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Brenda Fina

DICROSMO CIRCULAR CD es una tcnica espectroscpica de absorcin que provee informacin acerca de la estructura de macromolculas biolgicas. La seal medida en CD es la diferencia entre las Abs (A) de la luz polarizada circularmente hacia la izquierda (l) y hacia la derecha (r): CD = A(r) - A(l) Se utiliza como fuente luz polarizada (UV-VIS) y las muestras a analizar, adems de absorber, deben ser ptica// activas: deben ser quirales, es decir, no disponer de un plano de simetra y no ser superponibles con su imagen especular. La teora de dicrosmo circular fue desarrollada por Biot y Fresnel: un rayo de luz polarizado en un plano puede considerarse formado por dos componentes polarizados circularmente, uno a la derecha y el otro a la izquierda. Estos componentes estn en fase y son de la misma amplitud. Al pasar por un medio pticamente activo (es decir que rota el plano de la luz polarizada), cada componente interacta de manera diferente con los centros quirales de las molculas presentes en el medio. Esta interaccin induce un desfasamiento y un cambio de magnitud en ambos componentes polarizados circularmente, lo que provoca una rotacin del plano de polarizacin en un ngulo alfa La desviacin en el plano de la luz polarizada se debe al cambio en el ndice de refraccin entre la luz polarizada circular a la izquierda y a la derecha. La distorsin de este plano genera una elipse:

A B (A) Los vectores de los componentes del haz antes de llegar a la muestra. (B) Esos mismos vectores despus de interactuar con los solutos de la muestra, fuera de fase. La onda resultante: polarizacin elptica, debido a la diferencia en absorcin que presenta la molcula para cada tipo de polarizacin circular. La rotacin del plano y la diferente absorcin de los componentes circularmente polarizados varan de acuerdo con la longitud de onda, pudindose obtener espectros de estos fenmenos, esto es, grficas de la rotacin o elipticidad versus la longitud de onda. Las medidas de CD se realizan determinando la diferencia de absorbancias entre la luz polarizada circularmente hacia la izquierda A(l) y hacia la derecha A(r). Teniendo en cuenta la ley de Lambert-Beer, que define el proceso de transicin electrnica en la espectroscopia UV-VIS, se puede expresar esta diferencia de absorbancias como: A() = AL() -AR(l) = [L() -R()].l.c= .l.c donde c es la concentracin molar del soluto quiral, es el coeficiente de extincin molar y l el paso de luz. Cuando la luz polarizada atraviesa un medio quiral, los vectores elctricos describen una elipse cuyo eje mayor se encuentra en un nuevo ngulo de rotacin. Cuando los vectores elctricos de las dos
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componentes circulares se encuentran en la misma direccin, la suma de sus magnitudes proporciona el eje semimayor de la elipse, y cuando estn en direcciones opuestas, la diferencia de sus magnitudes proporciona el eje semimenor de la elipse. El CD se define mediante la relacin entre el eje semimayor y semimenor. Esta relacin es la tangente del ngulo , conocido como elipticidad. Este ngulo generalmente es muy pequeo, por lo que puede aproximarse tan y se relaciona con la absorbancia mediante la siguiente expresin: = 32,98. A o expresado como elipticidad molar: [] = 3298.

tg = a/b

= arctg (a/b)

a es eje menor, b el mayor

vs.

