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CAPTULO 2.3.4.

INFLUENZA AVIAR

RESUMEN
La influenza aviar (IA), est causada por virus especficos de la influenza del grupo A que son miembros de la familia Orthomyxoviridae y pertenecen al gnero influenzavirus A. Existen tres tipos de influenza A, B y C; slamente infectan las aves los influenzavirus de tipo A. El diagnstico se realiza mediante el aislamiento o deteccin y la caracterizacin del virus. Ello se debe a que las infecciones en las aves pueden dar lugar a una amplia variedad de signos clnicos dependiendo del hospedador, la cepa de virus, el estado inmune del hospedador, la presencia de algn microorganismo secundario exacerbante y las condiciones ambientales. Identificacin del agente: Se inoculan en la cavidad alantoidea de embriones de pollo de 9 11 das de edad suspensiones en una solucin de antibiticos obtenidas a partir de frotis orofarngeos o cloacales (o heces) recogidos de aves vivas, o de heces y muestras de rganos de aves muertas. Los embriones se incuban a 3537C durante 47 das. El lquido alantoideo de aquellos huevos que contienen embriones muertos o moribundos durante la incubacin y todos los embriones en el periodo final de incubacin se utilizan para determinar la presencia de actividad hemoaglutinante. La existencia de virus de la influenza tipo A puede confirmarse mediante un ensayo de inmunodifusin entre el virus concentrado y un antisuero frente a los antgenos de la nucleocpsida y/o de la matriz, que son comnes en todos los virus de la influenza tipo A. Recientemente, en ciertos casos, se ha sustituido el aislamiento en embriones por la reaccin en cadena de la polimerasa inversa (RT-PCR). Para realizar la subtipificacin del virus, el laboratorio debe poseer antisueros monoespecficos preparados frente a los antgenos aislados de cada uno de los 16 subtipos de hemoaglutinina (H1 H16) y 9 subtipos de neuraminidasa (N1N9) de los virus de la influenza tipo A, los cuales pueden utilizarse en ensayos de inmunodifusin. Alternativamente, el virus recin aislado puede examinarse mediante ensayos de inhibicin de la hemoaglutinacin y de la neuraminidasa frente a una serie de anticuerpos policlonales contra un amplio rango de cepas de todos los subtipos. Como los trminos influenza aviar muy virulenta y la denominacin histrica peste aviar se refieren a la infeccin con cepas virulentas del virus de la influenza tipo A, es necesario evaluar la virulencia de un aislamiento en aves domsticas. Cualquier aislamiento de la influenza aviar se clasifica como influenza aviar de declaracin obligatoria (IADO). Aunque todas las cepas aisladas hasta la fecha han pertenecido bien al subtipo H5 H7, la mayora de los aislamientos H5 H7 han mostrado una baja virulencia. Debido al riesgo de que un H5 o un H7 de baja virulencia se conviertan en virulentos por mutacin en aves hospedadoras, todos los virus H5 y H7 han sido clasificados como virus de la IADO. En los ltimos aos, han evolucionado los mtodos empleados para la determinacin de la virulencia de una cepa en las aves y existe una mayor comprensin de las bases moleculares de la patogenicidad, pero todava implican la inoculacin del virus infeccioso de un mnimo de ocho gallinas susceptibles de 48 semanas de edad; las cepas se consideran muy virulentas si causan ms del 75% de mortalidad en 10 das o tienen un ndice de patogenicidad intravenosa (IPIV) mayor de 1.2. La caracterizacin de las cepas del virus patgenas que son sospechosas debera realizarse en un laboratorio de seguridad vrica . Todos los aislamientos de IA se identifican como virus de la influenza aviar de declaracin obligatoria y muy virulenta (IAMVDO). Independientemente de su virulencia en los pollos, los virus H5 o H7 con una secuencia de aminocidos en el sitio de corte de la HAO similar a cualquiera de las observadas en los virus virulentos son considerados como IAMVDO. Los aislamientos de H5 y H7 que no son patgenos para los pollos y no tienen una secuencia de aminocidos en el sitio de corte de la HAO similar a cualquiera de las que se han observado los virus de la IAMVDO se identifican como virus de la influenza aviar de declaracin obligatoria y poco virulenta (IAPVDO) y

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los aislamientos de IA distintos de H5 o H7 que no son muy virulentos en los pollos se identifican como influenza aviar poco virulenta (IAPV). Pruebas serolgicas: Como todos los virus de la influenza tipo A poseen antgenos de la nucleocpsida y de la matriz similares, para detectar anticuerpos frente a estos antgenos, se emplean pruebas de inmunodifusin en gel de agar. En estas pruebas se utilizan preparaciones de virus concentradas que contengan uno o ambos tipos de antgeno. No todas las especies de aves desarrollan anticuerpos precipitantes demostrables. Los ensayos de inhibicin de la hemoaglutinacin tambin se han empleado en la serologa diagnstica de rutina, aunque es posible que esta tcnica no detecte algunas infecciones concretas debido a que la hemoaglutinina es especfica del subtipo vrico. Se han empleado los enzimoinmunoensayos para detectar anticuerpos frente a antgenos especficos del virus de la influenza tipo A. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Histricamente, en la mayora de los pases las vacunas diseadas especficamente para contener o prevenir la IAMVDO se encuentran prohibidas o estn desaconsejadas por las agencias gubernamentales porque pueden interferir con las polticas de control o eliminacin de la enfermedad. Durante la dcada de 1990 en Mxico y Pakistn se utilizaron profilcticamente vacunas inactivadas mediante emulsin con aceites para controlar brotes generalizados de IADO, y en Mxico, El Salvador y Guatemala, tambin se utiliz, en pruebas de campo, una vacuna recombinante del virus de la viruela aviar que expresaba un gen HA homlogo. Durante el brote de IAPVDO de 19992001 en Italia, se utiliz una vacuna inactivada del mismo tipo de hemoaglutinina que el virus silvestre, pero con una neuraminidasa diferente. Ello permiti distinguir entre las aves vacunadas y las infectadas con el virus silvestre y eventualmente desemboc en la erradicacin del virus silvestre. Se ha llevado a cabo el uso profilctico de vacunas contra H5 y H7 en zonas de Italia para prevenir las infecciones por IAPVDO y varios pases del sureste asitico han utilizado la vacunacin profilctica para controlar las infecciones por el H5N1 de la IAPVDO. Los virus de la IAMVDO no deberan usarse como inculo en la produccin de vacunas. Si la IAMVDO se utiliza en estudios de sensibilizacin, la instalacin debera cumplir los requisitos de la OIE para la Contencin de los patgenos del Grupo 4.

A. INTRODUCCIN
La influenza aviar de declaracin obligatoria (IADO) est causada por virus del tipo A de la familia Orthomyxoviridae, del gnero influenzavirus A. Los virus de la influenza tipo A son los nicos ortomixovirus conocidos que afectan a las aves. Se ha demostrado que muchas especies de aves son susceptibles a la infeccin con los virus de la influenza tipo A; las aves acuticas constituyen el reservorio mayoritario de estos virus, pero una abrumadora mayora de los aislamientos han sido poco virulentos en pollos y pavos. Los virus de la influenza tipo A poseen protenas de la nucleocpsida y de la matriz antignicamente relacionadas entre s, aunque se clasifican en subtipos en base a los antgenos de hemoaglutinina (H) y neuraminidasa (N) (80). En la actualidad se reconocen 16 subtipos H (H1H16) y 9 subtipos N (N1N9). Hasta la fecha, los virus muy virulentos de la influenza tipo A, que producen una enfermedad clnica aguda en los pollos, pavos, y otras aves econmicamente importantes, solamente se han asociado con los subtipos H5 y H7. La mayora de los virus del subtipo H5 y H7 aislados a partir de aves han sido poco virulentos en las aves de corral (2). Debido al riesgo de que los virus H5 y H7 de baja virulencia se conviertan en virulentos por mutacin, todos los virus H5 y H7 han sido identificados como virus de la influenza aviar de declaracin obligatoria (IADO) (81). Dependiendo de la especie, la edad y el tipo de ave, los rasgos caractersticos de la cepa vrica implicada y los factores ambientales, la enfermedad muy virulenta que afecta a las aves totalmente susceptibles puede variar desde una muerte sbita con pocos signos clnicos o sin signos patentes, hasta una enfermedad ms caracterstica con manifestaciones clnicas variadas, que incluyen sntomas respiratorios, secreciones oculares y nasales, tos y disnea, hinchazn de los senos y/o la cabeza, apata, disminucin del canto, disminucin de la ingesta de agua y de alimentos, cianosis de la piel no cubierta de plumas, la barba y la cresta, signos de descoordinacin y nerviosismo y diarrea. Otras manifestaciones clnicas de los pavos yacentes son el descenso de la puesta de huevos y su escasa calidad. Lo normal es que la alta morbilidad vaya acompaada por un rpido e inexplicable aumento de la mortalidad. Sin embargo, ninguno de estos signos puede considerarse patognomnico. Adems, los virus de la influenza aviar poco virulenta (IAPV), que normalmente solo causan la enfermedad leve o no clnica, pueden producir, en determinadas circunstancias, una gama de sntomas cuya gravedad se acerca a la de la influenza aviar muy virulenta, sobre todo si van acompaados de infecciones exacerbantes. De ah que el diagnstico confirmativo de la enfermedad dependa del aislamiento del virus causal y de la demostracin de que cumple con uno de los criterios definidos en la seccin B.2. Eso se puede lograr en

