Está en la página 1de 94

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS.

Fundada en 1551
FACULTAD DE CENCAS BOLGCAS
E.A.P. DE CENCAS BOLGCAS
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios
en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
TESS Para optar el Ttulo Profesional de: BLOGO con Mencin en Gentica
AUTOR
ANGELA RENEE ARIAS RAMREZ
LIMA - PER 2002
AGRADECIMIENTOS .
1
ABREVIATURAS . .
3
RESUMEN .
5
ABSTRACT .
7
1. INTRODUCCIN .
9
1.1. OBJETIVOS . .
10
1.1.1. GENERALES .
10
1.1.2. ESPECFICOS . .
10
2. ANTECEDENTES .
13
2.1. DESCRIPCIN DE LA PLANTA . .
13
2.1.1. CLASIFICACIN TAXONMICA . .
14
2.1.2. DESCRIPCIN BOTNICA .
14
2.1.3. NMERO DE CROMOSOMAS . .
15
2.1.4. DISTRIBUCIN GEOGRFICA .
15
2.1.5. IMPORTANCIA NUTRICIONAL .
15
2.2. METABOLITOS SECUNDARIOS .
16
2.2.1. GLUCOSINOLATOS . .
16
2.2.2. ALCALOIDES .
19
2.3. CULTIVO DE TEJIDOS . .
20
2.3.1. CULTIVO DE CALLOS . .
22
2.3.2. HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO . .
23
2.3.3. EL EXPLANTE .
24
2.3.4. CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS . .
25
2.4. CROMATOGRAFA . .
26
2.5. ELECTROFORESIS EN GEL .
27
3. MATERIAL Y MTODOS .
29
3.1. INDUCCIN DE CALLOS . .
29
3.1.1. MATERIAL VEGETAL .
29
3.1.2. EXPLANTES . .
30
3.1.3. MEDIO DE CULTIVO PARA LA INDUCCIN DE CALLOS .
30
3.1.4. INDUCCIN DE CALLOS . .
30
3.2. DETECCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS . .
31
3.2.1. EXTRACCIN Y DETECCIN DE GLUCOSINOLATOS . .
31
3.2.2. EXTRACCIN Y DETECCIN DE ALCALOIDES . .
32
3.3. DETECCIN DE MIROSINASAS .
33
3.3.1. ELECTROFORESIS .
33
3.3.2. EXTRACCIN DE LAS MUESTRAS .
33
3.3.3. DETECCIN DE ACTIVIDAD . .
33
4. RESULTADOS . .
35
4.1. INDUCCIN DE CALLOS . .
35
4.2. DETECCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS . .
38
4.2.1. GLUCOSINOLATOS . .
38
4.2.2. ALCALOIDES .
38
4.3. DETECCIN DE MIROSINASAS .
39
5. DISCUSIN .
41
5.1. INDUCCIN DE CALLOS . .
41
5.2. DETECCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS . .
43
5.3. DETECCIN DE MIROSINASAS .
45
6. CONCLUSIONES . .
47
7. RECOMENDACIONES .
49
BIBLIOGRAFA .
51
APNDICE . .
57
AGRADECIMIENTOS
Al profesor Rolando Estrada, por todo el apoyo y cario que me brind mientras estuve en el
LRGB.
Al Dr. Csar Fuertes, investigador del Instituto de Qumica Orgnica Aplicada a la
Farmacia, de la Facultad de Farmacia y Bioqumica sin cuya asesora, apoyo y enseanzas este
trabajo no hubiera podido llevarse a cabo.
A mis padres, Juan y Hortensia por su amor, apoyo y paciencia.
A mis hermanos Marina, Nina, Juana. Lena, Paul y Eva por su amor y apoyo incondicional.
A Juan Diego y Alessia que vinieron a iluminar nuestras vidas y llenarlas de esperanza y
alegra.
A mi mam Eloy, a mi mam Jessi y a mi pap Csar, y a mis primos aunque sera ms
adecuado decir hermanos.
A Vernica, Delcy y Enrique, por ensearme a querer y a sentirme querida como nunca
antes y a Luchito Alanya con todo mi cario.
