ADRIANE FERREIRA DA SILVA

PLANTAS UTILIZADAS NA MEDICINA POPULAR BRASILEIRA COM POTENCIAL ATIVIDADE ANTIFNGICA CONTRA LEVEDURAS DETERIORADORAS DE ALIMENTOS

BELO HORIZONTE 2010

ADRIANE FERREIRA DA SILVA

PLANTAS UTILIZADAS NA MEDICINA POPULAR BRASILEIRA COM POTENCIAL ATIVIDADE ANTIFNGICA CONTRA LEVEDURAS DEGRADADORAS DE ALIMENTOS

Monograf ia de Instituto como Grau de

apresentada em de para Cincias Federal

ao

Programa do da Gerais, do em Dr.

Ps-Graduao

Microbiologia Biolgicas Minas a

Universidade de

pr-requisito

obteno

Especializao sob
Rosa

Microbiologia
Carlos Augusto

orientao
e

do

Co-orientao

da Dra. Susana Johann.

BELO HORIZONTE 2010

LISTA DE TABELA

TABELA 1: Leveduras utilizadas........................................................18

SUMRIO

1 INTRODUO....................................................................................... 2 REVISO DA LITERATURA................................................................. 2.1 Leveduras que causam estragos nos alimentos................................. 2.2 Sistemas de preservao dos alimentos............................................ 2.3 Conservantes antimicrobianos a partir de produtos naturais..............
2.4 Plantas medicinais..............................................................................

07 08 08 09 11
13

3 JUSTIFICATIVA....................................................................................
4 OBJETIVOS..........................................................................................

14 16 17
17 17 17 17 17 18 19

4.1 Objetivo Geral.....................................................................................

4.2 Objetivos especficos.......................................................................... 5 MATERIAIS E MTODOS..................................................................... 5.1 Plantas utilizadas................................................................................ 5.2 Meios de cultura utilizados.................................................................. 5.3 Microrganismos................................................................................... 5.4 Preparo do Inoculo das leveduras...................................................... 5.5 Mtodo de disco-difuso.....................................................................

5.6 Determinao da concentrao mnima inibitria............................... 6 RESULTADOS E DISCUSSO............................................................ 7 CONCLUSO........................................................................................ REFERNCIAS........................................................................................

19 21 23 24

RESUMO

A comida deteriorada um problema srio na indstria porque produz produtos

inaceitveis para o consumo. Na produo em larga escala a conseqncia deste processo grande em particular se os materiais utilizados possurem um

alto valor econmico.

No

presente

trabalho

foi

analisado

ao

de

cinco

extratos

vegetais

das

plantas Piper abutiloides, Inga sp, Alternanthera brasiliana, Herissantia crispa e

Rubus urticaefolius contra 37 leveduras causadoras de deteriorao em

alimentos pelo mtodo de disco de difuso e o mtodo de determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM). Pelo mtodo de disco difuso foi

possvel observar que a maioria dos extratos foi inativa contra as leveduras testadas. Somente o extrato de P. abutiloides foi ativo contra Candida

parapsilosis isolada do refresco de laranja. Posteriormente foi analisada a CIM

deste
extrato

extrato C.
j havia

parapsilosis,
apresentado

CIM

encontrado
antifngica

de
contra

125ug/mL.
outras

Este

mesmo

atividade

leveduras.

Portanto,

extrato

de P.

abutiloides mostrou

ter

potencial

de

atividade

antifngica contra C. parapsilosis isolada de trs refrescos de suco.

Palavras-chave: Extratos vegetais, levedura, antifngico e alimentos

ABSTRACT

The

food

spoiling

is

serious

problem

in

industry

because

it

produces

unacceptable foods consumption. In large-scale production, the consequence of spoiling is high particularly if the materials used possess a high economic value.

In this work we examined the action of five plant extracts Piper abutiloides, Inga sp, Alternanthera brasiliana, Herissantia crispa and Rubus urticaefolius against

37 yeasts causing deterioration in food using the disk diffusion method and the
determination of the minimal inhibitory concentration (MIC). By disk diffusion it was observed that most of the extracts was inactive against the yeasts. Only the extract of P. abutiloides was active against Candida parapsilosis isolated from orange juice the CIM value of this extract against C. parapsilosis was

125ug/mL. This same extract had presented antifungal activity against other yeasts. Therefore the extract of P. abutiloides showed potential antifungal

activity against C. parapsilosis isolated from fruit juice.