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algunas circunstancias especficas mediante la deteccin del virus en el hospedador infectado, sobre todo, mediante tcnicas moleculares que permitan la determinacin de la virulencia del virus. La comprobacin de los sueros de las aves sospechosas empleando mtodos de deteccin de anticuerpos puede complementar el diagnstico, aunque estos mtodos no son adecuados para una identificacin detallada. El diagnstico con vistas a un control oficial se establece en base a los criterios de patognesis acordados oficialmente, de acuerdo con ensayos in-vivo o determinantes moleculares (p. ej. la presencia de muchos aminocidos bsicos en el sitio de corte de la protena precursora de la hemoaglutinina HAO) y la tipificacin de la hemoaglutinina. Estas definiciones evolucionan a medida que aumenta del conocimiento cientfico de la enfermedad. La IAMV y la IADO est sometidas a un control oficial y el virus presenta un gran riesgo de diseminacin fuera del laboratorio; en consecuencia, debera realizarse una valoracin de riesgos para determinar el nivel de bioseguridad necesario para el diagnstico de laboratorio y la vacunacin de los pollos; la caracterizacin del virus debera realizarse por lo menos de acuerdo al nivel 3 de biocontencin. La instalacin debera cumplir los requisitos para el grupo de contencin adecuado, determinado mediante la valoracin del riesgo, como se resume en del captulo 1.1.2. Bioseguridad y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa y en las instalaciones de los animales. Los pases que carezcan de un laboratorio nacional o regional especializado deberan enviar sus muestras a un laboratorio de referencia de la OIE.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente (Prueba prescrita para el comercio internacional)

Las muestras recogidas a partir de las aves deberan incluir el contenido intestinal (heces) o frotis cloacales y orofarngeos. Las muestras de la trquea, pulmones, sacos areos, intestino, bazo, rin, cerebro, hgado y corazn tambin deben recogerse y procesarse, bien separada o conjuntamente. Las muestras de aves vivas deberan incluir frotis orofarngeos y cloacales. Para evitar daar a las aves pequeas y frgiles, los frotis pueden realizarse mediante torundas pequeas que suelen estar disponibles en el mercado para su uso en humanos. Si no estn disponibles, la recogida de las heces puede servir como una alternativa adecuada. Las muestras deberan colocarse en tampn salino fosfato isotnico (PBS), pH 7,07,4, con antibiticos o con una solucin que contenga protena y antibiticos. Los antibiticos pueden modificarse de acuerdo con los condicionantes locales, pero podran ser, por ejemplo, penicilina (2.000 unidades/ml), estreptomicina (2 mg/ml), gentamicina (50 g/ml) y micostatina (1.000 unidades/ml) para los tejidos y los frotis orofarngeos, pero a una concentracin cinco veces mayor para las heces y los frotis cloacales. Es importante reajustar el pH de la solucin hasta un pH 7,07,4 despus de la adicin de los antibiticos. Se recomienda que la solucin utilizada para el transporte de los frotis contenga protena para estabilizar el virus (ej. Infusin cerebrocorazn, suero de ganado hasta un mximo del 5% [v/v] o albmina bovina 0,5% [p/v]). Deberan prepararse las heces y los tejidos finamente picados como suspensiones del 1020% (p/v) en la solucin de antibiticos. Las suspensiones deberan procesarse lo antes posible despus de la incubacin durante 12 horas a temperatura ambiente. Cuando no se pueda realizar el procesado inmediato, pueden guardarse las muestras a 4C hasta 4 das. Para un almacenamiento prolongado, las muestras de diagnstico y los aislamientos deberan guardarse a 80C. Debe evitarse la repeticin de la congelacin y descongelacin. El mtodo preferido para el cultivo de los influenzavirus de tipo A es la inoculacin de embriones de pollo libres de patgenos especficos (SPF), o embriones libres de anticuerpos especficos (SAN). Los lquidos sobrenadantes de las heces o las suspensiones de tejidos obtenidos mediante clarificacin por centrifugacin a 1.000 g se inoculan en la cavidad alantoidea de al menos 5 embriones de aves SPF o SAN con 911 das de incubacin. Los embriones se incuban a 3537C durante 47 das. Los huevos que contienen embriones muertos o moribundos, y todos los embriones restantes al final del periodo de incubacin, deberan en primer lugar enfriarse hasta los 4C, y entonces los fluidos alantoideos deberan estudiarse para determinar la presencia de actividad hemoaglutinante (HA) (ver seccin B.3.b.). La deteccin de la actividad HA en los lquidos aminoalantoideos libres de bacterias indica una alta probabilidad de la presencia de un virus de la influenza tipo A o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que dan una reaccin negativa deberan pasarse en, al menos, uno o ms lotes de embriones de pollo. Puede confirmarse la presencia del virus de la influenza tipo A mediante pruebas de inmunodifusin en gel de agar (IGDA), demostrando la presencia de los antgenos de la nucleocpsida o la matriz, siendo ambos comunes a todos los virus de la influenza tipo A (vase la seccin B.3.a.). Los antgenos pueden preparase concentrando el virus a partir del lquido alantoideo infectivo o extrayendo las membranas corioalantoideas infectadas; estas se prueban frente a antisueros positivos conocidos. Los virus pueden concentrarse a partir del lquido alantoideo infectivo mediante ultracentrifugacin, o mediante precipitacin en ambiente cido. Este ltimo mtodo consiste en la adicin de HCl 1,0 M al lquido alantoideo infectivo hasta que alcance aproximadamente un pH de 4,0. La

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mezcla se coloca en un bao con hielo durante 1 hora y entonces se clarifica mediante centrifugacin a 1.000 g a 4C. Se descarta el lquido sobrenadante. Los concentrados vricos se resuspenden en tampn glicina/sarcosil: este consiste en un 1% de lauril sarcosinato sdico tamponado hasta pH 9,0 con glicina 0,5 M. Estos concentrados contienen polipptidos de la nucleocpsida y de la matriz. Las preparaciones del antgeno enriquecido en nucleocpsida tambin pueden obtenerse a partir de las membranas corioalantoideas para su uso en el ensayo IGDA (7). Este mtodo implica retirar las membranas corioalantoideas de los embriones infectados que presentan lquidos alantoideos con actividad HA. Entonces las membranas se homogeneizan o se trituran hasta obtener una pasta. Esta se somete a tres ciclos de congelacindescongelacin, seguido de una centrifugacin a 1.000 g durante 10 minutos. Se desecha el precipitado y se emplea el sobrenadante como antgeno despus de un tratamiento con formalina al 0,1%. La utilizacin de la prueba IGDA para demostrar los antgenos de la nucleocpsida o la matriz constituye una forma satisfactoria de indicar la presencia de virus de la influenza aviar en el lquido amnioalantoideo, aunque actualmente estn disponibles varios enzimoinmunoensayos (ELISA). Existe un ELISA sensible y especfico que demuestra la nucleoprotena del virus de la influenza tipo A empleando un anticuerpo monoclonal frente a la nucleoprotena de este virus (47, 49, 64). Se encuentra disponible como un kit comercial. Cualquier actividad de HA en los fluidos estriles concentrados a partir de los embriones inoculados es debida, muy probablemente, a un virus de la influenza tipo A o a un paramixovirus aviar (unas cuantas cepas de reovirus aviar pueden dar esta reaccin, o el fluido no estril podra contener HA de origen bacteriano). Actualmente existen nueve serotipos reconocidos del paramixovirus aviar. La mayora de los laboratorios dispondrn de antisuero especfico frente al virus de la enfermedad de Newcastle (paramixovirus aviar tipo 1), y en vista de su existencia ampliamente generalizada y uso casi universal como vacuna viva en las aves de corral, es mejor evaluar su presencia mediante ensayos de inhibicin de la hemoaglutinacin (HI) (vase el captulo 2.3.14. La enfermedad de Newcastle). Alternativamente, la presencia del virus de la influenza puede confirmarse mediante el empleo de la reaccin en cadena de la polimerasa de transcripcin inversa (RT-PCR) empleando cebadores conservados especficos de la nucleoprotena o especficos de la matriz (3, 53). La presencia de los subtipos H5 H7 del virus de la influenza tambin puede confirmarse utilizando cebadores especficos de los subtipos H5 H7 (21, 46, 53, 79). El mtodo recomendado por el Comit de Expertos de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) (80) para la subtipificacin antignica definitiva de los virus de la influenza tipo A implica la utilizacin de antisueros muy especficos dirigidos contra los subtipos H y N (45), y preparados en un animal que ofrezca un mnimo de reacciones inespecficas (p.ej. la cabra). Una tcnica alternativa consiste en el uso de antisueros policlonales obtenidos frente a una serie de virus de la influenza intactos. La identificacin del subtipo mediante esta tcnica se encuentra fuera del alcance de la mayora de los laboratorios de diagnstico no especializados en el virus de la influenza. Existe ayuda disponible por parte de los laboratorios de referencia de la OIE (vase el cuadro que se muestra en la parte 3 de este Manual de animales terrestres).

