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CA
Departamento de Qumica Biolgica Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - UBA Pa elln !! " #to Piso $ttp%&&'''() (*cen(u a(ar

CA22E2A

B
Biologa

+,-2

Q
Qumica

E7PEC02/F/0/4E023A 5a espectro*otometra englo a una sere de t8cnicas analticas de gran utilidad para determinar la concentracin de sustancias en solucin( 5as t8cnicas espectro*otom8tricas de mayor utilidad en )umica iolgica son la a sorciometra9 en especial en el rango U:-:isi le9 y la medicin de *luorescencia( En am as t8cnicas se apro;ec$an distintos aspectos de la interaccin de las radiaciones electromagn8ticas con las mol8culas( Presentaremos por separado los aspectos <sicos so re las radiaciones electromagn8ticas y so re la energa de las mol8culas9 am os temas necesarios para entender la ase terica de estos m8todos( 5as radiaciones electromagn8ticas El espectro de radiaciones electromagn8ticas a arca un amplio rango de *recuencias( 5as de menor *recuencia son las ondas de radio9 seguidas por las microondas9 el in*rarro=o9 la >ona del ;isi le9 el ultra;ioleta9 los rayos . y la radiacin gamma ?*igura -@(

Figura -( Espectro electromagn8tico 5a descripcin de una radiacin electromagn8tica se puede $acer consider<ndola como un *lu=o de partculas ?*otones@ o ien como una onda propag<ndose en el espacio( De la descripcin ondulatoria9 se toma el concepto *recuencia ? )9 la cual se de*ine como el nAmero de ;eces )ue pasa un m<ximo de la onda por un punto dado del espacio por unidad de tiempo( /tro concepto Atil es el de Blongitud de ondaB )ue es la distancia en el espacio entre dos m<ximos consecuti;os de la misma y se sim oli>a con la letra griega lam da ? @( 4ientras la *recuencia es un in;ariante para una determinada radiacin9 la longitud de onda depende de la ;elocidad de esta en el espacio ?:@9 segAn% C:& 5a ;elocidad : est< determinada por el medio en )ue la onda se propaga( En el ;aco9 la E ;elocidad de la lu> es ; C c C D(-, m&s En un medio denso9 como el agua o una cu eta9 la ;elocidad es menor ?y por lo tanto la longitud de onda es mas pe)ueFa@9 y se calcula como% :Cc&n donde n es el ndice de re*raccin del medio(

5a longitud de onda N/ es un in;ariante caracterstico de una radiacin determinada ?por e=emplo9 el color ;erde tiene una longitud de onda de alrededor de G+G nanometros en ;aco o en el aire9 y de DHG nm en una cu eta llena de agua ?n C -(DD@( 5a *recuencia ?y su capacidad de impresionar los conos de la retina y $acernos ;er el color ;erde@ si lo es( 4<s all< de esto9 es comAn
+

re*erirse a las distintas *recuencias de la radiacin electromagn8tica dando como dato la Blongitud de onda en el ;acoB9 aun)ue el medio sea otro( En esta con;encin9 cuando se $a la de G+G nm9 se est< $a lando de lu> ;erde( Pasando de la descripcin ondulatoria a la cu<ntica9 la energa de un *otn ?E@ asociado a una radiacin de una *recuencia determinada es directamente proporcional a la *recuencia y la constante de proporcionalidad es la constante de PlancI ?$@( E C $ Com inando las expresiones anteriores ?y considerando la longitud de onda en el ;aco9 no la real@ tenemos% E C $c& 5a mol8cula( El estado energ8tico de una mol8cula se puede desglosar en cuatro contri uciones9 las cuales est<n *uertemente a*ectadas por la temperatura( - la energa de ida a las traslaciones - la energa rotacional ?rotacin de la mol8cula alrededor de sus e=es@( - la energa ;i racional ?;ariacin oscilante de las distancias entre nAcleos atmicos@( - la energa electrnica ?;ariacin de la densidad electrnica en los estados cu<nticos permitidos de la mol8cula@ Cada una de las contri uciones a la energa total de la mol8cula se encuentra cuanti>ada( Esto )uiere decir )ue al entregar energa a la mol8cula9 la energa de la misma aumenta en cantidades discretas y no en *orma continua( Dependiendo de la cantidad de energa reci ida esta se almacenar< en alguna de las *ormas arri a nom radas9 es decir9 acelerando la mol8cula9 gir<ndo mas r<pidamente9 $aci8ndola ;i rar en *orma m<s en8rgica o cam iando su densidad electrnica9 es decir9 promo;i8ndo la mol8cula a un estado electrnico excitado( 5a energa t8rmica es su*iciente para pro;ocar transiciones entre ni;eles de energa( Esto se puede compro ar experimental y tericamente( De los c<lculos se demuestra )ue a temperatura am iente existe una enorme cantidad de ni;eles traslacionales9 y a mayor temperatura estos se mue;en con mayor ;elocidad9 producto de la a sorcin de la energa t8rmica por las mol8culas( El nAmero de ni;eles rotacionales ocupados a temperatura am iente es muc$o menor ya )ue los ni;eles rotacionales est<n m<s espaciados en energa )ue los traslacionales( AAn as9 $ay cientos de ni;eles rotacionales ocupados en una mol8cula mediana a temperatura am iente( Algo similar ocurre con las ;i raciones aun)ue el nAmero de ni;eles ocupados a 0 am iente es aAn menor ?los cuatro o cinco ni;eles m<s a=os@( En cam io9 los ni;eles electrnicos no alcan>an a excitarse a temperatura am iente y casi todas las mol8culas ?en ausencia de-otra *uente de energa@ se encuentran en el estado energ8tico mas a=o9 llamado estado *undamental( De ido a la di*erente separacin de los ni;eles energ8ticos9 se puede pro;ocar una transicin entre ni;eles rotacionales entregando una energa )ue no alcance para pro;ocar una transicin ;i racional ?ni electrnica9 por supuesto@( 5as energas necesarias para estas transiciones caen en la >ona de las microondas( 7 la energa entregada es mayor ?microondas de mayor energa o !2 le=ano@
D

podremos estudiar las transiciones ;i racionales ?en este caso9 en e)uipos su*icientemente sensi les9 tam i8n se nota la contri ucin de los ni;eles rotacionales cuya separacin no es desprecia le *rente a la de los ni;eles ;i racionales@( 7i la energa entregada es aAn mayor ?!2 cercano9 ;isi le9 U: cercano@ y se excitan los ni;eles electrnicos9 la contri ucin por los ni;eles ;i racionales no se puede medir con precisin pero a*ecta la apariencia de los espectros de a sorcin ?anc$o de las andas9 $om ros9 etc@( Fotones de energa mas alta ?U: le=ano9 rayos .9 rayos ) ioni>an o destruyen la mol8cula y&o dan lugar a reacciones nucleares@ 5a interaccin radiacin-mol8cula Este proceso es simplemente un intercam io de energa entre los *otones y la mol8cula( 5os *otones cuya energa sea su*iciente para pro;ocar un cam io en alguno de los componentes de la energa de la mol8cula9 podr< ser a sor ido en algunos casos( En un e)uipo adecuado podemos cuanti*icar la intensidad ?esto es9 la energa total producto de los *otones )ue llegan al detector por unidad de tiempo@ de un $a> de cual)uier radiacin electromagn8tica( En el caso de la lu> ;isi le9 !2 y U: cercanos9 se utili>an como detectores los *otodiodos9 *ototransistores y *otomultiplicadores( Conociendo la intensidad de la lu> incidente so re un determinado material9 y midiendo la intensidad del $a> luego de atra;esar la muestra podremos9 en el caso )ue exista a sorcin de *otones9 cuanti*icar esta a sorcin( Como ;imos9 disponemos de un amplio espectro de energas en las radiaciones electromagn8ticas como para poder estudiar di*erentes aspectos de una mol8cula( Con radiaciones de a=a energa ?microoondas@ podremos estudiar los ni;eles energ8ticos rotacionales de las mol8culas y calcular importantes par<metros estructurales ?so re todo en mol8culas pe)ueFas@( Al aumentar la energa de la radiacin ?in*rarro=o le=ano@ comen>amos a excitar los ni;eles ;i racionales de las mol8culas y con los espectros o tenidos se pueden $acer estudios estructurales e identi*icacin de compuestos( 5a excitacin de las mol8culas con lu> ;isi le o ultra;ioleta pro;oca modi*icaciones en la distri ucin de los electrones( 5a distri ucin y tipo de los enlaces de una mol8cula determinan la separacin entre los ni;eles energ8ticos electrnicos permitidos9 y por lo tanto9 la energa re)uerida al *otn incidente para )ue sea a sor ido( Por e=emplo un ;idrio es incoloro por )ue no a sor e *otones en el espectro ;isi le( Un $a> de lu> lanca9 o sea )ue contiene *otones de todas las *recuencias dentro de la >ona del ;isi le pasa a tra;es del ;idrio incoloro y sale lanca9 o sea ningAn *otn *ue a sor ido( Un ;idrio coloreado a sor e *otones de ciertas longitudes de onda con relati;a *acilidad y pro;oca un cam io de color en el $a> emergente( Una lu> ultra;ioleta de menos de J D,, nm ?recordar )ue siempre $a lamos de longitud de onda en ;aco9 aun)ue en el ;idrio sea otraK@ no logra atra;esar una capa de ;idrio ya )ue los *otones de mayor energa son a sor idos( El ;idrio comAn es BnegroB para )uienes tu;ieran o=os )ue solo ;en el U:( 5os e)uipos utili>ados para mediciones de a sorcin U:-;is9 tam ien llamada Bespectroscopa electrnicaB9 y )ue en rigor muc$as ;eces incluyen una regin del in*rarro=o cercano ?L,,--+,, nm@ se componen <sicamente de% - una *uente de lu> ?l<mpara de tungsteno para el ;isi le-!2 y de deuterio o xenon para el ultra;ioleta@ - un sistema )ue permita dispersar las radiaciones de di*erente longitud de onda emitidas por la *uente9 generalmente red de di*raccin9 antes un prisma( - un detector ?en el pasado un *ototu o9 actualmente dispositi;os de estado slido como *otodiodos o *ototransistores@(

5as muestras se colocan en solucin y dentro de cu etas adecuadas( 5as cu etas se colocan en el paso de la lu> $acia el detector( Es importante no rayar las paredes de las cu etas ya )ue esto a*ecta la precisin de las mediciones( 7i alguna de las sustancias contenidas en la cu eta a sor e parte de la lu> incidente9 notaremos una disminucin en la intensidad del $a> trasmitido respecto al $a> incidente9 a la longitud de onda )ue corresponda( El logaritmo de la disminucin relati;a ?llamado a sor ancia@ ser< proporcional a la concentracin de mol8culas presentes en la solucin y a la longitud del camino ptico ?espesor de la cu eta@( 5a relacin entre estos par<metros se llama ley de 5am ert-Beer% A C -log !t&!o .l(c En esta ecuacin9 A es la a sor ancia9 ! t es la lu> transmitida )ue sale de la cu eta9 ! o es la intensidad de la lu> antes de pasar por la cu eta9 l es el espesor de la cu eta9 c es la concentracin y es la constante de proporcionalidad )ue depende de la sustancia )ue a sor e la lu> as como de la longitud de onda de la lu> incidente( El signo Baproximadamente igualB nos indica )ue la 5ey de 5am ert-Beer no se cumple siempre en *orma exacta9 mientras )ue los dos primeros miem ros de la igualdad son estrictamente iguales9 dado )ue -log !t&!o es la de*inicin de la a sor ancia( En la escala de molaridad ?la mas ampliamente usada y recomendada por !UPAC@9 la constante corresponde a la a sor ancia de una solucin -4 de dic$a su stancia9 por lo )ue se la llama Ma sorti;idad molarN( 7u nom re antiguo9 presente aAn en muc$os textos es Mcoe*iciente de extincin molarN( En otras escalas de concentracin se pre*iere utili>ar otra letra9 para e;itar con*usiones( 5a a sor ancia se relaciona con la disminucin de la intensidad de un $a> de lu> )ue atra;iesa la muestra9 pero no de manera lineal9 sino logartmica( Por lo tanto9 dado )ue la a sor ancia de una su stancia suele cam iar muc$o con la longitud de onda9 de e usarse ?para una medicin correcta@ una lu> monocrom<tica( OPor )u8P Para e=empli*icar esto9 imaginemos )ue una medicin de una solucin - m49 )ue se e*ectAa usando dos longitudes de onda di*erentes simult<neas9 - y +9 )ue corresponden a la a sorti;idades ----molares - C D#, 4 cm y + C L-, 4 cm 9 en ;e> de usar una longitud de onda promedio prom( Para *acilitar los c<lculos9 supongamos )ue la a sorti;idad real a prom es tam i8n un promedio ? prom --C G+G 4 cm @9 como se ;e en la *igura +( Esta es una situacin comAn en el B ordeB de una anda de a sorcin(

Figura +
G

Para una intensidad de lu> incidente igual para am as longitudes de onda9 de ;alor ! *otones&seg y una cu eta de - cm de longitud9 tenemos% a -% !o? -@ C -, *otones&seg A? -@ C ,9D# -Q -,9D# -Q !t ? -@ C -, *otones&seg x -, C ,9#GL(-, *otones&seg a +% !o ? +@ C -, *otones&seg A? +@ C ,9L-Q -,9L-Q !t? +@ C -, *otones&seg x -, C ,9-HG(-, *otones&seg
-Q -Q

C -,

-Q

7i la lu> N/ es monocrom<tica9 y al detector llegan tanto - como +9 y nosotros tratamos de $acer la medicin usando la longitud de onda BpromedioB9 tenemos( !o ?total@ C +(-, *otones&seg -Q -Q -Q !t ?total@ C ,9#GL(-, *otones&seg R ,9-HG(-, *otones&seg C ,9QG+(-, *otones&seg 5a a sor ancia medida con lu> no monocrom<tica es A C - log ?!t &!o@ C ,(#EL )ue no corresponde a la a sor ancia de medir con una lu> monocrom<tica de longitud de onda prom 9 )ue $u iera dado A C ,(G+G( 7i usamos una lu> no monocrom<tica9 con centro en prom y )ue se extiende de - a +9 tendremos un error por de*ecto en la concentracin del L9+S En resumen9 de e usarse lu> monocrom<tica9 dado )ue la suma de logaritmos no es el logaritmo de la suma Determinacines en la pr<ctica El primer paso para una determinacin cuantitati;a implica el an<lisis del espectro y la seleccin de la longitud de onda de algAn m<ximo de a sorcin en el cual se pueda medir la a sor ancia( 7e de e tener presente la existencia de posi les inter*erentes en la solucin )ue pudieran enmascarar la a sor ancia del compuesto a determinar( En este caso se pueden $acer mediciones a dos o m<s longitudes de onda di*erentes y calcular o descontar el aporte de las inter*erencias ?Ocmo lo $araP@( 7i para el sistema en estudio se cumple la ley de 5am ert-Beer ;eremos )ue la dependencia de la a sor ancia con la concentracin es lineal( 5a ecuacin correspondiente es ACm (c donde m es la pendiente de la recta y comprende a la a sorti;idad y el espesor de la cu eta9 am os constantes ?recordemos )ue la a sorti;idad depende de la longitud de onda9 la cual de e mantenerse esta le@( Para poder o tener una relacin entre la a sor ancia y la concentracin de la sustancia a determinar9 se construye una cur;a de cali racin( Pare esto se preparan standards de concentraciones conocidas en las mismas condiciones )ue las muestras a determinar ?mismo sol;ente9 mismo pT9
-Q

etc(@( A estos standards se los somete al mismo procedimiento )ue a las muestras para determinar la a sor ancia ?reacciones )umicas9 extracciones9 etc@( Con las concentraciones y las a sor ancias medidas en los patrones se calculan los par<metros de la recta ACm(c ?pendiente9 ordenada al origen9 + coe*iciente de correlacin r @( Entonces9 una ;e> )ue se miden las a sor ancias de las muestras incgnita9 se calcula la concentracin en cada tu o utili>ando los par<metros de la recta de cali racin( El m8todo de la cur;a de cali racin tiene sus limitaciones )ue de en ser tenidas en cuenta( 5a m<s importante es )ue en las >onas de mayor concentracin se suelen o ser;ar des;iaciones de la linealidad( Estos des;os pueden ser $acia ;alores mayores de a sor ancia )ue los calculados ?des;iaciones positi;as@ o $acia ;alores menores ?des;iaciones negati;as@( 5a existencia de des;iaciones depende de cada sistema de medicin y de e ser anali>ado de antemano para conocer el rango Atil de concentraciones en el )ue ese m8todo es con*ia le( El rango de concentraciones utili>ado para la cur;a de cali racin de e ser elegido de *orma tal )ue las muestras incgnita den un ;alor de a sor ancia comprendido entre los extremos de la cur;a de cali racin( 5a cota m<xima tam i8n est< limitada por la concentracin a partir de la cual se o ser;en des;iaciones de la linealidad ?si una muestra da una lectura en la >ona no lineal se la de er< diluir adecuadamente9 notar )ue si antes de la lectura se $i>o una reaccin )umica la dilucin se de er< $acer antes de la adicin de reacti;os@( !nstrumentos 5os espectro*otmetros pueden ser de simple o de do le $a> con monocromador9 o i8n de matri> de diodos( En los dos primeros casos el es)uena de los e)uipos 8s similar9 constan de una *uente de lu>9 un sistema selector de longitud de onda ?monocromador@9 un sitio donde colocar la cu eta ?a tra;es de la cual pasa la lu> ya monocrom<tica@ y un detector( En los e)uipos de simple $a> ?por e=emplo el ;ie=o y conocido spectronic +,@ existe un solo compartimento donde colocar la cu eta mientras )ue en los de do le $a>9 los compartimentos son dos% uno para la cu eta )ue lle;a la muestra y el otro para la cu eta con la solucin de re*erencia( A$ora ien9 OCu<l es la ;enta=a de usar un e)uipo de do le $a>P 5a respuesta9 mas all< de la construccin espec*ica del instrumento9 radica en )ue el de do le $a> es capa> de cali rarse constantemente con la celda de re*erencia9 de modo )ue ;ariaciones de sensi ilidad en el detector y&o de intensidad de la *uente de lu> no a*ectan la medida( En un instrumento de simple $a>9 en cam io9 es con;eniente e*ectuar una medida del lanco inmediatamente antes de $acer una medicin9 y tam i8n una medida de Boscuridad totalB( De esta *orma minimi>amos la posi ilidad de cometer errores de ido a la inesta ilidad de los elementos internos del e)uipo( ?Por supuesto9 a cada longitud de onda $ay )ue $acer esta ;eri*icacin( 5os e)uipos )ue cam ian mec<nicamente la longitud de onda lo $acen en *orma autom<tica@( En los e)uipos de matri> de diodos9 cada ;e> mas usados9 la lu> se pasa por la cu eta antes de llegar a la red de di*raccin( 5uego9 la lu> )ue sale9 y a la cual ya le *altan las *recuencias a sor idas9 es dispersada por una red de di*raccin )ue la en;a $acia miles de detectores minAsculos ?la matri> de diodos@( Este tipo de espectro*otmetro permite tomar un espectro completo en milisegundos9 y no tiene partes m;iles( 7u des;enta=a ?muy menor@ radica en )ue pasa m<s lu> por la muestra9 y toda a la ;e>(