Keywords: Plant extracts, yeast, antifungal and food

1 INTRODUO A deteriorao do alimento industrializado constitui um problema para a

industria. Devido produo em larga escala, a deteriorao do alimento geralmente resultado nos da atividade microbiana. dos A proliferao e dos de

microrganismos

alimentos

depende

nutrientes

condies

estocagem (LOUREIRO, 2000).

Alguns alimentos so estocados a temperatura ambiente, o que permite o crescimento de leveduras, que podem causarem deteriorao perceptveis do alimento (STRADFORD, 2006). Geralmente, as leveduras resistem melhor s condies extremas do que as bactrias e so frequentemente encontradas em

produtos de baixo pH (DEAK & BEUCHAT, 1996).

As bactrias e os vrus so os principais causadores de surtos de

doenas gastrintestinais, intoxicaes ou outras infeces alimentares (FLEET, 2007). Enquanto as leveduras capazes de causarem problemas gastrintestinais tm sido associadas ao consumo de bebidas estragadas, especialmente por

Saccharomyces spp. e Zygosaccharomyces spp. (STRATFORD, 2006).

Em uma recente reviso a respeito de novos patgenos emergentes, Hazen (1995) a afirma alguns que fatores, as infeces tais como causadas atividades por leveduras esto ampla

associadas

teraputicas,

utilizao de antibiticos e indivduos com o sistema imune comprometido. O autor afirma que algumas leveduras como Candida utilis, Saccharomyces

cerevisiae e Candida lipolytica so capazes de causar doenas no homem.

Como estas leveduras tambm causam deteriorao nos alimentos, a presena destes microrganismos pode ser considerada como um problema para a sade

pblica (LOURERO & QUEIROL, 1999).

Diante da necessidade de novos e efetivos conservantes para a

preservao dos alimentos, o presente trabalho visa o estudo sobre a utilizao

dos extratos de plantas medicinais na conservao de alimentos.

Para isto, sero testados cinco extratos de planta contra diversas

leveduras causadoras de deteriorao em refrescos de frutas.

2 REVISO DA LITERATURA

8 2.1 Leveduras que causam estragos nos alimentos As leveduras so responsveis pela deteriorao de uma gama de

produtos refrigerados e tambm daqueles que so mantidos em temperaturas ambiente, incluindo leite e produtos lcteos, saladas, maioneses, produtos de padaria, gelias, conservas, frutas, carne e peixe cru (BETTS; LINTON &

BETTERIGDE, 1998). Loureiro & Querol (1999) afirmam que dez espcies de leveduras Dekkera hansenii, bailii, Kloeckera bruxellensis, Issatchenkia orientalis, apiculata, cerevisiae, Pichia Debaryomyces

membranifaciens, Zygosaccharomyces bisporus,

Saccharomyces

Zygosaccharomyces

Zygosaccharomyces rouxi e Candida holmii so as principais causadoras de deteriorao em alimentos.

A deteco da deteriorao por leveduras dos alimentos requer a

presena de aproximadamente 1,0 x105 - 1,0x106 clulas/ml (INGRAM, 1949). No entanto, uma inoculao de 100 clulas/ml apenas pode resultar em

deteriorao de sucos de frutas (LLOYD, 1975).

Com especialmente Thamnidium, relao a deteriorao bovina, Rhizopus; de carnes gneros por so ao dos fungos, como: e

carne

vrios

responsveis,

Mucor;

Cladosporium,Penicillium;

Sporotrichum

Chrysosporium (JAY, 2007). J para as carnes de peixes, os principais gneros de leveduras envolvidos so: Candida, Cryptococcus, Debaryomyces,

Hansenula, Pichia, Rhodotorula, Sporobolomyces e Trichosporon, (JAY, 2007).

Exemplos de deteriorao extremos por leveduras incluem:

refrigerantes, vinhos fermentados, presena de muco sobre a carne e tambm colnias leveduras produo de leveduras nos alimentos (STARTFORD, 2006). como o mesmo a A maioria na do das

so capazes de gs,

de causarem estragos visveis, o estufamento e/ou

excesso exploso

causando

recipiente (GRINBAUM, 1994).