espectro de CD

Los espectros de dicrosmo circular se obtienen generalmente en las regiones del ultravioleta cercano (250 a 350 nm) y lejano (180 a 250 nm) de la radiacin electromagntica. En la regin del ultravioleta cercano, los cromforos ms importantes son los grupos aromticos de las cadenas laterales de triptfano, tirosina, y fenilalanina. Ya que la asimetra en estos grupos qumicos se debe exclusivamente a su entorno y como los residuos aromticos se encuentran distribuidos en toda la macromolcula, los espectros en esta regin son un reflejo de la conformacin global de la protena. Adems las seales en esta regin son extremadamente sensibles a los cambios en la conformacin. Los espectros de dicrosmo en la regin del ultravioleta lejano, se deben principalmente a los enlaces amida que unen los residuos de los aminocidos entre s. La asimetra de estos cromforos se debe al arreglo espacial de la cadena principal de la protena, por lo cual, las seales de dicrosmo circular se pueden interpretar en trminos del contenido de estructura secundaria presentes, es decir, del porcentaje de residuos que se encuentran en alguna conformacin estructural (hlices , hojas , giros y otros tipos estructurales). Transiciones electrnicas: Las bandas observadas en los espectros de absorcin y de CD de macromolculas en solucin corresponden principalmente a las transiciones electrnicas entre los niveles vibracionales ms bajos y diversos niveles vibracionales en el primer estado excitado. Una transicin electrnica se produce porque el campo elctrico de la radiacin, el magntico o ambos inducen a los electrones a un nuevo estado de energa. El efecto del campo elctrico es un rearreglo lineal de los electrones llamado momento dipolar elctrico de la transicin y se denota por el vector . La direccin de es la misma que la del dipolo de polarizacin, esto es la direccin en la cual los electrones son empujados. El campo magntico induce un rearreglo circular de la densidad electrnica llamado momento dipolar magntico de transicin, m En una molcula aquiral la redistribucin neta de electrones se da siempre en el plano, pudiendo ser lineal (0; m=0) o circular (=0; m0), pero tambin puede darse que ambos momentos sean diferentes de 0 y en este caso el rearreglo es en una espiral. En una molcula quiral, el rearreglo de electrones durante una transicin es siempre helicoidal. Si la hlice formada por el movimiento de electrones es hacia la derecha (dextrgira), es ms fcilmente inducida por luz polarizada hacia la izquierda, y se observa una seal positiva de CD; mientras que si es hacia la izquierda, se induce ms fcilmente por luz polarizada hacia la derecha, y la seal es negativa. Esto es debido a que el vector del campo elctrico de la luz interacta con , y simultneamente el vector del campo magntico de la luz interacta con m.

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Estos dos sistemas aromticos tienen 6 anillos fusionados, en el primero son coplanares entre si y en el segundo, uno de los anillos esta en otro plano (el anillo 1 no est unido al 6). Si se mira desde arriba, el primero seria como una dona, y el segundo como un fraccin de hlice. En la molcula aquiral (la primera) hay una distribucin plana de los electrones, confinada en dos planos, uno por arriba de la molcula y otro por debajo, mientras que en la quiral (la segunda), la distribucin de los electrones es helicoidal. Entonces, tenemos que para el primer caso, el momento dipolar elctrico es cero (se anulan) y el momento dipolar magntico resultante es un vector hacia arriba (por la regla de la mano derecha). En el segundo caso, tanto el momento dipolar elctrico como el magntico son diferentes de cero. Ambos vectores estn dirigidos hacia arriba. El producto escalar de .m es tambin distinto a cero lo que implica que ambos vectores no son perpendiculares. Para que una transicin sea permitida en CD (para que una sustancia absorba en CD) debe inducirse una circulacin helicoidal de corriente, es decir, que el producto escalar entre los momentos dipolares sea distinto de cero. Esto es lo que se conoce como las reglas de seleccin de CD. Formas de anlisis de los espectros de CD: Para una coleccin de molculas quirales, se espera observar una seal de CD si los fotones de luz que inciden sobre la muestra tienen la energa suficiente para causar la transicin. La ecuacin que resume los requerimientos de paralelismo entre y m para un movimiento de electrones helicoidal necesario para CD es la ecuacin de Rosenfeld: R= Im { . m} R es la intensidad de CD para la transicin en una coleccin de molculas quirales orientadas al azar. Se lo conoce como la fuerza de CD o fuerza rotacional. Im significa la parte imaginaria de. Los mtodos para el anlisis de los espectros de CD son: Mtodos empricos: Se basan en la comparacin con otros sistemas. La mayora de las aplicaciones de CD involucran anlisis espectrales cualitativos y/o empricos. Por cualitativo se entiende que es la observacin: cuando se hace determinado cambio (aumento o disminucin de la T, etc), se observa dicho cambio en el espectro de CD. Si el anlisis es cuantificado midiendo el cambio en el espectro de CD en funcin de la concentracin, temperatura, fuerza inica, etc, y/o comparando con otro sistema relacionado (tanto espectroscpicamente como estructuralmente), entonces se trata de un anlisis emprico. Ab initio: Se basan en clculos a partir de la ecuacin de Rosenfeld. Estos clculos requieren mucho trabajo para asegurar que sean confiables, y generalmente solo sirven para un determinado sistema. Anlisis Cromofrico: La caracterstica principal de un cromforo como grupo funcional, es que puede ser considerado como una subunidad bien definida espectroscpicamente dentro de una molcula que es muy poco perturbada por el resto del sistema. Un cromforo aquiral aislado no tiene CD intrnseco, por lo que se puede deducir el CD inducido en una la transicin particular del medio que rodea al cromforo. Dado que los cromforos son aquirales, m=0, =0 o y m son perpendiculares entre si. La transicin m=0, 0 se llama dipolo elctrico permitido, dipolo magntico prohibido. La transicin m0, =0 es dipolo
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magntico permitido, dipolo elctrico prohibido. La intensidad de CD es inducida por los dos tipos de transiciones, la primera (m=0, 0) requiere la induccin de la componente magntica, mientras que la segunda (m0, =0), la de la componente elctrica. Dependiendo de cual componente sea inducida se podrn determinar aspectos de la geometra de la molcula. Cromforo Amida: El enlace peptdico posee una rotacin limitada respecto al enlace O=C-NH debido a su carcter parcial de doble enlace que resulta de la deslocalizacin de un par de electrones no enlazante del tomo de nitrgeno. Por lo tanto no es pticamente activo por si mismo, pero el entorno quiral en el que se encuentra hace que pueda ser detectado por CD.

