Prctica Determinacin de cido ascrbico en jugo por cromatografa de lquidos de alta resolucin con deteccin UV con arreglo de diodos

Introduccin

Los componentes bsicos de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin son: contenedor de fase mvil, sistema de suministro de solvente, inyector, columna y detector. El equipo utiliza alta presin para pasar la fase mvil (y analito) a travs de una columna empacada con pequeas partculas ( 10-6 m) que constituyen la fase estacionaria. La cromatografa de fase enlazada es muy utilizada en HPLC. En ella, la fase estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte (slica, SiO2). Las fases

estacionarias pueden ser de fase inversa (RP) si los grupos enlazados son de carcter no polar [cadenas de C8 (n-octilo) o C18 (n-octadecilo)] o de fase normal (NP) si son de carcter polar (grupos aminopropilo o cianopropilo). En RP, la fase mvil es relativamente polar (agua, metanol o acetonitrilo) mientras que en NP es un disolvente relativamente apolar (hexano, diclorometano). As, en NP, el componente menos polar (mas soluble en fase mvil) se eluye primero y el aumento de la polaridad de la fase mvil disminuye el tiempo de elucin del componente ms polar. En contraste, en RP, los componentes ms polares eluyen primero, y el aumento de la polaridad de la fase mvil aumenta el tiempo de elucin del componente menos polar. El detector UV/Vis es muy utilizado en HPLC. Este detector aprovecha las propiedades de absorcin de los analitos en la regin ultravioleta y visible (Vis) del espectro electromagntico para generar una seal. La absorcin medida a una longitud de onda dada generalmente cumple la ley de Beer. La lnea base representa la mxima transmisin de luz, y cualquier desviacin de ella indica una prdida o absorcin de radiacin. Los detectores UV/Vis con arreglo de diodos tienen la ventaja de que registran en segundos el espectro de un soluto que eluye de la columna. Esto permite que el espectro del analito en la muestra pueda ser comparado con el espectro del estndar para una mejor identificacin de los analitos.

Objetivo Determinar el cido ascrbico en jugo por cromatografa de liquidos de alta resolucin utilizado el mtodo de calibracin por estndar externo. Calcular el lmite de deteccin y cuantificacin del mtodo.

Materiales Tubos Eppendorf, 1.5 mL Jeringas (3 mL) Filtros para jeringa (0.45 m) Micropipetas Puntas para micropipetas Membranas 0.45 m Equipo para filtracin de fase mvil Equipo Centrfuga Cromatgrafo de lquidos

Sustancias cido L-ascrbico (99.5% de pureza) -mercaptoetanol Acetonitrilo grado HPLC cido frmico

Metodologa Procedimiento A. Preparacin de las disoluciones estndar de cido ascrbico 1. Preparar una solucin acuosa de 1000 mg/L de cido ascrbico (aa). 2. A partir de la solucin anterior, tomar el volumen necesario para preparar 1 mL de cada una de las siguientes disoluciones estndar de aa: 50, 100, 200, 400, 600, y 800 mg/L. 3. De cada disolucin estndar, tomar una alcuota de 100 L y colocarla en un vial. 4. Reducir el cido ascrbico con mercaptoetanol, segn el procedimiento C. Procedimiento B. Tratamiento del jugo y de la muestra problema 1. Tomar una alcuota de 1.0 a 1.5 mL del jugo. 2. Centrifugar a 5000 rpm durante 4 minutos. 3. Filtrar el sobrenadante a travs de filtro de membrana de 0.45 m y recolectar el filtrado.

Llevar a cabo el procedimiento C por triplicado para cada muestra.

Procedimiento C. Reduccin del cido ascrbico del jugo y de los estndares 1. Tomar 100 L del filtrado en el caso del jugo, y 100 L de la solucin problema. 2. Aadir a cada muestra 100 L de mercaptoetanol (10 mM) para reducir el aa que haya sido oxidado. De esta forma, se determinar el contenido total de cido ascrbico. 3. Incubar cada muestra durante 10 min a temperatura ambiente. 4. Inyectar en el cromatgrafo de lquidos.
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Condiciones cromatogrficas y de deteccin

Dimensiones de la columna Fase estacionaria Temperatura de columna Modo de elusin Volumen de inyeccin Fase mvil Flujo Detector Longitud de onda de deteccin 250 mm x 4.6 mm ID x 5 m de partcula C18 C8 Ambiente Isocrtico 20 L Agua/cido frmico (0.1%, v/v) 0.8 mL/min UV, arreglo de diodos (DAD) 245 nm