As espcies de leveduras que produzem elevadas quantidades de gs

incluem Zygosaccharomyces
bruxel ensis e

bail i,

Saccharomyces

cerevisiae,

Dekkera

Saccharomycodes

ludwigii

(STRATFORD,

2006). Dekkera e

Brettanomyces ssp. crescem e formam flocos em refrigerantes (STRATFORD,

2006). O excesso da produo de gs por leveduras resultado da

fermentao de acares (STRATFORD, 2006). A formao de um biofilme nos alimentos caracterstico de um nmero pequeno de leveduras,

9 principalmente
orientalis,

as

espcies
anomala, P.

Candida
fluxuum, P.

boidinii,

C.
P.

intermedia,

C.

pseudointermedia, C. pseudolambica, C. tropicalis, Issatchenkia occidentalis, I.

Pichia fermentati, galeiformis e P.

membranifaciens (VOLLEKOVA et al , 1996).

A deteriorao dos alimentos pode ocorrer tambm devido atividade proteoltica de muitas leveduras (INGRAM, 1958). Estas crescem na presena de fontes de nitrognio Muitas e protenas, leveduras utilizando degradam o estes leite compostos e seus para o

crescimento

celular.

derivados,

principalmente a casena, devido ao de enzimas proteolticas (INGRAM,

1958).

2.2 Sistemas de preservao dos alimentos

A preservao dos alimentos visa a reduzir os riscos de contaminao e crescimento de bactrias, leveduras e bolores (FREITAS, 2004). So vrias as metodologias usadas para a preservao dos alimentos. Entre elas, se

destacam: o congelamento, o resfriamento, a pasteurizao, a esterilizao e a irradiao (COSTA et al, 2005). Porm, alguns destes mtodos de conservao podem ser inviveis, industriais devido ou das ao alto custo de para a implementao do nas

instalaes

condies

armazenamento

alimento

(COSTA et al, 2005).

O minimiza cidos empacotamento a contaminao usualmente de frutas, bebidas e vegetais em sacos Os ento, plsticos

microbiana em

(STRATFORD, latas quentes

2006). ou,

alimentos so

so

colocados

processados a temperaturas prximas de 100 C, o que resulta na destruio das clulas vegetativas de bactrias, leveduras, fungos e seus esporos e parte dos esporos das bactrias (CAMARGO, 1975). A deteriorao microbiolgica dos alimentos enlatados conseqncia da sobrevivncia dos microrganismos aps o tratamento trmico ou microfuros do recipiente ocorridas aps este

mesmo tratamento (CAMARGO, 1975).

Em sua maior parte, as deterioraes dos alimentos por microrganismos

mesfilos
Clostridium.

so

causadas

por

bactrias

esporuladas
como

dos

gneros Bacillus e
alimentos

Alimentos

superficialmente

aquecidos,

alguns

cidos, podem tambm permitir o aparecimento e mesmo a deteriorao por

bactrias no esporuladas, ou at fungos e leveduras (CAMARGO, 1975).

10 Os esporos da maior parte dos microrganismos mesfilos, so

destrudos em tempo relativamente curto a 100 C, embora uma pequena parte possa sobreviver a tratamentos mais rigorosos. Os esporos que sobrevivem no causam, necessariamente, deteriorao dos alimentos, uma vez que as condies podem ser desfavorveis para germinao e crescimento

(CAMARGO, 1975).
Muitas espcies de Bacillus so aerbias e, dessa forma, no podem se desenvolver em alimentos embalados a vcuo. No entanto, quando o vcuo

mal produzido, vrias espcies de Bacillus podem causar deteriorao, estando

entre os alimentos mais atingidos as carnes, os alimentos marinhos e o leite

em p (CAMARGO, 1975).
Esporos sexuais de leveduras so destrudos pela pasteurizao, sendo sua presena em alimentos enlatados resultado de falha de processamento. Frutas enlatadas, geleias, sucos de fruta, xaropes e leite condensado sem

acar so deteriorados por leveduras fermentativas com estufamento da lata

pela produo de CO2 (CAMARGO, 1975).

