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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DEL ECUADOR ESCUELA DE BIOANALISIS Bioqumica Clnica Prctica 6 Mgtr. Elena Granda M.

TEMA OBJETIVOS : Microscopa Bsica

Identificar las partes que componen el Microscopio compuesto. Deducir la funcin que tiene cada una de las partes identificadas. Aplicar tcnicas para la realizacin de preparaciones microscpicas.

INTRODUCCIN La interpretacin de la metodologa que se requiere en cada una de las determinaciones que se efectan en el laboratorio clnico depende del grado de exactitud en su procesamiento, estando a su vez sujeto al conocimiento, habilidad y destreza en el manejo.de los instrumentos y equipo de laboratorio. En la actualidad el uso de los instrumentos, unos relativamente sencillos y otros bastantes complejos, facilitan el procesamiento de muestras en el laboratorio. A medida que continan las investigaciones para un diagnostico ms rpido y un perfilamiento ms precoz de los resultados, se estn perfeccionando mas y mas instrumentos, y la automatizacin, de una u otra manera, adelanta a pasos agigantados. Sin embargo, estos no pueden introducirse inmediatamente en el laboratorio sin que el usuario tenga un entendimiento bsico y rutinario de ellos. Es importante, que antes de desenvolverse en el manejo de instrumentos se adquieran las bases tericas que los sustentan. Pocos instrumentos han dado el rendimiento cientfico del microscopio; la ciencia en general le debe progresos admirables, siendo aplicable a sin nmero de reas como son; fsica, qumica, medicina, metalurgia, entre otras. El microscopio como su nombre lo indica, es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo, las imgenes microscpicas pueden aumentar de 40 a 1000 veces el tamao original. No obstante, la funcin ms importante del instrumento no es solo ver los objetos pequeos sino interpretar lo que se ve, debido a esto, el empleo del microscopio exige ms que en ningn otro caso, un gran conocimiento del instrumento y su adecuado manejo para lograr imgenes amplificadas con la menor cantidad posible de defectos pticos y el logro de contraste adecuado.

Usando un criterio globalizante, los sistemas del microscopio podran ser catalogados en: Sistema ptico : oculares y objetivos Sistema mecnico: pie, brazo, cabezal, revlver, platina, tornillos de ajuste (macro y micromtrico) y de desplazamiento. Sistema de iluminacin: fuente de luz. Hay que mencionar aqu que en ste sistema existen otros elementos que van a permitir obtener la iluminacin adecuada, ya sea llevando la luz al sitio adecuado o regulando la intensidad de la misma, para ello los microscopios suelen estar adaptados con el condensador y uno o dos diafragmas, los filtros tambin se relacionan con este sistema.

Los objetos a ser visualizados con un microscopio deben ser previamente preparados. Bsicamente hay dos tipos de preparaciones que se usen en el laboratorio: 1. Hmedas llamadas tambin directas o en fresco: son muestras cuyo procesamiento no es muy elaborado, en trminos generales permanecen en medio lquido durante la observacin; pueden ser vistan con la adicin o sin la adicin de colorantes. En algunas ocasiones es posible ver alguna actividad vital como motilidad. En general este tipo de preparaciones son observadas con objetivos de 10x y 40x. Las preparaciones hmedas generalmente, duran muy poco tiempo, ya que el diluyente en el cual se encuentran los objetos tienden a resecarse. 2. Fijas llamadas tambin secas o permanentes: su procesamiento requiere mayor elaboracin. El diluyente est ausente al momento de la observacin. Se requiere teirlas y ste tipo de preparaciones pueden ser vistas con lente de 10x, 40x, y 100x, ste ltimo es el ms usado para este tipo de preparaciones. Para la realizacin de este tipo de preparaciones ya sean fijas o permanentes va a depender de la naturaleza de la muestra y del objetivo o el propsito de la observacin. Para las preparaciones hmedas se puede hacer una emulsin directa del material a observar en una gota de diluyente a usarse, que ha sido colocada sobre un portaobjetos. Puede, en otros casos, hacerse una dilucin previa si el material es muy concentrado, en caso contrario se puede concentrar mediante centrifugacin del material. En el caso de preparaciones secas se requiere una fijacin del material que impide que la muestra fluya del portaobjetos y a la vez permite preservar estructuras. El procesamiento de fijacin va a diferir de acuerdo al propsito del examen. MATERIALES Solucin salina 0.85% Desinfectante Azul de metileno Microscopios Bistur Portaobjetos y cubreobjetos