Hay dos enlaces con rotacin permitida: R-C-NH determinado por el ngulo y O=C-C-R determinado por el ngulo . Las diferentes estructuras secundarias que se encuentran en pptidos y protenas se definen segn los valores de estos dos ngulos diedros del esqueleto polipeptdico, por lo que son los responsables de los espectros de CD particulares de los diferentes elementos de estructura secundaria (-hlice, lamina , etc).

experimentar dos transiciones electrnicas:

El enlace amida absorbe la luz en el UV lejano y puede

1. * Momento dipolar elctrico La transicin tiene un momento dipolar elctrico neto por lo que hay un desplazamiento lineal de la carga. No hay momento dipolar magntico.

2. n

* Momento dipolar magntico La transicin no tiene un momento dipolar elctrico neto, pero si un pequeo momento dipolar magntico por lo que hay un desplazamiento circular de la carga. (Al pasar al *, la carga se desplaza por encima y/o por debajo del plano transicin rotacional)
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La transicin * es la de mayor energa porque se pasa de un orbital enlazante a uno antienlazante y se observa como un pico positivo a 190nm; la transicin n * es de menor energa ya que se pasa de un orbital no enlazante a uno antienlazante, y se visualiza como un pico negativo centrado a 220nm El cromforo Fenilalanina La cadena lateral de la Phe tiene un alto grado de simetra por lo que absorbe uy dbilmente. El espectro tiene 4 bandas vibracionales que pueden ser positivas o negativas y tienen diferentes intensidades. En el espectro de CD de una protena, la estructura vibracional de la Phe puede observarse cuando la protena est plegada. Debido al alto grado de simetra, la Phe tiene el menor coeficiente de extincin molar, y en consecuencia la menor fuerza rotacional de los 3 aa aromticos. Phe es tambin el aa menos sensible a los cambios en el entorno debido a que la transicin es insensible al cambio en la polaridad del solvente. El cromforo Tirosina Es ms asimtrico que la Phe, por lo que las bandas son ms intensas. Las bandas vibracionales tienen todas el mismo signo. En una protena plegada, el espectro de absorcin de este aa est compuesto por bandas anchas superpuestas, y el pico principal est a 276nm con un hombro a 283nm. La Tyr es capaz de formar puentes de H, lo que disminuye su energa de transicin del estado basal al excitado y lleva a un corrimiento del espectro hacia el rojo. La posicin del pico de la Tyr puede dar indicios sobre el entorno de la misma. El cromforo Triptfano El Trp absorbe mucho ms intensamente que los otros aa aromticos, sin embargo en una protena suele haber ms residuos de Tyr, por lo que la contribucin de ambos al espectro suele ser similar. El cromforo Puente disulfuro Este cromforo resulta de la unin covalente de dos Cys de una protena. Aunque la absorcin de este enlace es dbil, la intensidad de la banda en el espectro de CD puede ser fuerte. Sin embargo, la contribucin al espectro de CD de este cromforo est siempre bajo los cromforos aromticos. La contribucin del cromforo disulfuro al UV cercano es un pico que puede ser positivo o negativo, entre 250 y 300nm, sin bandas vibracionales distinguibles.