4U0/D/7 PA2A 5A CUAN0!F!CAC!1N DE P2/0E3NA7 E7PEC02/F/0/4U02!C/7 a@ 4U0/D/7 D!2EC0/7% i@ !n;olucran medicin de a sor ancia( El dosa=e de protenas se $ace en solucinV los lmites del dominio de medicin corresponden a la >ona del espectro donde el sol;ente no a sor e o lo $ace en *orma desprecia le( Por lo tanto9 las mediciones de a sorcin en solucin acuosa est<n limitadas al ultra;ioleta cercano y a la >ona ;isi le del espectro( 5as mol8culas )ue a sor en a estas longitudes de onda se conocen como crom*oros% estos son9 principalmente las mol8culas )ue tienen anillos arom<ticos o do les ligaduras con=ugadas( En el caso de las protenas los crom*oros son los residuos de amino<cidos arom<ticos y las uniones peptdicas ?0a la -@( 5a a sorcin de un crom*oro a una longitud de onda determinada depende de su naturale>a9 de su concentracin y de la longitud del camino ptico dentro de la solucin( Esto se representa en la ley de 5am ert-Beer% A .l(c A% a sor ancia del crom*oro a una longitud de onda de determinada( % a sorti;idad molarV tam i8n llamada coe*iciente de extincin molar( l% longitud del camino ptico en la cu eta( c% concentracin del crom*oro en la solucin9 en moles&litro( 0a la -% Caractersticas espectrales de los crom*oros( Crom*oro 5ong( de onda para la A sorti;idad molar a sorcin m<xima ?nm@ ?5&mol(cm@ 0ripto*ano +E, G(Q,, 0irosina +LG -(#,, Fenilalanina +GL +,, Unin peptdica -H, #-E(,,, Puente disul*uro +G, D,, 5as t8cnicas espectro*otom8tricas tam i8n tienen otras *uentes de ;ariacin9 por e=emplo9 en el caso de la tirosina se de e considerar el pT por existir una *orma *enlica( A la ;ista de la ecuacin de la 5ey de 5am ert-Beer es di*cil imaginar un m8todo de dosa=e de un crom*oro por la medicin de su a sor ancia a una longitud de onda determinada( Para o tener una sensi ilidad m<xima9 es pre*eri le elegir una longitud de onda correspondiente a un pico de a sorcin( Es necesario notar9 de todos modos9 los pro lemas de inter*erencias en el curso de estas e;aluaciones groseras )ue pudieran resultar de la presencia o no de9 por e=emplo9 <cidos nucleicos o compuestos arom<ticos ?0a la +@( 0a la +% Comparacin entre la medicin a +E, nm y +,G nm( 6rupos arom<ticos ?+E, nm@ Unin peptdica ?+,G nm@ :EN0AWA7 6ran espectro de sensi ilidad Protenas sin grupos arom<ticos DE7:EN0AWA7 !nter*erencia de <cidos nucleicos Deteccin de otros compuestos u otros compuestos arom<ticos )umicos ?sol;entes9 etc(@

ii@ !n;olucran medicin de *luorescencia( 5as protenas presentan *luorescencia en el ultra;ioleta cercano9 de ida al tripto*ano9 la tirosina y a ciertas coen>imas como NADT y NADPT ?0a la D@( Esta *luorescencia se puede apro;ec$ar para el dosa=e de protenas( De ido a las di*erencias en el entorno de los *luor*oros9 en la estructura nati;a de las protenas9 el espectro de emisin y la e*iciencia cu<ntica ?nAmero de *otones emitidos&nAmero de *otones a sor idos@ ;aran de una protena a otra( 5as di*erencias en los entornos de los *luor*oros entre protenas tienden a desaparecer cuando existe desnaturali>acin( Es importante notar )ue el espectro de emisin de una protena )ue contiene a la ;e> tirosina y tripto*ano depende de la longitud de onda de excitacin( En e*ecto9 en el caso de una excitacin a +L, nm9 la tirosina es capa> de trans*erir la energa de un *otn a sor ido al tripto*ano9 )ue podra emitir a DG, nm( Esta trans*erencia es inexistente si la excitacin se $ace a +H, nm9 donde la a sorcin de energa por parte de la tirosina es desprecia le( 0a la D% Caractersticas espectrales de los *luor*oros( Fluor*oro 5ongitud de onda m<xima ?nm@ Excitacin Emisin 0ripto*ano +E, DG, 0irosina +LG D,, NADT y NADPT D#, #L, @ 4U0/D/7 EN 5/7 QUE !N0E2:!ENEN 2EACC!1NE7 QU!4!CA7% i@ 48todo de 5o'ry( En -H+L9 Folin y Ciocalteau ponen a punto las condiciones para el empleo del reacti;o )ue $oy en da lle;a sus nom res y es la ase del m8todo de determinacin de protenas descrito en -HG- por 5o'ry X col( El constituyente acti;o de este reacti;o es el <cido mixto *os*omoli dotAngstico( El e*ecto de -as protenas so re este <cido es una reduccin por p8rdida de uno9 dos o tres <tomos de oxgeno por el tungstato y&o moli dato( 7e o tienen9 as9 muc$as especies reducidas )ue poseen un color a>ul caracterstico ?a sorcin m<xima% L#G-LG, nm@( 5a *i=acin de co re por )uelacin *acilitara la trans*erencia de electrones $acia el <cido mixto( 5os grupos cromog8nicos de las protenas )ue inter;ienen en el m8todo de 5o'ry son la tirosina9 el tripto*ano y9 en menor proporcin9 la cistena9 la cistina9 la $istidina9 as como los enlaces peptdicos ?la $idrlisis de una protena reduce su cromogenicidad en un G,-L,S@(
Reactivo de Folin: 3H
2O-P2O5-13WO3-5MoO 3-10H2O

/ 3H2O-P2O5-14WO3-5MoO 3-10H2O

Figura -( 48todo de 5o'ry X col(

/tros m8todos )umicos( 2ecientemente se $an puesto a punto otros m8todos )umicos de dosa=e de protenas( Es el caso del dosa=e con <cido icinconnico ?BCA@ o del o-*talalde$do mercaptoetanol( El primer m8todo es comerciali>ado por Pierce y consiste en dos soluciones9 otra de sul*ato de co re y otra de <cido +R R icincnico( Como en el m8todo de 5o'ry9 los iones Cu se reducen a Cu en presencia de protenas( R El Cu es )uelado por dos mol8culas de BCA9 *ormando un compuesto de color pArpura ?a sorcin m<xima a GQ+ nm@ con una respuesta lineal para concentraciones de protenas entre -,, y -+,, g&m5( El m8todo del o-*talalde$do mercaptoetanol9 in;olucra la *ormacin de un compuesto *luorescente( 5a emisin se puede medir con un *luormetro acoplado a un microscopio para mediciones en un ;olumen de solucin )ue puede ser in*erior a un nanolitro ?es posi le poner en e;idencia cantidades de al Amina del orden de +G+ pg&-+Q p5@( Esta t8cnica podra resultar muy interesante para el dosa=e de protenas en *isiologa ?el *luido contenido en pe)ueFos ;asos lin*<ticos donde el ;olumen es generalmente de -,, a G,, p5@( c@ 4U0/D/7 QUE !N:/5UC2AN F!WAC!1N A C/5/2AN0E7( Fi=acin co;alente( Es posi le utili>ar la reacti;idad de ciertos grupos super*iciales de las protenas para insertar mol8culas crom*oras o *luor*oras( 5a *luorescamina9 comerciali>ada por los la oratorios 2oc$e a=o el nom re de Fluram9 es un e=emplo( Esta mol8cula )ue se *i=a so re las aminas primarias9 en el estado li re no es *luorescente( A pT H9 se o tiene muy r<pidamente un compuesto *luorescente entre la amina primaria y la *luorescamina( Esta reaccin se produce paralelamente con una degradacin de la *luorescamina9 m<s lenta9 )ue produce compuestos no *luorescentes( 7e mide a la longitud de onda de emisin a #LG nm9 excitando a DH,nm( Es posi le detectar ,(G g de protenas utili>ando un proceso manual( 5a intensidad de *luorescencia re*le=a la cantidad de *luorescamina unida9 esto es9 la cantidad de amina primaria( Es necesario notar )ue este m8todo N/ E7 E7PEC!F!C/ PA2A P2/0E3NA7 y de e ser utili>ado slo con protenas li res de toda contaminacin con aminas primarias ?p8ptidos9 amino<cidos9 <cidos nucleicos9 0ris9 etc(@( i@

ii@

Figura +( 2eaccin de la *luorescamina con aminas primarias( Fi=acin no co;alente( Ciertas mol8culas poseen a*inidad por las protenas y por lo tanto se pueden unir a ellas m<s o menos *uertemente( 7e las puede utili>ar para dosar protenas en solucin ya )ue el espectro de a sorcin de estas mol8culas se modi*ica por la unin a la protena ?con o sin tratamiento posterior@( El e=emplo m<s comAn es9 ciertamente9 el m8todo de Brad*ord )ue utili>a la unin de la protena al
-,

ii@

Coomassie Blue( Este colorante existe en tres *ormas di*erentes ?aninica9 neutra y catinica@ )ue tienen9 cada una9 un espectro de a sorcin caracterstico( 5a *orma aninica es la )ue se *i=a9 pre*erencialmente9 a las protenas9 a tra;8s de interacciones electrost<ticas con los grupos catinicos de las protenas( De estudios de unin del colorante so re poliamino<cidos $omog8neos9 se demostr )ue la interaccin con los grupos arom<ticos =uega un papel importante en la *i=acin( Estas interacciones representan el GES de la energa total de unin( Este tipo de estudios sugieren )ue la unin del Coomassie Blue se reali>a si la mol8cula a dosar contiene grupos *uncionales <sicos( 5a respuesta m<xima se o tendra con protenas ricas en arginina( 7e $an puesto a punto otros m8todos asados en la unin de plata u oro coloidal( 5a coloracin con plata se o tiene incu ando -, minutos9 a temperatura am iente9 la solucin de protena en presencia de glutaralde$do al +9GS y nitrato de plata en solucin amoniacal( El desarrollo de la coloracin se detiene por la adicin de tiosul*ato de sodio y se mide la a sor ancia a #+, nm( En cuanto al oro coloidal9 es de color ro=o pArpura en ausencia de protenas ?m<ximo de a sorcin a GD, nm@( 5a *i=acin de protenas despla>a este m<ximo -, nm $acia el ro=o y ensanc$a el pico lo su*iciente como para o tener un aumento no desprecia le de la a sor ancia a GHG nm(

Figura D( 48todo de Brad*ord( ( 4U0/D/7 N/ E7PEC02/F/0/4U02!C/7% 4arcacin 2AD!AC0!:A Es posi le *i=ar )umicamente una mol8cula radiacti;a so re una protena( 5a radiacti;idad unida es proporcional a la cantidad de protena presente( Existe un m8todo de dosa=e en soluciones muy diluidas9 )ue com ina9 una precipitacin de las protenas con <cido tricloroac8tico y una marcacin con --*luor-+9#-dinitro enceno radiacti;o9 de acuerdo a una modi*icacin del m8todo descrito por 7c$ult> y Yassarman( De esta *orma se pueden determinar concentraciones de protenas de -,, a E,, ng&m5(

--

CA2AC0E2!70!CA7 DE 5/7 D!70!N0/7 4U0/D/7( Especi*icidad e inter*erencias( 5os di*erentes m8todos de dosa=e de protenas )ue $an sido descriptos no son -,,S espec*icos( Za se $a mencionado la reacti;idad de la *luorescamina con otras aminas primarias )ue no son protenas( 5a medicin de a sor ancia a +E, nm tam i8n es inter*erida por la presencia de otros crom*oros )ue presenten una a sorcin9 no desprecia le a esta longitud de onda9 como los <cidos nucleicos o ciertos sol;entes( 5a medicin de la a sorcin a otras longitudes de onda9 as como la ;isuali>acin de un espectro de a sorcin pueden permitir la estimacin de la importancia de las inter*erencias( 5as inter*erencias de numerosas sustancias constituyen unos de los principales incon;enientes del m8todo de 5o'ry9 en comparacin con otros ?Brad*ord9 plata u oro coloidal@( Estas sustancias son deri;ados aminados ?por e=emplo los amino<cidos@9 los componentes de ciertos u**ers ?citrato de sodio9 Tepes@9 agentes )uelantes ?ED0A@9 detergentes ?0ritn .--,,@9 dodecilsu-*ato de sodio ?7D7@9 <cidos grasos9 nucletidos9 algunas sales ?ioduro de sodio@9 a>Acares9 etc( 5as principales inter*erencias con el Coomassie Blue son los detergentes( El 7D7 en concentracin del -S pro;oca una ;ariacin en la a sorcin e)ui;alente a ##9GG g&m5 ?B7A% seroal Amina o;ina utili>ada como est<ndar@( En condiciones extremas o particu-ares ?0ris +49 glicerol HHS9 sacarosa - 49 etc(@ la ;ariacin en la a sorcin est< le=os de ser desprecia le ?0a la #@( En el caso de los m8todos de coloracin con plata u oro coloidal9 las ;ariaciones dadas son del orden de algunos nanogramos( Ellas representan9 en algunos casos9 m<s del H,S de la a sorcin del testigo( 5os ensayos se $icieron solo so re una cantidad de +G, ng para plata y de E, ng para el oro coloidal( El e*ecto de los inter*erentes se puede corregir9 posi lemente9 utili>ando un testigo con la misma cantidad de este agente )ue el presente en la muestra9 en el caso )ue se pueda conocer( 5a cantidad real de protena se o tendra por sustraccin entre el testigo y la muestra( /tra *orma9 r<pida y e*ica>9 de li rarse de estos agentes es el desalado por *iltracin en geles ?7ep$adex@ o la di<lisis( AAn se encuentra el pro lema de dosa=e de protenas Men lneaN9 donde la respuesta de er< o tenerse muy r<pidamente( 0a la #% E*ecto de di;ersas sustancias inter*erentes en el dosa=e por el m8todo de Brad*ord ?;alores dados por - m5 de sustancia dosada en las condiciones del est<ndar@ 7ustancia inter*erente [Cl - 4 0ris + 4 ED0A ,9- 4 6licerol HHS -mercaptoetanol 7acarosa - 4 0ritn .--,, ,9-S 0ritn .--,, -S 7D7 -S g e)ui;alentes de B7A ,9,G +9D# ,9DQ -9QH ,9DQ -9-L -9-L GD9-, ##9G, i@

-+

iii@ 5mite de deteccin( El lmite de deteccin en un m8todo de dosa=e de protenas representa la cantidad mnima de protena necesaria para dar una respuesta detecta le( Una estimacin se puede dar representando la medicin de la a sorcin9 la *luorescencia o la radiacti;idad9 en *uncin de la cantidad de protenas ?comprendido dentro del inter;alo de linealidad@( 7i aplicamos este tipo de estimacin a los di;ersos m8todos de deteccin9 midiendo la intensidad de la respuesta9 podemos dar la clasi*icacin )ue se o ser;a en la *igura #% primero9 los m8todos de plata y oro coloidal9 despu8s9 en m<s de + rdenes de magnitud9 el m8todo de Brad*ord )ue detecta cantidades cinco ;eces menores )ue el m8todo de 5o'ry( En cuanto a los otros m8todos ?aparte del o-*talalde$do mercaptoetanol9 reser;ado a aplicaciones muy restringidas y extremas@9 sus um rales de deteccin ser<n del orden del m8todo de Brad*ord(

Figura #( 5mite de deteccin de los m8todos de dosa=e( Adem<s es interesante comparar los m8todos de deteccin de las protenas en solucin9 con a)uellos en los )ue las protenas est<n inmo;ili>adas en un soporte de nitrocelulosa ?0a la G@( 0a la G% Coloracin no espec*ica de protenas inmo;ili>adas so re matri> de nitrocelulosa( Colorante 7ensi ilidad Coomassie Blue ,9G--9, g Amido BlacI -,B ,9G--9, g 0inta C$ina ,9--,9G g Pun> 7 ,9G--9, g Plata u oro coloidal ,9--,9G g Nitrato de plata #--, ng

-D

Dinitro*luoro enceno

-, ng

Nota% no de emos con*undir el lmite de deteccin con la sensi ilidad del m8todo9 )ue tiene )ue ;er m<s con la pendiente )ue relaciona la ;ariacin de la respuesta *rente a la ;ariacin en la concentracin o cantidad del compuesto a determinar( Un m8todo puede tener un lmite de deteccin menor )ue otro y9 sin em argo9 presentar una ;ariacin muc$o menor en la respuesta *rente a pe)ueFas ;ariaciones en la concentracin de la sustancia a determinar( :ariacin de la respuesta de una protena a otra( 5a composicin y la con*iguracin de di*erentes protenas no son iguales( Adem<s9 como $emos ;isto9 ;arios m8todos de dosa=e ponen en =uego grupos presentes en cantidades ;aria les de una protena a otra( En el caso del m8todo de Brad*ord9 las protenas ricas en arginina reaccionan m<s )ue las otras( El mismo caso se da en el m8todo de la *luorescamina en el )ue las protenas ricas en lisina dar<n seFal m<s intensa( 5os m8todos de plata9 oro coloidal y la marcacin radiacti;a no escapan de ;ariaciones )ue oscilan $asta del do le9 como lo demuestran los ;alores medidos para la !g6 y la insulina9 cuando se elige la seroal Amina o;ina como est<ndar ?0a la Q@( 0a la Q% 2espuesta de distintas protenas a m8todos di*erentes ?S de respuesta de la B7A en iguales cantidades@( 08cnica B7A !g6 !nsulina /ro coloidal -,, G# ++ Plata -,, -D, Brad*ord -,, D+ GD 5o'ry -,, QE -,G En tanto sea posi le9 es pre*eri le $acer las mediciones relati;as a un testigo de composicin id8ntica a la de la muestra( En el caso de me>clas comple=as9 puede ser aconse=a le utili>ar el m8todo de 5o'ry o dos m8todos9 disminuyendo al mnimo los riesgos de error( Conclusin( Existen numerosos m8todos de dosi*icacin de protenas9 )ue aportan un cierto nAmero de ;ariantes( A)u se $an expuesto slo los m<s corrientes y e*icaces( 5a coexistencia de todos estos m8todos es a causa de la imposi ilidad de9 *rente a un caso concreto9 a;enturarse a elegir por uno u otro( 5a eleccin de un m8todo de dosa=e de protenas depender<9 so re todo9 de la precisin re)uerida y de la cantidad de protena a dosar9 adem<s de la *acilidad de puesta en marc$a9 la rapide> de la respuesta en el curso de un proceso9 la adaptacin del e)uipamiento disponi le9 adem<s de las condiciones del dosa=e( Como resultado9 es )ue de emos considerar todo dosa=e de una protena de*inida como una indicacin manc$ada de errores9 de ido a contaminantes de todo tipo9 presentes en el medio y&o a la composicin misma de la protena( Este tipo de error se podr< eliminar9 ya sea por)ue la composicin aminoacdica es esta le ?permitiendo el tra>ado de cur;as est<ndar testigos@9 o uti-i>ando otros tipos de dosa=e como la respuesta a anticuerpos monoclona-es( B!B5!/62AF3A - Delo ette T9 Friry A9 Ple'niaI F X Egly W4 ?-HH-@ 5e dosage des prot8ines( Bio*utur N\ HL( ;@ i;@

-#

A!75A4!EN0/ Z PU2!F!CAC!1N DE EN]!4A7 5a propiedad caracterstica de las en>imas es su capacidad de catali>ar ciertas reacciones )umicas ien de*inidas( 5a presencia de una en>ima se detecta9 en general9 por la reaccin )ue catali>a9 y la cantidad de la misma se estima a partir de la ;elocidad de la reaccin( 4ED!DA DE 5A :E5/C!DAD Es el paso esencial en la t8cnica de estudio de una en>ima( 5as cur;as de transcurso de reaccin de la mayor parte de las reacciones en>im<ticas tienen la *orma indicada en la *igura( 7e o ser;a )ue la ;elocidad disminuye con el tiempo% :arias causas pueden contri uir a )ue se produ>ca esta disminucin% a@ el producto puede in$i ir9 @ el grado de saturacin de la en>ima con sustrato disminuye por el agotamiento del mismo a medida )ue progresa la reaccin9 c@ la reaccin in;ersa se $ace m<s importante al aumentar la concentracin del producto9 d@ la en>ima ?o coen>ima@ puede inacti;arse al pT o temperatura de reaccin9 y ;arios de estos *actores pueden interactuar simult<neamente( A causa de esto9 se $ace di*cil deri;ar una ecuacin )ue responda a la cur;a( Entonces se recurre a la medicin de la ;elocidad inicial% solo al comien>o d8la reaccin9 cuando los *actores mencionados no $an tenido tiempo de actuar9 las condiciones se conocen con precisin( Esto permite determinar )u8 e*ecto produce so re la ;elocidad inicial la ;ariacin de solo un *actor9 manteniendo al resto constante( Por e=emplo9 se estudia el e*ecto de la concentracin de sustrato so re la ;elocidad inicial9 a medida )ue se incrementa la concentracin del sustrato9 la ;elocidad inicial aumenta $asta un ;alor m<ximo% la ;elocidad m<xima( En este momento se dice )ue la en>ima esta saturada con sustrato( Una manera correcta de explicar este concepto es la siguiente% suponiendo una ;ida media de ,9,- segundos para el comple=o en>ima-sustrato antes )ue reaccione9 el nAmero m<ximo de reacciones elementales por segundo )ue puede producir una mol8cula de en>ima es de -,,( A a=as concentraciones de sustrato9 el nAmero de comple=os *ormados capaces de reaccionar por unidad de tiempo ser< proporcional al nAmero de c$o)ues entre mol8culas de en>imas y sustrato9 )ue ser< a su ;e> proporcional a la cantidad de sustrato presente( 7i la concentracin de sustrato aumenta9 el nAmero de colisiones por unidad de tiempo es mayor )ue el nAmero de con;ersiones )ue la en>ima puede producir en ese tiempo y la ;elocidad no puede exceder de -,, con;ersiones por mol8cula de en>ima por segundo( En estas condiciones se trans*orma una cantidad constante de sustrato por unidad de tiempo9 )ue es la m<xima cantidad posi le( Cuando $a transcurrido cierto tiempo y la concentracin de sustrato disminuye9 o ien cuando se parte de concentraciones de sustrato menores9 el nAmero de c$o)ues ya no excede al de trans*ormaciones posi les y es *uncin de la cantidad de sustrato presente(

