esto servira de consejo para futuros establecimientos.
En cambio la germinacin de las esporas ocurre a menudo en un perodo variable entre 2 y 30
das despus de la desinfeccin, aun as estudios con Scutellospora reticulata demuestran que

71
ABBOTT L., ROBSON A., GAZEY C., (1994) Selection of inoculant vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi. In: NORRIS J., READ D., VARMA
A.,(eds) Techniques for mycorrhizal research. Academic. San Diego, 137ppp
72
BRUNDRETT M., ABBOT L., JASPER D. (1999). Glomalean fungi from tropical Australia.:Comparison of the effectiveness of isolation
procedures. Mycorrhiza 8:305314
73
DECLERCK S., CRANENBROUCK S., LE BOULENG E., (2001) Modeling the sporulation dynamics of arbuscular mycorrhizal fungi in
monoxenic culture. Mycorrhiza 11:225230.


RESULTADOS Y ANLISIS
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++

para una exitosa asociacin y produccin de nuevas generaciones de esporas en cultivos
monoxnicos tardara ocho meses.
74

Otro factor clave para poder producir inculo en un sistema in vitro sobre races transformadas,
es conocer los diferentes macro, micronutrientes y suplementos necesarios para el
establecimiento de HMA, como tambin el hecho que algunos azcares como la sacarosa
pueden ser inhibitorios de la colonizacin micorrzica.
59
Lo mencionado anteriormente pudo ser
una de las causas por las que la colonizacin de las esporas en races transformadas de M.
truncatula no se vio favorecida, puesto que nuestro medio MSR contena en su composicin
sacarosa.
Para ambos tipos de inculo, esporas y segmentos de raz colonizada, es importante asociarlos
con una raz husped poco despus de la germinacin para evitar daos de las hifas formadas
durante el proceso de asociacin y el aumento de la colonizacin.
73

Por ltimo creemos que se debe considerar la especie de raz transformada a usarse, ya que
races transformadas de zanahoria son catalogadas como una de las especies ms adecuadas
hasta el momento para el cultivo de HMA; debido a su facilidad de propagacin y
mantenimiento
75

Aunque el cultivo in vitro de los HMA sigue siendo un desafo, ya que slo se han logrado
cultivar algunas especies, se ha convertido en el mtodo mas eficaz y predilecto para
aislamientos de HMA de especies y condiciones conocidas.



74
DE SOUZA F., DECLERCK S., (2003), Mycelium development and architecture, and spore production of Scutellospora reticulata in
monoxenic culture with Ri T-DNA transformed carrot roots, Mycologia, 95(6):10041012.
75
BCARD G., PICH Y., (1992) Establishment of vesicular-arbuscular mycorrhiza in root organ culture: review and proposed methodology.
Method Microbiol 24:89108


CONCLUSIONES
Universidad Tcnica Particular de Loja


+,

4. CONCLUSIONES

Se logr la multiplicacin de los HMA sobre plantas micotrficas hospederas de Lolium
perenne, y se revel el efecto que estos tienen sobre el crecimiento y desarrollo de plantas
de C. pubescens y C. officinalis en condiciones de invernadero. Los plantas de C. pubescens y
C. officinalis inoculadas con HMA, (T1, T2), permitieron la obtencin de mejores rendimientos y
un mayor desarrollo de la planta: mayor altura y tamao total, mayor dimetro de tallo, mayor
desarrollo radical, mayor nmero de hojas, mayor produccin de biomasa; en comparacin a los
dos otros tratamientos (T3, T4).

Aunque no altamente significativa, la influencia de estos tratamientos sobre la calidad de la
planta ha sido marcada en C. pubescens, sin embargo los rendimientos obtenidos, como
tambin el desarrollo morfolgico fueron casi similares con C. officinalis.

Aun as, se pudo comprobar el alto predominio que tiene el Inculo de Galpagos, con la
especie de C. pubescens, pues fue la combinacin que mejor resultados dio, conformando la
fuerte relacin que existe entre los HMA y el hecho de que esta planta sea una especie invasiva
en Galpagos.