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Espectro de dmeros en CD Si dos cromforos son idnticos o muy parecidos y estn muy cerca pero no en el mismo plano, se va a ver un acoplamiento significativo en las transiciones de ambos que se dan a la misma energa (E): los de estas transiciones tienen igual modulo, pero distinta orientacin y sentido por lo que se acoplan para dar una de las dos hlices segn se encuentren en fase o desfasados, por lo que en el espectro de CD se espera observar dos picos. Las dos hlices que se formen tendrn igual magnitud, pero seal de signo opuesto en el espectro de CD y energas muy cercanas a E, por lo que se ver un espectro con dos picos, uno negativo y uno positivo. El ejemplo ms simple es el de los anillos bifenilos: estos no son coplanares y dependiendo de los sustituyentes que tengan van a adoptar una orientacin determinada. Los anillos A y C son idnticos, son dos cromforos aquirales que aislados no tienen seal en CD debido a que sus momentos dipolares son perpendiculares (.m=0). Sin embargo, el dimero AC s va a tener seal en el espectro de CD ya que una de las componentes del momento dipolar magntico de C puede interaccionar con la componente del dipolo elctrico de transicin de A y como A y C son iguales (tienen la misma energa), se produce un acoplamiento en sus momentos dipolares de transicin, esto es lo que se denomina acoplamiento excitnico. As se observa un desdoblamiento excitnico en el estado excitado, y en consecuencia va a haber seal de dicrosmo. Desdoblamiento Excitnico: es la energa de interaccin entre dos dipolos. Depende del mdulo, la distancia (r) y la orientacin de cada dipolo:

1 r

E = E V12 Donde V12 es la energa de interaccin dipolar, que en trminos del espectro se denomina desdoblamiento excitnico entre los monmeros. Es normalmente el valor que sube o baja la energa, es decir la diferencia entre los dos nuevos niveles de energa. V1,2 = 1. 2 _ 3(1. r) (2 r) r r Si la interaccin entre los dipolos es atractiva, entonces V12 es menor que 0, si es repulsiva, es mayor. . r = .r cos ; siendo es el ngulo entre el dipolo y la distancia.
3 5

Las energas de las dos bandas son:

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Si =0 (paralelos) cos = 1 . r = .r Si =90 (perpendiculares) cos = 0 r = 0. Los momentos dipolares no interactan por lo que no hay seal en CD. Como el desdoblamiento es inversamente proporcional a la distancia (r), solo voy a ver perturbaciones cuando los cromforos estn lo suficientemente cerca (2 a 3 A) El signo y magnitud de cada banda est dada por la fuerza rotacional R: R = E RAC (sen ) (sen ) (sen ) / 4h Donde RAC es el vector que va desde A a C, el ngulo es el comprendido entre RAC y ; es el ngulo c a c + entre RAC y y el ngulo comprendido entre y . R corresponde a la transicin que ocurre a la + energa E y R a la que ocurre a la energa E . Si 0<<180, los tres vectores, RAC, y (CAR) forman un sistema de coordinadas a mano derecha, y entonces la seal de CD para el estado + es positiva, mientras que si 180<<360 los tres vectores forman un sistema de coordinadas hacia la izquierda y la seal positiva corresponde al estado -. El espectro de CD que se obtenga para un dmero depender del ngulo entre los dos dipolos, es decir del valor del ngulo , que se define como la orientacin relativa del momento magntico de un cromforo con respecto al otro. As se concluye que el espectro resultante depende de la conformacin. Volviendo al ejemplo de los bifenilos, donde = = 90, podemos hacer rotar un anillo con respecto al otro (variar ) y observar el espectro obtenido:
a c a 2

1. Si 0<<90

2. Si 90<<180

3. Si 180<<270

4. Si 270<<360

V>0 V<0 V<0 Si == 0 R =0 no existe quiralidad Si ===90 R mximo; V=0 CD experimental nulo =0 R =0 CD experimental nulo Si == 90 = 270 V= 0 = 45/ 135 mximo CD experimental.

