La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras

clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color morado. y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella Recoger muestras. Hacer el extendido en espiral. Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las clulas gram positivas se tien de color azul-prpura. Enjuagar con agua. Agregar lugol y esperar entre 1 minuto. Enjuagar con agua. Agregar alcohol acetona y esperar 30 segundos (parte crtica de la coloracin). Enjuagar con agua. Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1 minuto. Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.

Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin.

Explicacin
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugoles un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o lafucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina). Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de

violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de prosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram. Los representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina. El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-prosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de Gram. La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas. Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente: El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gramnegativas, los lpidos de la pared (ms abundantes que en las clulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teora, pero es indudable la importancia general de la pared celular. Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanismo de la tincin de Gram. Stearn (1923) bas la suya en una combinacin qumica entre el colorante y las protenas de las bacterias, Las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con cidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones cidas, reaccionan con los cidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias obedece en gran parte a su contenido protenico; estos

microorganismos se conducen como cuerpos anfteros, al combinarse con colorantes cidos en soluciones cidas y con los bsicos en medio alcalino. La combinacin con ambos tipos de colorante no se produce en el punto isoelctrico. Como los microorganismos contienen ms de una protena, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye ms bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Segn Stern y Stearn, los microorganismos grampositivos tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones: Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad. Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes cidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad. Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez. En la zona isoelctrica caracterstica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante. Parece estar bien demostrado que las protenas de las bacterias no son simples, sino ms bien una dbil combinacin de sustancias protenicas con otras lipoideas o grasas. La materia grasa extrada de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una proporcin mucho mayor de cidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloracin Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carcter ms cido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes bsicos. El cambio de respuesta a la coloracin de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos dbilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reaccin se vuelve cida en el curso del desarrollo.

Gianni (1952) comprob que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reaccin. Otra explicacin de la reaccin de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un ncleo gramnegativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reaccin grampositiva depende de que se forme una combinacin compleja entre los componentes de la coloracin de Gram y las protenas de la pared celular, sera de esperar que las bacterias desintegradas por medios fsicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podra cambiar el carcter qumico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los grmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram. La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la clula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusin celular exenta de protenas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinin de que la reaccin grampositiva consiste esencialmente en la

formacin, dentro de la clula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difcil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los microorganismos grampositivos, a diferencia de la de los gramnegativos, sera prcticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecern teidos despus de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminar sin dificultad el complejo formado despus del tratamiento con yodo. Ni los grupos sulfhidrilo ni las protenas bsicas han influido especficamente en el mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloracin.

Fijar un frotis
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

Tincin
Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C.

Enjuague
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1% .

Mordiente
Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante un minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijacin en las bacterias.

Decoloracin (paso critico)

Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul.

Lavado y secado
Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.

Tincin de contraste
Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.

Nuevo enjuague
Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica. BACTERIAS RESISTENTES A LA TINCION DE GRAM Las siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tien como gramnegativas: Mycobacterias (estn encapsuladas). Mycoplasmas (no tienen pared). Formas L (prdida ocasional de la pared). Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).