2.

Evaluacin de la virulencia

El trmino influenza aviar muy virulenta se relaciona con la valoracin de la virulencia en los pollos y la implicacin de cepas muy virulentas del virus. Se utiliza para describir una enfermedad de las aves plenamente susceptibles con signos clnicos tales como descargas oculares y nasales, tos, y disnea, hinchazn de los senos y/o de la cabeza, apata, disminucin del canto, una disminucin considerable de la ingesta de comida y bebida, cianosis de la porcin de piel sin plumas, de las barbas y de la cresta, descoordinacin de movimientos y nerviosismo, y diarrea. Otras manifestaciones clnicas de los pavos yacentes son el descenso de la puesta de huevos y la pobre calidad de los mismos. Lo normal es que la alta morbilidad vaya acompaada por un rpido e inexplicable aumento de la mortalidad. Sin embargo, ninguno de estos signos puede considerarse patognomnico y puede producirse una mortalidad sin que dichos signos estn presentes. Adems los virus de la influenza aviar poco virulenta (IAPV), que normalmente no causan enfermedad o causan una enfermedad leve, pueden causar una enfermedad mucho ms grave si se hallan presentes infecciones exacerbantes o factores ambientales adversos y, en algunas circunstancias, la gama de sntomas clnicos puede ser idntica a la de la influenza aviar muy virulenta. En el Primer Simposio Internacional sobre la Influenza Aviar celebrado en 1981 (5), se decidi abandonar el trmino peste aviar y definir a las cepas muy virulentas de la influenza aviar teniendo en cuenta su capacidad para producir no menos de un 75% de mortalidad en 8 das, en al menos ocho pollos susceptibles de 48 semanas de edad e inoculados por va intramuscular, intravenosa o en el saco areo caudal. Sin embargo esta definicin result poco adecuada cuando se aplic a los virus responsables de los brotes extensos surgidos en gallinas en 1983 en Pensilvania y los estados circundantes de los EEUU. El problema fue causado principalmente por la presencia de un virus con baja patogenicidad, demostrada en ensayos de laboratorio, pero que mostr ser muy patgeno despus de sufrir una mutacin puntual. Despus de considerarlo detenidamente, varios grupos internacionales asumieron consideraciones posteriores para incluir a tales virus como potencialmente patgenos.

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Las consideraciones finales llevadas a cabo se basaron en el hecho de que, mientras que se han producido numerosos aislamientos de cepas de los subtipos H5 y H7 de baja patogenicidad, todas las cepas de la influenza aviar de alta patogenicidad aisladas hasta la fecha han presentado hemoaglutinina bien de tipo H5 H7. Puede obtenerse ms informacin relativa a la patogenicidad potencial de los subtipos H5 H7 secuenciando su genoma, ya que la patogenicidad se encuentra asociada con la presencia de mltiples aminocidos bsicos (arginina o lisina) en el sitio de corte de la hemoaglutinina. Por ejemplo, la mayora de los virus del subtipo H7 con baja virulencia han presentado los motivos de aminocidos en el sitio de corte de la HA0 -PEIPKGR*GLF- o -PENPKGR*GLF-, mientras que algunos ejemplos de motivos de aminocidos en los virus de la influenza aviar muy virulenta (o virus IAMV) H7 son: -PEIPKKKKR*GLF-, PETPKRKRKR*GLF, -PEIPKKREKR*GLF-, y -PETPKRRRR*GLF-. La secuenciacin de aminocidos del sitio de corte en los aislamientos de virus de la influenza con baja virulencia en aves de los subtipos H5 y H7 permitira identificar los virus que, como el virus Pennsylvania, tienen la capacidad de convertirse en muy patgenos para las aves de corral despus de sufrir una mutacin puntual. En 1992, la OIE adopt criterios para clasificar los virus de la influenza aviar como muy patgenos, basndose en la patogenicidad en pollos, crecimiento en cultivo celular y la secuencia de aminocidos para la pptida conectada (41), La Unin Europea adopt criterios similares en 1992 (16). La OIE ha adoptado los siguientes criterios, que constituyen una modificacin del procedimiento previo de la Organizacin, para la clasificacin del virus de la influenza aviar como IAMVDO: a) Se utiliza uno de los dos mtodos siguientes para determinar la patogenicidad en los pollos. Un virus IAMVDO es: i) Cualquier virus que es letal1 para seis, siete u ocho gallinas susceptibles de 48 semanas de edad durante 10 das despus de la inoculacin intravenosa con 0,2 ml de una dilucin 1/10 de lquido alantoideo infectivo libre de bacterias o ii) Cualquier virus que tenga un ndice de patogenicidad intravenosa 1.2. El procedimiento el IPIV es como sigue: Se diluye 1/10 en tampn salino estril el fluido alantoideo fresco con un ttulo >1/16 (>2 o > log2 4 expresado como el inverso). Se inyectan 0,1 ml del virus diluido intravenosamente en diez pollos SPF o SAN de 6 semanas de edad. Las aves se examinan en intervalos de 24 horas durante 10 das. Durante cada observacin cada ave se punta como 0 si se encuentra normal, 1 si est enferma, 2 si est muy enferma, 3 si se ha muerto. (El juicio sobre las aves enfermas o muy enfermas es una valoracin clnica subjetiva. Normalmente, las aves enfermas deberan manifestar uno de los siguientes sntomas, y las muy enfermas ms de uno: afectacin respiratoria, depresin, diarrea, cianosis en la piel expuesta o en las barbas, edema en la cara y/o en la cabeza, sntomas nerviosos. Las aves muertas deben puntuarse como 3 en cada uno de los das siguientes de observacin despus de la muerte2.) El ndice de patogenicidad intravenosa (IPIV) es la puntuacin media por ave por observacin durante un periodo de 10 das. Un ndice de 3,00 significa que todas las aves murieron en 24 horas, y un ndice de 0,00 significa que ninguna ave mostr signo clnico alguno durante los 10 das del periodo de observacin.
4

b)

Para todos los virus H5 y H7de baja virulencia en pollos, debe determinarse la secuencia de aminocidos de la pptida de conexin de la hemoaglutinina. Si la secuencia es similar a la observada para otros aislamientos de IA muy virulenta, los aislamientos de ensayo deben considerarse como muy virulentos (http://www.offlu.net/OFFLU%20Site/Projects/Table%20HPAI%20cleavage%20site%20sequences.pdf).

La OIE tiene el siguiente sistema de clasificacin para identificar los virus en torno a los cuales se debern tomar medidas para la informacin sobre la enfermedad y su control (81): a) Todos los aislamientos de IA que cumplen con los criterios anteriores se identifican como influenza aviar muy virulenta y de declaracin obligatoria y (IAMVDO)

1 2

Cuando las aves estn demasiado enfermas para comer o beber, deben sacrificarse de forma humanitaria. Cuando las aves estn demasiado enfermas para comer o beber, deben sacrificarse de forma humanitaria y computarse como muertas en la siguiente observacin.