-G

E70UD!/ DE UNA EN]!4A El estudio completo de una en>ima in;olucra la in;estigacin de un gran nAmero de propiedades caractersticas )ue se detallan a continuacin9 pero de las )ue generalmente se estudian solo unas pocas% a@ propiedades *isico)umicas% coe*icientes de sedimentacin y di*usin9 peso molecular9 *orma9 punto isoel8ctrico9 esta ilidad *enle al calor9 pT9 oxidacin9 etc(9 re;ersi ilidad de la reaccin y constante de e)uili rio9 calor9 energa li re y entropa de la com inacin en>ima-sustrato y de su con;ersin en productos9 medida de las constantes de ;elocidad de la reaccin9 e*ecto de acti;adores e in$i idores( @ estructura% composicin en amino<cidos9 secuencia9 presencia de grupos prost8ticos9 grupos sul*$idrilos9 etc( c@ propiedades en>m<ticas% naturale>a de la reaccin9 coen>ima9 especi*icidad( d@ propiedades iolgicas% signi*icado en el meta olismo9 acoplamiento con otras en>imas9 locali>acin9 gen8tica9 e*ectos de su de*iciencia9 inmunologa( A7PEC0/7 0UCN!C/7 DE5 02ABAW/ C/N EN]!4A7 El 8xito del tra a=o con en>imas depende del cuidado con )ue se e;iten las condiciones en las cuales son inesta les( Estas condiciones ;aran con las en>imas9 pero en general de en e;itarse altas temperaturas y acide> o alcalinidad extremas( Durante el aislamiento y la puri*icacin con;iene tra a=ar a ,\C para estandari>ar y e;itar pT mayor )ue H o menor )ue G9 sal;o excepciones( 4uc$as en>imas se desnaturali>an en super*icie9 por lo cual de e e;itarse la *ormacin de espuma( 5os sol;entes org<nicos inacti;an muc$as en>imas a temperatura am iente9 de modo )ue los *raccionamientos con los mismos de en lle;arse a ca o a a=a temperaturaV esta no de e ele;arse $asta9 )ue el sol;ente se $aya eliminado o diluido a concentraciones inocuas( Por Altimo9 las puri*icaciones de en lle;arse a ca o sin p8rdidas inAtiles de tiempo9 y lo m<s con;eniente9 en general9 es guardar las preparaciones en congeladora( En cuanto a la t8cnica de tra a=o con en>imas9 de en tomarse ;arias precauciones en lo )ue se re*iere a las condiciones de la reaccin% a@ @ c@ d@ e@ De en elegirse pT y temperatura en las >onas de mayor esta ilidad de la en>ima( 5a reaccin de e lle;arse a ca o en termostato( Elegir un u**er adecuado para e;itar cam ios de pT( E;itar la introduccin de tra>as de otras en>imas ?por e=emplo de sali;a@( Elegir una cantidad de en>ima adecuada para o tener ;ariaciones apropiadas de la magnitud a medir(

A!75A4!EN0/ Z PU2!F!CAC!1N En general9 las en>imas se encuentran *ormando parte de me>clas comple=as9 usualmente en el interior de c8lulas )ue adem<s poseen cientos de otras en>imas( Pueden *ormar parte de agregados moleculares9 comple=os con otras en>imas9 protenas inertes9 <cidos nucleicos9 polisac<ridos o lpidos( Paro estudiar una en particular9 se $ace indispensa le entonces un proceso de puri*icacin(

-Q

A@ 4U0/D/7 DE E70!4AC!1N El primer re)uerimiento para aislar una en>ima es encontrar un ensayo cuantitati;o de acti;idad mediante el cual pueda ;alor<rsela con;enientemente( Para decidir si un paso de la puri*icacin tiene sentido9 es necesario medir la cantidad de en>ima y la cantidad de impure>as antes y despu8s de ese paso9 y comparar los resultados de ;arios procedimientos posi les( 7lo en t8rminos cuantitati;os se puede sa er si se $a producido algAn progreso( Puesto )ue una gran parte del tiempo empleado en el aislamiento de una en>ima est< dedicado a determinar la acti;idad de las distintas *racciones9 es desea le )ue esa sea una operacin r<pidaV es pre*eri le sacri*icar precisin por rapide> en las determinaciones( 5a naturale>a del ensayo depender< del tipo de reaccin )ue catali>a la en>ima( Por e=emplo9 si el sustrato A es con;ertido mediante reacciones en>im<ticas en un producto P y el ensayo se asa en la estimacin de P( Puede ocurrir )ue la trans*ormacin se produ>ca a tra;8s de un intermediario ?B@( 7i en algAn paso de la puri*icacin se separan las en>imas in;olucradas en la trans*ormacin9 no se detectar< acti;idad por el ensayo utili>ado( Esto puede con*irmarse si la acti;idad se reco ra me>clando las *racciones( Entonces el m8todo de e cam iarse por otro )ue ;alore B9 as algunas de las en>imas in;olucradas en la *ormacin de B podr< puri*icarse en re*erencia a la?s@ otra?s@( 0am i8n se podra agregar un exceso de la?s@ en>ima?s@ in;olucrada?s@ en la segunda parte de la reaccin y seguir midiendo P( Un pro lema seme=ante se presenta cuando est< in;olucrada una coen>ima( 7i 8sta es conocida9 se la puede agregar en exceso9 y si no lo es9 puede agregarse un extracto del te=ido pre;iamente calentado9 ya )ue muc$as coen>imas son esta les al calor( B@ UN!DADE 7 7i la en>ima en estudio no $a sido pre;iamente identi*icada9 su acti;idad espec*ica9 as como la pure>a de la preparacin inicial9 son desconocidas( En general9 en los te=idos9 una en>ima pude estar presente en una proporcin de -&-, a -&-,, del material total( Por lo tanto9 es necesario (de*inir una unidad de en>ima ar itraria para poder expresar la pure>a y la acti;idad de las di;ersas *racciones o tenidas durante la puri*icacin en *orma cuantitati;a( 5a pure>a de la en>ima puede expresarse entonces como el cociente entre la acti;idad ?o sea la cantidad de en>ima@ y la cantidad total de protenas( A este cociente se lo llama Acti;idad Espec*ica( 5a acti;idad de una en>ima depende de condiciones tales como temperatura9 pT9 concentracinV por lo tanto es necesario especi*icarlas y usar las mismas condiciones para comparar acti;idades( 5a eleccin del sustrato es muy^ importante% de e ser arato9 de *<cil determinacin9 esta le en ausencia de en>ima y no su*rir reacciones laterales( Es necesario usarlo en concentracin tal )ue sature la en>ima9 de modo )ue la ;elocidad sea independiente de la concentracin de sustrato y proporcional a la cantidad de en>ima( C@ FUEN0E DE 5A EN]!4A 5a acti;idad de una en>ima ;ara considera lemente en di*erentes organismos y aAn en los di;ersos te=idos de un mismo organismo( Para estudios mecansticos generales9 de e seleccionarse a)uella )ue sea rica en la en>ima( En estos casos9 particularmente en te=idos animales9 la *uente de e ser *resca9 dado )ue la mayora de las en>imas se deterioran r<pidamente( Frecuentemente la eleccin de la *uente de en>ima permite simpli*icar la extraccin y puri*icacin de la en>ima(

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D@ !4P/20ANC!A DE 5A 5/CA5!]AC!1N !N02ACE5U5A2 DE 5A EN]!4A 5as en>imas pueden locali>arse dentro de los siguientes grupos% -@ En>imas en solucin ;erdadera en el citoplasma( Permanecen en el so renadante luego de la eliminacin de los componentes particulados( 5a ruptura de las c8lulas en un u**er adecuado li era tales en>imas al medio( +@ En>imas asociadas a estructuras celulares ?mem ranas9 mitocondrias9 etc(@9 pueden encontrarse% a@ en solucin dentro de una mem rana9 y pueden ser extradas despu8s de la destruccin de la misma @ asociadas a material lipoproteico insolu le( Para pasarlas a solucin de e disociarse el comple=o( El conocimiento de la locali>acin intracelular y solu ilidad relati;a de las-en>imas $a permitido desarrollar procedimientos de extraccin di*erencial )ue *acilitan la puri*icacin( E@ E.02ACC!1N DE EN]!4A7 5as condiciones para extraer las en>imas y pasarlas a solucin son a menudo crticas y re)uieren el estudio de muc$as ;aria les( Es necesario destruir las c8lulas9 e;entualmente las estructuras9 y disociar las en>imas de otras mol8culas( A ;eces es necesario pasarlas a solucin como comple=o mucoproteico o nAcleo proteico y disociarlo luego durante la puri*icacin( Aun)ue la dispersin de agregados moleculares puede *recuentemente lograrse mediante medios mec<nicos9 en muc$os comple=os en>im<ticos est<n in;olucradas *uer>as )umicas espec*icasV de la naturale>a de las mismas depende el m8todo a emplear( En general9 el primer paso consiste en la o tencin de un $omogenato9 )ue implica la destruccin de la c8lula y el pasa=e de las en>imas a solucin o suspensin( Esto puede lle;arse a ca o por% a@ Tomogenei>acin mec<nica% puede utili>arse un $omogenei>ador de ;idrio9 mortero9 li)uadora9 a ;eces con la ayuda de a rasi;os como al Amina9 arena o olitas de ;idrio9 y con un sol;ente adecuado9 isotnico ?sacarosa ,9+G 49 NaCl ,9HS9 [Cl ,9-G 4@ o ligeramente $ipertnico9 en un u**er adecuado para controlar el pT@( @ Tomogenei>acin snica% el c$o)ue de ondas snicas o ultrasnicas pro;oca cam ios de presin de miles de atms*eras9 )ue rompen la pared celular( 7e usa generalmente para acterias y le;aduras9 y a ;eces para determinados te=idos animales ? a>o9 riFn9 eritrocitos@( c@ Desintegracin t8rmica% El congelamiento y descongelamiento r<pidos y repetidos suelen usarse para desintegrar acterias y eritrocitos( Por congelacin se *orman cristales de $ielo intracelulares9 destruyendo la estructura( Al descongelarse9 las c8lulas se destruyen osmticamente de ido a la presencia desagua pura9 y se li era su contenido( d@ Desintegracin )umica% se utili>an agentes )ue atacan la pared celular9 como el etanol9 8ter de petrleo9 isopentanol9 etc( e@ Tomogenei>acin por des$idratacin% se asa en la precipitacin de protenas por sol;entes org<nicos( En la preparacin del Bpol;o acetnicoB se utili>a acetona en *ro(

-E

F@ PU2!F!CAC!1N % 5os m8todos a elegir dependen de la *uente iolgica y de la concentracin de la en>ima9 y se asan en las distintas propiedades *isico)umicas de las protenas( El primer paso consiste en la separacin de los distintos componentes intracelulares9 generalmente por centri*ugacin( 5as partculas )ue di*ieren en densidad o tamaFo sedimentan a distintas ;elocidades por aplicacin de una *uer>a centr*uga ?campo gra;itacional g@( Una centri*ugacin di*erencial permite la separacin del $omogenato en ;arias *racciones( Un es)uema tipo es el siguiente%

Cada una de las *racciones precipitadas puede tratarse con agentes )umicos para solu ili>ar las en>imas particuladas( A partir de a)u comien>a la puri*icacin( En general9 los procesos de puri*icacin pueden asarse en el mo;imiento de su stancias en una *ase l)uida ?electro*oresis o *iltracin en geles@ o en la transicin de sustancias de una *ase a otra ?cromatogra*a o precipitacin@( 5as separaciones por m8todos pertenecientes a grupos di*erentes pueden depender de las mismas propiedades9 por e=emplo de la carga el8ctrica de la mol8cula( 5a eleccin de un determinado procedimiento es un pro lema de ensayo y error9 $ay )ue pro ar procedimientos y seleccionar( En general9 la repeticin de un paso es ;enta=osa9 ya sea en *orma sucesi;a o interpolando otros pasos9 aun)ue a ;eces pro;oca grandes p8rdidas de acti;idad total( Una ;e> lle;ado a ca o un paso satis*actorio9 la cantidad de material resultante de e ser mane=a le antes de pasar al paso posterior( 7e anali>ar<n a continuacin los m8todos m<s usados9 en orden ar itrario( -@ Precipitacin espec*ica% 5os <cidos nucleicos pueden ser precipitados espec*icamente con sustancias <sicas ?por e=emplo protaminas9 )ue son protenas pe)ueFas *<cilmente elimina les por di<lisis@9 o por precipitacin con cationes di;alentes( Algunas protenas pueden precipitarse espec*icamente con otros cationes( +@ 7olu ilidad di*erencial% este m8todo esta relacionado con los *actores )ue modi*ican las solu ilidades espec*icas9 tales como pT9 concentracin de sales neutras9 sol;entes org<nicos9 etc( i@ Precipitacin *raccionada por cam io de pT% aun)ue no es muy usada9 suele ser ;enta=osa cuando se tra a=a con te=idos animales( 7e a=usta el pT a G y luego se centri*ugaV as se eliminan gran cantidad de nAcleoprotenas y material particulado( ii@ Precipitacin *raccionada con sol;entes org<nicos% la presencia de sol;entes org<nicos misci les con agua a*ecta la solu ilidad de las protenas de di;ersas maneras( Un *actor importante es la constante diel8ctrica ?D@ del sol;ente9 )ue al ser menor )ue la del agua

-H

disminuye la solu ilidad de=a mol8cula proteica( Adem<s incrementa la des$idratacin de la macromol8cula9 *a;oreciendo la precipitacin( Por otra parte9 puede aumentar la solu ilidad a tra;8s de cadenas laterales Bno polares de la protena( Corno la des$idratacin puede pro;ocar desnaturali>acin9 este tipo de *raccionamiento de e lle;arse a ca o a a=a temperatura y tan r<pido como sea posi le( iii@ Precipitacin *raccionada por sales inorg<nicas% las solu ilidades de distintas protenas ;aran en un amplio rango9 y este $ec$o puede utili>arse para precipitarlas selecti;amente( Cada protena tiene una solu ilidad mnima con respecto al pT9 usualmente en el punto isoel8ctrico9 cuando la carga neta de la protena es cero( 5a *uer>a inica tam i8n in*luye en la solu ilidad% las concentraciones a=as de sales inorg<nicas aumentan la solu ilidad ?salting-in@ ya )ue disminuye la atraccin entre mol8culas proteicas( 5as concentraciones altas de sales disminuyen la solu ilidad de las protenas ?salting-out@ por neutrali>acin de su carga9 lo )ue $ace disminuir la interaccin con el sol;ente9 y adem<s por des$idratacinV aumenta as la interaccin entre las mol8culas de protenas y se produce la precipitacin( Es un m8todo muy e*ecti;o y suele emplearse en *orma repetida durante un proceso de puri*icacin( El agente precipitante m<s usado es el sul*ato de amonio de ido a su gran solu ilidad en el agua lo )ue permite usarlo en altas concentraciones9 es econmico y no tiene e*ectos noci;os so re las9 protenas( 7in em argo9 las soluciones se acidi*ican durante la adicin de sal9 de modo )ue de e controlarse el pT9 por lo )ue es comAn el agregado de T DN conc( Para no tener ;ariaciones grandes del ;olomaen total( D@ Desnaturali>acin *raccionada por calentamiento% por calentamiento a una temperatura dada y por un tiempo determinado es posi le desnaturali>ar protenas extraFas )ue pueden eliminarse por centri*ugacin( E;identemente9 el calentamiento no de e a*ectar a la en>ima )ue se desea puri*icar9 a la )ue a ;eces con;iene proteger mediante el agregado de sustrato( A los *ines pr<cticos9 con;iene tener un aFo de agua a la temperatura deseada9 otro unos grados m<s caliente y otro *ro( 5a solucin9 se coloca en el m<s caliente y se agita para e;itar so recalentamiento( Una ;e> alcan>ada la temperatura9 se pasa al otro aFo ?)ue tiene la temperatura deseada@ y se de=a el tiempo necesario9 transcurrido el cual se pasa al aFo *ro( 5as protenas sometidas al cam io de pT9 temperatura9 agitacin ;iolenta9 sol;entes org<nicos9 etc(9 su*ren desnaturali>acin9 )ue consiste en una modi*icacin de sus propiedades caracteri>ada por cam ios *sicos )ue alteran la estructura secundara9 terciaria y cuaternaria( 5a desnaturali>acin ;a acompaFada de cam ios de ;iscosidad ?)ue aumenta@9 en la solu ilidad ?disminuye y9 en algunos casos se produce precipitacin@ y p8rdida de acti;idad iolgica( #@ Fraccionamiento por adsorcin% 7e asa en el $alla>go emprico de )ue muc$as protenas pueden unirse re;ersi lemente a la super*icie de muc$os adsor entes( Pude utili>arse para puri*icar y para concentrar en>ima a partir de soluciones diluidas( Puede $acerse en columnas o en B atc$B( 7i la protena est< muy diluida puede $acerse la adsorcin en atc$ y9 luego colocar el adsor ente en una columna para proceder a la elucin( 5a elucin puede $acerse tam i8n separando por centri*ugacin el adsor ente con la protena adsor ida y resuspendi8ndola en una solucin capa> de elur algunos o todos los materiales adsor idos( 5os adsor entes m<s usados son el *os*ato de calcio9 la $idroxiapatita y la al Amina(

+,

G@ Cromatogra*a en columnas% i@ Filtracin por tamices moleculares% esta t8cnica se anali>a en detalle en una seccin posterior( El medio soporte es un dextrano entrecru>ado )ue permite el pasa=e de mol8culas de cierto tamaFo al interior del gel( Cuando se pasa una solucin de un material iolgico a tra;8s de una columna de este material9 las partculas pe)ueFas entrar<n dentro de las del gel y recorrer<n mayor distancia )ue las mol8culas grandes9 )ue al no poder penetrar en la red9 slo recorren el espacio entre partculas( El resultado es )ue las mol8culas grandes eluyen directamente y las pe)ueFas salen retrasadas( As9 el orden de elucin estar< directamente relacionado con el tamaFo de las mol8culas( ii@ Cromatogra*a de intercam io inico% ;er seccin correspondiente( Q@ Electro*oresis preparati;a% 7e utili>an medios soportes tales como el almidn o el pol;o de celulosa9 en columnas o placas )ue admiten una cantidad grande de muestra( 5os principios de la metodologa se desarrollan en p<ginas siguientes( L@ Centri*ugacin preparati;a y ultracentri*ugacin% Uno de los procedimientos m<s utili>ados y ya descripto anteriormente es el de la centri*ugacin di*erencial )ue se emplea comAnmente como metodologa inicial para el aislamiento de *racciones su celulares( /tros m8todos son% i@ Centri*ugacin de sedimentacin >onal% implica la *ormacin de una capa de la muestra en un gradiente de densidad l)uido continuo( 5a muestra se somete a centri*ugacin $asta )ue se $aya e*ectuado la separacin deseada9 esto es9 antes de su sedimentacin completa9 lo cual se comprue a empricamente9 pero despu8s del tiempo su*iciente para )ue las partculas se $ayan trasladado por el gradiente para *ormar >onas o andas discretas ?Figura -@(

Fig( - 7eparacin de ;elocidad y separacin isopcnica utili>ando gradiente de densidad( ?a@ 4e>cla de partculas *ormando una anda en la parte superior de un gradiente de densidad l)uido *ormado antes de la centri*ugacin( ? @ Centri*ugacin de las partculas( En la separacin de ;elocidad9 la *raccin re)uerida no alcan>a su posicin isopcnica( En la separacin isopcnica9 se continAa la centri*ugacin $asta )ue las partculas deseadas $an alcan>ado su posicin isopcnica en el gradiente( ii@ Centri*ugacin isopcnica ?de igual densidad@% la separacin isopcnica puede practicarse con o sin el empleo de un gradiente de densidad( En ausencia de un gradiente de densidad continuo9 se centri*uga la muestra inicialmente a una ;elocidad su*iciente para )ue sedimenten las partculas m<s pesadas )ue las )ue se re)uieren(

+-

Despu8s de separar y desec$ar las partculas m<s pesadas9 la muestra se suspende en un medio )ue tenga la misma densidad )ue la *raccin )ue $ay )ue aislar( 5a me>cla se centr*uga $asta )ue el material re)uerido se $aya sedimentado y las partculas de densidad in*erior al material deseado $ayan *lotado $asta el menisco ?Figuras - y +@(