Con respecto al porcentaje de colonizacin micorrzica, se observ que con el T2 tuvo un mejor
rendimiento con un 80.72% y 92.64% en Cinchona officinalis y pubescens respectivamente,
mientras que con el T1 se logr una porcentaje de colonizacin de 66,76 % y 67,22% en
Cinchona officinalis y pubescens tambin respectivamente. Todo este resultado concuerda con
los obtenidos de las variables respuesta medidas y anteriormente descritas.

Si bien se pudieron observar estructuras micorrzicas como vesculas e hifas, la presencia de
arbsculos fue escasa, esto se debi a que las races de las plantas ya no estaba en un
proceso activo de intercambio de nutrientes en cuyos casos los arbsculos mueren y su
presencia en las placas teidas es nula o casi nula.



CONCLUSIONES
Universidad Tcnica Particular de Loja


+-

Por otra parte los mtodos de cultivo in vitro de HMA mostraron resultados poco favorables, en
el caso del cultivo monosprico se pudo observar un crecimiento hifal y localizado de
Scutellospora savanicola pero no se estableci exitosamente la simbiosis como tal con las
races transformadas de Medicago truncatula. El escaso periodo de tiempo puede llegar a ser
un factor de este resultado por lo que se recomienda que los cultivos permanezcan mucho ms
tiempo y evaluar futuros resultados. El cultivo de races con HMA de Glomus sp. in vitro, no
produjo ninguna germinacin si bien una de las causas, es que pudo deberse a que ciertos
tipos de propgulos de hongos no resultan efectivos para este tipo de cultivos, tambin se debe
considerar que antes de realizarlo se debe confirmar la colonizacin de los segmentos a
cultivar.

Hoy en da la utilizacin de micorrizas constituye uno de los componentes mas importantes
dentro de la agroecologa moderna y es una buena opcin para el desarrollo de una agricultura
sostenible, evitando as el uso de productos qumicos (Barea, 2003). Ligndose siempre a
mantener el equilibrio de los ecosistemas terrestres y la fertilidad de los suelos. En este
contexto los HMA juegan un papel importante en la produccin de plantas de Cinchona
officinalis, la cual se encuentra amenazada en la provincia de Loja.


PERSPECTIVAS A FUTURO
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+=

5. PERSPECTIVAS A FUTURO

Continuar con los estudios que permitan conocer la interaccin de los HMA con el medio que
les rodea, mediante experimentos multifactoriales en campo y muestreos, que revelen la
realidad ecolgica de los mismos, de tal forma que se impulse la aplicacin de procesos de
restauracin de ecosistemas degradados, y as se puedan desarrollar especies alimenticias y
medicinales que son usadas por el ser humano.

Crear un banco de germoplasma de HMA que permita conservar la biodiversidad de estos
hongos y sea un aporte cientfico para posteriores investigaciones.

Realizar ms ensayos de cultivos monoxnicos, puesto que representa una forma ms segura y
estril de aislamiento de HMA.

Seleccionar inculos de HMA eficientes (interaccin HMA- microbiota del suelo) para diferentes
cultivos de plantas y condiciones edafoclimticas.


BIBLIOGRAFA
Universidad Tcnica Particular de Loja


+;