V>0

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Desde el punto de vista experimental, hay dos situaciones que no se pueden distinguir, el caso 1 y 3 son iguales; y el caso 2 y 4 tambin. Esto es debido a que tanto la seal de CD (R), como la energa, no varan al pasar de uno a otro.

V12

Desdoblamiento Excitnico: 2V12

E0

E0

E0

Absorbancia

Entonces, para un dmero formado por dos cromforos interactuantes puede describirse el espectro de CD como: + + Formado por dos bandas de igual magnitud pero de signo opuesto, R centrada a E y R centrada a E. R depende de la intensidad de las transiciones de los cromforos aislados y de su orientacin relativa y distancia. V12 tiene un valor bajo por lo que las bandas se encuentran centradas a escasa distancia y gran parte de las seales se cancelan. R es mximo cuando ===90, pero en este caso, V12=0 y las seales se cancelan. Anlisis de la estructura proteica usando CD: CD es una de las tcnicas mas sensibles para determinar las estructuras 2rias y monitorear cambios en dicha estructura. Es el puente de unin entre la secuenciacin (estruc 1ria) y las tcnicas cristalogrficas o RMN (estruc 3ria) El cromforo en el UV lejano (180 a 250nm) es el enlace peptdico; y en el UV cercano (250 a 350nm) son los residuos aromticos, Tyr, Trp y Phe, y el pte S-S de Cys. El CD en el UV lejano permite
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obtener medidas empricas de la estructura de la protena y su conformacin. Se pueden diferenciar hlices, hojas giros y random coil. En el CD en el UV-cercano se debe constatar que la protena tenga un espectro. La intensidad en el cercano es mucho menor que en el lejano por lo que se requiere mayor cc de protena. Esto es debido a que en una protena hay menos residuos aromticos que enlaces peptdicos. Este tipo de CD depende del plegamiento de la protena (estructura 3ria) y es como una huella dactilar de la misma en condiciones nativas (plegada). Esto implica que este mtodo es til para saber si la protena est correctamente plegada. Tambin se puede seguir el cambio conformacional provocado por algn ligando que se una a un residuo aromtico.

UV Lejano

UV Cercano

En amarillo se observa el espectro en el UV Lejano de la protena plegada y en verde el de la misma protena pero desplegada o desnaturalizada. Esta ltima casi no tiene seal de CD debido a que como la protena pierde su estructura secundaria, pierde su quiralidad. En el UV-Cercano se verifica que la protena tenga un espectro, es un control cualitativo que sirve para chequear la integridad de la protena. En una protena plegada o pptido el enlace amida no se encuentra aislado sino en un arreglo continuo y debido a las interacciones entre los grupos amida de las protenas es que cambia la estructura electrnica y las propiedades espectrales. El desdoblamiento excitnico es entre los planos definidos por los enlaces peptdicos, que actan como dmeros muy similares aunque los aa tienen distintos grupos R. Los desdoblamientos que surjan van a depender de la orientacin de uno de los planos con respecto al siguiente. Si se cumplen los dos requisitos para que haya dicrosmo cuando tenemos un dimero, que ambos cromforos estn lo suficientemente cerca y que sean muy parecidos, entonces podremos ver el espectro de CD. De acuerdo al tipo de estructura secundaria de la que se trate, se van a tener patrones de acoplamiento, distancias y orientaciones caractersticas. La Poly-L-Lisina se utiliz como modelo debido a que en solucin acuosa y a distintos pH adquiere diferentes estructuras secundarias. Grficos de CD de las estructuras secundarias UV-Lejano Hay dos transiciones en el UV lejano tanto para las protenas plegadas como para las desordenadas. Una es la transicin * que se presenta como un pico positivo a 212 nm, y la otra es negativa a 195nm y corresponde a la n *. -hlices: En la estructura de hlice la secuencia aminoacdica gira alrededor de un eje y las cadenas laterales quedan en la superficie de la hlice. Cada giro tiene una unidad repetitiva de 3.6 aminocidos. La

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hlice se encuentra estabilizada por enlaces de hidrgeno de los grupos amida, entre el hidrgeno unido al nitrgeno (electropositivo) del residuo (i) y el tomo de oxgeno (electronegativo) del residuo (i+4). Las hlices son anfipticas; tienen una zona polar en la superficie y una zona hidrofbica en la cara interna.