Uma alimentcios estratgia a usada de para preveno da deteriorao dos produtos tpicos so:

adio

conservantes

cido-fraco.

Exemplos

cido actico, cido ascrbico e cido benzoico (PAPADIMITRIOU, 2006). O cido propinico inibe muitos esporos de Bacillus (PONTE & TSEN, 1987). O cido ascrbico considerado mais efetivo do que o cido propinico, e ambos inibem o crescimento de leveduras em vrios produtos de padaria (SUHR,

2004).
A fermentao de saladas e maioneses conseqncia da ao de leveduras que possuem alto grau de resistncia ao cido actico, ingrediente utilizado nesses produtos com fins de conservao (BETTS; LINTON &

BETTERIGDE, 1998). As leveduras mais encontradas so: S. cerevisiae e S.

exiguus (BROCKLEHURST et al., 1983; HUNTER et al., 1994).

O concentraes uso de atmosfera elevadas de modificada CO ,
2

no

interior

da tem

embalagem, sido

com

mais

tambm

empregado

comercialmente com a finalidade de inibir o crescimento de microrganismos, principalmente os aerbios (CRUZ; SOARES, 2002). Segundo Cruz e Souza (2002), a tcnica de carbonatar a gua que foi utilizada para a produo do macarro tipo massa fresca, em substituio injeo de CO2 na embalagem,

11 obteve resultados satisfatrios para a inibio de bolores e leveduras durante 50 dias de armazenamento a 7- 1C.
+

2.3 Conservantes antimicrobianos a partir de produtos naturais

Com a tendncia de aumentar o uso natural de conservantes biolgicos em produtos de alimentos, agentes naturais antimicrobianos de fermentao e produto naturais tm podem exigido ser utilizados (MO; ZHU & com CHEN, baixos 2008). nveis Os de

consumidores

mais

alimentos

naturais

aditivos qumicos e com prazos de validade maiores. A legislao que trata do consumo de produtos alimentcios tem restringido o uso de alguns

antimicrobianos sintticos, devido possibilidade destes serem txicos para os consumidores (BRUL & COOTE, 1999; BURT, 2004). Neste sentido, os

temperos, devido ao antimicrobiana, tm surgido como compostos efetivos capazes de fornecer segurana microbiolgica para o alimento (SOUZA et al.,

2005).
Desde o princpio das civilizaes, os vegetais tm sido utilizados no s como fonte alimentcia, tm sido mas tratadas tambm com medicamentosa. chs (infuso, As mais e diversas macerado),

enfermidades

decoco

sucos, tinturas, banhos, cataplasmas e unguentos, preparados a partir de parte

das plantas (PEREIRA et al, 2006).

No Brasil, os estudos sobre pesquisas antimicrobianas de origem

vegetal tiveram provavelmente incio com Cardoso e Santos (1948). Os autores avaliaram como extratos de ou 100 plantas, usadas na teraputica medicamentosa, autores, somente

cicatrizantes

anti nflamatrias.

No estudo destes

cinco extratos apresentaram atividade inibitria contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Proteus spp. (LIMA, 2001). Mais recentemente, outros

autores revisaram os efeitos antimicrobianos de produtos naturais e verificaram o grande arsenal de molculas al., a 1999; potencialmente BILLING dos extratos & antimicrobianas SHERMAN, de 2.300 (COWAN, 1998). Em 1943, S.

1999; Osborn,

KOLODZIEJ et pesquisando

atividade

plantas

contra

aureus e E. coli, verificou que espcies de 63 gneros continham substncias

que inibiam o crescimento de um ou de ambos os microrganismos.