Fig( +% 7eparacin isopcnica sin el empleo do un gradiente ?a@ Partculas distri uidas $omog8neamente por lodo el tu o antes de la centri*ugacin9 ? @ Despu8s de la centri*ugacin9 el material m<s ligero )ue la *raccin re)uerida $a su ido a la parte superior del tu o9 mientras )ue la *raccin deseada se $a sedimentado en el *ondo del tu o( iii@ Centri*ugacin isopcnica de e)uili rio% En la centri*ugacin isopcnica de e)uili rio se $ace uso generalmente de sales de metales pesados9 como por e=emplo de cesio o ru idio9 para la preparacin del gradiente9 s ien puede emplearse tam i8n sacarosa( 5a muestra9 se me>cla $omog8neamente con una disolucin concentrada de cloruro de cesio ?CsCl@( 5a centri*ugacin de la disolucin concentrada de CsCl produce un gradiente de concentracin de cloruro de cesio9 y por tanto un gradiente densidad )ue se *orma de ido a la gran masa del in cesio( Entonces tiene lugar una redistri ucin de las mol8culas en el gradiente9 y el campo centr*ugo las lle;a $acia una regin en la )ue la densidad de la disolucin es igual a su propia densidad de *lotacin( i;@ Centr*ugas preparati;as% 5as centr*ugas preparati;as pueden clasi*icarse en tres grandes grupos% centr*ugas de uso general9 centr*uga de alta ;elocidad y ultracentr*ugas preparati;as( 5as centr*ugas de uso general son aparatos con una ;elocidad m<xima de Q,,, rpm ?aproximadamente Q,,, g@( Estas centr*ugas di*ieren solamente en su m<xima capacidad de cargaV todas ellas son capaces de utili>ar una gran ;ariedad intercam ia le de rotores angulares ?presentan un <ngulo li=o respecto del e=e de giro@ y de alanceo ?a)uellos )ue presentan un <ngulo ;aria le respecto del e=e seFalado@ permitiendo e*ectuar la separacin en tu os de -,9 G, y -,, era o mi( Existen centr*ugas de alta ;elocidad con ;elocidades m<ximas del orden de las +G,,, rpm y una m<xima *uer>a centr*uga de EH,,,g( 5a c<mara del rotor est< re*rigerada para eliminar el calor producido por la *riccin entre el aire y el rotor( 5as ultracentr*ugas preparati;as desarrollan una ;elocidad m<xima de LG,,, rpm y producen una *uer>a centr*uga m<xima de Gl,,,,g( 5as c<maras del rotor est<n a la ;e> re*rigeradas y e;acuadas9 para as minimi>ar la produccin de calor por *riccin( ;@ Ultracentri*ugacin analtica% 5a ultracentri*ugacin analtica di*iere de la ultracentri*ugacin preparati;a en )ue se utili>a *undamentalmente para el estudio de las caractersticas de la sedimentacin de macromol8culas y estructuras iolgicas9 m<s )ue para la o tencin de *racciones determinadas( En consecuencia9 se utili>an rotores especialmente diseFados y sistemas de deteccin para el continuo control del proceso de sedimentacin en un campo centr*ugo(
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E@ Digestin en>im<tica% Permite eliminar otras macromol8culas )ue acompaFan a las en>imas en estudio% <cidos nucleicos con nucleasas9 glucgeno y almidn con amilasa9 <cido $ialurnico con $ialuronidasa9 etc( 7i la en>ima en estudio resiste la accin de proteasas9 el uso de 8sta permite eliminar otras protenas inter*erentes( H@ Cromatogra*a de a*inidad% el medio soporte tiene una a*inidad espec*ica por la sustancia a aislar( 7e asa en la propiedad iolgica de ciertas protenas de unir ligandos en *orma espec*ica y re;ersi le( 7e $ace pasar la solucin )ue contiene la en>ima a9 puri*icar a tra;8s de una columna )ue contiene un polmero insolu le o gel9 al )ue se $a unido co;alentemente un ligando espec*ico de la en>ima9 por e=emplo un in$i idor competiti;o( 5as protenas )ue no tiene a*inidad espec*ica por el ligando pasar<n de largo9 y las )ue interaccionan con el in$i idor se retardar<n segAn su a*inidad por el mismo a=o las condiciones experimentales( 5a protena espec*icamente ligada puede eluirse alterando la composicin del sol;ente de manera )ue ocurra la disociacin( -,@ !soelectroen*o)ue preparati;o ?!EFp@% consiste en el *raccionamiento de an*olitos de alto peso molecular ?protenas y polip8ptidos@ de acuerdo con sus puntos isoel8ctricos caractersticos( Para ello se pro;oca la migracin de las mol8culas por accin de un potencial aplicado a tra;8s de un gradiente continuo de pT9 $asta lograr la *ocali>acin de la protena en>im<tica( El isoelectroen*o)ue tiene algunas ;enta=as so re la electro*oresis y la cromatogra*a de intercam io inico9 en las cuales separaciones similares generalmente re)uieren condiciones especiales )ue pueden no ser igualmente e*ecti;as para todos los componentes de la muestra( Adem<s9 el !EFp *acilita la deteccin de tra>as de componentes )ue pueden estar demasiado di*usos como para ser detectados en electro*oresis en gel Por e=emplo9 en gl ulos ro=os lisados9 es posi le detectar componentes )ue constituyen tan solo el ,9+S de las protenas totales( C2!0E2!/7 DE T/4/6ENE!DAD Cuando una puri*icacin en>im<tica $a alcan>ado la etapa donde posteriores puri*icaciones o pasos no producen un incremento en la acti;idad espec*ica9 pueden in;estigarse con m8todos analticos la $omogeneidad y pure>a de la preparacin o tenida( Pueden utili>arse m8todos cromatogr<*icos9 electro*oresis9 ultracentri*ugacn9 *ocali>acin isoel8ctrica( 5a o tencin de un Anico pico proteico es indicati;o de $omogeneidad9 si esto $a sido compro ado por ;arios m8todos( AN_5!7!7 DE 5/7 DA0/7 Para =u>gar si un m8todo de puri*icacin es adecuado9 de en calcularse la recuperacin y el grado de puri*icacin alcan>ados( Considerando las unidades en>im<ticas totales de la etapa inicial como el -,,S puede calcularse el rendimiento de cada etapa re*iriendo las unidades totales de cada paso a las iniciales( Para calcular el grado de puri*icacin9 de e o tenerse primero el ;alor de acti;idad espec*ica alcan>ado en cada paso( 7i se considera la acti;idad espec*ica inicial como unidad de puri*icacin9 el grado de puri*icacin de cada etapa se calcula $aciendo el cociente entre la acti;idad espec*ica de dic$a etapa y la del primer paso( 7ECUENC!A DE 5/7 4U0/D/7 DE F2ACC!/NA4!EN0/ Aparentemente los m8todos pueden usarse en cual)uier orden9 pero existen ciertas restricciones )ue $acen )ue $aya un orden lgico( Como el calentamiento tiene por o =eto eliminar grandes cantidades de protenas inespec*icas y no re)uiere el agregado de grandes ;olAmenes de l)uido9 es lgico )ue se $aga al principio( En muc$os casos no es practica le por la inesta ilidad de la en>ima o por la presencia de en>imas proteolticas )ue la daFaran muc$o al ele;ar la temperatura9 o ien por)ue no aumenta el grado de
+D

puri*icacin( A continuacin se de e elegir entre la precipitacin con sales9 sol;entes org<nicos o adsorcin( El me=or orden se determina experimentalmente9 pero de en $acerse ciertas o ser;aciones( En los primeros pasos se tienen grandes ;olAmenes de solucin en>im<tica9 y el uso de sol;entes org<nicos puede estar limitado por la capacidad de la centr*uga re*rigerada( Esto no ocurre si el material de partida es un pol;o esta le9 ya )ue puede tra a=arse con porciones de tamaFo con;eniente( Para la precipitacin con sul*ato de amonio ;ale la misma o ser;acin9 este procedimiento no re)uiere eliminacin pre;ia de sales mientras )ue la adsorcin9 )ue es el otro paso posi le s las re)uiere( Para ello se usan m8todos de di<lisis o el desalado por tami>a=e molecular )ue ;eremos m<s adelante( En cuanto a la di<lisis9 de emos recordar )ue dada su magnitud9 las mol8culas de protenas no di*unden a tra;8s de las mem ranas cuyos poros son de tamaFo in*erior a algunos milimicrones9 por e=emploV colodin9 pergamino9 celo*<n9 ele9 mientras )ue las mol8culas m<s pe)ueFas y so re todo los iones las pueden atra;esar( Esta particularidad se apro;ec$a en la di<lisis9 para separar las sales de las protenas )ue no diali>an( El T +/ y los solutos pe)ueFos9 como glucosa o sales9 pasar<n li remente a tra;8s de la mem rana9 no as las protenas( 2eempla>ando el T +/ del recipiente exterior con T +/ destilada *resca ;arias ;eces9 a concentracin de las pe)ueFas mol8culas de soluto en la solucin de protenas9 puede reducirse $asta una cantidad desprecia le( 7i ien $ay aparatos disponi les para la di<lisis r<pida de grandes ;olAmenes de l)uido9 se necesitaran ;arios metros de tu o de celo*<n para diali>ar9 por e=emplo9 -, litros( 5a di<lisis es el proceso m<s lento en la puri*icacin9 y aun)ue generalmente es ine;ita le9 su uso de e reducirse al mnimo y restringirse a las Altimas etapas9 cuando los ;olAmenes son pe)ueFos( Puede $a er p8rdida de acti;idad durante la di<lisis9 por inesta ilidad de la en>ima9 perdida de algAn co*actor y una causa muy comAn9 a menos )ue se utilice agua muy pura para la preparacin de RR u**ers9 es la entrada de tra>as de metales in$i idores( Un e=emplo de ello es el Cu V las en>imas tienen gran a*inidad por 8l y aun)ue la concentracin en el l)uido externo sea muy pe)ueFa9 puede ocurrir )ue todas las tra>as presentes entren en el tu o( Esto es m<s importante en los Altimos pasos )ue en la preparacin cruda( En de*initi;a9 si la di<lisis es *acti le9 la adsorcin es el me=or paso inicial9 los adsor entes sedimentan r<pido9 la mayora del l)uido puede separarse por decantacin y as se e;ita la centri*ugacin de grandes ;olAmenes( 5os eludos de un *raccionamiento por adsorcin a menudo contienen sales9 y por lo tanto parece lgico )ue el paso siguiente sea una precipitacin con sul*ato de amonio9 e;it<ndose una di<lisis pre;ia9 pero a menos )ue $aga un segundo *raccionamiento enseguida9 $a r< )ue diali>ar despu8s9 aun)ue el ;olumen se $a r< reducido considera lemente( B!B5!/62AF3A Bio)umica 6eneral( CA2D!N!9 0/22E79 CA243N A005 Ed( El Ateneo( Dixon X Ye 9 En>ymes( Ed( 5ongmans9 -HQ#( Colo'icI X [aplan9 4et$ods in En>ymology( :ol( ! ?-HGG@9 :ol( !!! ?-HGL@9 :ol( ..!! ?-HL-@( Acad8mic Press !nc( Pu lis$ers9 N(Z( 7c$'immer X Pardee9 Ad;ances in En>ymology9 -# DLG ?-HGD@( B(5(Yilliams X [( Yilson9 BPrincipios y 08cnicas de Bio)umica ExperimentalN( Ed( /mega9 -HE-(

+#

0UCN!CA7 DE 5AB/2A0/2!/
E5EC02/F/2E7!7 C/N7!DE2AC!/NE7 6ENE2A5E7 Cuando se aplica un campo el8ctrico en una solucin )ue contiene iones y&o grupos cargados se produce la migracin de 8stos $acia uno u otro electrodo9 segAn sus cargas netas ?los aniones $acia el <nodo ?R@ y los cationes $acia el c<todo ?-@@( Esta t8cnica opera segAn un principio di*erente a la cromatogra*a y es por eso un procedimiento alternati;o para separar sustancias similares )ue posean cargas en sus mol8culas( 7in em argo9 tam i8n pueden separarse mol8culas no cargadas si son modi*icadas pre;iamente por la introduccin de alguna cargaV por e=emplo% los a>Acares son neutros pero con;irti8ndolos en sus comple=os con orato9 los iones a>Acar- orato cargados negati;amente migran $acia el <nodo( 5a electro*oresis se puede clasi*icar en dos tipos principalesV segAn se realice en ausencia o en presencia de medio soporte se tiene la electro*oresis li re ?o del lmite m;il@ y la electro*oresis de >ona( En la electro*oresis de >ona la me>cla se siem ra en un medio soporte% papel9 agar almidn9 acetato de celulosa9 etc( en una >ona estrec$a o anda lo m<s angosta posi le( 5uego de reali>ada la corrida electro*or8tica se locali>an las sustancias separadas en >onas discretas mediante re;eladores adecuados( FAC0/2E7 QUE !NF5UZEN EN 5A 4!62AC!1N DE 5/7 !/NE7( -@ Caractersticas del in mismo% carga en signo y magnitudV *orma9 tamaFo9 tendencia a disociarse9 comportamiento an*ot8rico si lo $ay( +@ Caractersticas del medio en )ue est< el in% concentracin de electrolitos9 *uer>a inica9 propiedades diel8ctricas9 propiedades )umicas9 pT9 temperatura9 ;iscosidad9 presencia de mol8culas no polares )ue pueden in*luir so re la ;iscosidad o las propiedades diel8ctricas del electrolito con )ue pueden reaccionar para *ormar comple=os cargados9 etc( D@ Caractersticas del campo aplicado% su intensidad9 pure>a y distri ucin a lo largo del camino de migracin( 5a ;elocidad de un in depende de su mo;ilidad del gradiente del ;olta=e del campo el8ctrico( #@ Caractersticas del medio soporte% adsorcin9 *uer>a electroendosmtica( dx :C ` CE dt C mo;ilidad E C campo el8ctrico : C ;elocidad

4ientras la ;elocidad de migracin de <cidos y ases son proporcionales al grado de disociacin9 la direccin de migracin depende solo de la carga neta( R 5as sustancias an*ot8ricas como los amino<cidos ?2CTN TDC//B@ pueden ser aniones o cationes9 dependiendo del pT del u**er( 7i el pT est< por encima del punto isoel8ctrico ?el pT al cual la carga neta es cero@ existir<n como aniones y si est< por de a=o como cationes% A pT -9 )ue est< de a=o del punto isoel8ctrico de todos los amino<cidos9 $a r< mo;imiento $acia el c<todo de todos

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ellos( 5a lisina )ue es m<s <sica en ;irtud de sus dos grupos amino9 se mo;er< m<s le=os )ue la serina9 y el <cido asp<rtico )ue menos <sico )ue la serina se mo;er< aAn menos )ue la serina( 5o mismo ocurre con las protenas )ue se componen de amino<cidos con sus di*erentes puntos isoel8ctricos9 los )ue determinan el punto isoel8ctrico glo al de la protena( Esta se mue;e segAn el pT del u**er y la concentracin de la solucin en una direccin y con una ;elocidad determinada( 5a *uncin del u**er en la electro*oresis es no-solamente la de mantener el pT y transportar la corriente sino tam i8n la de pro;eer iones )ue se com inen con los grupos -C//T ?<cidos@ y NT + ?alcalinos@ li res de las protenas( 5as sales as *ormadas estar<n m<s o menos disociadas9 segAn el pT del u**er( Para )ue una partcula migre en un campo el8ctrico9 es necesario )ue posea una carga9 exceso o de*iciencia de electrones9 )ue le otorgan una carga neta( Una partcula )ue se mue;e en un campo constante ?*uer>a constante@ en un medio ;iscoso9 alcan>a *inalmente una ;elocidad constante de ido a la *uer>a retardadora ?de *riccin@9 opuesta al mo;imiento )ue aumenta linealmente con la aceleracin( Esta *uer>a de% ro>amiento depende de la geometra de la partcula( As9 la mo;ilidad electro*or8ica de un in es directamente proporcional a la carga neta e in;ersamente proporcional al tamaFo de la mol8cula y a la ;iscosidad de la solucin( 5a distancia recorrida es proporcional al tiempo de electro*oresis a=o condiciones controladas( En la mayora de los casos9 es poco pr<ctico lle;ar a ca o la electro*oresis en-ausencia de electrolitos9 )ue en general lle;an la mayora de la corriente( Una ra>n es la necesidad de mantener una capacidad u**er adecuada en el medio( /tra ra>n es )ue con solutos )ue son polielectrolitos es necesario agregar su*iciente cantidad de electrolitos para cumplir los re)uerimientos de unin de los contraiones al polielectrolito( El electrolito de la solucin introduce *uer>as resisti;as )ue aumentan con su concentracin9 se produce una disminucin de la mo;ilidad por)ue se agrega una *uer>a de *riccin9 de ido a )ue iones de carga opuesta a la del in )ue migra( En consecuencia9 el l)uido )ue rodea a la partcula se mue;e en direccin opuesta a 8sta con un lgico descenso de la mo;ilidad(

El grado de e*ecti;idad de los electrolitos en crear el e*ecto retardador9 depende de su concentracin y de su cargaV no depende de la naturale>a )umica sino de su ;alenciaV es mayor cuanto mayor sea la *uer>a inica cuya expresin es%

5a mo;ilidad ?@ es in;ersamente proporcional a la ra> cuadrada de la *uer>a inica( FAC0/2E7 AC0UAN0E7 EN 5A E5EC02/F/2E7!7 7/B2E PAPE5 DE F!502/ (

5a mo;ilidad electr*or8ica de sustancias cargadas en la electro*oresis so re papel de *iltro9 se encuentra sometida a una serie de *actores )ue aceleran o retardan su ;elocidad de despla>amiento(

+Q

a@ Accin de la capilaridad( 7i una tira de papel de *iltro se coloca como puente entre dos recipientes llenos de solucin u**er se producir< de ido a la estructura microcapilar del papel una succin $acia la >ona central del mismo en *orma tal )ue9 si am os recipientes tienen el mismo ni;el9 la ;elocidad de las corrientes l)uidas ser<n iguales y am os *rentes l)uidos llegar<n al mismo tiempo a la >ona central del papel( @ Accin de e;aporacin y de la temperatura( Como el papel de *iltro se encuentra en una c<mara $Ameda saturada de ;apor9 se producir< condensacin en la caa interna de la tapa de la celda electro*or8tica9 )ue tiene menor temperatura9 so re todo durante la circulacin de la corriente9 lo )ue disminuir< la concentracin (de la *ase ;aporV esto a su ;e> pro;ocar< la e;aporacin del l)uido en la super*icie del papel de *iltro9 lo )ue produce la succin del u**er de los recipientes electrdicos( Al aumentar la temperatura del sistema9 aumenta la conducti;idad de los iones como resultado del aumento de la ;elocidad de migracinV a=a la resistencia y si se mantiene el ;olta=e constante la intensidad de corriente aumenta( 7in em argo9 la e;aporacin del sol;ente pro;oca la concentracin del electrolito en la solucin9 y la ;elocidad de migracin del soluto ser< menor ?se $ace mayor la *uer>a inica@( Este e*ecto es contrario al descrito anteriormente( Cuando se reali>a el proceso a corriente constante9 el ;olta=e decrece pues la resistencia a=a continuamente( Esto resulta-en una menor destilacin del sol;ente y una ;elocidad de migracin m<s constante durante todo el experimento( En la electro*oresis de alto ;olta=e se genera gran cantidad de calor y es necesario diseFar aparatos )ue mantengan re*rigerado el sistemaV por e=emplo9 se sumerge el papel en un l)uido no in*lama le como el C!#C( 7i no se tomara esa precaucin9 el papel puede incendiarse pues se seca totalmente ya )ue el l)uido se e;apora del medio soporte( Con ;olta=es no mayores -,, ;olts ?+ a D ;&cm de largo de tira@ este e*ecto se $ace desprecia le( c@ Electroendosmosis% 7i no se permite )ue los grupos ioni>ados migren en un campo el8ctrico9 por e=emplo9 por estar ad$eridos al medio soporte9 el l)uido circundante de er< mo;erse para o tener termodin<micamente las condiciones de la electro*oresis( En electro*oresis li re este e*ecto no es importante( En un medio soporte como el papel )ue se considera como un gran nAmero de capilares9 la electroendosmosis es de mayor importancia( En el papel de *iltro9 )ue tiene algunos grupos car oxilos ?aproximadamente uno por cada G,, residuos de glucosa@9 el sol;ente )ue rodea a estos grupos9 ad)uiere una carga positi;a y se mue;e $acia el c<todo( Este mo;imiento del l)uido u**er se llama *lu=o electroendosmtico( Es mayor en u**ers menos concentrados y en a)uellos cuyo pT *a;orece la ioni>acin de los grupos C//T del papel9 es decir u**ers alcalinos( Es mayor con papel grueso )ue con papel *ino y de una uena calidad( El *lu=o electroendosmtico del u**er9 arrastra consigo sustancias no ioni>adas( Por lo tanto $a r< un mo;imiento aparente de sustancias no ioni>adas durante la electro*oresis9 sustancias de las cuales no se espera )ue se mue;an9 pues no tienen carga9 mientras )ue al mismo tiempo las sustancias ioni>adas son arrastradas por este e*ecto con el u**er $acia uno u otro lado(

+L

5a contri ucin de la electroendosmosis depender< del soporteV es muy alta para olillas de ;idrio y casi nula en geles de poliacrilamida( 4ED!/7 7/P/20E Papel El papel de *iltro $a sido uno de los soportes m<s utili>ados en electro*oresis por su *<cil ad)uisicin y ;ersatilidad( Existen ;arios dispositi;os diseFados para reali>ar electro*oresis en papel9 pero todos de en contar con una *uente de poder de corriente continua y una cu a ;ertical u $ori>ontal donde se sumergen las tiras de papel con las muestras a separar( 5a *uente de poder de corriente continua de e adaptarse para corridas electro*or8ticas a corrientes constante y a ;olta=e constante( El circuito incluye un ;oltmetro y un ampermetro y salidas para conectar9 generalmente dos cu as electro*or8ticas( A su ;e>9 cada cu a est< di;idida en ;arios compartimientos9 por lo menos tres9 uno para cada uno de los electrodos9 donde se coloca el u**er y se sumergen los extremos de las tiras de papel y uno central )ue sir;e de separacin entre am os( 5a *uncin del u**er es mantener $Ameda la tira para )ue *luya la corriente y regular el pT durante el experimento de *orma tal )ue las sustancias migren en condiciones aproximadamente constantes( El tipo de u**er se elige experimentalmente entre los )ue tienen un pT adecuado9 en los cuales las protenas u otras sustancias a separar9 son solu les( El ni;el de u**er en am os compartimientos de e ser id8ntico a *in de eliminar el si*onamiento del l)uido del compartimiento m<s lleno $acia el otro( Normalmente9 el *lu=o del u**er de e ser igual desde am os comportamientos $acia el centro de la tira( 5a ni;elacin de los mismos es m<s segura cuando se tiene un do le compartimiento para cada electrodo( 5a ni;elacin entre los dos compartimentos andicos y los dos catdicos se reali>a a tra;8s de un pe)ueFo ori*icio )ue se practica en la di;isin( Una ;e> colocadas las tiras de papel en la cu a9 se de e iniciar la corrida electro*or8tica lo antes posi le a *in de no permitir la di*usin de la muestra sem rada( 5uego de la corrida9 las tiras se secan y colorean para su ;aloracin colorim8trica o densitom8trica( Acetato de Celulosa 5os principios de la electro*oresis en mem ranas de acetato de celulosa son esencialmente los mismos )ue papel( Este medio soporte contiene la celulosa sustrada pues parte o todos los grupos $idroxilo de las unidades de glucosa est<n reempla>adas por acetato( Esto elimina casi enteramente las propiedades adsor entes de la celulosa y la separacin en acetato de celulosa se puede $acer en la d8cima parte del tiempo re)uerido en papel Es un soporte delgado y microporoso )ue presenta las siguientes ;enta=as% -@ 4nima a sorcin9 no presenta coleadas y se la;a m<s *<cilmente el color del B*ondoB(