Los espectros muestran un doble mnimo a 222nm y 208nm, y un mximo intenso a 191nm. El mximo presenta una intensidad alta debido a la asimetra intrnseca de hlice. Las intensidades de las 3 bandas reflejan el grado de abundancia de la estructura helicoidal en la protena. La transicin * se desdobla en 2 transiciones debido al acoplamiento excitnico: * mximo positivo a 191nm. Es la de mayor energa. * mnimo negativo a 208-210nm Adems, el acoplamiento excitnico de esta transicin, baja la energa de la transicin n * produciendo un corrimiento hacia el rojo. As, la transicin n * se presenta como un mnimo negativo a 222nm Lmina : La cadena polipeptdica est prcticamente extendida en forma de lmina. La distancia axial entre los aminocidos es de 3.5 y est estabilizada por puentes de hidrgeno entre grupos NH y CO de las diferentes cadenas polipeptdicas. Las cadenas adyacentes en la hoja pueden estar dirigidas en la misma direccin (hojas paralelas) o en direcciones opuestas (hojas antiparalelas).

Las protenas con estructura 2ria mayoritariamente presentan un mximo simple y un mnimo simple, pero sus espectros son muy variables porque las hojas pueden ser paralelas o antiparalelas y por la variacin en el largo y ancho.
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* banda positiva entre 190 y 200nm n * banda negativa entre 210 y 225nm + :

En las protenas que son mezcla de 2 dominios: y separados, generalmente predomina la forma del espectro de la hlice, ya que esta es intrnsecamente asimtrica. Sin embargo, la intensidad del mximo es mucho menor que en el espectro de la hlice sola. + significa que la protena tiene ambos dominios, pero bien diferenciados en el espacio: primero un dominio y luego uno , o al revs. n * banda negativa a 222nm (mnimo) * banda negativa a 208-210nm (mnimo) * banda positiva a 190-195nm (mximo) La banda a 208-210nm tiene mayor intensidad que la de 222nm /: 210 > 222

/ significa que la protena tiene una mezcla de los dos dominios. El espectro es similar al anterior. La diferencia es que la banda a 222nm generalmente tiene mayor intensidad que la banda a 208-210nm. 210 < 222

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Random Coil:

Para las protenas sin estructura ordenada (oligopptidos, polipptidos cortos con puentes disulfuro o grupos prostticos y protenas desnaturalizadas) se observa un mnimo intenso a 200nm y puede haber algunos mximos o mnimos dbiles por encima de 210nm debido a las partes de la protena plegadas al azar. Giros : Los giros se producen cuando la cadena peptdica cambia bruscamente y, generalmente se encuentran en zonas superficiales de las protenas. En el giro estn involucrados cuatro residuos que estn formando un ngulo de 180 grados.

global.

Los giros tienen un espectro bien definido, sin embargo son difciles de observar en el espectro

El espectro de los giros tipo I se parece al de las hlices en la regin del UV 210 a 220 nm, pero la banda positiva a 190 es ms dbil. Los giros tipo II originan un espectro similar al de la hoja , pero corrido al rojo entre 5 y 10nm. En ciertas circunstancias los giros tipo I pueden dar un espectro similar al del tipo II. Las transiciones caractersticas de un giro son las n * que muestran una banda negativa dbil a 220-230nm y la * que muestra una banda positiva a 220-210nm y una negativa a 180-190nm.

