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TRANSFORMACIN GENTICA DE LAS LINEAS GERMINALES DE GUSANO DE SEDA Bombyx mori L.

PARA LA EXPRESIN DE ALBMINA HUMANA MEDIANTE EL USO DEL TRANSPOSN piggyBac

TRANSFORMACIN GENTICA DE GUSANO DE SEDA Bombyx mori L. MEDIANTE USO DEL TRANSPOSN piggyBac
Universidad Tecnolgica de Pereira. Centro de Biologa Molecular y Biotecnologa (CENBIOTEP) Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y Tecnologia Francisco Jos de CaldasCOLCIENCIAS Centro de Desarrollo Tecnolgico de la Sericultura (CDTS)

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Albmina Humana Gusano de seda piggyBac Metodologa CDTS (Granja El Pilamo)

ALBUMINA DE SUERO HUMANA


Funciona primordialmente como acarreador:
Esteroides. cidos grasos. Hormonas tiroideas. Drogas.

Estabiliza el volumen del fluido extracelular. Tratamiento desnutricin


Sida Cncer

Compone casi la mitad de las protenas sricas. Es una protena expresada en hgado en donde compone el 10% de la expresin.

ALBUMINA DE SUERO HUMANA


Pertenece a una familia de protenas
Albmina Fetoprotena Protena unin a vitamina D

Cromosoma 4 q11-22
Regin q11-13 Gene se distribuye en 16.961pb 15 exones

Protena soluble monomrica no glicosilada.


3 Dominios 65.000daltos (585aa)

La albmina es la protena srica mas usada


Ampliamente prescrita para reemplazar volumen sanguneo en trauma (accidentes, quemaduras) Obtenida a partir de suero humano
Transmisin virus

Obtencin metodologas de ADN recombinante que no han sido completamente eficientes.


Bacterias Levaduras Plantas

Necesidad anual se encuentra en el rango de las 500 toneladas (1.5 billones de dlares).

Gusano de seda (Bombyx mori L)


Clasificacin taxonmica del gusano de seda:
Reino:Animalia Filum:Artropoda Subfilum:Hexapoda Clase: Insecta Subclase: Pterygota Superorden: Neoptera Orden: Lepidoptera Suborden: Macrolepidoptera Superfamilia: Bombycoidea Familia: Bombycidae Genero: Bombyx Especie: Bombyx mori L.

Organismo dioico. 2n = 56 cromosomas


Pequeos Holocntricos.

Genoma haploide de B.mori es 560 x 106pb. Se han identificado 60 especies


Especies ms importantes
Bombyx mori (n=28) Bombyx mandarina (n=27)
Antepasado Bombyx mori

Caractersticas Biolgicas
Tiempo de generacin:
50 das (No-diapausa) 6 meses (Diapausa)

Nmero de progenies: 400

Crecimiento de la larva desde eclosin hasta secrecin de seda: 10.000 veces Tamao larval: 8cm El stock gentico del gusano de seda lo componen:
Razas geogrficas
China Japonesa Europea Tropical

Lneas endogmicas Mutantes

Posee celulas especializadas en la glndula posterior 85% de su produccin de protenas para seda (fibrona) Debido a proceso endomitoticos el genoma haploide de estas celulas puede llegar a ser hasta 400.000X 1000 celulas producen 300mg = 80g protena/clula/da
Mejor sistema celulas de mamfero produce 50pg protena/clula/da

Facilidad en la cra y manejo


300 M2 1.5 millones gusanos 5 trabajadores

Sistemas de alteraciones postrasducionales adecuadas y compatibles con aquellas presentes en mamferos.


Corte pptido seal Plegamiento adecuado

ASPECTOS EN BIOSEGURIDAD
Salud humana
Toxicidad Alergenicidad Patogenicidad Resistencia a antibiticos

Produccin agropecuaria
Aparicin resistencia o tolerancia Aparicin nueva plagas o superplagas Reduccin de otras variedades de lepidpteros

Biodiversidad
Competitividad Dao a otros organismos Flujo de genes Ventajas selectivas en el ambiente

Ambiental
Persistencia Dispersin Manejo adecuado de desechos
Tejidos Medios de cultivo Organismos modificados genticamente

piggyBac (IFP2)
Elemento transponible de tipo II, especifico para elementos repetitivos cortos de TTAA Descubierto en cultivos celulares de Trichoplusia ni (Lepidoptero) infectadas con baculovirus Presenta tamao de 2,4kpb y repeticiones invertidas perfectas de 13pb Codifica para una transposasa