+E

7eparacin neta con andas ien de*inidas( +@ 4aterial $omog8neo9 microporoso y )umicamente relati;amente puro( D@ Pro;ee una separacin m<s r<pida y con menos material9 )ue en papel( #@ 7epara me=or la protena de la al Amina s8rica( G@ 7e puede transparentar para su BscanningB o colorear las andas y medir colorim8tricamente con B lancosB a=os( 5as des;enta=as son% su tendencia a secarse durante la corrida por su delgade>9 su alta electroendosmosis y su costo( 6el de agar( Es otro medio soporte )ue se emplea so re placas de ;idrio o portao =etos( El $ec$o de )ue el agar posea grupos sul*ato pro;ee una acide> *uerte a este medio soporte9 lo )ue signi*ica una seria des;enta=aV pueden producirse coleadas9 es decir )ue las >onas no presentan lmites de*inidos y de=an una estela tras de s( 5a constitucin )umica espacial del agar $ace posi le la existencia de uniones interinicas9 o teni8ndose migraciones9 para protenas9 distintas de las o tenidas en papel de *iltro( Desde el punto-de ;ista cuantitati;o9 los *raccionamientos en geles de agar tienen la ;enta=a de )ue presentan una excelente separacin y resolucin( 5a electroendosmosis es grande y su in*luencia de e ser controlada por un sem rado adecuado de la muestra9 dado )ue las 9 y parte de las glo ulinas tienden a migrar $acia el c<todo por el *lu=o eectroendosmtico( El uso com inado de la electro*oresis en agar con la inmunodi*usin9 $a pro ado ser una $erramienta muy Atil en inmunologa para caracteri>ar una serie de sistemas antgeno-anticuerpo( Por este m8todo se pueden indi;iduali>ar una mayor cantidad de *racciones de las protenas s8ricas9 lo )ue sera imposi le de lograr con otro procedimiento distinto de la inmunoelectro*oresis( Una ;e> separadas las andas proteicas por electro*oresis9 se siem ra el antisuero en una cuenca practicada a tal e*ecto y se permite la di*usin en c<mara $Ameda( 5uego9 se *i=a y colorea el agar9 o ser;<ndose las lneas de inmunoprecipitacin )ue se reconocen por su u icacin9 grosor y longitud9 a am os lados de la cuenca y a la altura de cada *raccin de protena s8rica separada por electro*oresis( 6el de Almidn ( /*rece un tipo de soporte )ue permite com inar la electro*oresis y la *iltracin molecular( 5a preparacin exacta del gel y la naturale>a del almidn son esenciales para una uena separacin electro*or8tica( Pe)ueFas ;ariaciones en la composicin del gel pro;ocan grandes *luctuaciones en el poder de resolucin(^ 5a capacidad de las mol8culas para atra;esar una malla o red depende de su tamaFo9 *orma y de interacciones como a sorcin e intercam io inico9 con la matri> del gel( /tro tipo de gel )ue utili>a las propiedades de *iltracin com inadas con la electro*oresis es el gel de poliacrilamida( 6el de poliacrilamida ( Este medio soporte es un polmero de acrilamida entrecru>ada con N9N^-dimetilacrilamida( is-

+H

Con una proporcin del +S de isacrilamida la me>cla ya puede geli*icarse9 pero el di<metro de poro depende de la concentracin total de acrilamida( 7in em argo9 a cual)uier concentracin dada de acrilamida total el di<metro del poro9 tiene un mnimo cuando la concentracin de is es del GS( 5a *ormacin de poliacrilamida por polimeri>acin de los monmeros se produce en presencia de radicales li resV 8stos son pro;istos por la *otodescomposicin de la ri o*la;ina en presencia de lu> a ultra;ioleta o *luorescente( 5a adicin de 0E4ED ?N9 N9 Na9 N 9 t8trametil-etilendiamina@ es ;enta=osa como catali>ador de la polimeri>acin( /tra ase usada es el dimetil amino propionitrilo en ;e> de 0E4ED( 5a geli*icacin se retarda manteniendo la me>cla a temperatura cercana a los ,\ C( Acrilamida R isacrilamida polmero 2i o*la;ina o persul*ato de amonio ?iniciador@ 0E4ED ?catali>ador@ lu> El e)uipo utili>ado para corridas electro*or8ticas en este medio soporte9 consta de una *uente de poder9 dos reser;orios9 uno superior y otro in*erior para el u**er9 conectados entre s por tu os o placas de ;idrio )ue contienen al gel(

D,

E7QUE4A DE UN EQU!P/ DE E5EC02/F/2E7!7 EN 6E5 DE P/5!AC2!5A4!DA

Tay dos tipos de sistemas de u**ers% continuo y discontinuo( Un sistema continuo tiene solamente una clase de gel9 el gel separador9 y usa el mismo u**er en am os compartimientos y en gel( En un sistema discontinuo9 m8todo desarrollado por /rnstein ?-HQ#@ y Da;is ?-HQ#@ ?Ann( N( Z( Acad( 7ci( Z+A% D+--D#H y #,#-#+L9 respecti;amente@9 se coloca arri a del gel separador ?separating gel@ un gel de poro grande no restricti;o9 llamado gel concentrador ?stacIing gel@( Cada uno de estos geles est< $ec$o con un u**er di*erente y los u**ers de los compartimientos andico y catdico son di*erentes a los de los geles( 5a resolucin otorgada por un sistema discontinuo es muc$o mayor )ue la de un sistema continuo9 aun)ue 8ste Altimo es m<s *<cil de reali>ar( En un sistema discontinuo9 la mo;ilidad electro*or8tica de una protena9 )ue es una medida de la ;elocidad de migracin de una especie cargada en un campo el8ctrico9 es intermedia entre la mo;ilidad del in del u**er en el gel concentrador ?in lder o leading ion@ y la mo;ilidad del in del u**er en el compartimiento superior9 ?in de arrastre o trailing ion@( Cuando la electro*oresis comien>a9 los iones y las protenas comien>an a migrar dentro del gel concentrador( 5as protenas se ;an concentrando cada ;e> m<s en una >ona muy estrec$a ?stacI@ limitada por el in lder y el in de arrastre( 5as protenas siguen migrando de este modo en el gel concentrador $asta llegar al gel separador en *orma de una anda muy *ina9 con la )ue se logra una resolucin muc$o mayor( Esta concentracin de protenas no ocurre en un sistema continuo donde las protenas entran al gel separador en una anda tan anc$a como la muestra sem rada( Como resultado se o tienen andas di*usas y po remente resueltas(

D-

Per*il electro*or8tico de suero $umano en gel de poliacrilamida en condiciones no desnaturali>antes(

Determinacin de P4 por PA6E Taciendo la corrida de una protena desconocida y de otras conocidas a di*erentes concentraciones del gel y representando el log 2 * ?donde 2 * es la mo;ilidad de cada anda respecto del colorante@9 ;ersus la concentracin del gel9 y luego las pendientes negati;as de cada cur;a ;ersus el peso molecular9 se puede $allar el peso molecular de la sustancia desconocida(

D+

T Tay acuerdo general entre la mayora de los autores )ue el log de ( ?mo;ilidad electro*or8tica@ de una partcula est< linealmente relacionado a la densidad del gel ?0@( log C log o - [0 o C mo;ilidad li re a ,S de densidad de gel [ C constante de retardo aR S0C m b -,, a C g de acrilamida C g de is m C ;ol del u**er ?m5@

5a mo;ilidad electro*or8tica es una constante *sica a=o condiciones electro*or8ticas de*inidas( 7i los experimentos se $acen a=o condiciones de*inidas de tiempo y campo el8ctrico se pueden comparar las distancias de migracin directamente( [ C Ic b P4 R a a C interseccin en ordenadas de lnea de cali racin( Ic C coe*iciente de entrecru>amiento constante9 para entrecru>amiento cte( 5uego% log ( C log
,

-?

b P4 R a@ 0

Esta ecuacin descri e la mo;ilidad electro*or8tica de una protena es*8rica compacta en un gel de densidad 0 y entrecru>amiento C9 como *uncin de su tamaFo ?proporcional al P4@ y mo;ilidad li re o lo )ue a su ;e> depende de la carga( El I c est< relacionado con C para cada preparacin espec*ica del gel $ec$o con reacti;os iguales a=o condiciones id8nticas de polimeri>acin% SC C aR a C g de poliacrilamida( SC C concentracin porcentual de entrecru>ador re*erido a 0( ^ b -,,

Del gr<*ico log ;s 0 se deduce )ue% -@ rectas paralelas en tales representaciones indicaran protenas de id8ntica *orma pero di*erente carga +@ lneas no paralelas indicaran protenas de di*erente tamaFo D@ lneas no paralelas con pendientes )ue di*ieran unas de otras en el mismo grado9
DD

re;elando una *amilia regular de cur;as9 signi*ica la existencia de polmeros o in;ersamente9 de su unidades de una unidad proteica( 5a posi ilidad de distinguir entre tamaFo y di*erencias de carga en las protenas permitira por e=emplo decidir cu<l es el paso siguiente en un proceso de puri*icacin9 o sea algAn m8todo de separacin asado en di*erencias de tamaFo molecular ?*iltracin por geles@9 o cromatogra*a de intercam io inico9 s se separan en ase a carga( 7i se agrega urea o sodio-dodecil-sul*ato9 se pueden correr geles )ue permiten separar las su unidades de las mismas y determinar luego su peso molecular( Cuando la estructura terciaria de las protenas est< adem<s mantenida por puentes 7-79 es necesario desarrollar la corrida pre;io tratamiento de la muestra con mercaptoetanol u otro agente reductor( Cuando se corre el gel en presencia de 7D7 ?sodio dodecil sul*ato@ se separan las su unidades proteicas de acuerdo a su tamaFo molecular y no ya a su densidad de carga9 dado )ue el detergente produce uni*ormidad en las cargas( 5as protenas migran como aniones9 y en esas condiciones se esta lece una relacin lineal in;ersa entre la distancia de migracin ?expresada como mo;ilidad relati;a@ y el log P4(
5og P4

2*

4igracin de una proteina 4o;ilidad relati;a C 4igracin del colorante indicador del *rente b Am os corridos simult<neamente9 se lo denomina 2*( ( !7/E5EC02/ENF/QUE( El an<lisis isoel8ctrico o en*ocado se o tiene aplicando una di*erencia de potencial so re un sistema de electrolito en el cual el pT aumenta del <nodo al c<todo( El gradiente de pT es mantenido por el agregado de an*olitos ?oligop8ptidos sint8ticos@ al medio soporte( Estos crean >onas de pT de*inido y esta le ?dado el gran poder u**er )ue los an*olitos poseen@( 5as protenas al migrar $acia uno u otro electrodo encontrar<n en el camino un sector con el pT correspondiente a su p!V en ese momento su mo;ilidad electro*or8tica es nula y se dice )ue la protena $a sido Ben*ocadaB en una estrec$a >ona( Esto permite separar protenas por sus puntos isoel8ctricos aAn cuando no posean grandes di*erencias entre ellos ?actualmente por este m8todo se logran separar protenas con di*erencias entre su p! de ,9,,+G unidades de pT@( En la pr<ctica se de e esta ili>ar el sistema para e;itar la con;eccin y el me>clado de los an*olitos en*ocadosV esto se logra por agregado de sacarosa o construyendo el gradiente de pT so re un medio soporte como poliacrilamida o agarosa(

D#

B!B5!/62AF3A( -@ 5a oratory 0ec$ni)ues in Bioc$emistry and 4olecular Biology :olume !( 0(G( YroI and E( YorI Nort$-Tolland Pu lis$ing Company( +@ Paper C$romatograp$y and Electrop$oresis( :olume !( 6unter ]'erg X Wo$n 2( Y4taIer ?Academic Press@ -HQL( D@ Electro*oresis( Wuan 4iguel Castagnino( Eude a( % #@ T( 2amer 4aurer9 Desc( Electrop$oresis and 2elaled 0ec$ni)ues y Polyacrylamide 6el Eleclrop$oresisV Ed( Yalter de 6ruyter X Co(9 Berln9 -HL-( CUE70!/NA2!/ l@ OCmo se explica la separacin electro*or8tica de protenas y de sustancias no cargadas y )u8 *actores inter;ienen en la mo;ilidad de protenasP +@ Enumere ;enta=as del acetato de celulosa respecto al papel( D@ OCmo se logra o tener una ;elocidad constante de migracinP Discutir las *uer>as )ue actAan so re una mol8cula sometida a un campo el8ctrico en un medio ;iscoso( #@ OQu8 propiedades caracteri>an a los geles de almidn y poliacrilamidaP G@ a@ OCmo se determinan P4 de protenas desconocidas en geles de poliacrilamidaP

@ O7e pueden separar electro*or8ticamente las D protenas con un gel de #SP( OPor )u8P Oy con el de QSP Explicar el gr<*ico( Q@ OTacia )u8 polo migra una protena de punto isoel8ctrico #9G en un u**er orato de pT E9QP Oy una de p! E9HP L@ OQu8 *uncin cumple cada uno de los reacti;os empleados en la- preparacin del gel de poliacrilamidaP E@ ODe )u8 depende la eleccin de un u**er de corridaP DiscAtalo en t8rminos de pT y (

DG

C2/4A0/62AF3A Existen numerosos m8todos )ue se pueden usar para separar y caracteri>ar me>clas de sustancias( 5a eleccin est< a menudo determinada por las caractersticas *sicas y )umicas de los solutos en la muestra9 su masa o ;olumen y el grado de puri*icacin re)uerida( 5a cromatogra*a es una t8cnica analtica de separacin de alto poder de resolucin9 y de considera le comple=idad adapta le a sustancias presentes en me>clas $omog8neas las cuales se separan como consecuencia de sus di*erentes ;elocidades de migracin9 al percolar un l)uido ?o un gas@ a tra;8s del material poroso o pul;erulento( 7e asa en las propiedades *sicas de las mol8culas tales como solu ilidad9 adsorcin9 ;olatilidad9 etc( Es astante impro a le )ue dos sustancias distintas ex$i an cuantitati;amente el mismo par de propiedades *sicas( En estas di*erencias )ue ien pueden ser muy pe)ueFas9 se- asan las separaciones cromatogr<*icas( En general los sistemas est<n compuestos de dos *ases con una sustancia )ue se distri uye entre ellas en *orma di*erencial( Una de las *ases ?*ase m;il@9 se de=a *luir so re la otra ?*ase estacionaria@9 en e)uili rio con ella( 5a *ase m;il puede ser un l)uido o un gas9 y la *ase estacionaria puede ser una pelcula de l)uido9 un slido *inamente di;idido9 o un slido inerte loti>ado( Una ;e> introducida la me>cla a separar en el sistema cromatogr<*ico9 las propiedades ya mencionadas de los componentes de la me>cla determinan si se mue;en o no9 y si lo $acen9 con )ue ;elocidad relati;a( Dado )ue la separacin es imposi le si $ay ;arios componentes )ue no se mue;en9 las *ases de en elegirse de tal modo )ue todos los componentes de la me>cla se mue;an a ;elocidades di*erentes( Esta di*erencia en las ;elocidades de migracin es la ase de las separaciones cromatogr<*icas( En gran medida9 las propiedades anteriores est<n determinadas por la polaridad de las sustancias9 <sicamente signi*ica la posesin por una mol8cula de centros separados9 positi;os y negati;os( Estas densidades de cargas permiten la interaccin con otras mol8culas( El agua tiene un *uerte dipolo permanente en-;irtud de su geometra molecular9 con*iguracin electrnica y su unin $idrgeno s siendo altamente polar( 5os compuestos org<nicos oxigenados tales como alco$oles9 cetonas9 esteres9 8teres son dipolos menos *uertes9 con menos uniones puente de $idrgeno y por lo tanto menos polares )ue el agua( 5os $idrocar uros son lo compuestos menos polares( En general la polaridad de los compuestos org<nicos aumenta con el nAmero de grupos *uncionales y disminuye con el aumento del peso molecular( Por eso los $idratos de car ono son considerados polares en ;irtud de sus muc$os grupos ox$idrilos( Por otra parte los sol;entes polares tienden a disol;er solutos polares m<s r<pidamente )ue a los no polares y ;ice;ersa( 0endiendo en cuenta todas estas ;aria les se $an desarrollado numerosas t8cnicas )ue contemplan las di*erentes com inaciones posi les entre *ases *i=as y m;iles y t8cnicas de desarrollo del cromatograma( As tenemos cromatogra*a en papel9 en capa delgada9 de intercam io inico9 *iltracin por geles9 cromatogra*a en *ase gaseosa9 etc( Para los *ines de identi*icacin de una sustancia es necesario en cada tipo de cromatogra*a9 de*inir un par<metro caracterstico de la misma( Como el comportamiento cromatogr<*ico esta sometido a muc$as ;aria les operacionales dic$os par<metros normalmente no se ta ulan sino )ue se comparan con los est<ndares conocidos cromatogra*iados simult<neamente9 y en las mismas condiciones(

DQ

Algunos de estos par<metros son% 2elacin Frontal ?2F@ % distancia recorrida por la sustancia 2* C distancia recorrida por el sol;ente o un est<ndar 7e utili>a en papel9 capa delgada en ciertas columnas( 7i la relacin es con respecto al sol;ente9 el 2F ;ara entre , y -V pero cuando se utili>a un est<ndar de re*erencia9 el ;alor puede ser mayor )ue -( En $idratos de car ono se usa como est<ndar a la glucosa( distancia recorrida por la sustancia 2g C distancia recorrida por la glucosa( :olumen de elucin% 7e usa principalmente en *iltracin por geles y es el ;olumen de eluyente necesario para elur la sustancia de la columna o sea el ;olumen recogido desde el momento de la siem ra $asta la salida de un determinado soluto( 0iempo de retencin o ;olumen de retencin% 7e usa en cromatogra*a en *ase gaseosa( Es el ;olumen de gas el tiempo ?a un *lu=o de gas conocido@ necesario para detectar la sustancia en la salida de la columna9 desde el momento de la siem ra( Fuer>a inica o pT% 7e utili>a en resinas de intercam io inico y es la *uer>a inica o el pT al cual eluye una sustancia )ue $a sido pre;iamente a sor ida en la columna( A continuacin se detallan algunas t8cnicas cromatogr<*icas )ue se utili>an en tra a=os pr<cticos% Cromatogra*a en papel% 7e puede explicar mediante dos *enmenos )ue ocurren simult<neamente% particin y adsorcin( Adsorcin% la sustancia tiende a ser retenida por la celulosa por *uer>as de super*icie( En este caso el papel es la *ase *i=a mientras )ue el sol;ente de desarrollo es la *ase m;il( Particin% 7e sa e )ue la celulosa del papel a sor e una cierta cantidad de agua de ido a la polaridad de am as( Existe por lo tanto un *enmeno de particin de la sustancia entre el agua retenida ?*ase *i=a@ y el sol;ente de desarrollo ?*ase m;il@ 5a di*erente solu ilidad de las sustancias en am as *ases determinar< la ;elocidad de migracin de las mismas( 5a *ase *i=a acuosa se encuentra *uertemente ligada a la celulosa del papel y para explicar la particin con sol;entes misci les con el agua9 tales como el etanol o piridina9 es preciso admitir )ue dic$a agua no es e)ui;alente a agua li re9 por)ue si as lo *uese9 am as *ases no coexistiranV se puede admitir )ue el agua *orma parte de un comple=o celulosa-agua en al cual las mol8culas en solucin en el sol;ente org<nico pueden ligarse por sus grupos $idr*ilos( / sea )ue este proceso re;ersi le es de adsorcin si se considera la ligadura con el con=unto del comple=o o de particin entre el sol;ente si se atri uye m<s importancia a la asociacin con las mol8culas de agua9 )ue9 por otra parte9 est<n inmo;ili>adas en este comple=o( En la pr<ctica se utili>a la cromatogra*a en papel para identi*icacin de los productos de $idrlisis de los polisac<ridos(