6. BIBLIOGRAFIA

ABBOTT L., ROBSON A., GAZEY C., (1994) Selection of inoculant vesicular-arbuscular
mycorrhizal fungi. In: NORRIS J., READ D., VARMA A.,(eds) Techniques for mycorrhizal
research. Academic. San Diego, 137ppp
ALINHOFF C., CACERES A., LUGO L., (2009), Cambios en la biomasa de races y micorrizas
arbusculares en cultivos itinerantes del Amazonas Venezolano. INCI, 34(8):571-576.
ANDERSSON L., (1998), A revision of the genus Cinchona (Rubiaceae-Cinchoneae), Bot. Gard.
80:175
AZCN G., BAREA J., (1980), Micorrizas, Investigacin y Ciencias (Espaa), 47:8- 16.
BAGO B., PFEFFER F., SHACHAR Y., (2000).. Carbon metabolism and transport in arbuscular
mycorrhizas. Plant. Mundi Prensa. Mxico, pp78-99.
BAGO B., SHACHAR H., PFEFFER P., (2000), El micelio externo de la micorriza Arbuscular como
puente simbitico entre la raz y su entorno, En: Alarcon A., Ferrera R., Ecologa, Fisiologa y
Biotecnologa de la micorriza Arbuscular, Mundi Prensa, Mxico pp 78-92.
BAYNES M. (2011). Endophytic Fungal Communities of Bromus Tectorum: Mutualisms, Community
Assemblagesand Implications for Invasion. Thesis of Master of Science with a Major in
Environmental Science. University of Idaho. Moscow.
BCARD G., PICH Y., (1992) Establishment of vesicular-arbuscular mycorrhiza in root organ
culture: review and proposed methodology. Method Microbiol 24:89108
BELLGARD S., (1993). The topsoil as the major store of propagules of vesicular-arbuscular fungi in
southeast Australian sandstone soil, Mycorrhiza 3:19-24.
BLASZKOWSKI J., (2003), Arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota) species deposited in the
Department of Plant Pathology, University of Agriculture in Szczecin, Poland
BRUNDRETT M., ABBOT L., JASPER D. (1999). Glomalean fungi from tropical
Australia.:Comparison of the effectiveness of isolation procedures. Mycorrhiza 8:305314
BRUNDRETT M., BOUGHER N., DELL B., GROVE T.,, MALAJCZUK N., (1996) Working with
mycorrhiza in forestry and agriculture, Aciar Moniograph, Australia, 185 pp.
CASTILLO R., SOTOMAYOR L., ORTIZ O., BORIE F., RUBIO R., (2009), Effect of Arbuscular
Mycorrhizal Fungi on an Ecological Crop of Chili Peppers (Capsicum annuum L.), Chilean J.
Agric. Res, .69:79-87
CHAURASIA B., KHARE K., (2005), Hordeum vulgare: A suitable host for mass production of
Arbuscular mycorrhizal fungi from natural soil. Applied Ecology and Environmental Research
4:45-53


BIBLIOGRAFA
Universidad Tcnica Particular de Loja


+>

CHILTON M., TEPFER D., PETIT A., DAVID C., TEMP J., (1982) , Agrobacterium rhizogenes
inserts T-DNA into the genome of host plant root cells. Nature, 295:432434
COVACEVICH F., ECHEVERRIA H., (2008), Receptivity of an Argentinean pampas soil to arbuscular
mycorrhizal Glomus and Acaulospora strains. World J. Agric. Sc. 4:688-698.
CRANENBROUCK S., VOETS L., BIVORT C., RENARD L., DECLERCK S., (2005), Methodologies
for in Vitro Cultivation Of Arbuscular Mycorrhizal Fungi With Root Organs, In: DECLERCK S.,
STRULLU S., FORTIN J., (Eds.), In Vitro Culture of Mycorrhizas, Belgium, 396 pp.
DALP Y., DECLERCK S., (2002), Development of Acaulospora rehmii spore and hyphal
swellings under root-organ culture, Mycologia, 94:850855.
DE SOUZA F., DECLERCK S., (2003), Mycelium development and architecture, and spore
production of Scutellospora reticulata in monoxenic culture with Ri T-DNA transformed carrot
roots, Mycologia, 95(6):10041012.
DECLERCK S., CRANENBROUCK S., LE BOULENG E., (2001) Modeling the sporulation
dynamics of arbuscular mycorrhizal fungi in monoxenic culture. Mycorrhiza 11:225230.
DIOP T., PLENCHETTE C., STRULLU D., (1994) Dual axenic culture of sheared-root inocula of
Vesicular arbuscula rmycorrhizal fungi associated with tomato roots, Mycorrhiza 5:1722
FERRERA-CERRATO R., GONZLEZ-CHVEZ M., (1998). La simbiosis micorrzica en el manejo
de vivero de los ctricos. Textos Universitarios, Universidad Veracruzana, Mxico pp. 37-63.
FERRERA-CERRATO R., y PREZ J., (1995), Agromicrobiologa, elemento til en la agricultura
sustentable. Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrcolas, Montecillo-Mxico, pp: 36-50.
FORTIN J., BCARD G., DECLERCK S., DALP Y., COUGHLAN A., PICH Y., (2002),
Arbuscular mycorrhiza on root-organ cultures. Can J Bot 80:120
FRANK A. B., (1885). On the root symbiosis depending nutrition through hypogeous fungi of certain
trees. Proc. Amer. Conf. Myc, 6:18-25.
GARCIA J., OCAMPO J., (2002), Regulation of the plant defence response in arbuscular mycorrhizal
simbiosis, J.Exp. Bot., 53:1377-1386
GARMENDIA A., (2005). El rbol de la quina (cinchona spp), Distribucin, caracterizacin de su
hbitat y arquitectura, U.T.P.L.
GEDERMANN J., NICOLSON H., (1963). Spore of micorrhizal endogone species extracted from soil
by wet sieving and decanting. Transactions of the Brithish of Mycological society. 46:235-244.
GIOVANNETTI M., (2000), Spore Germination and Pre-Symbiotic Micelial Growth. In: Kapulnik, Y.,
Douds D., Arbuscular mycorrhizas: Physiology and Function, Chapter 3. pp: 47 - 68.
GONZLEZ C., MONROY A., GARCA E., OROZCO M., (2005) Influencia de hongos
micorrizgenos arbusculares (hma) en el desarrollo de plntulas de Opuntia streptacantha