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b)

Los aislamientos H5 y H7 que no son virulentos para los pollos y no tienen una secuencia de aminocidos en el sitio de corte de la HAO similar a la de los observados para los virus de la IAMVDO, se identifican influenza aviar poco virulenta de declaracin obligatoria (IAPVDO). Los aislamientos distintos de H5 o H7 que no sean virulentos para los pollos se identifican como influenza aviar poco virulenta (IAPV).

c)

Se han empleado con xito una variedad de tcnicas y estrategias para secuenciar los nucletidos de la regin del gen HA que codifica la regin del sitio de corte de la hemoaglutinina de los subtipos H5 y H7 del virus de la influenza aviar, lo que permite deducir los aminocidos presentes. El mtodo utilizado con mayor frecuencia ha sido la RT-PCR, empleando parejas de cebadores complementarios a zonas del gen a cada lado de la regin codificadora del sitio de corte, seguido de la secuenciacin directa (78). Pueden facilitarse varias fases del protocolo empleando sistemas comerciales y secuenciadores automticos. Ahora que la presencia de mltiples aminocidos bsicos en el sitio de corte de la HA se ha establecido como un indicador preciso de la virulencia efectiva o potencial de los virus de la influenza H5 y H7, parece inevitable que la determinacin del sitio de corte mediante secuenciacin u otros mtodos se convertir en el mtodo preferido para la valoracin inicial de la virulencia de estos virus, y se incorporar en las definiciones acordadas. Ello permitir reducir el nmero de ensayos in vivo, aunque, en la actualidad, todava se requerira la inoculacin de las aves para confirmar un resultado negativo, ya que no puede desecharse la posibilidad de la existencia de cultivos vricos que contengan poblaciones mixtas de virus con mucha y con poca virulencia. Aunque los verdaderos virus de la IAMV aislados hasta la fecha han pertenecido a los subtipos H5 H7, se ha descrito que al menos dos aislamientos, ambos del subtipo H10 (H10 N4 y H10 N5), habran cumplido las definiciones de la OIE y la UE para los virus de la IA muy virulenta (IAMV) (76), ya que mataron 7/10 y 8/10 pollos con valores IPIV>1,2 cuando las aves se inocularon por va intravenosa. Estos virus no produjeron muertes o sntomas de la enfermedad cuando se inocularon intranasalmente, y no presentaron mltiples aminocidos bsicos en sus sitios de corte de la hemoaglutinina. Parece que algunos virus de la IA de tipo H10 son nefrotrpicos y las aves que mueren tienen virus con un ttulo alto en los riones, lo que indica un mecanismo renal patgeno (50). A la inversa, se han descrito cuatro virus que tienen sitios de corte HAO que contienen muchos aminocidos basicos, pero que muestran una baja virulencia (IPIV <1.2) cuando se inyectan por va intravenosa en pollos de 6 semanas (33). Otras anomalas son las representadas por los virus de la IAMV H7N3 de Chile 2002 (57) y de Canada 2004 (42), que muestran secuencias distintas e inusuales de aminocidos en el sitio de corte de PEKPKTCSPLSRCRETR*GLF y PENPKQAYRKRMTR*GLF, respectivamente.Parece que estos virus han aparecido como resultado de una recombinacin entre el gen HA y los genes de la nucleoprotena y de la matriz, respectivamente, lo que tiene como efecto la insercin de 11 aminocidos en el sitio de corte de la HA0 en el caso del virus chileno, y de 7 aminocidos en el caso del virus canadiense. Los dos son extremadamente virulentos cuando se inyectan por va intravenosa en pollos de 6 semanas de edad.

3.
a)

Pruebas serolgicas
Inmunodifusin en gel de agar (prueba alternativa para el comercio internacional)
Todos los virus de la influenza poseen antgenos de la nucleocpsida antignicamente similares y antgenos de la matriz antignicamente similares. Este hecho permite detectar la presencia o ausencia de anticuerpos frente a cualquier virus de la influenza mediante ensayos IGDA. Las preparaciones concentradas de virus, como se describi anteriormente, contienen antgenos de la matriz y la nucleocpsida; el antgeno de la matriz difunde ms rpidamente que el antgeno de la nucleocpsida. Los ensayos IGDA se han empleado extensa y rutinariamente para detectar anticuerpos especficos en parvadas de pollos o pavos como un indicador de la existencia de la infeccin. Generalmente, estos ensayos han utilizado preparaciones enriquecidas de nucleocpsida obtenidas a partir de las membranas corioalantoideas de embriones de pollo (7) que han sido infectados a los 10 das de edad, se han homogeneizado, congelado y descongelado tres veces, y centrifugado a 1.000 g. Los fluidos sobrenadantes se inactivan mediante la adicin de formalina al 0,1% o betapropiolactona al 1%, se centrifugan de nuevo y se utilizan como antgeno. No todas las especies de aves pueden producir anticuerpos precipitantes despus de la infeccin con el virus de la influenza. Normalmente, los ensayos se realizan empleando geles de agarosa al 1% (p/v) o agar purificado con un 8% (p/v) de NaCl en tampn fosfato 0,1M, pH 7,2, que se vierten en placas de Petri o en portaobjetos hasta obtener un grosor de 23 mm. Se cortan pocillos en el agar de aproximadamente 5 mm de dimetro y separados 25 mm empleando un molde y un cter. Usando un patrn para los pocillos, debe colocarse cada suero sospechoso al lado de un suero y antgeno positivo conocido. Ello crear una lnea continua de identidad entre el control positivo conocido, el suero sospechoso y el antgeno de la nucleocpsida. Deberan aadirse a cada pocillo aproximadamente 50 l de cada reactivo.

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Las lneas de precipitina pueden detectarse despus de aproximadamente 2448 horas, aunque esto puede depender de las concentraciones de anticuerpo y antgeno. Estas lneas se observan mejor frente a un fondo oscuro iluminando por detrs. Se considera un resultado especfico positivo cuando la lnea de precipitina entre el pocillo del control positivo es continua con la lnea entre el antgeno y el pocillo problema. Las lneas cruzadas se interpretan como debidas a un suero problema que carece de identidad con los anticuerpos del pocillo del control positivo.

b)

Ensayos de hemoaglutinacin e inhibicin de la hemoaglutinacin


En diferentes laboratorios se realizan distintas variantes de los protocolos de los ensayos de HA y HI. Los siguientes ejemplos recomendados se basan en el uso de placas de micropocillos de plstico con el fondo en V, y en las que el volumen final para ambos ensayos es de 0,075 ml. Los reactivos necesarios para realizar estos ensayos son PBS isotnico (0,01 M), pH 7,07,2, y hemates (RBC) obtenidos a partir de un mnimo de tres pollos SPF o SAN y resuspendidos en un volumen igual de solucin de Alsever. Las clulas deberan lavarse tres veces en PBS antes de emplearse como una suspensin al 1% (clulas concentradas v/v). Cuando sea adecuado deberan utilizarse en cada ensayo antgenos y sueros control positivos y negativos. i) ii) Ensayo de hemoaglutinacin Se distribuye 0,025 ml de PBS en cada pocillo de un placa de microensayo de plstico con el fondo en V. Se coloca 0,025 ml de la suspensin vrica (p.ej. fluido alantoideo infectivo) en el primer pocillo. Para una determinacin precisa del contenido de HA, debera realizarse a partir de un rango estrecho de una serie de diluciones, p.ej. 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, etc. Se preparan y distribuyen diluciones medias de 0,025 volmenes de la suspensin vrica en toda la placa. Se distribuye 0,025 ml ms de PBS en cada pocillo. Se reparte 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v) en cada pocillo. Se mezcla cuidadosamente tapando la placa y se dejan sedimentar los RBC durante 40 minutos a temperatura ambiente, p.ej. 20C, o durante 60 minutos a 4C si la temperatura ambiente es elevada, por lo que los RBC deberan sedimentarse hasta observar un botn ntido. La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de arrastre de los RBC con forma de gota. El ttulo debera leerse como la dilucin ms alta que da lugar a una HA completa (ausencia de arrastre); esto representa 1 unidad HA (UHA) y puede calcularse de manera precisa a partir del rango inicial de las diluciones. Ensayo de inhibicin de la hemoaglutinacin (prueba alternativa para el comercio internacional) Se distribuye 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulacin con fondo en V. Se coloca 0,025 ml de suero en el primer pocillo de la placa. Se preparan y distribuyen diluciones medias de 0,025 volmenes de suero en toda la placa. Se aaden 4UHA de virus/antgeno en 0,025 ml a cada pocillo y se dejan durante un mnimo de 30 minutos a temperatura ambiente (p. ej. unos 20C) o 60 minutos a 4C. Se aade 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v) en cada pocillo y, despus de mezclar cuidadosamente, se dejan sedimentar los RBC durante unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. 20C, o durante 60 minutos a 4C si la temperatura ambiente es elevada, por lo que los RBC deberan sedimentarse hasta observar un botn ntido. El ttulo HI es la dilucin ms alta de suero que ocasiona la inhibicin completa de 4 UHA de antgeno. La aglutinacin se valora inclinando las placas. Solamente en aquellos pocillos en los que los RBC se arrastran en la misma proporcin que los pocillos control (que contienen solo 0,025 ml de RBC y 0,05 ml de PBS) debera considerarse que presentan inhibicin. La validez de los resultados debera evaluarse frente a un suero control negativo, el cual no debera producir un ttulo >1/4 (>22 o >log2 2 expresado como el inverso), y un suero control positivo en el que el ttulo debera encontrarse dentro de una dilucin del ttulo conocido.