DL

Cuestionario -@ OPor )u8 es necesario eliminar las sales de una muestra antes de cromatogra*iarlaP +@ OCu<l es el *undamento de la cromatogra*a en papelP D@ De*ina 2*( OQu8 importancia pr<ctica tiene su utili>acinP Bi liogra*a( c Balls9 A(N(9 Yalden9 N(N( and 0$ompson9 2(2(9 W( Biol( C$em( -LD9 H ?-H#E@( c Bio)umica 6eneral9 T(N( 0orresV T( Carminatti9 CE( Cardini Ed( El Ateneo( c Ciangelosi y col( ?-HH,@( W( Bacteriol( -L+9 +-L+( cConrand 7tump*% /utlines o* Bioc$emistry(

DE

C2/4A0/62AF3A EN C/5U4NA DE 6E5 Es un m8todo cromatogr<*ico )ue en *ase l)uida separa mol8culas de acuerdo a di*erencias en sus dimensiones moleculares9 de all tam i8n se lo denomina Btami>a=e molecularB( De ido a )ue los tamaFos de polmeros como protenas9 <cidos nucleicos9 o $idratos de car ono di*ieren considera lemente9 esta t8cnica resulta a menudo muy -Atil para separar me>clas completas de estas sustancias( 5a cromatogra*a en columna de gel es una t8cnica9 analtica en la cual9 el lec$o cromatogr<*icos es el instrumento para o tener la- separacin( Este lec$o consiste en diminutas partculas porosas no cargadas ?gel@9 generalmente Bempa)uetadasB dentro de un tu o o columna( El espacio entre las partculas es ocupado por l)uido )ue se $ace *luir a tra;8s de la columna( 5as sustancias a ser separadas son transportadas a tra;8s del lec$o por el *lu=o del l)uido( 5a *ase estacionaria ?gel@ retarda el camino de la sustancia a tra;8s del lec$o( Compuestos con di*erentes pesos moleculares son retenidos en grado ;aria le y migran a lo largo del lec$o con di*erentes ;elocidades( El retardo se produce por la distri ucin de las sustancias entre el l)uido y la *ase estacionaria( 5a propiedad caracterstica )ue distingue la cromatogra*a en gel de otro tipo de cromatogra*a es )ue los granos )ue *orman la *ase estacionaria constituye un gel no cargado( Este gel se B$inc$aB con el mismo sol;ente )ue percola a tra;8s del lec$o( 0picamente9 los geles son macromol8culas )ue tienen gran a*inidad por el sol;ente( 5as cadenas de polisac<ridos $an sido entrecru>adas ?caso de 7ep$adex@ para *ormar una malla tridimensional )ue las $ace insolu les( El tamaFo de los poros depende del grado de entrecru>amiento de las cadenas de polisac<ridos( En lugar de disol;erse en el l)uido9 se B$inc$aB9 tomando grandes cantidades de l)uido( En -HQ+ Flodin present un modelo simple para explicar el comportamiento espec*ico de geles en cromatogra*a( Considera )ue el coe*iciente de particin de las mol8culas de soluto entre las partculas de gel ?*ase gel@ y el l)uido intersticial ?entre partculas@ est< regido exclusi;amente por e*ectos est8ricos( 7eFala )ue la matri> del gel ocupa una parte grande del espacio en las inmediaciones de los entrecru>amientos( 5as mol8culas grandes no pueden penetrar en estas regiones9 mientras )ue las pe)ueFas se pueden aproximar m<s a los entrecru>amientos( Estas restricciones est8ricas9 segAn Flodin9 di;iden el gel en >onas permitidas y >onas pro$i idas( Cuando m<s grandes son las dimensiones moleculares del soluto9 mayor es la proporcin de gel )ue se constituye en la >ona pro$i ida( Esto induce a las mol8culas grandes a emerger del lec$o cromatogr<*ico antes )ue las pe)ueFas( 5as mol8culas m<s pe)ueFas tienen acceso a lodos los espacios entre las cadenas de la matri> del gel y por lo tanto se distri uir<n igualmente entre el l)uido li re y el l)uido en gel9 eluy8ndose con el mayor retardo( Aun)ue este modelo explica el comportamiento de elucin de la mayora de las sustancias9 se o ser;aron ciertas excepciones( No explica ;olAmenes de elucin mayores )ue el ;olumen total del l)uido del lec$o cromatogr<*ico ?suma de cantidad de l)uido en el gel y entre los grados del gel@( A pesar de algunas des;iaciones o ser;adas9 para los *ines pr<cticos es su*iciente la siguiente descripcin% todas las mol8culas son transportadas a tra;8s del lec$o cromatogr<*ico por el *lu=o del l)uido entre los granos del gel( 5as mol8culas grandes est<n9 por ra>ones est8ricas9 impedidas de penetrar dentro de los granos del gel9 y se despla>ar<n o ;ia=ar<n a la misma ;elocidad )ue el l)uido( 5as mol8culas m<s pe)ueFas podr<n penetrar dentro de los granos del gel y saldr<n con un retardo( Es decir las mol8culas ser<n eluidas del gel segAn sus pesos moleculares decrecientes( El principio se ilustra en la *igura -(

DH

Figura -% Principio de la cromatogra*a en gel( 7e aplica a la columna una muestra )ue contiene mol8culas grandes y pe)ueFas( 5as mol8culas pe)ueFas ?puntos c$icos@ pueden pasar dentro e los granos del gel ?crculos a iertos@ y )uedan re>agadas respecto de las mol8culas grandes ?puntos grandes@9 )ue no pueden penetrar dentro de los granos( Propiedades caractersticas Este tipo de cromatogra*a es t8cnicamente simple de reali>ar y marcadamente insensi le a la composicin del *luido y a la temperatura( ( AAn los compuestos m<s l< iles pueden ser tratados con poco riesgo de destruccin( 5a cromatogra*a en gel separa aAn sustancias de muy alto peso molecular( :ariando el grado de entrecru>amiento de las cadenas de polisac<ridos )ue *orman la trama tridimensional del gel9 se puede ;ariar el rango de *raccionamiento dentro de lmites muy amplios( As los geles microreticulares m<s densos separan sustancias de peso molecular menor )ue -,,,V con otros geles9 los rangos se extienden $asta pesos moleculares de ;arios millones 5os lec$os cromatogr<*icos generalmente no necesitan regeneracin y pueden ser usados una y otra ;e>( 5os materiales son marcadamente esta les9 y el mismo gel puede ser usado por ;arios aFos siempre )ue se e;ite la proli*eracin micro iana9 por e=emplo mediante el agregado de a>ida de sodio ,9,+S o sales de mercurio ?,9,,--,9,GS@( De*iniciones 5ec$o cromatogr<*co% material empa)uetado en la columna m<s el l)uido intersticial( Eluyente% l)uido )ue percola a tra;8s del lec$o entre las partculas del gel( Par<metros utili>ados para la caracteri>acin del lec$o :t C : del lec$o contenido en la columna9 :t C :i R :o R :g :o C :olumen muertoV es el ;olumen del l)uido en e espacio intersticial entre los granos del lec$o( 7e determina empricamente midiendo el ;olumen de elucin de un soluto )ue se excluye completamente de los poros de la matri> del gel( :i C :olumen internoV es el ;olumen ocupado por el sol;ente contenido dentro de las partculas de gel en la columna( Puede calcularse conociendo el peso del gel ?a@ y el ;alor del agua a sor ida por $idratacin ?:r@ :i C a x :r :g C :olumen de la matri>9 es el ;olumen del dextrano ?en el caso de 7ep$adex@ sin incluir al sol;ente contenido dentro de las partculas( :x C :olumen de la *ase gel en el lec$o cromatgr<*ico9 se o tiene por di*erencia entre : t y :o ?:er *igura D@(

#,

Par<metros usados para caracteri>ar el comportamiento del soluto En el curso de un desarrollo cromatogr<*ico9 se determina en el eludo la concentracin de las sustancias en la muestra( 5os datos o tenidos se usan para $acer un gr<*ico de concentracin ?o alguna ;aria le apropiada relacionada con la concentracin@ ;ersus el ;olumen de eluido recogido despu8s de la aplicacin de la muestra( De esta cur;a de elucin es posi le caracteri>ar el comportamiento de las di;ersas sustancias so re el lec$o cromato gr<*ico( 5a ;aria le m<s importante es el ;olumen de elucin : c( 0ericamente9 es el ;olumen de eluyente )ue se re)uiere para transportar las mol8culas de la sustancia a tra;8s de la columna( Para pe)ueFos ;olAmenes de muestra aplicados ?su*icientemente pe)ueFos como para ser despreciados en comparacin con el ;olumen de elucin@9 se toma como :e el ;olumen de l)uido )ue $a pasado por la columna entre la aplicacin de nuestra muestra y la posicin del pico m<ximo en el diagrama de elucin9 si la cur;a es sim8trica( 7i el ;olumen de muestra es tan grande )ue la cur;a de elucin alcan>a un BplateauB9 el : e es el ;olumen eludo desde el comien>o de la aplicacin de la muestra $asta el punto de in*lexin de la parte ascendente del pico de elucin( Para muestras de tamaFo intermedio )ue no *orman plateau en sus cur;as de elucin9 el : e se medir< a partir del punto donde se aplic la mitad del ;olumen de muestra $asta el m<ximo de la cur;a de elucin( 0odos estos criterios re)uieren tericamente9 )ue las cur;as de elucin sean sim8tricas( Para -caracteri>ar el comportamiento del soluto independientemente de las dimensiones geom8tricas de la columna9 se usan los siguientes par<metros% :e&:o% donde : o es el ;olumen de elucin para una sustancia )ue es completamente excluida del gel( En algunos casos la in;ersa del ;olumen de elucin relati;o ?:e&:o@(2 C constante de retencin9 se usa para la caracteri>acin de sustancias( El ;alor de :e&:o es *<cil de calcular( 7in em argo9 es algo dependiente del empa)uetamiento de la columna( :e&:t% donde : t es el ;olumen total del lec$o cromatgr<*ico( Es tam i8n muy *<cil de calcular( Como ya se indic9 la cromatogra*a en gel de iera considerarse como un caso especial de cromatogra*a de particin( 5a teora de la cromatogra*a pro;ee una correlacin entre el comportamiento de una sustancia y su coe*iciente de particin entre la *ase m;il y la *ase estacionaria( :e C :o R [ :s donde [ es el coe*iciente de particin entre las *ases y : s es el ;olumen de la *ase estacionaria9 En cromatogra*a en gel se usan dos di*erentes coe*icientes de particin( 5a di*erencia entre am os radica en la de*inicin de la *ase estacionaria( 7i se considera *ase estacionaria toda la *ase gel ?:x@9 se o tiene el coe*iciente de particin( :e - :o [a; C :t - :o 7i por otro lado se considera *ase estacionaria slo el l)uido )ue em e e el gel9 resulta el siguiente coe*iciente de particin( :e " :o [d C :i C :t " :o " a:g :e - :o

7iendo mg% la masa del gel :g% el ;olumen esp( Part(

#-

Par<metros usados para la caracteri>acin de los geles :r C Bagua em e idaB es la medida m<s comAn de la capacidad de $inc$arse del gel( 2epresenta la cantidad de agua ?en m5@9 em e ida por - g de gel seco( No incluye el l)uido intersticial entre los granos( Finalmente el tamaFo de la partcula de los granos es una ;aria le importante( !n*luye en el anc$o de las andas separadas9 la resolucin9 la dilucin y la ;elocidad de *lu=o )ue pueden conseguirse ?:er *igura #@(

Figura #% Cur;as de elucn de un a>Acar a@ en columnas de 7ep$adex 6-+G9 de igual tamaFo9 igual *lu=o ?#G m5&$@ pero distinto poroV @ columnas de 7ep$adex 6-+G de iguales poros9 pero distintas ;elocidades de *lu=o( Propiedades importantes de los geles para cromatogra*a 5a matri> del gel de e ser inerte( El riesgo de desnaturali>acin de las protenas y <cidos nucleicos es considera le( A*ortunadamente $ay muc$os tipos de gel )ue interaccionan muy poco con estas sustancias( De en ser )umicamente esta les( 5os geles de en ser esta les en un amplio rango de pT y temperatura para permitir la li re eleccin de las condiciones experimentales( Ba=o contenido de grupos inicos9 para e;itar e*ectos de intercam io inico( Para *acilitar la adaptacin del m8todo a di*erentes pro lemas9 es aconse=a le una amplia seleccin de tipos de gel con la misma composicin )umica pero con rangos de *raccionamiento di*erentes( En el caso de geles microreliculares el rango de *raccionamiento est< determinado principalmente por las propiedades de B$inc$amientoB( 5os geles con a=os contenidos de sustancia seca permiten el acceso a mol8culas m<s grandes )ue a)uellos con altos contenidos9 de sustancia seca( El contenido de sustancia seca en estos geles puede ;ariar aproximadamente G,S p&; $asta GS p&; ?:r C - a :r C +,@(

#+

Esto corresponde a una ;ariacin del lmite de exclusin de peso molecular de alrededor de -,,,9 a pesos moleculares de alrededor de G,,(,,, ?determinado para p8ptidos y protenas@( El tamaFo de partcula de e ser cuidadosamente controlado( Un lec$o *ormado por pe)ueFas partculas dar< generalmente una muy uena resolucin( Esto es de ido a )ue el mecanismo )ue da lugar a >onas m<s di*usas se ampli*ica a medida )ue aumenta el tamaFo de la partcula( Con partculas grandes9 la di*usin de las macromol8culas es mayor( Por otra parte9 la resistencia al *lu=o de un lec$o de partculas grandes es menor y la ;elocidad m<xima de *lu=o )ue se puede lograr es mayor( El grado super*ino se emplea para cromatogra*a en capa delgada o cromatogra*a en columna cuando se re)uiere una resolucin muy altaV el grado *ino para *ines preparati;os con uena resolucin pero *lu=o m<s r<pidoV los grados medio y grueso se emplean generalmente para cromatogra*a preparati;a cuando es necesario operar a un *lu=o m<s r<pidoV el grado grueso suele usarse tam i8n en operaciones en B atc$B( 5a in*luencia de la ;elocidad de *lu=o y el tamaFo de la partcula se ilustran en la *igura #( 6rado del gel% caracterstica del gel9 relacionada con el tamaFo de las partculas del mismo y especi*icada por el *a ricante( 08cnica experimental Preparacin del gel% 5as partculas secas se $idratan agreg<ndolas lentamente9 con agitacin constante para e;itar la *ormacin de grumos9 a un gran exceso de agua o solucin acuosa de NaCl al -S del mismo u**er )ue se usar< luego para la elucin( En un principio el $inc$amiento es r<pido de ido a la gran a*inidad por el agua9 pero el e)uili rio *inal se alcan>a luego de un perodo de tiempo )ue depende del tipo de gel( Cuando el gel se est< $inc$ando con;iene remo;er las partculas *inas por sedimentacin y decantacin repetida9 $asta )ue el so renadante sea claro( Antes de empa)uetar la columna9 con;iene diluir la suspensin del gel $asta o tener una ;iscosidad tal )ue permita su ir r<pidamente a la super*icie cual)uier ur u=a presente y es muy ;enta=oso desairear la suspensin someti8ndola a G - -, minutos de ;aco( Preparacin de la columnaV Cual)uier tu o cilndrico de ;idrio pro;isto de una salida regula le sir;e para ser adaptado a la cromatogra*a en gel( El tamaFo de la columna depender< de la cantidad de muestra y de los *ines del experimento( En general9 la relacin di<metro-altura9 puede ;ariar de -%-, a -%+,( El tu o de e estar en posicin per*ectamente ;ertical( Empa)uetamiento de la columna% 7e llena medio o tres cuartas partes de la columna con agua o el u**er de elucin9 estando la lla;e de salida cerradaV luego se agrega la suspensin del gel cuidando de no *ormar ur u=as( Una ;e> agregado el gel comien>a a sedimentarV cuando se *orm una capa de +-G cm se a re la lla;e y comien>a a *luir el l)uido lentamente9 a medida )ue esto ocurre se ;a agregando el resto de la suspensin $asta completar el ;olumen re)uerido9 e;itando )ue sedimente totalmente el gel en la columna antes del agregado del nue;o gel( Nunca de e de=arse secar la columna( Una ;e> armada la columna se e)uili ra el gel con D a G ;olAmenes de columna del medio eluyente( Aplicacin de la muestra% Tay ;arios m8todos9 uno de ellos consiste en sem rar la muestra a=o una capa de eluyente9 deposit<ndola so re la super*icie del gel9 en ;irtud de una di*erencia de densidad( Para ello suele aFadirse sacarosa a la muestra aumentando su densidad( 0amaFo de la muestra% Depende del o =eto del experimento9 generalmente ;olAmenes de muestras grandes dan menor dilucin del solutoV pero cuando se desea una uena separacin de las sustancias en estudio9 el ;olumen inicial de e ser lo m<s pe)ueFo posi le( Cuando9 en cam io9 se trata de o tener un m<ximo de rendimiento para un cierto grado de separacin9 la muestra puede llegar a ser tan grande como -&D a -&+ del ;olumen de la columna(

#D

Aplicaciones En muc$as preparaciones io)umicas el desalado o el cam io de u**er constituyen pasos de importancia( 5as sales y las protenas son muy di*erentes y en consecuencia no $ay ninguna di*icultad terica implcita( El modo m<s usual de desalado es pro a lemente la di<lisis( 7in em argo9 la di<lisis insume un tiempo considera le9 )ue puede causar desnaturali>acin de las protenas l< iles( 5os intercam iadores inicos no se pueden usar para desalar protenas ya )ue estas se unen tam i8n a estos empa)ues( 5a cromatogra*a en gel es un m8todo simple y r<pido para desalar o cam iar el u**er( El tamaFo de la muestra puede llegar $asta un +G-D,S del ;olumen del lec$o( 7ep$adex 6-+G y Bio-6el P-Q son los tipos de gel m<s adecuados para estos *ines( El lec$o del gel de e ser e)uili rado antes del experimento con una solucin de la composicin inica deseada ?agua destilada en el caso de desalado@( 5a elucin se $ace con el mismo l)uido( 5a ;elocidad de *lu=o puede ser alta ?-,-+, m5&$@ lo )ue $ace posi le completar toda la operacin en una $ora( 5a cromatogra*a en gel $a sido usada con uenos resultados para la eliminacin de in$i idores y co*actores de en>imas( Esta remocin es muy importante en estudios cin8ticos de reacciones en>im<ticas( Puede llegar a ser muy di*cil de lograr por otros m8todos9 particularmente con en>imas l< iles )ue se inacti;an por precipitacin o di<lisis prolongada( Determinacin de pesos moleculares 7e $a demostrado )ue los :e de protenas glo ulares est<n determinados por sus pesos moleculares( En un rango considera le9 el :e es aproximadamente *uncin lineal del logaritmo de P4( Este m8todo puede tam i8n ser usado para la determinacin de pesos moleculares de p8ptidos y de otras macromol8culas( Como la relacin entre P4 y :e es di*erente para di*erentes tipos de mol8culas9 se de e $acer una cur;a de cali racin en cada caso( Con este m8todo se pueden determinar P4 de en>imas aAn en preparaciones9 crudas( 7e mide la acti;idad en>im<tica en el eluido de la columna y se calcula el :e( 7e puede estimar el P4 de le en>ima por medio de la cur;a de cali racin )ue se o tiene por cromatogra*a de protenas de P4 conocido( Este es el Anico m8todo para estimacin de P4 de protenas )ue no re)uiere puri*icacin extensa( Fraccionamiento En -HQL9 con el empleo de columnas de 7ep$adex 6--,,9 Auricc$io y Bruni puri*icaron L,, ;eces en una sola etapa9 glucosidasa a partir de $gado de ratas y9 riFn $umano( El $ec$o interesante en esta aplicacin del 7ep$adex es )ue de ido a la analoga estructural entre almidn y dextranos9 una interaccin del tipo en>ima-sustrato retard el pasa=e de las glucosidasa9 las cuales se eluyeron muc$o despu8s )ue todas las dem<s protenas )ue la acompaFa an permitiendo as su puri*icacin( Bi liogra*a -@ !on Exc$angers in /rganic and Bioc$emistry( Calmon and 0(2((T Dressman9 Editors interscience( Pu lis$ers9 !nc( Ne' ZorI9 N(Z( -HGL( +@ !on Exc$ange 2esines9 Fourt$ Edition9 0$e Britis$ Drug Nouses 5td( D@ Batlle9 A(4(C(9 Ciencia e !n;estigacin9 +#9 +#-9 -HQE #@ 5a oratory 0ec$ni)ues in Bioc$emistry and 4olecular Biology( :olumen -( Ed( 0(7( YorI and E( YorI( Nort$-Tolland Pu lis$ing Company9 Amsterdam9 5ondon9 -HQH( G@ Flodin9 PW( C$romalog( G9 -,D?-HQ-@ Cuestionario -@ Expli)ue el *undamento del tami>a=e molecular( +@ D8 por lo menos + e=emplos de empleo de 7ep$adex9 distintos al desarrollado(
##