Os compostos isolados de plantas so substncias com estruturas

qumicas bem diferenciadas dos antimicrobianos obtidos a partir de bactrias,

12 leveduras e de fungos. Tais produtos podem atuar no metabolismo

intermedirio ativando enzimas, alterando a ao de inibidores que influenciam a absoro de nutrientes do meio, interferindo nos processos enzimticos em nvel nuclear ou ribossomal, provocando alteraes nas membranas ou

interferindo no metabolismo secundrio dos microrganismos (SINGH; SHUKLA, 1984). Muitos trabalhos tm sido realizados com o objetivo de isolar e elucidar compostos qumicos oriundos de plantas com potencial antimicrobiano (LIMA, 2001). Neste mercado receber principais a seja contexto, de embora a maioria o dos antifngicos de produtos existentes naturais Entre esto no voltou as as a

origem dos na

sinttica, cientistas busca

estudo

ateno ferramentas

(YUNES, de novos

CECHINEL modelos

2001).

moleculares

informaes de como as plantas so utilizadas por diferentes grupos tnicos e o estudo farmacolgico das preparaes utilizadas. Estes tpicos so

abordados respectivamente no mbito da Etnobotnica e da Etnofarmacologia

(RATES, 2001). O efeito inibitrio contra E. coli e P. aeruginosa da combinao de leos

de organo, manjerona, tomilho e manjerico foi recentemente demonstrado (GUTIERREZ; RYAN; BOURKE, 2008). As misturas de manjerona e tomilho tambm exibiram efeitos inibitrios contra Listeria monocytogenes em

combinao com manjerico, alecrim e slvia (GUTIERREZ; RYAN; BOURKE,

2008). Daferera et al. (2003) afirmam que a espcie Origanum vulgare L. e seus
derivados tm apresentado para serem resultados aplicados de na destaque como de agentes alimentos. Os

antimicrobianos

conservao

resultados mostraram que o leo essencial da espcie O. vulgare apresentou

efeito inibidor substancial contra todas as leveduras testadas (C. albicans, C. krusei, C. tropicalis, Pichia minuta e S. cerevisae), com a formao de grandes

halos de inibio no teste de difuso em disco (SOUZA et al., 2005).

Os trabalhos recentes sobre atividade antimicrobiana in vitro mostram que os leos essncias tm alto valor de inibio contra microrganismos

presentes em alimentos (PEREIRA et al, 2006). Entretanto, as concentraes utilizadas nos ensaios antimicrobianos so muito altas, o que pode prejudicar significativamente o sabor dos alimentos (CERRUTI & ALZAMORA, 1995).

Muitos autores sugerem a combinao dos produtos naturais com os mtodos

13 fsicos e qumicos tradicionalmente (CERRUTTI, 1996).

Novas tendncias em conservao conduzem a uma reduo nos nveis de conservantes utilizados em alimentos pela utilizao de antimicrobianos de origem animal, vegetal ou microbiana (CERRUTTI, 1996). Os compostos

utilizados

na preservao dos alimentos

fenlicos e leos essenciais so provavelmente os principais antimicrobianos e esto presentes, por exemplo, em vrios condimentos como organo, tomilho,

cravo, canela e pimenta da Jamaica (DZIEZAK, 1989).

2.4 Plantas medicinais Segundo Lima et al., (2009), a espcie Herissantia crispa capaz de inibir o crescimento bacteriano de E. coli, L. monocytogenes, Shigel a fleximeri, Shigella sonnei, Salmonel a spp. e Yersinia enterocololytica .
Lagrota (2006) demonstrou a atividade inibitria da espcie

Alternanthera brasiliana contra Herpes vrus, no seu ciclo de replicao.

A apresentou espcie Piper atividade abutiloides, pertencente contra diversas famlia leveduras Piperaceae, de importncia

antifngica

mdica

(JOHANN et

al,

2008).

Estes

autores

tambm

mostraram

que

espcie Rubus urticaefolius apresentou atividade contra Sporothrix schenckii com uma concentrao de R. inibitria mnima (CIM) de 125 o mg / ml. O de extrato

hexnico

urticaefolius apresentou

atividade

contra

crescimento

Cryptococcus neoformans e C. albicans. Ambos exibiram elevados valores de

CIM, que variaram entre 500 e 1000 g /ml (JOHANN et al, 2007).

3 JUSTIFICATIVA
Na indstria, a produo de alimentos feita em larga escala e quando ocorre deteriorao dos mesmos a perda muito grande. A deteriorao geralmente resultado da atividade microbiana. Um dos fatores que favorece a deteriorao dos alimentos por ao de microrganismos a temperatura e as

condies de estocagem.

14 Dentre principalmente os dos microrganismos deterioradores de alimentos, as leveduras

gneros Saccharomyces e Zygosaccharomyces podem

causarem problemas gastrintestinais nos indivduos por meio do consumo de

bebidas contaminadas por estes microrganismos.