iii) iv) v) vi)

vii)

i) ii) iii) iv) v)

vi)

vii)

Los ttulos HI pueden considerarse positivos si existe inhibicin a una dilucin del suero de 1/16 (24 o log2 4 expresado como el inverso) o ms alta frente a un antgeno de 4UHA. Algunos laboratorios prefieren emplear 8UHA en los ensayos HI. Aunque est permitido, afecta a la interpretacin de los resultados de forma que un ttulo positivo es 1/8 (23 o log2 3) o ms alto. El significado de un ttulo positivo mnimo no

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debe ser malinterpretado; no implica, por ejemplo, que las aves inmunizadas con ese ttulo estn protegidas contra el desafo o que las aves con ttulos inferiores sean susceptibles al desafo. En este ensayo los sueros de las gallinas raramente dan lugar a reacciones positivas inespecficas, y por lo tanto no es necesario su pretratamiento. Los sueros de otras especies distintas a las gallinas pueden a veces causar la hemoaglutinacin de sus RBC, por lo que esta propiedad debera determinarse antes y eliminarse mediante adsorcin del suero con RBC de gallina. Se realiza aadiendo 0,025 ml de RBC concentrados de gallina a 0,5 ml de cada antisuero, agitando cuidadosamente y dejando reposar durante al menos 30 minutos; los RBC se precipitan mediante centrifugacin a 800 g durante 25 minutos y se decantan los sueros adsorbidos. Alternativamente pueden usarse los RBC de las aves investigadas. El ensayo de inhibicin de la neuraminidasa se ha utilizado para identificar el tipo de neuraminidasa IA de los aislamientos, y para caracterizar los anticuerpos en las aves infectadas. El procedimiento necesita unos conocimientos y reactivos especializados; en consecuencia este ensayo se realiza normalmente en un Laboratorio de Referencia de la OIE. La estrategia DIVA utilizada en Italia (distincin de los animales infectados de los vacunados) tambin se basa en el empleo de un ensayo serolgico para detectar anticuerpos especficos anti-N; se ha descrito el procedimiento del ensayo (12).

c)

Enzimoinmunoensayo (ELISA) (prueba alternativa para el comercio internacional)


Se encuentran disponibles sistemas comerciales ELISA que detectan anticuerpo frente a la protena de la nucleocpsida. Se han elaborado kits con un formato de ELISA indirecto y competitivo que se estn utilizando para detectar anticuerpos especficos contra el virus de la IA. Los kits deben validarse de forma especfica para cada especie que se vaya a ensayar. Se utilizan diferentes ensayos y mtodos de preparacin del antgeno. Normalmente, tales ensayos han sido evaluados y validados por el fabricante, y es por tanto importante que se sigan cuidadosamente las instrucciones especficas para su empleo.

4.

Captura de antgeno y tcnicas moleculares

En la actualidad, las tcnicas convencionales para el aislamiento, caracterizacin y diagnstico del virus de la influenza aviar continan siendo el mtodo elegido, al menos para el diagnstico inicial de las infecciones. Sin embargo los mtodos convencionales tienden a ser costosos, emplean numerosa mano de obra y son lentos. Se ha producido una gran evolucin y mejora de las tcnicas moleculares y de otras tcnicas diagnsticas, muchas de las cuales se han aplicado para el diagnstico de las infecciones de la influenza aviar.

a)

Deteccin del antgeno


Existen varios sistemas de captura de antgeno disponibles comercialmente para la deteccin de los virus de la influenza tipo A en las aves de corral (49). La mayora son enzimoinmunoensayos y utilizan un anticuerpo monoclonal frente a la nucleoprotena; deben ser capaces de detectar cualquier virus de la influenza del tipo A. La principal ventaja de estos ensayos consiste en que pueden demostrar la presencia de IA en 15 minutos. Las desventajas son que puede carecer de sensibilidad, pueden no haber sido validados para diferentes especies de aves, no se consigue la identificacin del subtipo vrico y es un sistema caro. Las pruebas deben interpretarse solo en la bandada como un colectivo y no individualmente. Las muestras orofarngeas o traqueales de aves clnicamente infectadas o muertas proporcionan la mejor sensibilidad. Sin embargo, la falta de sensibilidad constituye una importante desventaja para la utilizacin de las pruebas de deteccin de antgeno disponibles. Chua et al. (14) evaluaron cinco pruebas de deteccin y mostraron sensibilidades globales que oscilan entre el 36,3% y el 51,4%; los mencionados autores sealaron que, en trminos de la sensibilidad obtenida mediante el uso de frotis cloacales o traqueales, las pruebas arrojaron peores resultados con aves de agua o aves silvestres que con muestras procedentes de pollos.

b)

Deteccin directa del ARN


Aunque, como queda demostrado por las definiciones actuales de la IAMVDO, las tcnicas moleculares se han empleado para el diagnstico de la influenza aviar durante algn tiempo, recientemente se han producido avances para su aplicacin en la deteccin y caracterizacin de los virus de la influenza aviar directamente a partir de muestras clnicas de las aves infectadas. Es obligatorio el uso de protocolos estrictos para evitar el riesgo de contaminacin cruzada entre las muestras clnicas cuando se utilicen mtodos de deteccin molecular muy sensibles que permiten una rpida deteccin del ARN vrico para el diagnstico laboratorial confirmativo de las infecciones por influenza aviar. Adems, los mtodos RT-PCR deben validarse de acuerdo con el estndar de la OIE (vase el captulo 1.1.4 Principios de validacin de las pruebas de diagnstico para las enfermedades infecciosas) utilizando materiales clnicos para demostrar que las pruebas son adecuadas para el fin y pueden aplicarse en el diagnstico de campo, el cual puede incluir el uso de estndares internos para la prueba. Por ejemplo, la amplificacin por la PCR del gen guardin que ayuda a la normalizacin de los resultados proporcionando informacin sobre este gen problema que equivale en trminos cuantitativos a la presencia de la muestra clnica presente en el frotis.