Usado para la transformacin de diferentes sistemas


Dpteros
Mosquitos: Aedes aegypti, Anopheles gambiae Moscas: Drosophila melanogaster

Lepidopteros
Trichoplusia ni. Bombyx mori Gelechiidae sp

METODOLOGIA

Obtencin del cADN de Albmina de Suero Humano

Extraccin de mARN a partir de hgado

Sntesis cADN Albmina mARN 5 AAAAA 3 Sntesis de primera cadena con el uso de retrotranscriptasa 5 3 3 AAAAA 3 5 Amplificacin de las molculas correspondientes al gene particular (albmina) 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3

5 5 3 5 3 5 3 5 3 3

3 5 3 5 3 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 5

Clonacin vector pGEM 3 5 5 3

Clonacin

Transformacin

Evaluacin en bases de datos

Seleccin

Secuenciacin

Transformacin
Plasmido ayudador
Vector no autnomo, no posee la regin correspondiente a ITR 5 (Repeticiones Terminales Invertidas) Encargado de llevar la funciones que deben ser suministradas en Trans (Transposasa) ITR 3 del transposon

Vector integrativo
Presenta secuencias de piggyBac correspondientes a ITR 5y 3 Secuencias correspondientes a genes reporteros Secuencias a los promotores especficos de tejido Secuencias correspondiente al transgene

Plasmido ayudador

pA3LacZ pA3GFP
Ava I

Sitio de policlonage pUC Secuencia gene actina A3 Iniciador primeros codones de piggyBac

pEGFP-N1

pA3GFP p3E1.2
Bgl II Gene piggyBac incompleto Ava I Sitio de policlonage pUC Secuencia gene actina A3 Iniciador primeros codones de piggyBac

PCR

Ava I

Bgl II

Ava I

Bgl II

p3E1.2

pHA3PIG

VECTOR INTEGRATIVO
PCR Cadena L fibrona Regin 3 poliA Cadena L fibrona PCR pBac(3xP3-DsRed) Cadena L fibrona Regin 5 EGFP

pBac(3xP3-DsRed)-pA Cadena L fibrona - EGFP - Cadena L fibrona Regin 5

pLE

5 ITR piggyBac 3xP3 DsRed L Fibrona 5 L Fibrona EGFP L Fibrona 3 3 ITR piggyBac

cADN albmina suero humana Secuencias factorX Secuencias 6His

pP - ALB

Constructos disponibles proceso de transgenesis

Alianzas con grupos internacionales


Universidad de Notre Dame
Indiana Greg Luttrell
Associate Director, Post-Award Administration

Instituto Tecnolgico de Kyoto


Kyoto Hajime Mori
Professor; Lab. of Insect Biotechnology

MICROINYECCIN
Micromanipulador El plsmido ayudador (pHA3PIG) y vector integrativo (pP-ALB) son disueltos a una concentracin de 0.2g/l Inyeccin de 15-20nl en embriones de 2-8 horas despus de oviposicin

Microinyeccin huevos constructo (piggyBac) Obtencin de adultos transformados

Cruce y obtencin de lneas homocigoticas para el transgene Identificacin recombinantes (Expresin de PFV y PFR)

Obtencin de capullos expresando albmina (identicados por expresin de PFV)

Centro de Desarrollo Tecnolgico de la Sericultura (CDTS)

Corporacin mixta sin nimo de lucro Sede obtenida por partes iguales entre Ministerio de agricultura y Gobernacin Departamento de Risaralda Ubicacin geogrfica
Granja El Plamo Vereda La Honda Municipio de Pereira Departamento de Risaralda

Funciones
Investigacin bsica y aplicada Mantenimiento bancos de germoplasma gusano de seda y morera Transferencia de tecnologas Promocin de la actividad

Capacitacin Produccin comercial de gusanos de seda y semilla de morera Establecimiento y mantenimiento banco germoplasma en Morera y Gusano de seda Cra lneas puras gusano de seda Produccin de hbridos Produccin de huevos Investigacin bsica gusano de seda

IMPACTOS
Brindar estrategias de valor agregado a la industria de la sericultura. Entrenamiento de personal
Investigadores de otros centros Estudiantes de Maestra y Doctorado

Establecimiento de un modelo de trabajo aplicable a:


Otros productos gnicos Otros organismos

Grupo de Investigacin
Investigador principal
Enrique Aguilar Fernandez

Coinvestigadores
Duverney Gaviria Arias Alvaro Hernn Alegra Soto

Estudiantes de Postgrado
Walter Ricardo Lpez ngela Maria Damelines Florez