Atualmente alimentos como: vrias o metodologias o so usadas para a a preservao a fraco (cido dos

congelamento, e a

resfriamento, de

pasteurizao, cido

esterilizao,

a irradiao

adio

conservantes

actico; cido propinico, cido ltico e outros). Porm, alguns destes mtodos de conservao podem nas do ser inviveis, industriais Alguns devido ou ao devido alto as custo para a de de dos

implementao armazenamento alimentos so

instalaes alimento. aos

condies

microrganismos tradicionais

contaminantes de preservao

resistentes

mtodos

alimentos. Por exemplo, as saladas contm leveduras que possuem alto grau de resistncia ao cido actico, ingrediente utilizado nesses produtos com fins de conservao. Portanto, o estudo de conservantes com atividade

antimicrobiana a partir de produtos naturais podem ser promissores, j que, muitas substncias presentes em plantas possuem ao inibitria contra

microrganismos. A legislao que trata do consumo de produtos alimentcios tem restringido o uso serem de alguns txicos de novos antimicrobianos para os sintticos, devido a de

possibilidade importncia

destes da

consumidores,

mostrando a

pesquisa

compostos

antimicrobianos

partir

produtos naturais.
Tendo em vista o grande prejuzo econmico e os possveis danos sade que os microrganismos contaminantes de alimentos podem causar, de grande importncia estudar novas formas de conservao dos produtos

alimentcios. Este trabalho, portanto visa estudar os extratos de cinco espcies de plantas medicinais contra leveduras causadoras de deteriorao em

alimentos.

15

4 OBJETIVOS 4.1 Objetivo Geral

Testar

os

extratos

de

cinco

plantas

medicinais

contra

leveduras

causadoras de deteriorao em alimentos.

4.2 Objetivos especficos

16

Testar

os

extratos

de Piper

abutiloides, Inga sp., Alternanthera

urticaefolius, contra 37 leveduras

brasiliana, Herissantia

crispa e Rubus

causadoras de deteriorao em alimentos, pelos testes de inibio em disco de difuso;

Determinar a concentrao inibitria mnima (MIC) dos extratos que

apresentaram atividade contra os microrganismos alvo.

5 MATERIAIS E MTODOS 5.1 Plantas utilizadas

Os

extratos

das

plantas Piper

abutiloides, Inga
cinco

sp , Alternanthera
plantas foram

brasiliana, Herissantia

crispa e Rubus

urticaefolius das

feitos a partir de folhas e caules conforme descrito por JOHANN (2007).

5.2 Meios de cultura utilizados

17

Para o crescimento das leveduras e para os testes de difuso em Agar,

foi utilizado o meio Agar Sabouraud. Para o ensaio de Concentrao Inibitria

Mnima (CIM), foi utilizado o meio RPMI 1640.

5.3 Microrganismos

Foram utilizadas 37 leveduras causadoras de deteriorao de refrescos de frutas, da coleo do Laboratrio de Minas de Ecologia As e Biotecnologia leveduras de

Leveduras/Universidade

Federal

Gerais.

utilizadas

esto citadas abaixo:

TABELA 1: Leveduras utilizadas nos experimentos de atividade antimicrobiana.

18 Cdigo do isolado 8.4, 10.3, 23.5 28.3 21.10 20.8 20.2, 29.1, 29.2 7.1 21.6, 31.3 4.6 15.1 28.1, 28.4 23.1, 32.1 10.5, 29.1, 33.2, 33.12 4.3, 12.6, 15.4, 21.14, 33.11 9.1 15.4 10.1, 29.3, 31.1 2.3, 20.6 11.2 33.9 15.8 Espcie Aureobasidium pullulans Candida boidini Candida cylindracea Candida intermedia Candida oleophila Candida orthopsilosis Candida parapsilosis Candida spandovensis Candida tropicalis Cryptococcus laurenti Kloeckera apis Lachancea fermentati No identificada Pichia fermentans Pichia jadinii Rhodotorula mucilaginosa Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces uvarum Torulaspora delbrueckii Trichosporon ovoides

5.4 Preparo do Inoculo das leveduras Para a preparao do inoculo, as amostras de leveduras foram
crescidas por 24 horas a 35C e posteriormente ressuspendidas, com o auxlio de uma ala de Henle, em soluo fisiolgica esterilizada e homogeneizada em vrtex. A concentrao de clulas foi ajustada para turbidez de 0,5 da escala de Mc Farland, equivalente a 1,0x106 5,0x106 UFC/ml. A partir deste inoculo

foram feitas diluies 1:50 e 1:20, correspondendo a um inoculo de 1,0x10 3 5x10 3 UFC/ml, respectivamente.