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Las reacciones control propician una mayor confianza en la integridad de las reacciones moleculares, en las muestras clnicas y en los resultados. Con la definicin de los cebadores adecuados, la tcnica de RT-PCR con muestras clnicas podra conllevar una deteccin rpida e identificacin del subtipo (al menos del H5 H7), adems de posibilitar la obtencin de un ADNc que puede emplearse para la secuenciacin de nucletidos (37, 54, 55). La aplicacin efectiva de los ensayos de RT-PCR puede consistir en la identificacin rpida de brotes sucesivos una vez que se han detectado los casos primarios y ha sido caracterizado el virus. Esta tcnica se utiliz con xito durante los brotes de IAMV en 2003 en los Pases Bajos. Las pruebas de anillo realizadas recientemente en la Unin Europea sirvieron para identificar los protocolos de la RT-PCR convencional para el H5 y el H7, que tienen suficiente sensibilidad para amplificar de forma directa a partir de los frotis obtenidos de aves de corral infectadas con IAMV (51). Se han aplicado modificaciones en el empleo de la RT-PCR para reducir el tiempo de identificacin del subtipo vrico y la secuenciacin. Por ejemplo, Spackman et al. (53) emplearon un sistema de RT-PCR de un solo paso con cebador/hidrlisis de sonda fluorescente en tiempo real, para permitir la deteccin de virus de la influenza aviar y la determinacin del subtipo H5 H7. Los autores concluyeron que el ensayo cumpli bien su funcin en relacin al aislamiento del virus y ofreci una alternativa ms barata y mucho ms rpida con diagnstico de muestras clnicas en menos de 3 horas. La prueba proporciona una sensibilidad y especificidad altas semejantes a las del aislamiento de virus a partir de frotis orofarngeos y traqueales de pollos y pavos, pero es posible que carezca de sensibilidad para la deteccin del virus de la influenza A en los frotis fecales, las heces y los tejidos de algunas especies de aves, porque la presencia de inhibidores de la PCR dan lugar a resultados negativos falsos (18). La incorporacin de un control positivo interno en la prueba servir para verificar la ejecucin adecuada de la misma. La RT-PCR en tiempo real, normalmente basada en la sonda de hidrlisis o mtodo Taqman para la generacin de la seal de fluorescencia especfica de la diana, se ha convertido en el mtodo de referencia de muchos laboratorios para el diagnstico, al menos parcial, a partir de muestras clnicas. Con ese mtodo se obtienen resultados rpidos, con una sensibilidad y especificidad comparables a las del aislamiento vrico, suponiendo ambas las condiciones ideales para el manejo de los brotes de IA, ya que la obtencin rpida de un diagnstico inequvoco es crucial para la toma de decisiones por la Autoridad Veterinaria Competente. Adems, se pueden disear sistemas de RT-PCR para operar con un formato de 96 pocillos en combinacin con la extraccin robotizada del ARN con alto rendimiento a partir de las muestras (1). El enfoque del diagnstico mediante la RT-PCR en tiempo real adoptada por la mayor parte de los laboratorios se ha basado en la deteccin genrica inicial del virus de la IA en muestras clnicas, en primer lugar mediante la orientacin inicial hacia el gen de la matriz (M), que est muy conservado en todos los virus de la influenza tipo A, y utilizando a continuacin pruebas de RT-PCR especficas en tiempo real para los virus de los subtipos H5 y H7. Para la identificacin de los subtipos, los cebadores utilizados en la las RT-PCR en tiempo real de tipo Taqman se orientan hacia la regin HA2 ya que esta est relativamente bien conservada dentro de los genes de la hemoaglutinina de los subtipos H5 y H7, y ha servido como regin objetivo para el H5 y H7. Spackman et al. (53) demostraron la deteccin especfica de estos subtipos, pero advirtieron que sus secuencias de cebadores/sondas para el H5 y el H7 se haban diseado para los aislamientos de H5 y H7 de Norteamrica y podran no ser tiles para los aislamientos H5 y H7. Result que tenan razn. Slomka et al. (52) describieron una modificacin de las secuencias de oligonucletidos del H5 utilizadas por Spackman et al. (53) para propiciar la deteccin de este virus H5N1 de la IAMV de cepas asiticas y de otros virus H5 euroasiticos de la IA que se aislaron durante la pasada dcada en aves de corral y en aves silvestres. Esta RT-PCR en tiempo real validada para el H5 eurasitico ha resultado til para la investigacin de muchas muestras clnicas de H5N1 de la IAMV enviadas a los laboratorios de referencia internacionales de Europa, frica y Asia desde el otoo de l ao 2005 (52). Uno de los problemas derivados de la rapidez con que van apareciendo nuevas pruebas es que se estn elaborando y describiendo sin una validacin adecuadas de las pruebas. Este problema se ha intentado resolver en relacin con algunos de los protocolos de la RT-PCR en tiempo real (52, 56). En la Unin Europea, los laboratorios nacionales de referencia han colaborado para definir y validar los protocolos que se puedan recomendar para su uso (51, 52). Se han descrito protocolos de la RT-PCR en tiempo real que amplifican regiones a ambos lados del sitio de corte del gen HA0. Esto puede proporcionar pruebas que sean tiles para virus especficos. Por ejemplo, Hoffman et al. (27) han descrito una prueba RT-PCR en tiempo real especfica para los virus asiticos de la IAMV H5N1 Quinghai del clado 2.2 que representa un medio rpido para determinar el prototipo para este subgrupo de virus H5N1de la IAMV sin secuenciacin. Se han diseado modificaciones del mtodo RT-PCR directo para la deteccin de ARN vrico con el fin de reducir el efecto de sustancias inhibidoras presentes en la muestra recogida, la posible existencia de cidos nucleicos contaminantes, y el tiempo necesario para obtener un resultado. Por ejemplo, la amplificacin de

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secuencias basadas en cidos nucleicos (NASBA) junto con la deteccin electro-quimioluminiscente (NASBA/ECL) consiste en una reaccin isoterma continua en la que no se necesita un equipamiento especializado tipo termociclador. Se han desarrollado ensayos NASBA para la deteccin en 6 horas del virus de la influenza aviar de los subtipos H5 y H7 en muestras clnicas (15, 29). Parece que el sistema de amplificacin isotrmica mediante asas de siembra (LAMP) para la deteccin del H5 mostr una sensibilidad alta y una especificidad fiable (28). Parece muy probable que en muy poco tiempo la tecnologa basada en mtodos moleculares se habr desarrollado lo suficiente para permitir realizar ensayos a pie del parvada para la deteccin de la presencia del virus de la influenza aviar, el subtipo especfico y los marcadores de virulencia. El grado en que se empleen tales ensayos en el diagnstico de la influenza aviar depender mucho del acuerdo y la adopcin de definiciones legales de las infecciones con vistas al control y el comercio.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO


Es importante que la vacunacin no se considere como la nica solucin para el control de los subtipos de la IADO o la IAPV si lo que se persigue es su erradicacin. Sin la aplicacin de sistemas de control, bioseguridad y despoblacin estrictas a la vista de la infeccin, cabe la posibilidad de que esos virus se hagan endmicos en poblaciones de aves de corral vacunadas. La circulacin del virus a largo plazo en una poblacin vacunada puede desembocar en cambios antignicos y genticos del virus, lo que ya ha ocurrido en Mxico (31). Se ha demostrado empricamente que la vacunacin proporciona proteccin contra los sntomas clnicos y la mortalidad debida a la IADO y la IAPVDO, reduce la diseminacin del virus y aumenta la resistencia al la infeccin, protege contra diversos virus de campo dentro del mismo subtipo de hemoaglutinina, protege contra la exposicin baja y el desafo, reduce la excrecin y, como consecuencia, la transmisin del virus de desafo por contacto (13, 19, 59, 85). Sin embargo, an as el virus es capaz de infectar y replicarse en aves vacunadas clnicamente sanas. La mayor parte de los trabajos en los que se evalan las vacunas se han realizado sobre pollos y pavos, y debe evitarse la extrapolacin de los resultados obtenidos a otras especies. Por ejemplo, en un sistema experimental en el que se utiliz H7N7 de la IAMV como virus de desafo, se demostr que, para los pollos y cercetas de collar (Callonetta leucophrys), la vacunacin redujo bastante la excrecin y aument la dosis infectiva, que se redujo drsticamente el contagio entre aves, pero que, en el caso de los faisanes dorados, Chrysolophus pictus, la vacunacin proporcionaba proteccin clnica pero no surta efecto sobre la excrecin del virus de desafo y no influa en la transmisin (69, 70). En algunos pases las vacunas diseadas para prevenir la IADO estn prohibidas de forma explcita o no recomendadas por las agencias gubernamentales porque se ha considerado que pueden interferir con las polticas de control para la erradicacin. No obstante, la mayora de las normas de control de la IA incluyen el derecho a utilizar vacunas en casos de emergencia. No se recomiendan las vacunas vivas convencionales de la influenza frente a ningn subtipo.

Vacunas convencionales

Tradicionalmente, las vacunas que usadas contra IADO o IAPV se han preparado con lquido alantoide infectado e inactivado por beta-propiolactona o formalina y emulsionado con aceite mineral. La existencia de un gran nmero de subtipos vricos, junto con la conocida variacin de diferentes cepas de un subtipo, plantea serios problemas a la hora de seleccionar cepas para producir vacunas de la influenza, especialmente la influenza IAPV. Adems, algunos aislamientos no crecen hasta un ttulo suficientemente elevado como para producir vacunas potentes sin tener que realizar una concentracin previa costosa. Las vacunas producidas han sido bien endgenas, por ejemplo, preparadas a partir de aislamientos implicados especficamente en una epizootia, o bien se han preparado a partir de virus que poseen el mismo subtipo de hemoaglutinina y que proporcionan grandes concentraciones de antgeno. Por ejemplo, en los EEUU se ha llevado a cabo cierta estandarizacin, en el sentido de que los laboratorios del servicio nacional de veterinaria han propagado y mantenido virus de la influenza de cada subtipo para su empleo como inculo vrico en la preparacin de vacunas inactivadas (6). Desde los aos setenta, en EE.UU. se han empleado de forma restringida vacunas inactivadas producidas con una licencia especial con fines comerciales (25, 35, 43). Se las ha usado sobre todo en pavos y contra virus que no son muy virulentos, pero que pueden causar graves problemas, especialmente en circunstancias exacerbantes. Se han empleado cantidades importantes de esas vacunas (26, 35). Durante los ltimos aos, en los EE.UU. la mayora de las vacunas inactivadas autorizadas se han usado en pavos reproductores para protegerles contra los virus de la influenza porcina H1 y H3 (58). En Italia tambin se ha utilizado durante varios aos la vacunacin convencional contra la principal cepa de la IAPV (17). Se ha utilizado la vacunacin contra las infecciones por H9N2 en Pakistn (39), en Irn (72), en la Repblica Popular China (32) y en varios pases del Medio Oeste.