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El espectro en el UV-lejano se puede suponer como la suma de los espectros componentes de la estructura 2ria: t = x + x + xc c Siendo t la elipticidad experimental corregida, x un factor que se calcula a partir de la estructura terciaria de la protena obtenida por cristalografa de rayos X, y son los espectros de cada tipo de estructura, hlices , laminas y random coil. El segundo trmino presenta un error intrnseco ya que la estructura se puede perder debido a la gran variabilidad en los espectros de las hojas beta y el tercer trmino presenta un error entre el 5 y 10%, debido a que se pierden los giros . Cuando se tienen una protena en estudio no conocida, con CD solo puedo saber el porcentaje de estructura secundaria que presenta. Por medio de algoritmos se ajustan los espectros de protenas conocidos al nuestro y se obtiene el % de cada estructura 2ria componente de la protena, y una supuesta estructura 3ria que luego se debe corroborar por medio de otras tcnicas. Por otro lado, comparando con otras protenas de estructura conocida se puede predecir la ubicacin de esas estructuras secundarias. Para poder estimar la estructura secundaria hay que tener en cuanta las siguientes suposiciones: Las estructuras tridimensionales obtenidas por mtodos como cristalografa de rayos X se retienen en solucin acuosa (ya que x se calcula con la estructura cristalogrfica, y adems porque las estructuras de referencia se obtienen por este mtodo). (valido) La combinacin de los distintos elementos estructurales 2rios individuales se suman para dar el espectro de CD, y la estructura 3ria no influye. (no valido) Al espectro de CD en el UV-lejano solo contribuye el cromforo peptdico y no los AA aromticos y dems cromforos no peptdicos. (no valido) Cada elemento estructural (-hlice, hoja , etc) se describe como un simple espectro de CD, y el efecto de variabilidad geomtrica se asume como despreciable. (no valido) Instrumentacin: La caracterstica ms importante de un Espectropolarmetro de Dicrosmo Circular, es que debe contar con una fuente de luz polarizada. La fuente es inmvil, y debe ser lo ms intensa posible de forma de minimizar los ruidos. Generalmente es luz monocromtica. La luz polarizada circularmente puede ser construida a partir de dos haces de luz polarizada linealmente que tengan la misma magnitud pero que estn fuera de fase una respecto a la otra. La luz pasa a travs de un polarizador lineal que esta orientado a 45 del retardador de onda. Se elige un retardador de espesor tal que los dos haces emergentes estn desfasados en /2 cuando lo atraviesen, de manera que ambos constituyan luz circularmente polarizada hacia la derecha. Si el polarizador se rota 90, la luz es circularmente polarizada hacia la izquierda. La luz polarizada pasa por un modulador fotoelstico que consiste en un material que se comprime y expande para producir radiacin circularmente polarizada (generalmente un cristal de seleniuro de zinc) la cual incide sobre la muestra bajo estudio, colocada en una celda con ventanas de materiales estables. La radiacin que emana de la celda pasa a un detector que proporciona los espectros de dicrosmo circular.

