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BIOTECNOLOGA

La biotecnologa es la tecnologa basada en la biologa, especialmente usada en agricultura, farmacia, ciencia de los alimentos, medio ambiente y medicina. Se desarrolla en un enfoque multidisciplinario que involucra varias disciplinas y ciencias como biologa, bioqumica, gentica, virologa,agronoma, ingeniera, fsica, qumica, medicina y vet erinaria entre otras. Tiene gran repercusin en la farmacia, la medicina, la microbiologa, la ciencia de los alimentos, la minera y la agricultura, entre otros campos.
Cules son las aplicaciones de la biotecnologa? Las aplicaciones de la biotecnologa son numerosas y se suelen clasificar como: * Biotecnologa roja: se aplica a la utilizacin de biotecnologa en procesos mdicos. Algunos ejemplos son el diseo de organismos para producir antibiticos, el desarrollo de vacunas y nuevos frmacos, los diagnsticos moleculares, las terapias regenerativas y el desarrollo de la ingeniera gentica para curar enfermedades a travs de la terapia gnica. * Biotecnologa blanca: conocida como biotecnologa industrial, es aquella aplicada a procesos industriales. Un ejemplo de ello es el diseo de microorganismos para producir un producto qumico o el uso de enzimas como catalizadores industriales, ya sea para producir productos qumicos valiosos o destruir contaminantes qumicos peligrosos (por ejemplo utilizando oxidorreductasas). Tambin se aplica a los usos de la biotecnologa en la industria textil, en la creacin de nuevos materiales, como plsticos biodegradables y en la produccin de biocombustibles. Su principal objetivo es la creacin de productos fcilmente degradables, que consuman menos energa y generen menos deshechos durante su produccin. La biotecnologa blanca tiende a consumir menos recursos que los procesos tradicionales utilizados para producir bienes industriales. * Biotecnologa verde: es la biotecnologa aplicada a procesos agrcolas. Un ejemplo de ello es el diseo de plantas transgnicas capaces de crecer en condiciones ambientales desfavorables o plantas resistentes a plagas y enfermedades. Se espera que la biotecnologa verde produzca soluciones ms amigables con el medio ambiente que los mtodos tradicionales de la agricultura industrial. Un ejemplo de esto es la ingeniera gentica en plantas para expresar plaguicidas, con lo que se elimina la necesidad de la aplicacin externa de los mismos, como es el caso del maz Bt. Si los productos de la biotecnologa verde como ste son ms respetuosos con el medio ambiente o no, es un tema de debate. * Biotecnologa azul: tambin llamada biotecnologa marina, es un trmino utilizado para describir las aplicaciones de la biotecnologa en ambientes marinos y acuticos. An en una fase temprana de desarrollo sus aplicaciones son prometedoras para la acuicultura, cuidados sanitarios, cosmtica y productos alimentarios.

Qu es la tecnologa del ADN recombinante?


ADN recombinante es una molcula que proviene de la unin artificial de dos fragmentos de ADN. Por lo tanto, la tecnologa de ADN recombinante es el conjunto de tcnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulacin e insercin en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una protena que le sea totalmente extraa. Estas tcnicas se emplean normalmente para la produccin de protenas en gran escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una protena humana y lograr una superproduccin, como

en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Como las bacterias se multiplican muy rpidamente y pueden expresar grandes cantidades de protenas, es posible lograr una sobreproduccin de la protena deseada. A esto justamente se dedica labiotecnologa, es decir a la utilizacin de organismos vivos o de sus productos con fines prcticos. El desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante fue posible gracias a varias lneas de investigacin: 1) el conocimiento de las enzimas de restriccin, 2) la replicacin y reparacin de ADN, 3) la replicacin de virus y plsmidos y 4) la sntesis qumica de secuencias de nucletidos.

FUNCION Esta tecnologa nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevar adems el gen o los genesque se desee. Este ADN puede incorporarse a las clulas de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podr "expresar" la informacin de dichos genes. MECANISMO

(De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricacin de insulina, lo que haramos al ponrselo a una bacteria es "obligar" a sta a que fabrique la insulina. Por lo tanto en la tecnologa del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas bsicas: 1. Corte especfico del ADN en fragmentos pequeos y manejables mediante la utilizacin de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restriccin que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo caracterstico de ellas estos dos principios: o Cada enzima de restriccin reconoce una secuencia especfica de nucletidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN. o Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restriccin.

En los siguientes dibujos puede verse como actuaran estas enzimas.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restriccin. Se aprecia la actuacin en ambas hebras.

En este esquema se ve el resultado de la actuacin de la enzima de restriccin. Ha quedado rota la molcula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente.

2. En la siguiente animacin puede verse "en vivo" la actuacin de las enzimas de restriccin.

3.

En esta sencilla animacin, tienes dos trozos de ADN de dos especies distintas. Especie A de color rojo y especie B de color azul. Puedes separar las hebras haciendo clic con el ratn y arrastrando. Rompers las hebras como lo hace una enzima de restriccin. Despus puedes unir las hebras de las dos especies distintas. Es un juego, pero as es como se hace.

Los fragmentos obtenidos despus de la actuacin de las distintas enzimas de restriccin, se pueden separar por tamaos, es decir, segn el nmero de pares de nucletidos que llevan, mediante la tcnica de electroforesis y as estudiar los distintos trozos. Segn donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar. En el proceso de la electroforesis se prepara una mezcla de fragmentos de ADN y se ponen en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en relacin inversa con su tamao, los fragmentos ms pequeos se mueven rpidamente, mientras que los grandes lo hacen muy lentamente.

La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (polymerase chain reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1983 por Kary 1 Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. FUNCION Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reaccin en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la dcada de 1980. MECANISMO

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensin de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parmetros. stos incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y de los dNTP en la reaccin, y la temperatura de unin de los cebadores, as como la 2 longitud del ADN que se desea amplificar.

Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opcin de realizar la reaccin de PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir, que el sistema del termociclador aplicar calor a la parte de arriba del vial que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que no incluan este sistema tenan que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensacin de la muestra, ya que en el eppendorf se encuentran dos fases:lquido y gas. Al condensarse la muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso fsico, conservando casi intacto el volumen de la muestra.

Inicio
Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C ( 98 C si se est usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor.

Desnaturalizacin
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la cadena, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin.

Alineamiento o unin del cebador


A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Lospuentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada.

Extensin o elongacin de la cadena


Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de el ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto.

Elongacin final
Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

Conservacin
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo. La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, 3 la electroforesis capilar. El/los tamao/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.