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En Utah se elabor en 1995 una vacuna inactivada a partir del virus de la IAPVDO, subtipo H7N3, responsable de una serie de brotes en pavos, en conjuncin con otras medidas, para controlar dichos brotes (26). De forma similar, en 2003 en Connecticut, se implement la vacunacin de gallinas y pollitas de reposicin con vacuna de H7N2 o H7N3 tras el surgimiento de un brote de IAPVDO causado por un virus H7N2 (61). La vacunacin contra IAMVDO del subtipo H5N2 se utiliz en Mxico tras los brotes de 19941995 (21, 22, 31), y en Pakistn contra el subtipo H7N3 (38) tras los brotes de 1995. Parece que en Mxico se ha erradicado el virus de la IAMVDO, pero el virus de la IAPVDO del subtipo H5N2 ha seguido circulando, mientras que en Pakistn en 2002 (66) y 2004 todava se estaban aislando los virus muy virulentos de la IA, que, desde el punto de vista gentico, son parecidos a los virus muy virulentos originales de la IA. Despus de los brotes de IAMVDO causados por el virus H5N1 en Hong Kong en 2002 (48), se adopt una poltica de vacunacin en ese territorio usando una vacuna contra el H5N2. En 2004 la extensin de los brotes de IA muy virulenta de tipo H5N1 en varios pases del Sureste asitico provoc que se utilizara una vacunacin profilctica en la Repblica Popular China, Indonesia y Vietnam. La vacuna inactivada contra la IA H7N se utiliz en Corea del Norte durante el ao 2005 para controlar un brote de IAMV. Tambin se ha utilizado la vacunacin profilctica en zonas restringidas de Italia para facilitar el control de los virus IAPVDO de tipo H5 y H7. En los ltimos aos, se ha permitido una vacunacin preventiva parecida en aves de corral de campo y en aves de zoo en varios pases de la Unin Europea.

Vacunas recombinantes

Se han fabricado vacunas recombinantes contra los virus de la IA mediante la insercin del gen codificador de la hemoaglutinina del virus de la influenza en un vector del virus vivo y la utilizacin de ese virus recombinante para inmunizar aves de corral contra la IA. (60). Las vacunas con vector vivo recombinante tienen varias ventajas: [1] se trata de vacunas vivas capaces de proporcionar inmunidad humoral y celular; [2] se pueden administrar a aves jvenes y producen una proteccin inicial, p.ej. el poxvirus aviar puede administrarse a pollos de un da, es compatible con la vacuna de la enfermedad de Mareks, y proporciona una proteccin importante a la semana siguiente; [3] ayudan a distinguir entre aves infectadas y aves vacunadas, ya que, por ejemplo, no inducen la produccin de anticuerpos contra los antgenos de la nucleoprotena o de la matriz que son comunes en todos virus de la IA. Por tanto, solo las aves infectadas de forma natural mostrarn anticuerpos en la prueba IGDA o en las pruebas ELISA utilizadas para la deteccin de anticuerpos de la influenza del grupo A (nucleoprotena y/o matriz). Sin embargo, estas vacunas tienen inconvenientes en el sentido de que replicarn de forma poco satisfactoria y proporcionarn inmunidad solamente parcial en aves que hayan estado sometidas a exposicin natural al virus vector o hayan sido vacunadas con dicho virus, i.e. poxvirus aviar o virus infecciosos de la laringotraqueitis para las vacunas recombinantes disponibles en la actualidad (34, 62). Si se utiliza en aves de un da o en aves jvenes, el efecto de los anticuerpos maternos frente al virus vector sobre la eficacia de la vacuna puede variar segn el tipo de vector. En relacin con la vacuna recombinante con poxvirus aviar, se ha informado de que se consigui una inmunizacin efectiva cuando se administr a pollos de 1 da que tenan distintos niveles de inmunidad materna (4). No obstante, cuando se esperan niveles altos de anticuerpos maternos debido a la infeccin o vacunacin previas, se deber confirmar la eficacia de la vacuna con vector de viruela aviar en los pollos de un da de edad. Adems, puesto que los vectores son virus vivos con un rango restringido de hospedadores (el virus de la laringotraquetis, por ejemplo, no se replica en los pavos), debe restringirse el uso de estas vacunas en especies para las que se haya demostrado la eficacia de las mismas. El uso de vacunas recombinantes est restringido a pases en los que estn autorizadas y su existencia es legal. La vacuna recombinante H5 de la viruela-IA se ha autorizado en El Salvador, Guatemala, Mxico, China y EE.UU. (59, 82). Las vacunas de poxvirus aviar que contienen H5 HA se han elaborado y evaluado mediante pruebas de campo (8, 23, 44, 63), pero la nicas experiencias de campo con esta vacuna han tenido lugar en Mxico, El Salvador, Guatemala y China, pases en los se utiliz durante la campaa de vacunacin contra los virus de la IAPV H5N2 y H5N1. Entre 1995 y 2006, en Mxico se usaron ms de 1.788 billones de dosis de la vacuna H5N2 inactivada en su programa de control del H5N2 (73, 74). Adems, en Mxico, Guatemala y El Salvador, se han usado ms de mil millones de dosis de la vacuna recombinante H5 para la viruela-IA para el control de la IAPVDO del tipo H5N2 desde 1997 a 2005, y China emple 606 millones de dosis en 2005 (82). Tambin se puede utilizar el virus de la enfermedad de Newcastle como vector para expresar los genes HA de la influenza (40). Se demostr que el virus de la vacuna recombinante contra la enfermedad de Newcastle (clon 30) que contiene y expresa un gen H5 HA protege a los pollos contra el desafo con virus virulento de la enfermedad de Newcastle o con virus H5N2 de la IAMV virus (71). En China (24), se produjo una cepa vacunal de virus recombinante similar basada en la enfermedad de Newcastle, denominado La Sota, que expresa la procedencia asitica del gen H5 HA y se ha informado de su eficacia en estudios sobre proteccin en los que se han utilizado los dos virus. Este ltimo virus se autoriz y utiliz ampliamente en China como una de las cuatro vacunas H5 autorizadas de acuerdo con la poltica actual de vacunacin obligatoria en virtud de la cual se vacunaron 8.2 billones de aves entre enero y septiembre de 2006 (36). Al igual que sucede con otras vacunas recombinantes, parece de dudosa adecuacin el uso de esta vacunacin aves adultas que estn bien inmunizadas contra la enfermedad de Newcastle, y no est claro hasta qu punto pueda verse afectada la eficacia de la vacuna por la presencia de inmunidad materna para el vector o la HA de la IA en pollos jvenes.

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Se ha utilizado un sistema de expresin del baculovirus para producir antgenos recombinantes H5 y H7 para incorporarlos a las vacunas (75). Se ha evaluado el ADN codificador de la hemoaglutina de H5 como posible vacuna para las aves de corral (30).

