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Prctica N 1: Preparacin, Fijacin: Coloracin Simple y Coloracin Gram

Analistas: Fecha: Lunes, 13 de agosto del 2012 Objetivos del anlisis: Utilizar la coloracin simple como tcnica de tincin que permita observar la forma y la disposicin de los microorganismos. Utilizar la coloracin Gram como tcnica de coloracin diferencial que permita clasificar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, segn el tipo de coloracin que adquieran. Manejar correctamente el microscopio.

Fundamento: La prctica se fundamenta en la utilizacin de la coloracin simple y la coloracin Gram como tcnicas que permitan observar la forma y la disposicin de la colonia de bacterias del gnero acetobacter provistas como muestra, a travs de un instrumento ptico de precisin, el microscopio. Definicin de la muestra: colonia de bacterias gnero acetobacter - Vas de contaminacin: A travs de la respiracin o el habla en el momento de la toma de muestra Descripcin de los equipos, materiales, reactivos: El equipo utilizado para la realizacin de la prctica fue el microscopio ptico, que consiste en un conjunto de lentes que permiten observar el frotis con un aumento de hasta 100x, pudiendo ser enfocado el objetivo con una alta precisin. Consta de las siguientes partes bsicas: Ocular: ente situada cerca del ojo del observador. Capta y ampla la imagen formada en los objetivos. Objetivo: lente situada cerca del revolver. Ampla la imagen, es un elemento vital que permite ver a travs de los oculares. Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador. Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Tubo: es una cmara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Revolver: Es un sistema que agarra los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro Tornillos macro y micromtricos: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo hace de forma rpida y el micromtrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura. Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparacin de delante hacia atrs o de izquierda a derecha y viceversa. Base: Es la parte inferior del microscopio que permite el sostn del mismo. Uno de los materiales utilizados, el asa bacteriolgica, asa de siembra o asa de platino, es un instrumento de laboratorio tipo pinza que consta de una base que puede estar hecha de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina o en un aro de 5 mm o en punta.

Se emplea para transportar, arrastrar o trasvasar inculos desde la solucin de trabajo al medio de cultivo (slido o lquido), de un medio a otro (resiembra) o para la realizacin del frotis. La cantidad de inculo que se trasvasa viene determinado por el dimetro del aro final del filamento, que se encuentra calibrado y normalmente oscila entre 0,1 y 0,01 ml. El mechero es una de las fuentes de calor ms sencillas del laboratorio y es utilizado para obtener temperaturas no muy elevadas. En la prctica fue utilizado para fijar el frotis al portaobjetos y para esterilizar materiales. Es un quemador de gas del tipo de pre-mezcla y la llama es el producto de la combustin de una mezcla de aire y gas. El quemador tiene una base pesada en la que se introduce el suministro de gas. De all parte un tubo vertical por el que el gas fluye atravesando un pequeo agujero en el fondo del tubo. Algunas perforaciones en los laterales del tubo permiten la entrada de aire en el flujo de gas proporcionando una mezcla inflamable a la salida de los gases en la parte superior del tubo donde se produce la combustin. Consta de una entrada de gas sin regulador, una entrada de aire y un tubo de combustin. El tubo de combustin est atornillado a una base por donde entra el gas combustible a travs de un tubo de goma, con una llave de paso. Presenta dos orificios ajustables para regular la entrada de aire. La cantidad de gas y por lo tanto de calor de la llama puede controlarse ajustando el tamao del agujero en la base del tubo. Si se permite el paso de ms aire para su mezcla con el gas la llama arde a mayor temperatura (apareciendo con un color azul). Si los agujeros laterales estn cerrados el gas slo se mezcla con el oxgeno atmosfrico en el punto superior de la combustin ardiendo con menor eficacia y produciendo una llama de temperatura ms fra y color rojizo o amarillento, la cual se llama "llama luminosa". Esta llama es luminosa debido a pequeas partculas de holln incandescentes. La llama amarilla deja una capa de carbn sobre la superficie que est calentando. Cuando el quemador se ajusta para producir llamas de alta temperatura, stas (de color azulado) pueden llegar a ser invisibles contra un fondo uniforme. El portaobjetoses una pequea lmina de vidrio rectangular donde se coloca la muestra para ser examinada al microscopio. El aceite de inmersin es un medio de inmersin para observacin microscpica de muestras para su posterior lectura. El aceite de inmersin para microscopia, que tiene aproximadamente el mismo ndice de refraccin que el vidrio del portaobjetos, elimina casi completamente la desviacin de los rayos de luz y aumenta considerablemente la eficacia de los objetivos de los microscopios. El azul de metileno o Cloruro de tetrametiltionina (C16H18N3ClS) es un slido en forma de cristales o polvo, poco soluble en agua y se descompone al llegar a la temperatura de ebullicin. Es incompatible con agentes oxidantes fuertes, agentes reductores fuertes, lcalis, dicromatos y yoduros (alcalinos). El violeta de gencianao cloruro de metilrosanilina es un colorante derivado del trifenilmetano. Inhibe el crecimiento de muchos hongos, incluidas las levaduras, y es tambin activo frente a algunos bacilos grampositivos. Es incompatible con agentes extremadamente oxidantes, y sensible a la luz. La safranina (C20H19ClN4), tambin llamada Safranina O o Rojo bsico 2, es un colorante biolgico de contraste que se utiliza en la Tincin de Gram para proporcionar un color violeta ms intenso a las bacterias grampositivas y tie de rosa a las bacterias gramnegativas. La fuschina bsica diluida (C20H19N3HCl) es un colorante de color magenta. Se vuelve de este color cuando se disuelve en agua; cuando est slido se presenta en forma cristales