BIBLIOGRAFA
Universidad Tcnica Particular de Loja


,(

Lem. sometidas a sequa en condiciones de invernadero , Revista Especializada en Ciencias
Qumico-Biolgicas, 8(1):5-10,
GUZMN S., FARAS J., (2005), Biologa y regulacin molecular de la micorriza Arbuscular,
Avances en Investigacin Agropecuaria, 9:17-31.
GUZMN S., LARIOS F., (2005), Biologa y regulacin molecular de la micorriza arbuscular.
Avances en Investigacin Agropecuaria 9:17-31.
HAMEL C., (1996), Prospects and problems pertaining to the manage-ment of arbuscular
mycorrhizae in agriculture. Agric. Ecos. Env. 60:197-210.
HARRISON J., (1997). The arbuscular mycorrhizal simbiosis: AN underground association. Review
Elsevier Trends Journal, 2(2): 54-60
HERNNDEZ M., (2000). Las micorrizas arbusculares y las bacterias rizsfericas como
complemento de la nutricin mineral de tomate (lycospersicon esculentm mill), Tesis de
Maestra, Inca.
HOLGUIN G., BASHAN Y., FERRERA-CERRATO R., (1996), Interactions between Plants and
Beneficial Microorganims. Ed. Terra, 14:2
INVAM (International Culture Collection of Arbuscular & Vesicular- Arbuscular Mycorrhizal Fungi),
2011, http:// invam.caf.wvu.edu/methods/cultures/GINCO.pdf)
JANSA J., MOZAFART A., ANKEN T., (2002), Diversity and strucuture of AMF comunities as
affected by tillage in a temperate soil. Mycorrhiza 12: 225-234.
JOHANSSON F., FINLAY R., (2004), Microbial interactions in the mycorrhizosphere and their
significance for sustainable agriculture. FEMS Microbiology Ecology, 48: 1-13.
JORGENSEN P., LEN M., (1999). Catalogue of the vascular plants of Ecuador. Syst. Bot. Missouri
Bot. Gard. 75:11182.
KLIRONOMOS J., MCCUNE M., NEVILLE J., (2000). The influence of arbuscular mycorrhizae on the
relationship between plant diversity and productivity. Ecol. Letters 3:137-141.
LEON D., (2006), Evaluacin y Caracterizacin de Micorrizas Arbusculares asociadas a Yuca
(Manihot esculenta sp) en dos regiones de la amazonia colombiana. Trabajo de tesis para el
titulo de microbilogo, Pontificia Universidad Javeriana, Bogot.
LINDERMAN R., DAVIS E., (2004). Varied response of marigold (Tagetes spp.) genotypes to
inoculation with different arbuscular mycorrhizal fungi. Sci. Hort. 99:67-78
LOAIZA T., SNCHEZ E., (2006), La corteza de Loja, Revista Ecuador Tierra Incgnita, ECU-10:1-4
MAHECHA G., OVALLE A., CAMELO D., ROZO A., BARRERO D. (2004), Vegetacin del territorio:
450 especies de sus llanuras y montaas, Colombia 871pp