Fuente

Monocromador Polarizador Retardador Muestra Detector Lock In Salida Modulador

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Brenda Fina

Aplicaciones y usos de CD: Determinacin de la estructura 2ria de protenas que no pueden ser cristalizadas. Estudio de ligando Estudio de cambios de entorno: pH, agentes desnaturalizantes, T, solventes, etc. Determinacin de estructuras 2rias de protenas de membranas (difciles de cristalizar) y dentro de vesculas lipdicas (in vivo) Estudio de interacciones protena-protena y cidos nucleico-protena Estudios de aspectos estructurales de: cidos nucleicos, polisacridos, pptidos, hormonas y otras molculas pequeas. Ventajas: Experimento simple, rpido y no destructivo. Requiere menores cc q las precisadas para RMN. Escala de t menor que RMN. Puede servir para el estudio de una interaccin ligando-MM, en donde el L tiene un muy corto t de residencia Se usa para cualquier tamao de molcula. Es el complemento de tcnicas ms detalladas y precisas (Cristalografa y RMN) Limitaciones: La deconvolucin de un espectro en 4 o 5 componentes que no varan de protena a protena puede ser una sobre simplificacin. Los espectros de referencia de prot 100 % -hlices no se pueden comparar con espectros de prot que solo tengan una fraccin de -hlices (la intensidad aumenta con la longitud de la hlice) Las bandas del UV-cercano puede contribuir al espectro en el UV-lejano. Las formas de las curvas en el UV-cercano dependen de la estructura 2ria y 3ria. Fuentes de error: Desviaciones y distorsiones en los espectros de estructuras tpicas, sobre todo en las laminas q tienen espectros muy variables La absorcin de los aromticos y ptes disulfuro. Error al suponer que no hay interaccin entre las estructuras 2rias (regla de aditividad) Absorcin del solvente: Hay que trabajar con buffers muy diluidos y que no absorban a menos de 200nm Consejos para obtener buena informacin a partir del espectro de CD: Primero es necesario correr un espectro de absorbancia normal para verificar que los valores de absorbancia mantengan linealidad segn la Ley de Beer y ver el rango de . Toda la luz que llegue a la celda debe pasar a travs de la muestra, no debe reflejarse en las paredes o base de la celda. Generalmente se usan cubetas cilndricas ya que estas tienen menos birrefringencia (lnea base de CD) y adems usan menor cantidad de muestra. Sin embargo, las celdas rectangulares son ms econmicas y pueden usarse para espectroscopia de absorbancia por lo que el CD y el espectro estndar se pueden hacer a partir de la misma muestra. Adems en estas ltimas se pueden hacer titulaciones seriadas ya que en un principio puede llenarse un 60% de la cubeta y luego ir agregando gradualmente. Se debe tomar el espectro de la lnea base con el solvente o buffer y luego sustraerlo al de la muestra para poder obtener el grfico final. El espectro de CD generalmente escanea de de mayor a menor, por lo que se debe seleccionar un rango de que comience al menos 20nm ms all que el que abarca la absorbancia normal. La concentracin de la muestra debe ser tal que los valores de absorbancia estn entre 0,2 y 1,5. Cuando es mayor a 2 la seal de CD no es confiable. El valor ptimo de absorbancia es 1,1. Para valores mayores, se debe verificar que la seal de CD sea proporcional a la cc de la muestra corriendo un espectro con una muestra diluida. Evitar buffer que absorban. Tengo que usar buffers que sean transparentes (fosfatos, boratos, Tris) Trabajar con bajas cc de fuerza inica.
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Brenda Fina

Evitar turbidez. Muchas veces lo que se hace es filtrar la muestra con filtros de 50 micras antes de ponerla en la cubeta para medir CD. Comparacin de CD con UV-VIS: El dicrosmo circular y la espectroscopia UV-vis son tcnicas de espectroscopia de absorcin electrnica basadas en el mismo proceso, el cambio de configuracin electrnica molecular del estado fundamental a un estado excitado debido a la absorcin de radiacin electromagntica. En el caso del UVvis se utiliza como fuente luz no polarizada, mientras que en los procesos dicroicos la luz est polarizada. En la forma de espectroscopia ms simple, la absorcin, se mide cuanta luz de una dada frecuencia es absorbida por una coleccin de molculas. Para que una sustancia absorba es necesario que cambie el momento dipolar de la transicin. El dicrosmo circular mide la absorcin diferencial de la luz polarizada circularmente hacia la derecha y hacia la izquierda. Como en CD se realiza una resta, se pueden obtener picos positivos y picos negativos, lo que permite ganar resolucin. As el CD tiene poca intensidad pero alta resolucin. Cuando se produce la interaccin entre 2 monmeros, se tiene un desdoblamiento excitnico de distinta energa. En UV-vis se obtienen 2 picos simtricos respecto de donde estara la transicin (E0) del + monmero, sin embargo que se pueda ver o no depende de la orientacin de los dipolos. As, si D o D es = 0, o si la intensidad de uno de los picos es mayor que la del otro, entonces un pico no se ver, y parecer que solo ha ocurrido un corrimiento al azul o al rojo dependiendo del caso. En CD, esto no ocurre. Si bien el V12 es el mismo que en UV-vis, ya que la muestra tiene las mismas transiciones, lo que cambian son las reglas de seleccin: Una componente es positiva y la otra negativa. + La intensidad de cada uno ya no depende del dipolo de transicin, sino de una fuerza rotacional R y R + La intensidad de R es la misma que la de R . En CD aparecen siempre las 2 componentes.

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