color verde oscuro. Su solubilidad en agua es de 2650 mg/L (25C), y tiene un punto de fusin de 200C. La solucin de Lugol, denominada tambin yodo custico, es una solucin yodoyodurada constituida por yodo, yoduro potsico y agua destilada. Tiene aspecto lquido, de color amarillento, olor picante (dbil) y miscible con el agua. Se debe evitar el contacto con agentes oxidantes fuertes. Descripcin de la metodologa de trabajo Para el caso de coloracin simple, se toma ligeramente con un asa de platino una parte del material a examinar de la colonia, y se extiende en el centro de un portaobjetos bien limpio y desengrasado, hasta ocupar aproximadamente 1 cm2 de superficie. Se pasa el portaobjetos 3-4 veces la llama del mechero, se deja enfriar y se coloca a la preparacin una solucin de colorante (azul de metileno y safranina). Luego, se lava con agua destilada para eliminar el exceso de colorante y se deja secar al aire. En el caso de la coloracin gram, la extensin, desecacin y fijacin se realiza de la misma manera que en la coloracin simple. Se tie con solucin de cristal violeta durante 1 minuto, y luego, se reemplaza este colorante por una solucin de Lugol, dejando actuar durante 1 minuto y se lava con agua. Se decolora con alcohol durante 30 segundos y se vuelve a enjuagar. Se tie con fuchsina bsica diluida durante 3 minutos, y por ltimo se lava y se seca para observar al microscopio. En el anlisis microbiolgico no se pudieron observar colonias con el microscopio, ni en la coloracin simple ni en la gram.

Resultados de la prctica Nombre de la bacteria Mtodo de Tincin Tincin Simple Resultados Al microscopio ptico se presentan como pequeas clulas cilndricas, frecuentemente en parejas, cortas y algo gruesas, alineadas o en cadenas, y a menudo agrupadas en forma de ocho. Es una bacteria gram negativa.

Acetobacter

Tincin Gram

Imagen ilustrativa:

Conclusin Durante la prctica se cumpli el objetivo del correcto enfoque del microscopio, sin embargo algunas estructuras no pudieron ser visualizadas correctamente, o no

visualizadas del todo, esto puede deberse a errores como: Error en la preparacin del frotis, provocndose una interferencia del medio de cultivo. Error en la fijacin del frotis. Se pudo haber desprendido o muerto la muestra de inters al calentar el portaobjetos para la fijacin. perdida de la muestra durante el enjuagado.

Bibliografa consultada RESEARCH AG. Reactivos Qumicos. Hoja de Seguridad. En lnea 15-08-12. Disponible en: http://www.research-ag.com/hojasdeseguridad/7421.pdf TORTORA, G. FUNKE, B. CASE, C. Introduccin a la microbiologa. Edicin 9. Ediciones Mdica Panamericana. 2007