5.5 Mtodo de disco-difuso

Esse mtodo teve como objetivo fazer uma triagem para saber qual dos

extratos vegetais eram ativos contra as leveduras testadas.

Primeiramente, os extratos brutos (2mg) das cinco espcies vegetais foram dissolvidos com metanol e adicionados nos discos de papel filtro, para

19 obter uma concentrao de 1000 g/disco. Como controle positivo, foi utilizado
10 l de anfotericina utilizada para B e, como os controle extratos. negativo, o metanol, 100l na do mesma quantidade dissolver Posteriormente

inoculo das leveduras foram colocados nas placas de petri e distribudos com

auxlio de um swab estril. Aps o inoculo, os discos impregnados com os

extratos foram colocados nas placas de petri contendo o meio Sabouraud, a

uma distncia de pelo menos 2,5 cm. As placas do ensaio foram incubadas a 28 C por um perodo de 24 a 48
horas. Para realizar a leitura dos resultados, os dimetros dos halos de inibio foram medidos com auxlio de uma rgua. Os extratos das plantas que

produziram halo de inibio foram considerados positivos.

5.6 Determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM)

Este mtodo foi realizado com os extratos que obtiveram resultados

positivos no ensaio acima. Este ensaio foi realizado conforme o CLSI (2002) e

com as modificaes sugeridas por Johann et al. (2007).

A primeira etapa do mtodo consistiu em pesar 2mg do extrato e colocar 50 l de DMSO (solvente para diluir os extratos) e 1950 l de RPMI.

Posteriormente, 1ml de RPMI foi pipetado em sete tubos de ensaio. A diluio seriada foi preparada, passando 1ml do primeiro tubo e deste para o segundo at o ltimo, que ficou com 2ml da soluo (extrato+DMSO+RMPI). As

concentraes dos extratos variaram, portanto de 1000 a 7,8g/ml.

Cem microlitros de cada diluio foram pipetados para os poos da

placa de microdiluio, em duplicata. Os poos controles foram os seguintes: A) Controle de crescimento do fungo: somente o meio de cultura e o inoculo. B) Controle de DMSO: somente DMSO, na concentrao do ensaio e o inoculo. C) Controle de esterilidade: extrato diludo e inoculo.
Posteriormente, foram pipetados 100 l do inoculo das leveduras nas placas de microdiluio. Os poos onde no ocorreu crescimento microbiano, em comparao com os controles, foram considerados positivos para a

atividade antimicrobiana do extrato.

20

6 RESULTADOS E DISCUSSO No presente trabalho foram testados 5 extratos das seguintes plantas: P.
abutiloides, Inga sp., A. leveduras realizada mtodo causadoras uma de de brasiliana, H. deteriorao das leveduras Neste em crispa e R. alimento. aos triagem, urticaefolius contra Primeiramente, extratos pde-se foi pelo que 37

triagem

sensveis de

testados perceber

disco

difuso.

ensaio

quase todas as leveduras testadas foram resistentes aos extratos. Somente o

21 extrato 10mm de P. na abutiloides foi do ativo contra a levedura Candida Como droga parapsilosis controle, foi

(Cdigo do isolado 31.3). Esta levedura apresentou um halo de inibio de presena extrato de P. abutiloides.

utilizada a anfotericina B, em que foi possvel observar halo de inibio contra

quase todas as leveduras testadas.