!N0E2CA4B!/ !1N!C/ El intercam io inico puede ser de*inido como un intercam io re;ersi le de iones entre un slido y un l)uido9 sin cam io sustancial en la estructura del slido( 5as resinas intercam iadoras pueden clasi*icarse en inorg<nicas y a su ;e> naturales9 sint8ticas y naturales modi*icadas( 0odas ellas tienen en comAn dos propiedades% son insolu les en agua y sol;ente org<nicos y contienen iones l< iles )ue pueden intercam iarse li remente con los iones del medio circundante sin )ue se ;eri*i)ue ningAn cam io *sico en la estructura( Este material es siempre de naturale>a comple=a y es9 de $ec$o9 de estructura polim8rica( Est<n *ormadas por un polmero insolu le cargado positi;a o negati;amente9 segAn los casos ?macrocatin o macroanin respecti;amente@9 completando su estructura el grupo inicamente acti;o( Este grupo est< siempre *i=o al polmero de alto peso molecular y es inm;il 5a carga el8ctrica del grupo inicamente acti;o est< siempre *i=o al polmero de alto-peso-molecular y es inm;il( 5a carga el8ctrica del grupo inicamente acti;o est< siempre alanceada por un nAmero e)ui;alente de caigas opuestas )ue son m;iles y se pueden intercam iar con otros iones de carga similar( Este grupo inico acti;o determina el comportamiento de la resina de intercam io( 7e pueden di;idir en dos tipos principales% a@ Catinica% 7on capaces de intercam iar cationes( @ Aninica% 7on capaces de intercam iar aniones( 2esinas de !ntercam io Catnico% Constan de un macroanin y de cationes l< iles( 6rupos tales como - 7/+/T9 CT+7/+/T9 le con*ieren propiedades *uertemente <cidas a la resina( 5as resinas d8 ilmente <cidas con*ieren los grupos -C//T9 - /T *enlicos9 y sus propiedades se aseme=an a las de un <cido d8 il insolu le( 5a *uer>a depende de la *acilidad de ioni>acin de los grupos <cidos( 5as resinas de intercam io catinicas se usan generalmente en dos *ormas% 5a *orma <cido li re o *orma R R de $idrgeno y la *orma salina9 a menudo Na o [ % 5a *orma $idrgeno a sor e cationes y li era la R cantidad e)ui;alente de iones $idrgeno en la solucin9 mientras )ue con la *orma Na se a sor en R cationes y se li era una cantidad e)ui;alente de iones Na ( En general9 para una mayor e*iciencia del proceso de intercam io inico9 la a*inidad del in a ser intercam iado de er< ser sustancialmente )ue la del in )ue se encuentra en la resina( 5as di*erencias de comportamiento entre los intercam iadores catinicos <cidos *uerte y <cidos d8 iles se ilustra en las ecuaciones siguientes9 donde 2 representa la matri> de la resina y el largo de las *lec$as indica la tendencia relati;a )ue tienen las reacciones para proceder $acia uno u otro lado% 2esina <cida *uerte l(2(7/+/T R NaCl +(2(7/+/T R NaTC/D 2(7/+/Na R TCl 2( 7/+/Na R C/+ R T+/

donde 2 C representa el es)ueleto insolu le 2esina <cida d8 il 2( C//T R NaCl 2( C//T R NaTC/D 2( C//Na R TCl 2( C//Na R C/+ R T+/
#G

5a *orma $idrgeno de los intercam iadores cationes <cido *uerte reacciona *<cilmente con sales de <cidos *uertes y d8 iles ?ecuaciones - y +@% en la reaccin +9 con la sal de un <cido muy d8 il9 el e)uili rio est< despla>ado liacia la derec$a9 ya )ue se producen pocos iones $idrgeno li res( 5a resina <cido d8 il reacciona con sales de <cidos muy *uertes en muy poca proporcin9 pues se producen iones $idrgeno li res )ue despla>an el e)uili rio $acia la i>)uierda( Am os tipos de resinas reaccionan con sales de <cidos d8 iles ?ecuaciones + y #@ y tam i8n pueden ser neutrali>adas con <lcali ?ecuaciones G y Q@( G( 2(7/ +/T R Na/T 2(C//T R Na/T 2(7/ +/Na R T+/ 2 C,,Na R T+/

2esinas intercam iadoras aninicas% constan de un macrocatin y de aniones l< iles( 7us propiedades deri;an del grupo amino y de grupos amino sustituidos en la estructura de la resina( 5a *uer>a <sica de la resina depende parcialmente de la naturale>a del grupo acti;o y tam i8n de su posicin( Por e=emplo% un grupo amino unido directamente a la matri> con*erir< menor car<cter <sico )ue un grupo similar unido a una cadena lateral( 5os intercam iadores <sicos d8 iles tienen grupos amino ?NT +@ y grupos amino sustituidos ?mono y di sustituidos@9 mientras )ue en el grupo amino cuaternario ?-N2 #/T@ da lugar a resinas <sicas *uertes( Estas Altimas est<n ioni>adas *uertemente y pueden usarse en todo rango de pT( 2( N2#/T R NaCl 2-N2#Cl R Na/T

5os grupos intercam ia les son $idro*licos9 tienden a pasar a la solucin cuando la resina se coloca en agua y como est<n unidos a la estructura del polmero tienden a lle;ar tam i8n a 8ste a solucin( Para e;itar esto9 en las resinas sint8ticas las cadenas del polmero se unen entre s por otras cadenas *ormando una mol8cula tridimensional )ue da un entrecru>amiento ?CrosslinIing@ seme=ante al )ue se encuentra en los compuestos naturales( Este entrecru>amiento entre cadenas disminuye la tendencia a solu ili>arse en agua y solo se B$inc$aB cuando la sustancia seca se pone en contacto con el agua( 5as reacciones de intercam io son re;ersi les9 de modo )ue normalmente no alcan>an un total despla>amiento $acia una u otra direccin9 sino )ue llegan al e)uili rio( Por ello es di*cil reempla>ar un in dado de una solucin9 por simple agitacin con la resina intercam iadora ?m8todo en atc$@( Para completar el proceso de e aFadirse un gran exceso de resina o ien pasar la solucin por una columna( 5a cromatogra*a en la columna re)uiere dos etapas% adsorcin y elucin( En la primera se utili>an condiciones )ue determinan una mayor a*inidad entre los componentes de la muestra y la resina( En la segunda etapa se usan condiciones )ue *a;orecen la disminucin de a*inidad de un dado soluto por la resina( Ello puede lograrse con un a=uste de pT9 aumento de concentracin de un in despla>ante9 aumento de temperatura9 etc( Por este m8todo se $an podido separar las me>clas de los numerosos amino<cidos )ue se o tienen por $idrlisis de una protena o los presentes en un medio iolgico( !gualmente pueden separarse los nucletidos producidos por $idrlisis de los <cidos nucleicos9 permite tam i8n preparar *<cilmente en estado de pure>a $idratos de car ono y sus deri;ados9 mediante la eliminacin de sales inorg<nicas de sus soluciones( Para este *in suelen usarse resinas mixtas9 o sea )ue contienen tanto aninicos como catnicos ligados a su matri>( 7i pasamos a tra;8s de ella por e=emplo% una solucin de $idratos de car ono con alto contenido en sales9 los aniones y cationes correspondientes a dic$as sales se pegar<n a la resina9 mientras^ )ue los $idratos de car ono se eluir<n con mayor *acilidad de ido a su car<cter no inico
#Q

Propiedades de las resinas de ntercam io -@ 5as reacciones de intercam io son este)uiom8tricas% por cada gramo del in intercam ia le9 captado por la resina9 se li era un e)ui;alente gramo del in de la resina a la solucin( +@ 5as reacciones de intercam io inico son re;ersi les( D@ 0odos los grupos inicos acti;os en la resina de intercam io son accesi les como sitios intercam iadores por los iones pe)ueFos( #@ En general9 cual)uier compuesto solu le y capa> de ioni>arse puede inter;enir en reacciones de intercam io( Capacidad de la resina% 5a capacidad total de la resina de intercam io es el nAmero de sitios inicos o potencialmente inicos por unidad de peso de resina ?milie)&gr@( Bi liogra*a -@ Dixon and Ye 9 En>ymes( Ed 5ogmans9 -HQ#( +@ Y$ite9 4andler9 7mit$( Principles o* Bioc$emistry( D@ Tans-Ulric$ Benemeyer9 4et$ods o* en>ymatic analisis( :erlag C$emic% Alemania -HQD( #@ Beman 4( und B=orI Ys 4eden 4et$eden der Flan>eanalyse( :ol :!9 -HQD9 pag( DL#( G@ 0( 7( YorI9 E( YorI9 5a oratory 0ec$ni)ues in Bioc$emisry and 4olecular Biology :ol -( Q@ Colo'icI 7( and [aplan 4et$ods in en>ymology9 :ol( !9 -HGG( :ol !!!9 -HGL y :ol ..!5 -HL-( Ac( Press !nc( Pu lis$ers( N(Z( L@ Conn and 7tump*% /utlines o* Bioc$emistry( E@ 5e$ninger( Bio)umica -HL+9 p<g H,y -#D( Cuestionario -@ Expli)ue mediante ecuaciones el *uncionamiento de una resina de intercam io catinico(

#L

2AD!AC0!:!DAD
El <tomo es la unidad m<s pe)ueFa de materia )ue mantiene las propiedades )umicas de un elemento dado( Un <tomo esta *ormado por electrones y un nAcleo( El nAcleo est< constituido por un dado nAmero de neutrones y un dado nAmero de protones cuya suma reci e el nom re de nAmero m<sico y se representa por A( 5as di*erencias entre los <tomos de di;ersos elementos dependen del nAmero de protones y neutrones contenidos en el nAcleo atmico9 )ue determina la masa y la carga del nAcleo( El nAmero y disposicin de los or itales electrnicos determina las propiedades )umicas de los elementos( 4A7A Protn Neutrn Electrn -9QL#G,L x -, -9QLD x -,
-+#

CA26A gr #9E,D- x -,
--,

u(e(s( ?positi;a@(

-+#

gr gr

sin carga el8ctrica de #9E,+- x -,

--,

H9-,QQ x -,

-+E

u(e(s( ?negati;a@

Cada especie de <tomo9 caracteri>ada por los correspondientes nAmeros de masa A y nAmero atmico ]9 se denomina nucledo( !stopos% poseen nAcleos con igual nAmero de protones9 pero distinto nAmero de neutrones9 y por tanto distinto nAmero m<sico( !stonos % nAcleos con igual nAmero de neutrones9 pero distinto nAmero de protones9 y por tanto distinto nAmero m<sico( !s aros % nAcleos con distinto nAmero de protones y distinto nAmero de neutrones9 pero igual nAmero m<sico(

5os BradionucleidosB naturales9 descu iertos a principios de siglo9 son istopos radiacti;os ?inesta les@ )ue se pueden o tener en la naturale>a(

E=emplos

Un elemento E se escri e E( El istopo esta le natural m<s a undante del car ono tiene Q protones y Q neutrones en -+ el nAcleo9 por lo tanto ]CQ9 AC]RNC-+ y todo el <tomo puede escri irse como C ?en muc$os casos9 el su ndice )ue indica el nAmero atmico es redundante pues este y el sm olo )umico identi*ican la especie )umica9 por lo -D tanto se omite el su ndice( El otro istopo natural pero menos a undante del car ono es el C9 )ue contiene L -# neutrones( El istopo radiacti;o m<s conocido del car ono es el C9 )ue contiene Q protones y E neutrones( El T es un istopo esta le del $idrgeno y tiene un protn pero ningAn neutrn( El T es un istopo esta le del D $idrgeno conocido como deuterio por)ue su nAcleo contiene + partculas nucleares9 un protn y un neutrn( El T9 denominado tritio9 es un istopo radiacti;o del $idrgeno *ormado por la com inacin de un protn y + neutrones( 0odos los istopos del $idrgeno tienen un Anico electrn circundante y por ende poseen id8nticas propiedades )umicasV no o stante9 sus propiedades *sicas son di*erentes ?punto de e ullicin y de congelacin@( En el caso del tritio9 su nAcleo es inesta le y como se discute m<s adelante9 su*re transiciones radiacti;as trans*orm<ndose en un nAcleo di*erente y esta le% el nAcleo de $elio(
+

#E

P2!NC!P!/7 DE 2AD!AC!1N Z 2AD!AC0!:!DAD

2AD!AC!1N NUC5EA2
5a li eracin de energa o materia durante la trans*ormacin de un <tomo inesta le en un <tomo m<s esta le se denomina radiacin nuclear( El nAmero y disposicin de los protones y neutrones en el nAcleo de un <tomo determina si el nAcleo es esta le o inesta le(

E70AB!5!DAD NUC5EA2 Tay --G elementos )umicos conocidos9 de los cuales9 H+ existen en la naturale>a y el resto $a sido o tenido arti*icialmente( 7e conocen $oy en da unos +,,, nucleidos9 de los cuales son esta les +L#( Unos D#, existen en la naturale>a y el resto se $an producido en el la oratorio( Por tanto9 la mayora de los nucleidos conocidos son radiacti;os( 5os nucleidos radiacti;os son inesta les y se trans*orman espont<neamente con el tiempo *ormando otros nucleidos( 7e presenta a continuacin una clasi*icacin de los nucleidos esta les atendiendo al nAmero par o impar de sus nucleones% 0AB5A DE NUC5E!D/7 E70AB5E7
] PA2 PA2 !4PA2 !4PA2 N PA2 !4PA2 PA2 !4PA2 A PA2 !4PA2 !4PA2 PA2 Nucleidos esta les -QG GG G, #
# +

E=emplos

Te 9 /

+,E E+ GL +Q QE +H

-L E L D + -

Fe Cu
-, G

5i T
Q D

5i

-# L

Como se puede o ser;ar9 slo $ay cuatro nucleidos esta les con ] y N impar9 mientras )ue $ay -QG nucleidos esta les con ] y N par lo )ue $ace suponer )ue%
Puesto )ue el nAmero de nucleidos esta les es m<ximo cuando ] y N son pares9 de e $a er una tendencia a *ormar pares protn-protn y neutrn-neutrn y puesto )ue solo $ay cuatro nucleidos esta les con ] y N impares9 un protn no tiende a aparearse con un neutrn( El nAmero de nucleidos esta les con ] impar y N par o con ] par y N impar representa cada uno la tercera parte de los nucleidos con ] y N pares9 lo )ue indica la posi ilidad de )ue el comportamiento de los neutrones y protones sea similar y )ue la naturale>a de la carga de los nucleones sea independiente de la esta ilidad(

B@ CA26A Z 0A4Ad/ DE5 NUC5E/

5a carga del nAcleo determina su posicin en el sistema peridico( 2ut$er*ord demostr )ue la mayor parte de la masa del <tomo y su carga positi;a est<n locali>adas en una pe)ueFa regin --# central del <tomo )ue llam nAcleo9 cuyo radio calcul del orden de -, m a tra;8s del estudio de dispersin de partculas al*a cuando inciden en nAcleos de <tomos met<licos( El radio nuclear

#H

$a sido recalculado posteriormente9 siendo del orden de -, nAmero m<sico A% 2 C r o(A

-&D

--G

m(9 y resultando ser proporcional al

ro es un ;alor constante para todos los nAcleos y es igual a -9D(-, m( Por tanto9 el ;olumen de un nAcleo si se considera su *orma es*8rica9 es proporcional al nAmero -G A de nucleones9 y la densidad nuclear es un ;alor constante9 -, ;eces mayor )ue la densidad de la materia macroscpica9 lo )ue da una idea de lo compactado )ue est<n los nucleones dentro de un nAcleo( As mismo9 demuestra )ue la materia macroscpica est< esencialmente ;aca9 ya )ue la mayor parte de la masa est< concentrada en los nAcleos( 5os nAcleos atmicos de una sustancia radiacti;a no son esta les y se transmutan espont<neamente en otros nAcleos emitiendo partculas al*a9 eta o gamma(
7i se representa la sucesin de nucledos esta les y cuasi-esta les9 es decir los istopos de los elementos )umicos9 en un gr<*ico )ue tenga por ordenadas el nAmero de neutrones9 N y por a scisa el nAmero de cargas ] de los nucledos respecti;os9 la posicin de cada nucleido aparece como una lnea a #D\ )ue corresponde a los )ue tienen NC]( Esta relacin slo se cumple con los nucledos m<s li;ianos y a medida )ue ;a aumentando el nAmero de masa9 crece tam i8n el Bexceso de neutronesB N-]( Este exceso es un *actor de esta ilidad )ue compensa la repulsin electrost<tica9 causada por el aumento continuo del nAmero de protones( Por lo tanto se re)uiere la adicin de neutrones a *in de aumentar la distancia promedio entre los protones del nAcleo para reducir las *uer>as el8ctricas( Tacia el extremo pesado de la serie N&] C -9GH(

--G

5os elementos indicados a la derec$a de la regin de esta ilidad representan nAcleos )ue tienen un exceso de protones o una de*iciencia de neutrones( De ordinario9 emiten un positrn capturan un electrn( A la i>)uierda de la regin de esta ilidad est<n los elementos )ue poseen nAcleos con exceso de neutrones de*iciencia de protones( 7u *orma m<s pro a le de desintegracin es emitiendo una partcula eta negati;a9 pero tam i8n es posi le la emisin de neutrones partculas al*a(

G,

F/24A7 DE DE7!N0E62AC!1N 2AD!AC0!:A 5os nucledos inesta les se trans*orman generalmente en nucledos esta les mediante uno de los procesos de desintegracin radiacti;a )ue se descri en a continuacin( - Emisin de partculas al*a ?@ - Emisin de electrn negati;o ? @ R - Emisin de electrn positi;o ? @ - Captura electrnica ?ce@( - Fisin espont<nea del nAcleo( - 0ransicin isom8rica ?0!(@ - Con;ersin interna( - Emisin de rayos gamma ?@(

G-

5as partculas al*a son <tomos de Te con carga +R9 es decir9 )ue $an perdido sus dos electrones( Por tanto9 poseen dos neutrones y dos protones( Es la radiacin caracterstica de istopos de nAmero atmico ele;ado9 tales como los del uranio9 torio9 radio9 plutonio( Dada la ele;ada masa de estas partculas y a )ue se emiten a gran L ;elocidad por los nAcleos ?su ;elocidad es del orden de -, m&s@9 al c$ocar con la materia pierden gradualmente su energa ioni>ando los <tomos y se *renan muy r<pidamente9 por lo )ue )uedan detenidas con tan slo unos cm de aire o unas mil8simas de mm de agua( En su interaccin con el cuerpo $umano no son capaces de atra;esar la piel( As pues9 tienen poco poder de penetracin siendo a sor idos totalmente por una l<mina de aluminio de ,(- mm de espesor o una simple $o=a de papel( 7on de escaso inter8s en )umica clnica(
A ]

# +

Te ? @ +

A-# ]- +

Z + Q ?energa@
#

E=emplo%

++Q

2a

+++

2n ?2adn@ + + Te ?part( al*a@

5as partculas eta son electrones emitidos a grandes ;elocidades prximas a la de la lu>( De ido a su pe)ueFa masa9 muc$o menor )ue la radiacin al*a9 poseen un poder de penetracin mayor )ue las partculas al*a( 5a emisin eta es a sor ida por una l<mina de aluminio de ,(G mm de espesor y )uedan *renadas en algunos m de aire9 o por - cm de agua( En el cuerpo $umano9 pueden llegar a traspasar la piel9 pero no so repasan el te=ido su cut<neo( 5os positrones son partculas con masa e)ui;alente a la de un electrn pero su carga es positi;a(
E=emplo%

+ p + A ]

+ + Q ?emisin de negatrones @
A

+ ]+- Z + + Q

+ n + + + Q ?emisin de positrones @
A ]

A ] --

Z + + Q

G+

En los procesos de desintegracin por emisin de partculas eta9 el nAmero de masa no ;ara de ido a )ue el nAmero total de nucleones sigue siendo el mismo ?la partcula pro;iene de un neutrn )ue se trans*orma en un protn o ;ice;ersa@( Estos procesos de desintegracin son conocidos como Btrans*ormaciones iso <ricasB( 7in em argo9 el nAmero atmico aumenta9 en - en la emisin de negatrones y disminuye en - en la emisin de positrones produci8ndose la Btrans*ormacin de los elementosB ?con;ersin de un elemento en otro@(

5a radiacin gamma% son radiaciones electromagn8ticas de la misma naturale>a )ue los rayos . pero de menor longitud de onda( 7u poder de penetracin es muy ele;ado *rente al de las partculas al*a o eta9 pudiendo atra;esar el cuerpo $umano( Quedan *renadas con espesores de m de $ormign o unos pocos cm de plomo9 por lo )ue cuando se utili>an *uentes radiacti;as )ue emiten este tipo de radiacin9 $ay )ue utili>ar linda=es adecuados(
Desintegracin por captura electrnica Adem<s de la desintegracin por emisin de positrones9 los nucledos de*icientes de neutrones pueden decaer por captura electrnica9 trans*ormando un protn en un neutrn( En el proceso de captura electrnica9 el electrn es capturado de los or itales m<s cercanos al nAcleo ?pre*erentemente [@ y con menor pro a ilidad los m<s ale=ados ?59 49 etc@(
El ;aco or ital creado por la captura electrnica es r<pidamente llenado por el electrn de una r ita superior9 produci8ndose la emisin de un rayo . caracterstico( Es9 as mismo9 una transicin iso <rica )ue conduce a la transmutacin de los elementos( El nAcleo $i=o *ormado mediante este tipo de desintegracin se $alla *recuentemente en un estado excitado o metaesta le y puede su*rir una posterior emisin de rayos gamma ? @( E=emplo% para un <tomo . de masa atmica A
]

. R -e

]--

ZRQ

7iendo el elemento Z de igual masa atmica A Emisin de rayos gamma ? @( En algunos casos9 los tipos de desintegraciones ya mencionados producen un nAcleo $i=o en estado excitado metaesta le9 lo )ue signi*ica )ue posee un exceso de energa por encima de la energa mnima posi le en su estado *undamental( Este nucledo excitado decae r<pidamente por emisin de rayos gamma9 radiacin electromagn8tica de muy corta longitud de onda( / s8r;ese )ue la emisin gamma no ;a acompaFada por ningAn cam io en el nAmero de masa9 nAmero de protones ni nAmero de neutrones( Por ello se denomina Btransicin isom8ricaB ?esto es siempre y cuando el tiempo de --+ la emisin de la radiacin sea mayor )ue -, seg@( E=% -D-

-D-m

.e

0(!(

-+G

-D-

.e

-+G

c(e(

-D-m

0e

0(!(

0e

P2/P!EDADE7 DE A56UN/7 2AD!/!710/P/7 DE !4P/20ANC!A B!/516!CA

GD

C!NE0!CA DE 5A 2AD!AC0!:!DAD 5a desintegracin de un nAcleo radiacti;o es un proceso espont<neo y es imposi le predecir cuando un <tomo se transmutar<( A$ora ien9 cuando $ay una gran cantidad de <tomos radiacti;os9 se puede demostrar )ue la cantidad de nAcleos iniciales disminuye con el tiempo( El nAmero de <tomos )ue se desintegran en un tiempo dado es directamente proporcional al nAmero de <tomos presentes en la muestra( 5a constante de proporcionalidad es conocida como la constante de desintegracin(

donde C C e ( 7i e;aluamos esta ecuacin a t C ,9 ;emos )ue e C C C N,(

N, C nAmero de <tomos iniciales N C nAmero de <tomos sin desintegrar en el instante t C constante de desintegracin 7e llama periodo de semidesintegracin ? t -&+@ al tiempo para el cual el nAmero de nAcleos iniciales se !710/P/ PA203CU5A E4!0!DA ENE263A DE 5A :ida media9 t e PA203CU5A ?4e:@ reduce a la D ,(,-E -+(D aFos T mitad( -# ,(-GG GGL, aFos C Cada ++ R ,(GG +(Q aFos Na sustancia -(+E radiacti;a +# -(DH -G $oras Na tiene un -(L-+(LG periodo de D+ -(L-#(+ das P DG semidesinte ,(-QL EL(- das 7 G DQ gracin( ,(L-# Db-, das Cl
-+G

! !