BIBLIOGRAFA
Universidad Tcnica Particular de Loja


,!

MOLINA M., MEDINA M., RESTREPO L., (2006), Evaluacin de sustratos y cultivos trampa bajo
condiciones controladas para la obtencin de hongos micorrzogenos de Aliso (Alnus
acuminata H.B.K.). Livestock Research for Rural Development. 18(2):26
MOORE-LANDECKER B., (1996), Fundamentals at the Fungi, First Edition, Prentice Hall publisher,
U.S.A. 574 pp
MORTON J., BENNY G., (1990). Revised classification of Arbuscular mycorhizal fungi
(Zygomycetes): a new order, Glomales, two new suborders, Glominae and Gigasporineae, and
two new families, Acaulosporaceae and Gigasporaceae, with an emendation of Glomacea.
Mycotaxon. 37: 471 491.

MOSSE B., (1981). Vesicular micorrizas arbusculares, Investigacin de Agricultura Tropical,
Universidad de Hawai, Hawai.
MUNKVOLD L., KJOLLER R., VESTBERG S., JAKOBSEN I. (2004). High functional diversity within
species of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytol 164:357-364
PHILLPS J. and HAYMAN D., (1970) Improve procedure for clearing roots and stainin parasitic and
vesicular arbuscular mycorrhizal fungi for rapid asesment of infection. Trans. Br. Mycol. Soc.
55: 158-161.
PLENCHETTE C., (2000). Receptiveness of some tropical soils from banana fields in Martinique to
the arbuscular fungus Glomus intraradices. Appl. Soil Ecol. 15: 253-260.
POZO M., (1999), Induccin de enzimas hidrolticas en races de tomate (Lycopersicon esculentum)
como respuesta a la formacin de MA y su implicacin en el control biolgico de Phythophtora
parastica. Tesis de doctorado, Universidad de Granada, Espaa.
READ D., (1999), Mycorhiza: The state of the art, second edition, A. Varma & B. Hock, Berlin, pp 3-
34.
REQUENA N., (1996), Exploracin de la biodiversidad microbiana (hongos de las micorrizas
arbuscula-Rhizobium-Rizobacterias) en un ecosistema mediterrneo desertificado dirigida a
una estrategia de revegetacin, Tesis doctoral de la Universidad de Granada.
RILLIG M., (2004). Arbuscular Mycorrhizae and Terrestrial Ecosystem Processes. Ecology Letters
7:740-754.
RIVERA R., FERNNDEZ F., SNCHEZ C., BUSTAMANTE C., HERRERA R. y OCHOA M. (1997).
Efecto de la inoculacin con hongos Micorrizgenos VA y bacterias rizosfricas sobre el
crecimiento de posturas de cafeto (Coffeea arabica L.) Cultivos Tropicales 18 (3):15-23
ROCHA L., RAMOS C., ROSALES C., (2009), Multiplicacin de Hongos Micorrzicos arbusculares
MA nativos de cultivos de cacao (Theobroma cacao), en Maiz (Zea mays), bajo distintos
tratamientos agronmicos, Tesis- Universidad Popular del Cesar, Valledupar.
RODRIGUES Y., DEL ANOVAL B., FERNANDEZ F., RODRIGUEZ P., (2004). Estudio comparativo
del comportamiento de seis cepas de hongos micorrzicos arbusculares en la interaccin en el
tomate (Licopersicon esculentum). Ecologa aplicada 3:162-171.