Posteriormente, parapsilosis 31.3, sendo

foi

realizada

CIM a

deste inibio

extrato do

contra

a C. da

possvel

observar

crescimento

levedura na concentrao de 125 g/ml. Em estudo realizado por Johann e

colaboradores (2008), o extrato hidroalcolico de P. abutiloides foi menos ativo contra uma linhagem clnica de C. parapsilosis, com CIM de 1000 g/ml. J o
extrato hexnico foi mais ativo com CIM de 500 g/ml. Esta diferena na

sensibilidade de C. parapsilosis ao extrato de P. abutiloides pode ser explicada

devido

ao

fato

de

estarem

sendo

testados

isolados

de C.

parapsilosis

proveniente de refresco, e no trabalho dos autores foi utilizada uma linhagem

de origem clnica.
No presente trabalho, os extratos brutos das espcies Inga sp., A.

brasiliana, H.

crispa e R.

urticaefolius foram

inativos

contra

todos

os

microrganismos testados. No entanto, em outro estudo, extratos da espcie R. urticaefolius apresentaram atividade contra diversas espcies de Candida de

origem

clnica

como C.

tropicalis e C.

albicans e

tambm

contra

fungo

dimrfico Sporothrix schenckii (Johann et al., 2007).

Segundo Herissantia Johann e colaboradores (2007), o extrato isolados etanlico clnicos de de C.

crispa no

apresentou

atividade

contra

krusei e C. tropicalis. J para isolados clnicos C. glabrata, o extrato foi ativo, com CIM de 500 g/ml, e para C. parapsilosis e Cr. neoformans, a atividade foi na concentrao de 125 g/Ml.
Corroborando com os resultados encontrados no presente trabalho,

Johann e colaboradores (2007) no encontraram atividade do extrato de A.

brasiliana contra os microrganismos C.

albicans,

C. krusei,

C. tropicalis, C.

parapsilosis, C. glabrata, S. schenckii e Cr. neoformans. No entanto, outros

autores verificaram que o extrato desta planta funcionava como inibidor da

proliferao de linfcitos (MORAES et al., 1994), e como agente antiviral contra o Herpes vrus simplex (LAGROTA et al., 1994).

22 A constituio qumica das espcies de Piper spp . tem sido amplamente

investigada compostos esteroides, em ativos todas como as partes alcalides, chalconas, do mundo e j levou ao isolamento dos propenofenois, di-hydrochalcones, ligninas, flavonas terpenos, e flavononas

piperolides,

(PARMAR et

al.,

1997),

que

podem

ser

os

responsveis

por

sua

atividade

antimicrobianas. Johann e colaboradores (2008) isolaram trs compostos com

atividade

antifngica

de P.

abutiloides:

pseudodilapiol,

conocarpan

Eupomatenoide-6. O composto pseudodilapiol teve atividade contra C. glabrata com CIM de 100 g/ml, C. albicans com CIM de 12.5 ug/ml, C. parapsilosis com CIM de 50g/ml, C. krusei e C. tropicalis com CIM de 6.2g/ml, e Cr.

neoformans e S.schencki com CIM de 12.5 g/ml. O composto Eupomatenoid-6 apresentou albicans na atividade contra C. de glabata na 100g/ml, C. concentrao de 0.3g/ml, C. concentrao de

concentrao

parapsilosis na

12.5g/ml, C.krusei na

concentrao

de

12.5g/ml, C.

tropicalis na

concentrao de 50g/ml, Cr. neoformans na concentrao de 1 g/ml e S. schenckii na concentrao de 25g/ml. J o composto Conocarpan apresentou atividade antifngica contra Candida glabata na concentrao de 3.1g/ml, C.

albicans na

concentrao

de

100g/ml, C.

parapsilosis na

concentrao

de

25g/ml, C.krusei na concentrao de 12.5g/Ml, C. tropicalis na concentrao

de 100g/Ml, C. neoformans na concentrao de 12.5g/ml e S. schenckii na

concentrao de 50g/ml (JOHANN et al., 2008). Portanto, existem diversos compostos presentes em P. abutiloides, que podem ser os responsveis pela atividade antifngica contra a linhagem de C.parapsilosis encontrada no

presente trabalho.

7 CONCLUSO
Neste trabalho foi verificado, dentre os cinco extratos de plantas

medicinais testados, que somente o extrato de P. abutiloides foi ativo contra a espcie C. parapsilosis, isolada de alimento. As substncias antimicrobianas
presentes neste extrato podem, aps futuros estudos, serem utilizadas como

um conservante de alimentos.

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