-D-

,(,DG ,(,+L ,(Q--,(DD ,(Q#-,(DQ-,(+E

Q, das

E(- das

G#

N= N , & +

t- & + = ln + &

El tiempo de ;ida promedio ?o ;ida media@ es el ;alor promedio de duracin del <tomo de una sustancia radiacti;a antes de )ue se desintegre( El t8rmino perodo de desintegracin ?te@ es un par<metro elegido ar itrariamente( No ocurre lo mismo con la ;ida media( Para calcularlo $ay )ue sumar los tiempos de ;ida de todos los <tomos indi;iduales y di;idir por el nAmero n o de <tomos inicialmente presentes( A un tiempo t9 $an so re;i;ido N C N o e -t 9 en el inter;alo ?t9 t R t@ se $an destruido ?-N@9 cada uno de los cuales $a ;i;ido un tiempo to9 por lo tanto9 el tiempo total ;i;ido por todos ellos es t ?- N@( 7umando todos los inter;alos de tiempo se tiene el tiempo total ;i;ido por todos los <tomosV di;idiendo por el nAmero de <tomos iniciales9 resulta el promedio de ;ida de un <tomo9 ;ida media ? @( El tiempo de ;ida de un <tomo puede ser de unos instantes $asta poseer ;ida in*inita(

= -& =

t- & + ,9QHD

Este t8rmino ;ida media no se utili>a en la pr<ctica( El importante para los c<lculos de actuali>acin de la cantidad de radiacti;idad es el perodo de semidesntegracin9 de*inido anteriormente(

En lengua=e corriente se acostum ra decir Bdesintegraciones por segundoB ?dps@9 Bdesintegraciones por minutoB ?dpm@( Q Existen dos unidades pr<cticas de acti;idad% el rul$er*ord9 rd9 igual a -, sr 9 )ue no est< en uso e*ecti;o y el curie ?Ci@ )ue est< de*inido9 por la Comisin !nternacional de Unidades y 4ediciones 2adiolgicas9 corno la cantidad de cual)uier nucledo radiacti;o en la cual el nAmero de -, desintegraciones por segundo es9 D9L -, ( - Ci C D9L -, s- C D9L -, dps C +9++ -, dpm D Q 4Altiplos% - curie ?Ci@ C -, milicurie ?mCi@ C -, microcurie ?Ci@ C -, etc( Actualmente se est< tendiendo a utili>ar el Bec)uerel ?B)@% lB)C ls C D9L -,
---, -, -, -+

nanocurie ?nCi@9 Ci

P2/P!EDADE7 DE 5A 2AD!AC!1N C/N 5A 4A0E2!A

Es importante conocer -as propiedades de la radiacin y el mecanismo de p8rdida de energa de radiacin cuando atra;iesa la materia9 ya )ue la operacin de todos los dispositi;os de deteccin para cual)uier tipo de radiacin depende de una o m<s propiedades particulares de la radiacin )ue se mide y de las interacciones de la radiacin con la materia(

GG

5a interaccin de la radiacin con la materia produce la trans*erencia de energa de un nAcleo radiacti;o al material circundante( Esta trans*erencia se logra a tra;8s de procesos de excitacin e ioni>acinV por lo tanto la radiacin emitida por los radionucleidos se denomina *recuentemente radiacin ioni>ante( 5a excitacin se produce cuando los electrones son pertur ados9 ;ariando su disposicin normal por a sorcin de energa de la radiacin incidente y lle;ados a un estado de mayor energa( 5a ioni>acin se produce cuando la energa a sor ida es su*iciente para causar la expulsin de un electrn de su r ita9 creando un par inico ?un electrn li re y un <tomo o mol8cula cargados positi;amente@( Esta capacidad de ioni>acin se expresa me=or como el nAmero de pares inicos producidos por unidad de longitud de recorrido de la partcula incidente9 es decir9 la ioni>acin espec*ica( CA26A 4A7A # me No posee !/N!]AC!1N RRR RR R PENE02AC!1N R RR RRR

R+ fno

Como se explic anteriormente las partculas al*a son nAcleos de $elio( 7u masa relati;amente grande $ace )ue las partculas ;ia=en en *orma lenta en lnea recta durante el proceso de ioni>acin( Adem<s de ido a su do le carga9 produce un alto grado de ioni>acin )ue pro;oca una p8rdida de energa r<pidamente a corta distancia( Por consiguiente9 son d8 ilmente penetrantes y pueden ser detenidas completamente por capas muy *inas de material slido( Por estas caractersticas son exteriormente menos riesgosas( 7in em argo9 s penetran en el organismo9 irradian intensamente los te=idos circundantes( 5os nucledos emisores de partculas al*a son rara ;e> utili>ados en medicina( En el caso de las partculas eta no se conocen di*erencias entre el negatrn y el electrn9 sal;o su origen( Como en el caso de las partculas al*a9 los negatrones y positrones tam i8n pierden su energa causando excitacin e ioni>acin( 5os positrones son antipartculas de los electrones y posee una ;ida media muy corta( Cuando el positrn $a perdido la mayor parte de su energa cin8tica y se pone en contacto con un electrn li re de la materia9 las dos cargas se e)uili ran y las dos masas desaparecen dando lugar a dos *otones gamma de ani)uilamiento de ,9G-- 4e; de energa9 c&u( De este modo la masa total de am as partculas se con;ierte en energa( De ido a la pe)ueFa masa )ue poseen las partculas eta9 es importante la des;iacin )ue su*ren al interaccionar con la materia( En el caso de radiacin electromagn8tica 9 dado )ue los *otones gamma no poseen carga ni masa y ;ia=an a la ;elocidad de la lu>9 podran atra;esar la materia durante una distancia considera le sin ninguna interaccin y luego perder toda o gran parte de su energa en una sola interaccin( 5os *otones pueden interaccionar con la materia en ;arias *ormas di*erentes9 segAn sus energas y las propiedades de la materia con )ue interaccionan(

4ED!C!1N DE 5A 2AD!AC0!:!DAD
Como se $a ;isto anteriormente9 la radiacti;idad puede medirse apro;ec$ando la interaccin de las radiaciones con la materia( En esta propiedad se asan los e)uipos para la determinacin de acti;idad de muestras radiacti;as( 5os e*ectos de interaccin pueden ser transitorios9 como la ioni>acin de gases9 )ue cesa cuando se retira la *uente de radiacinV o permanentes9 como la alteracin )umica en la placa *otogr<*ica( Por lo tanto9 existen dos tipos de detectores% Bcon memoriaB9 )ue su*ren e*ectos acumulati;os permanentes y detectores Binstant<neosB( 2e*iri8ndose exclusi;amente a radiacti;idad9 los primeros son so re todo Atiles como dosmetros 9 para medir a sorcin de energa de la radiacin9 y los segundos como contadores 9 por)ue permiten9 a tra;8s de la deteccin indi;idual de partculas o *otones9 contar el nAmero de desintegraciones en un inter;alo de tiempo9 es decir9 medir acti;idad(

5os dosmetros pueden ser% de termoluminiscencia ?D05@9 )umicos de placas *otogr<*icas( Estos Altimos se asan en )ue las radiaciones nucleares impresionan las emulsiones *otogr<*icas

GQ

en *orma an<loga a la lu>9 aun)ue la sensi ilidad de la pelcula ;ara con la naturale>a y la energa de la radiacin( Pelculas seleccionadas por la e*iciencia de su respuesta se utili>an prendidas a la solapa9 olsillo9 cinturn9 etc(9 como si *ueran escuditos o distinti;os9 en los cuales se a sor e localmente la energa de la radiacin9 )ue es acumulati;a(

El mecanismo de accin de los contadores se asa en% -( Excitacin atmica o molecular

5os )ue interesan en )umica iolgica son los contadores de centelleo( Estos pueden ser contadores slidos inorg<nicos ?ioduro de sodio ?Na!@9 ioduro de talio ?0l!@@V contadores slidos org<nicos ?antraceno9 estl eno@V contadores en soluciones l)uidas9 Bcentelladores l)uidosB ?+-G di*enil-oxa>ol ?PP/@ en enceno@ y los contadores en soluciones slidas Bcentelladores pl<sticosB ?0P ?p-ter*enilo@ en poliestireno@(
+( !oni>acin Puede ser de gas ?c<mara de ioni>acin9 contador proporcional9 contador 6eiger-4gller9 etc(@ o de slidos semiconductores ?contadores de germanio9 cortadores de silicio@( Una ;e> )ue las partculas o *otones son detectados9 pueden ser contados( El nAmero registrado por unidad de tiempo no es necesariamente la acti;idad a soluta total ?A@9 de la *uente emisora9 por)ue el detector raramente puede ser cien por ciento e*iciente( 5a *raccin de acti;idad registrada por el detector es 29 de manera )ue% 2 C (A ?7 @ donde A es la acti;idad a soluta o ;erdadera de la *uente ? en dps9 dpm9 etc@V 2 es el ;alor medido o acti;idad registrada9 y se expresa en BcuentasB por unidad de tiempo% cps9 cpm9 etc( y es el *actor9 de e*iciencia( Por lo tanto% C 2&A ?cps&dps9 cpm&dpm@ 5os detectores 6eiger-4gller consisten en un tu o de ;idrio cilndrico )ue encierra un c<todo de metal y un gas ioni>a le( En el centro $ay un alam re *ino9 el <nodo( En un extremo est< la llamada ;entana terminal9 )ue generalmente es muy delgada para permitir la entrada de partculas de a=a energa( 5a muestra slida se coloca
--

GL

so re una planc$eta )ue se u ica de a=o de esta ;entana terminal( El gas se ioni>a al interactuar con la radiacin y se genera una corriente el8ctrica entre los electrodos )ue se encuentran a gran di*erencia de potencial( Por medio de un circuito apropiado se registra esta corriente en *orma de pulso o cuenta en un gra*icador( Uno de los incon;enientes )ue posee es la geometra del aparatoV slo las partculas )ue son emitidas $acia arri a ser<n detectadas( Adem<s si la muestra slida es demasiado gruesa9 algunas de las radiaciones emitidas $aca arri a por el material )ue est< en el *ondo ser<n a sor idas por la muestra y nunca alcan>ar<n el tu o del detector( Esto se conoce como el *enmeno de Bsel*-a sorptionB( /tro incon;eniente )ue presenta es el de tener un a=o tiempo de resolucin ?+,, seg(@ o sea )ue para detectar otro e;ento ioni>ante como indi;idual de en pasar +,, seg( Este e)uipo es utili>ado para medir radiaciones eta(

Para medir radiacin gamma se utili>an los detectores de centelleo slido inorg<nico o los contadores slidos semiconductores ?germanio9 litio@( En el detector de Na! impuri*icado con 0l9 durante el crecimiento del cristal9 se les incorpora una pe)ueFa cantidad de talio )ue distorsiona la red del cristal9 d<ndole la caracterstica de centellear cada ;e> )ue la radiacin interacciona con 8l( Estos cristales est<n cu iertos con una l<mina de aluminio9 sal;o en una de sus ases en las )ue generalmente se coloca una ;entana de ;idrio9 en la cara in*erior del aluminio9 la )ue ;a ad$erida al cristal( Para detectar los centelleos se los trans*orma en pulsos de tensin o de corriente )ue son registrados( Finalmente nos detendremos en la descripcin de uno de los m8todos m<s usados en la medicin de la radiacin eta% el contador l)uido de centelleo( 5a muestra radiacti;a9 l)uida o slida9 se solu ili>a o suspende en un l)uido centellador( El mismo est< compuesto por un sol;ente org<nico ?generalmente tolueno@ y disueltas en 8l9 una o m<s sustancias centelladoras( Una me>cla muy usada9 )ue sir;e para contar soluciones acuosas9 consiste en una solucin de PP/ y dimetil P/P/P ?+-+-p-*enilen- is-#-metil-G-*eniloxa>ol@ en tolueno( /tra me>cla para contar me>clas acuosas es una me>cla de sol;entes9 conocida como Bray ?*ue )ui8n la propuso en -HQ,% metanol9 etilenglicol9 na*taleno y p-dioxano@( Toy en da son utili>adas me>clas comerciales )ue tienen la propiedad de ser iodegrada les( El proceso )ue ocurre es el siguiente% -(- 5a sustancia radiacti;a entrega su radiacin disip<ndola en el sol;ente( +(- El sol;ente la trans*iere al centelleador ?por e=( PP/@ )ue con;ierte esta energa en energa lumnica9 o sea en *otones de lu> ;isi le ultra;ioleta9 siendo el nAmero de *otones gamma emitidos proporcional a la energa a sor ida en el medio( 6eneralmente se agrega una sustancia secundaria )ue reci e esta energa lumnica y lle;a la longitud de onda de los *otones emitidos a una regin donde el *otomultiplicador posee mayor sensi ilidad(

GE

D(- Estos *otones emitidos llegan en *orma de pulsos a un tu o llamado *otomultiplicador )ue se encarga de ampli*icar la seFal reci ida( El *otomultiplicador est< constituido por% - un *otoc<todo( - una serie de lancos para una emisin secundaria llamados dnodos( - un sistema ptico-electrnico9 )ue permite guiar los electrones de un dinodo al ;ecino )ue se encuentra a m<s alto potencial( - un <nodo9 donde es li erada una corriente de electrones )ue dar< origen al pulso de tensin o seFal )ue despu8s de ser ampli*icada y clasi*icada9 ser< registrada( Al llegar el *otn se arranca un electrn del *otoc<todo )ue es atrado por el primer dinodo de ido a )ue se encuentra a mayor potencial )ue el *otoc<todo ?n)uel-cesio-antimonio@9 el campo el8ctrico esta lecido le imprime a este electrn su*iciente energa como para arrancar dos electrones9 )ue a su ;e> son atrados por el segundo dinodo y as sucesi;amente(

0UB/ F/0/4U50!P5!CAD/2
Una ;e> )ue los pulsos salen del *otomultiplicador9 pasan al preampli*icador y de a)u al ampli*icador donde son ampli*icados entre -,, y -,,, ;eces para alcan>ar una seFal adecuada para poder ser registrada( El e)uipo cuenta con tres o menos canales en los cuales se puede determinar un istopo di*erente( Cada canal posee un control de ganancia y dos discriminadores( El control de la ganancia es una medida de la tensin aplicada al *otomultiplicador( 5os discriminadores seleccionan los pulsos )ue ser<n registrados( En otras pala ras anali>an y clasi*ican los pulsos de acuerdo con su tamaFo( 7e los puede ;isuali>ar como una ;entana en la )ue se puede ;ariar la altura del piso y del tec$o a ;oluntad( 7 se aumenta el ni;el in*erior9 slo pasar<n los pulsos )ue superen dic$o ni;el( 7i simult<neamente se ;ara el ni;el superior9 pasar<n solamente a)uellos pulsos )ue caigan por encima del ni;el in*erior y por de a=o del ni;el superior9 los )ue no cumplan estos re)uisitos no ser<n registrados(

4U0/D/ /PE2A0!:/
7e coloca la muestra en el recipiente a medir ?de e ser transparente a la radiacin emitida por los centelleadores@ y se le agrega la solucin centelleante( 4anteniendo un anc$o de ;entana constante ?discriminador in*erior su*icientemente alto para eliminar el BruidoB del ampli*icador y discriminador superior en el m<ximo@ se ;ara la ganancia $asta o tener el m<ximo de acti;idad aparente( Este punto representa las condiciones ptimas de tra a=o para esa ;entana( 7e puede o tener el espectro de la muestra manteniendo constante la ganancia y ;ariando el anc$o de ;entana o ien a la in;ersa(

GH

EF!C!ENC!A DE5 APA2A0/

7i se tiene un est<ndar al cual se conocen las dpm )ue tena en una *ec$a determinada9 utili>ando la ley de desintegracin se pueden calcular las dpm )ue tendr< al tiempo de medicin( Esto representa el -,, S de e*iciencia( 5uego se mide en el aparato y se o tienen las cpm( De a)u es sencillo sacar la relacin de porcenta=e usando el algoritmo matem<tico adecuado(

QUENCT!N6
7i el sol;ente a sor e energa de las partculas eta y no las transmite al centelleador se dice )ue se produce M)uenc$ingN )umico( 7i el sol;ente a sor e los *otones de lu> emitidos por el centelleador9 se dice )ue se produce M)uenc$ingN por color( Para corregir el M)uenc$ingN se utili>a generalmente un procedimiento conocido como m8todo del est<ndar interno( 7e cuenta la muestra y se o tiene su ;elocidad de conteo ?:c m&cpm@( 5uego se agrega un est<ndar radiacti;o a la muestra de ;elocidad de desintegracin conocida ?:d s&dpm@ y se ;uel;e a contar la ;elocidad de conteo ?:c ms&cpm@ para o tener la e*iciencia y la ;elocidad de desintegracin de la muestra ?:d m&dpm@( Entonces%

e=
5uego

:cms :cm :ds

:cm e

:dm =

CNEA 6erencia Proteccin 2adiolgica y 7eguridad 5AB/2A0/2!/7 DE 2AD!/!710/P/7

4ED!DA7 B_7!CA7 DE 7E6U2!DAD

No comer9 e er9 ni *umar en el la oratorio( No e*ectuar operaciones con la oca(

Q,

No lle;ar a la oca pipetas9 *rascos de la;ados9 ni eti)uetas( No introducir en el la oratorio elementos a=enos al mismo9 ni e*ectuar en 8l otras tareas )ue las correspondientes al empleo del material radiacti;o( 0ra a=ar con guantes de goma( No salir del la oratorio con los guantes puestos( Al terminar el tra a=o No salir del la oratorio con los guantes puestos( 5a;ar los guantes9 puestos en las manos( Quitarse los guantes sin tocar su super*icie externa9 y colgarlos en un soporte adecuado( 5a;arse las manos9 si las condiciones de tra a=o no =usti*icaron el uso de guantes( 4onitorear manos9 ropas9 plano de tra a=o y elementos empleados( Descontaminar9 si es necesario( No continuar usando un guardapol;o contaminado( Disponer de los materiales de des$ec$o en un recipiente Mad $ocN9 y de=ar decaer antes de eliminar si se trata de nucleidos cortos( 5a;ar los elementos empleados exclusi;amente en la pileta de descontaminacin( 7i $ay salpicaduras o derrame de soluciones radiacti;as% Colocarse los guantes( 2ecoger eK l)uido con papel a sor ente( 4onitorear la super*icie seca9 y descontaminar en caso necesario( 7i no puede descontaminarse en el momento9 delimitar el <rea contaminada y colocar un letrero de ad;ertencia para los dem<s miem ros del la oratorio( Dar cuenta al =e*e de la oratorio(

Q-