BIBLIOGRAFA
Universidad Tcnica Particular de Loja


,)

SCHMIDT S. and SCOW, K., (1986). Mycorrhizal fungi on the Galapagos Islands. Biotropica, 18:236-240.
SELOSSE M., LE TACON F., (1998), The land flora: a phototroph fugus partnership, Tree, 13 (1): 15-20
SIEVERDING E., (1991) Vesicular-arbuscular mycorrhiza management in tropical agrosystems,
Academic Press, Great Britain 605pp.
SILVA F., (1999). Manual de anlisis qumicas de suelos, plantas y fertilizantes. Embrapa Informtica
agropecuaria. Brasilia.370 pp
SIQUEIRA J., CAMEIRO M., CURI N., ROSADO S., DAVIDE, (1988), Mycorrhizal colonization and
mycotrophic growth of native woody species as related to successional groups in Southeastem
Brazil. Forest Ecology and Management, 107:241-252
SMITH S., READ D., (1997). Mycorrhizal Symbiosis. 2da edicin, Academic Press, London. 605 pp.
SOLIS G., CARDENAS F., (2009). Efecto de los hongos micorrisgenos arbusculares (glomus
fasciculatum) en el crecimiento y desarrollo del cultivo de tomate de mesa (solanum
lycopersicum) variedades alambra y fortuna en la zona urcuqu provincia de imbabura. Tesis
Doctoral.
STARR F., STARR K., LOOPE Ll., (2003), Cinchona pubescens-Quinine tree Rubiaceae. Geological
Survey Biological, USA.
TAPIA J., (2003), Identificacin de hongos micorrzicos Arbusculares aislados de suelos salinos y
su eficiencia e plantas de lechuga. Tesis Doctoral, Universidad de Colima. Mxico
TEPFER D., (1989), Ri T-DNA from Agrobacterium rhizogenes: a source of genes having
applications in rhizosphere biology and plant development, ecology and evolution. In: Kousugg
T., Nester E., (eds), Plant microbe interactions: Molecular and genetic perspectives. Mc Graw-
Hill, New York, pp 294342
TROUVELOT A., KOUGH j., GIANINAZZI V., (1986). Mesure du taux de mycorhization va dun
systeme radiculaire. Recherche de mthodes destimation ayant une signification fonctionnelle.
In: GIANINAZZI V and GIANINAZZI S. (eds.)., Physiological and genetical aspects of
mycorrhizae, Inra press, Paris, pp. 217-221.

USUGA C., CASTAEDA D., FRANCO A., (2008) Multiplicacin de hongos micorriza arbuscular
(H.M.A) y efecto de la micorrizacin en plantas micropropagadas de banano, Revista Facultad
Nacional de Agronoma 61:4279-4290.
VAN DERHEIJDEN M., (1998), Different arbuscular mycorrhizal fungal species are potential
determinants of plant community structure, Ecology, 79(6): 2082-2091.
WILLIAMS S., VESTBERG M., UOSUKAINEN M., DOD J., (1992). Effects of fertilizer and arbuscular
mycorrhizal fungi on the post-vitro growth of micropropagated strawberry. Agron, 12: 851-857.
YU T., EGGER K.,, PETERSON R., (2001), Ectendomycorrhizal associations characteristics and
functions, Mycorrhiza 11: 167-177.


ANEXOS
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,*

7. ANEXOS


DATOS GENERALES DE LA PLANTA HOSPEDERA (Lolium perenne)

ANEXO 1













Clasificacin cientfica
Familia: Poaceae
Nombre cientfico: Lolium perenne
Nombre comn: Ray grass
Distribucin: Cosmopolita
Hbito y forma de vida: Plurianual o anual
Generalidades:
- Destaca por su rpida germinacin y una alta resistencia al pisoteo.
- Crece en todo tipo de suelos, mejor en terrenos hmedos y frtiles, pero tolera los suelos pesados.
- Extraordinaria densidad y excelente comportamiento estival e invernal, con un color oscuro y un
aspecto esttico del mejor nivel.
- No se adapta bien la sequia hay que regar bastante
- Es altamente exigente en agua y Nitrgeno
- La altura de corte aconsejable es de 2 a 4 cm
- Planta que ha demostrado ser apropiada para la multiplicacin de HMA (Molina et al 2006).