Pipetas Pasteur Tubos de 5ml y capilares Hisopos y palillos Muestras: sangre y orina

ACTIVIDADES Microscopa 1. Con la ayuda del instructor vaya reconociendo las partes del microscopio y descubriendo su funcin. 2. El instructor realizar demostraciones para las preparaciones microscpicas. Preparaciones microscpicas 1. Preparaciones hmedas: A partir de una suspensin. Coloque aproximadamente 1 ml de solucin salina en un tubo Con un hisopo haga un raspado de su mucosa bucal Suspenda el material dentro del lquido del tubo, sacudiendo bien el hisopo Elimine el exceso de material en las paredes del tubo Desechar el hisopo en desinfectante Colocar una gota de la suspensin sobre un portaobjetos y cbrala A partir de un material denso. Coloque aproximadamente 1 ml de solucin salina en un tubo Introduzca la punta de un capilar en una muestra de sangre total Sacuda ste material en el tubo que contiene el diluyente Coloque en el un extremo una gota de sangre total y en el otro extremo del portaobjetos una gota del material diluido Cubra las preparaciones En cul de las dos preparaciones espera ver mejor los elementos . A partir de un material diluido Mezcle bien una muestra de orina matinal Coloque aproximadamente 12 ml en un tubo cnico Centrifgelo de 5 a 7 minutos a 1500 rpm; equilibrando con otro tubo Deseche el sobrenadante Resuspenda el sedimento Coloque una gota en un portaobjetos y cbralo con un cubreobjetos. 2. Preparaciones Secas Frotis sanguneo Coloque una pequea gota de sangre total sobre un portaobjetos, dejando un espacio de 2 cm. Del borde de la placa.

Con una placa extensora, la que colocar a unos escasos milmetros de la muestra por delante de sta, incline la placa extensora a unos 40 a 45 grados. Lleve la placa extensora hacia atrs y ponga en contacto la muestra, permitiendo que la sangre se extienda a los largo del borde de la placa extensora. Suavemente deslice la placa extensora a lo largo de la placa portaobjetos sin perder el contacto con la muestra ni con el portaobjetos. Este movimiento debe ser uniforme, no debe detenerse hasta el final de la placa portaobjetos. Djela secar al ambiente. El espacio dejado en la parte superior de la placa portaobjetos se utiliza para colocar el nmero correspondiente de la muestra e identificacin. El instructor siguiendo estos pasos demostrar la realizacin de un frotis.

CONSULTA: Enumere cinco preparaciones secas y cinco preparaciones hmedas, con el respectivo procedimiento de cada preparacin. Enumere ventajas y desventajas de las preparaciones secas y hmedas. Enumere las medidas de Bioseguridad bsicas necesarias para realizar estas preparaciones. Parte 2 TEMA SUBTEMA OBJETIVOS Enfocar con propiedad, diferentes tipos de preparaciones microscpicas. Ejecutar tcnicas adecuadas de limpieza de los lentes y del sistema mecnico. : Microscopa Bsica : Enfoque con objetivos secos y de inmersin. Limpieza del microscopio.

INTRODUCCIN Cada tipo de preparacin microscpica requiere de un ajuste especial para que pueda ser observada con propiedad en el microscopio. Esto es razonable en vista de que las preparaciones hmedas por ejemplo tienen una naturaleza diferente a las de las preparaciones fijas, en trminos de contraste. Adems dentro de cada una de estas mismas preparaciones (fijas y hmedas), existen algunas que resultan ser ms gruesas que otras o tambin un tipo de preparaciones hmedas son vistas con la adicin de colorantes y otras sin la adicin de estas sustancias, todo ello conlleva al hecho de que el microscopistas debe estar alerta para hacer ciertos cambios en la iluminacin para obtener un buen resultado. No se pueden dar reglas precisas en lo que se refiere a la posicin del condensador y apertura del diafragma (en caso de que el microscopio posea condensador desplazable), pero si se puede hablar en trminos generales de que en este tipo de microscopios de condensador desplazable, usualmente las preparaciones fijas requieren mayor cantidad de luz lo cual se consigue subiendo el condensador a la posicin superior y puede requerirse adems colocar el lente abatible en posicin de trabajo, en caso de que el condensador tenga este tipo de lente frontal.