Deteccin de la infeccin en parvadas vacunadas y en aves vacunadas

Se ha propuesto una estrategia para la diferenciacin entre animales infectados y animales vacunados (DAIAV) como posible solucin para la eventual erradicacin de IADO sin necesidad de sacrificar aves de forma masiva con el consiguiente perjuicio econmico que eso conllevara, especialmente en pases en vas de desarrollo. (20). Esa estrategia proporciona las ventajas de la vacunacin (menos virus en el medio ambiente), pero la capacidad para identificar parvadas infectadas permitira la puesta en prctica de otras medidas de control, incluida la erradicacin. En los procedimientos DAIAV, se utilizan estrategias amplias de deteccin dentro de la poblacin vacunada: (1) deteccin del virus de la influenza A, o (2) deteccin de anticuerpos contra la infeccin por el virus de la influenza A. En las parvadas, un mtodo sencillo consiste en la observacin regular de aves centinela sin vacunar dentro de cada bandada vacunada, pero este mtodo conlleva algunos problemas, especialmente el relativo a la identificacin de las aves centinela dentro de grandes parvadas. Como sistema alternativo o subsidiario, se pueden realizar pruebas de infeccin natural de aves vacunadas mediante la deteccin del virus de campo o de anticuerpos contra el virus. En la deteccin del virus de campo, se pueden ensayar frotis orofarngeos o cloacales de las aves muertas a diario o enfermas, de forma individual o en grupo, mediante mtodos moleculares, tales como la RT-PCR en tiempo real o mediante enzimoinmunoensayo de captura en las poblaciones vacunadas. Para el empleo del DAIAV serolgico, deben utilizarse sistemas de vacunacin que faciliten la deteccin de la infeccin natural en poblaciones vacunadas. Se han desarrollado varios sistemas en los ltimos aos. Uno de ellos es el uso de vacunas que contengan un virus con el mismo subtipo de hemoaglutinina (H) pero diferente neuraminidasa (N) que el virus natural. Los anticuerpos frente a la N del virus natural actan como marcadores naturales de la infeccin. Este sistema se ha utilizado en Italia tras el resurgimiento en el ao 2000 de un virus H7N1 de la IAPVDO. Para complementar las medidas directas de control, se desarroll una estrategia de DAIAV usando una vacuna que contena H7N3 para combatir una infeccin natural por H7N1. Las aves vacunadas y las infectadas naturalmente se distinguieron empleando un ensayo serolgico para detectar anticuerpos especficos anti-N (10, 11). La misma estrategia se utiliz controlar la IAPVDO causada por H7N3 en Italia en 20022003 (9), en este caso con una vacuna de H7N1. En los dos casos, la erradicacin mediante la estrategia DAIAV trajo como resultado la erradicacin del virus natural. Puede haber problemas con ese sistema en caso de que surja un virus natural con un antgeno frente a la N diferente o si ya hay subtipos con diferentes antgenos frente a la N circulando en el campo. Como alternativa, el uso de vacunas que solo tengan HA, por ejemplo, vacunas recombinantes, permite la utilizacin del clsico IGDA y de pruebas ELISA basados en NP o en matriz para detectar la infeccin en aves vacunadas. En relacin con las vacunas inactivadas, se ha descrito una prueba para la deteccin de anticuerpos frente a la protena vrica no estructural (67). Este sistema todava tiene que ser validado en condiciones de campo.

Produccin de vacunas convencionales

La informacin que se da a continuacin se basa principalmente en la experiencia en EEUU, y en las instrucciones y poltica para la licencia de las vacunas de influenza aviar en ese pas (68). Los principios bsicos de produccin de vacunas, concretamente las vacunas inactivadas, son comunes a varios virus, p. ej. la enfermedad de Newcastle (captulo 2.3.14). Las instrucciones para la produccin de vacunas veterinarias se dan en el captulo 1.1.8. Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las directrices que se muestran aqu y en el captulo 1.1.8. pretenden ser de carcter general y pueden completarse mediante requisitos nacionales o regionales. La instalacin para la produccin de la vacuna debera funcionar bajo los procedimientos y prcticas de seguridad adecuados. Si se emplea un virus IAMVDO o en estudios de sensibilizacin con la vacuna, la zona de la instalacin donde se realiza este trabajo debera cumplir los requisitos para los patgenos del Grupo 4 de Contencin tal como se esboz en el captulo 1.1.2.

1.
a)

Control del inculo


Caractersticas del inculo
Solamente deberan emplearse virus de la influenza tipo A bien caracterizados y de probada baja patogenicidad, obtenidos preferiblemente a partir de un depsito nacional o internacional, para establecer el

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inculo original para la obtencin de vacunas inactivadas de cualquier subtipo. No se deben utilizar los virus de la IAMV como virus del inculo para la vacuna de la IA.

b)

Mtodo de cultivo
Se establece un inculo original, y a partir de este un inculo de trabajo. El inculo original y el inculo de trabajo se producen en huevos embrionados SPF y SAN. El establecimiento de un cultivo original puede implicar solamente la produccin de un gran volumen de lquido alantoideo infectivo (mnimo 100 ml), que puede almacenarse en alcuotas liofilizadas (0,5 ml).

c)

Validacin como vacuna


El inculo original debera revisarse despus de su preparacin en cuanto a su esterilidad, inocuidad, potencia y ausencia de agentes externos especficos.

2.

Mtodo de fabricacin

Para producir la vacuna, en primer lugar se establece un inculo de trabajo en huevos embrionados SPF o SAN, a partir del cual se producen los lotes de vacuna, mediante la expansin de una alcuota del inculo original hasta un volumen suficiente que permita la produccin de la vacuna durante 1218 meses. Es mejor almacenar el inculo original en forma lquida a menos de 60C, ya que los virus liofilizados no siempre se multiplican con ttulos altos despus del primer pase. Las vacunas inactivadas de la influenza preparadas a partir de virus convencionales se producen en embriones de pollo. El mtodo de produccin consiste bsicamente en la propagacin del virus de manera asptica; todos los procedimientos se llevan a cabo en condiciones estriles. Es habitual diluir el inculo de trabajo en tampn isotnico estril (PBS, pH 7,2), de manera que se inoculan en cada cavidad alantoidea de 9 11 embriones de pollo SPF o SAN de diez das de edad aproximadamente 103 104 EID50 (dosis infectiva 50% por embrin ) por 0,1 ml. Dichos embriones se incuban a 37C. Los embriones que mueren en 24 horas deberan descartarse. El periodo de incubacin depender de la cepa de virus que se emplee y tendr que ser predeterminado para asegurar un mximo rendimiento con el mnimo nmero de muertes de embriones. Los embriones infectados deberan enfriarse a 4C antes de concentrarse. Se elimina la cscara de la parte superior de los huevos y se aspiran los lquidos alantoideos. Deber evitarse la inclusin de cualquier material de la yema y albmina. Todos los fluidos deberan almacenarse inmediatamente a 4C y ensayarse para la existencia de contaminacin bacteriana. Durante la preparacin de vacunas inactivadas, el lquido alantoideo concentrado se trata, bien con formaldehdo (una concentracin final tpica es 1/1.0001/4000) o beta-propiolactona (una concentracin tpica final es 1/2.0001/4.000). El tiempo necesario debe ser suficiente para asegurar la ausencia de virus vivos. La mayora de las vacunas inactivadas se formulan con lquido alantoideo (ingrediente activo) inactivado y no concentrado. Sin embargo los ingredientes activos pueden concentrarse para facilitar el almacenamiento de antgeno. El ingrediente activo se emulsiona normalmente con aceite mineral o vegetal. Las formulaciones precisas generalmente son secretos comerciales.

3.

Control del proceso

En las vacunas inactivadas, debe ensayarse la totalidad del proceso de inactivacin en embriones de pollo, tomando por lo menos 10 alcuotas de 0,2 ml de cada lote y pasando cada alcuota al menos dos veces en embriones SPF o SAN.

4.

Control del lote

La mayora de los pases han publicado especificaciones para el control de la produccin y ensayo de las vacunas, que incluyen la definicin de las pruebas obligatorias con las vacunas durante y despus de su fabricacin.

a)

Esterilidad
Las determinaciones de esterilidad y ausencia de contaminacin con materiales biolgicos pueden encontrarse en el captulo 1.1.9.

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b)

Inocuidad
En las vacunas inactivadas, se administra una dosis doble por la va recomendada a diez aves de 3 semanas de edad, y se observa durante 2 semanas la ausencia de signos clnicos de enfermedad o lesiones locales.

c)

Potencia
Generalmente se evala la potencia de la vacuna contra la influenza aviar ensayando su capacidad para producir un ttulo de HI elevado en las aves. Puede emplearse un ensayo convencional de potencia que implique el empleo de tres dosis diluidas y la sensibilizacin con el virus virulento (p. ej. captulo 2.3.14.) para vacunas preparadas para proteger frente a subtipos de IAMVDO o IAPV. En las vacunas inactivadas frente a otros subtipos cuando no se encuentran disponibles virus virulentos, los ensayos de potencia pueden basarse en la medida de la respuesta inmune o la sensibilizacin y valoracin de la morbilidad y la reduccin cuantitativa de la replicacin de virus de desafo en los tractos respiratorio (orofarngeo o traqueal) e intestinal (cloaca). La valoracin del contenido de antgeno de hemoaglutinina (77) puede permitir la extrapolacin in vitro de la potencia en los siguientes lotes de vacuna.

d)

Estabilidad
Cuando se almacena bajo las condiciones recomendadas, la vacuna debera mantener su potencia durante al menos 1 ao. Las vacunas inactivadas no deben congelarse.

e)

Conservantes
Puede utilizarse un conservante para la vacuna distribuida en contenedores multidosis.

f)

Precauciones (riesgos)
Debe tenerse cuidado en evitar la autoinyeccin con las vacunas emulsionadas en aceite.

5.
a)

Pruebas en el producto final


Inocuidad
Ver seccin C.4.b. arriba

b)

Potencia
Ver seccin C.4.c. arriba

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* * *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la influenza aviar muy virulenta (vase el cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la lista ms actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int).

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