ANEXOS
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,+


1. Desechar el alcohol de las races y enjuagar con agua de grifo.
2. Cortar segmentos de aproximadamente 1cm de longitud y colocarlos en tubos
eppendorf de 1,5ml
3. Adicionar KOH al 10% a las races y poner en el bloque calentador a 45C
durante 15-20 minutos. Enjuagar 3 veces con agua de grifo.
4. Adicionar HCl al 10% durante 1 minuto a temperatura ambiente
5. Desechar el HCl y sin lavar, agregar el azul de metileno al 0,05% a 45C durante
15 minutos.
6. Pasado el tiempo de tincin se sacan las races y se colocan en un portaobjetos
limpio, agregndoles una gota de Polivinyl-lactoglycerol.
7. Evaluar en el microscopio.


MODIFICACIN DEL MTODO DE PHILLIPS Y HAYMAN, (1974)
PARA LA CLARIFICACIN Y TINCIN DE RACES.

ANEXO 2



ANEXOS
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,,


DISTRIBUCIN DE LAS PLANTAS EN EL INVERNADERO

ANEXO 3






















%13BC9

D#4:9E#36C74

F:7G13 *
F:7G13 )

Cinchona pubescens Cinchona officinalis

F:7G13 !
Cada bolita (de las grandes) es una repeticin y representa una de las bolitas de color rojo o
amarillo de arriba.
En cada repeticin estn todos los tratamientos y cada tratamiento tiene tres replicas (es
decir tres plantas). Un total de 12 plantas.




ANEXOS
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,-


FOTOS DEL ENSAYO


ANEXO 4


MUCL41833 - Cinchona pubescens






Vesculas.

Hifas
Hif.
Arbsculos,


ANEXOS
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,=

MUCL41833 - Cinchona officinalis












ANEXOS
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,;

Inculo de Galpagos - Cinchona pubescens



Inculo de Galpagos - Cinchona officinalis








ANEXOS
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,>


Fertilizante - Cinchona officinalis Fertilizante - Cinchona pubescens


Blanco - Cinchona pubescens Blanco - Cinchona officinalis














ANEXOS
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-(


ESTIMACIN DE LA MICORRIZACIN
SEGN TROUVELOT et al., 1986

ANEXO 5









ANEXOS
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-!


MODIFICACIN DEL MTODO DE TAMIZADO HMEDO Y
DECANTACIN PARA LA SEPARACIN DE ESPORAS DEL SUELO
(Gerdeman Y Nicolson, 1963), EN COMBINACIN CON LA TCNICA
DE FLOTACIN EN AZCAR (Walker, 1997)


ANEXO 6


1. Pesar 100 g de suelo seco
2. Colocarlo en un vaso de precipitados, agregar agua y agitar vigorosamente
3. Dejar reposar de 5- 10 segundos y pasar el sobrenadante en un serie de tamices ordenados
del mayor a menor (500,125 y 40 !m ) repetir el proceso hasta que el agua salga clara.
4. Recoger el contenido retenido del tamiz de 125 y 40 !m y colocarlos en tubos para
centrifuga, agregarles sacarosa al 70%.
5. Centrifugar entre 1500 y 2000 rpm, durante 5 minutos
6. Dejar descansar los tubos en esa misma posicin para permitir que las esporas floten en la
solucin.
7. Verter el sobrenadante en el tamiz de 40!m y enjuagar con abundante agua para eliminar
los restos de sacarosa de la muestra.
8. El material retenido en el tamiz ser debidamente etiquetado y analizado bajo el
estereoscopio.



a) Mtodo de tamizado b) Obtencin de esporas c) Espora viable de Scutellospora
savanicola.
. 3

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