Adems de la iluminacin, para hacer el enfoque mismo, es bueno que el principiante se acostumbre a enfocar primero con el lente panormico y luego pase al lente requerido. Para enfocar con lente de 4x, una vez colocada la placa en la platina, se debe acercarla hacia el objetivo con el macromtrico y con el micromtrico se hace el ajuste final. Cuando se vaya a cambiar a otro objetivo no es necesario mover el micromtrico, sino nicamente el micromtrico y finalmente ajustar la luz. ACTIVIDADES ENFOQUE CON LENTES SECOS 1. Realice una preparacin hmeda de cualquiera de las muestras con las que usted trabaj en la prctica anterior. 2. Coloque la placa sobre la platina y ajuste con la pinza sujetadora que se encuentra a la derecha del carro. Poner el objetivo de 4x en posicin de trabajo. 3. Suba la platina hacia el objetivo (accionando el macromtrico), mientras usted observa por los oculares, hasta visualizar la preparacin. 4. Mueva suavemente el micromtrico hasta conseguir la nitidez de la imagen de los microscpicos. 5. Cambie al objetivo de 10x, sin mover la platina. Haga el ajuste necesario con el micromtrico y regule la luz con el diafragma de iris. 6. Cambie al objetivo de 40x, observando los mismos cuidados dichos en el paso 5. 7. Con la misma preparacin vare la posicin del condensador (superior, media e inferior) y la posicin del diafragma iris (abierta, medianamente abierta y cerrada). Vare tambin la posicin del lente abatible. 8. Repita todo el procedimiento con una preparacin hmeda coloreada. ENFOQUE CON LENTE DE INMERSION 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Enfoque una preparacin fija con lente de 4x o de 10x. Con el condensador a su tope mximo y para el lente abatible en su posicin de trabajo. Retire el lente seco y no ajuste ningn otro lente objetivo. Coloque una pequea gota de aceite de inmersin en el punto luminoso que aparece en la placa. No mueva el macromtrico por ningn concepto. Coloque el lente de inmersin en posicin de trabajo. Haga el ajuste pertinente con el micromtrico para obtener la definicin de la imagen. Una vez terminada la observacin, retire la placa, limpie el objetivo con papel de microscopio. Apague y desconecte el microscopio. Deje el microscopio adaptado con el lente de menor aumento, cbralo y regrselo al lugar adecuado.

En la dos preparaciones hmedas y fijas es necesario que realice de muestras sin teir y coloreadas.

NOTA IMPORTANTE: Una actividad previa al enfoque que usted debe realizar es el ajuste de los oculares a su distancia interpupilar. Una vez encontrada la distancia interpupilar adecuada a sus ojos, recuerde que esta es su medida que siempre la debe usar en otras situaciones en que requiera microscopio. LIMPIEZA DEL MICROSCOPIO Todo microscopio debe mantenerse siempre cubierto para evitar la acumulacin de polvo en este equipo. A ms del polvo otros elementos pueden ser perjudiciales para el microscopio como determinados aceites de inmersin, que por descuido, se han dejado secar en el microscopio. En ste ltimo caso debe limpiarse con xilol. No es necesario usar xilol en los otros lentes. Recuerde que el abuso del xilol puede provocar daos en el montaje de los lentes, ya que algunos pegamentos utilizados para unir los lentes suelen ser disueltos con esta sustancia qumica. El tecnlogo debe limitarse a la realizacin de la limpieza de las superficies tanto de la parte mecnica cuanto de los lentes. Limpiezas o ajustes a niveles ms profundos deben ser encomendados a tcnicos experimentados. PROCEDIMIENTO 1. Con un papel de microscopio limpie la lente frontal de los objetivos y tambin los oculares. 2. Si durante la observacin el lente de 100x se muestra sucio utilice para su limpieza un papel de microscopio embebido con xilol. 3. Con un pedazo de tela apropiado, esto es que no desprenda pelusa limpie toda la parte mecnica. CUESTIONARIO 1. Cul es la mejor posicin del condensador, diafragma iris y lente abatible para los objetivos 4x,10x,40x, 100x. 2. Qu ventaja tiene la observacin hmeda coloreada respecto de la preparacin hmeda no coloreada.? 3. Cul es la razn de teir las preparaciones para observacin con lente de inmersin.? 4. Realice un protocolo de trabajo desde la utilizacin del microscopio hasta la observacin de una placa. Recomendacin mirar este video: http://www.youtube.com/watch?v=0Tunrrm3OlM