A Mary Glvez y Judith Toledo, mis maestras y amigas a las que siempre llevo en el
corazn y a Miles por su amistad sincera y su entusiasmo contagiante.
A mis amigos de la Facultad de Ciencias Biolgicas, en especial a Nancy, Maggi, Miriam,
Mara Esther, Ingrid, al profesor Mariano, a la profesora Caleen Tvara, y a todos los amigos que
conoc en esta casa de estudios y que no puedo enumerar por razones de espacio.
A mis amigos del LRGB, los dinosaurios Csar, Fredy, Rafo, Pepe, Flor, Margarita, y
Augusto que me hicieron sentir bienvenida y en mi segundo hogar, a los que siguieron llegando:
Hctor, Indira, Mariellix, Alberto, Elisa, Gilmar, Roberto, Gerardo, Nancy, las profesoras
Vidalina y Yolanda para compartir preocupaciones y alegras, los chicos que hoy estn
empezando su camino en especial a Arturo, Alex, Ivett y Joel.
AGRADECIMIENTOS
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 1
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
2 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
ABREVIATURAS
IAA - cido indol actico
IBA - cido indolbutrico
NAA - cido Naftalenactico
2,4D - cido 2,4-diclorofenoactico
BAP - Bencil amino purina
KIN - Kinetina
ZEA - Zeatina
2ip - 2-isopentenidenina
ABREVIATURAS
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 3
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
4 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
RESUMEN
Lepidium peruvianum Chacn (maca), es una crucfera altoandina, que crece a entre los 3,500 y
4500 m.s.n.m. Originaria de la meseta del Bombn, en los departamentos de Junn y Pasco; por
sus cualidades medicinales y su alto valor nutritivo, es una planta de alto inters econmico,
cuyo cultivo se ha extendido a otras regiones de nuestro pas. En el presente trabajo se estudi la
susceptibilidad de la especie a las tcnicas del cultivo de tejidos como herramienta de produccin
de metabolitos secundarios. Se realiz la induccin de callos en diferentes explantes de L.
peruvianum utilizando la auxina 2,4-D y la citoquinina Kinetina, en un factorial de medios con
diferentes concentraciones auxina/citoquinina. Se obtuvieron callos en la mayora de los medios
usados, la relacin de hormonas ms eficiente fue 1 M auxina/citoquinina. Se evalu la
presencia de glucosinolatos y alcaloides en los callos obtenidos y se compararon con muestras
control de hipoctilos de maca. Se observ la presencia variable de dos fracciones de
glucosinolatos en los callos, en la mayora de los casos las manchas tuvieron una coloracin ms
intensa en los callos que en los controles. De otro lado se observ una alta variabilidad en la
presencia de alcaloides y otros metabolitos no identificados en los callos obtenidos en este
trabajo. Tambin se evalu cualitativamente la presencia de mirosinasas en los callos obtenidos,
observndose bandas positivas en los callos y las muestras de plantas de maca.
RESUMEN
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 5
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
6 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
ABSTRACT
Lepidium peruvianum Chacn, is a Cruciferae native from the Andes. It grows between 3,500
and 4500 m. Original from the Bombn plateau, located at the Peruvian localities Junn and
Pasco. It became in a crop with a high economical value, due its medicinal and nutritional
properties. Actually, it is extended to other regions of the country. The main objective of this
research is to study the tissue culture ability of the crop to use in vitro tissues as a tool for
secondary metabolite production.
Leaves, petioles, roots and hypocotils of L. peruvianum were tested as explants to induce
calli. Different concentrations of 2,4-D and Kinetin, in MS basic medium were tested. Calli were
induced in most of the media tested, the most efficient hormone ratio auxin/citokinin was 1. It
was evaluated the presence of glucosinolates and alkaloids in the callus induced and compared to
maca hypocotils as control sample. Two glucosinolates fractions were obtained from calli
analyzed. It was found one or two fractions according to the callus and in most of the cases the
concentration was higher in callus than in control. In the other hand, it was observed a high
variability in the alkaloid fractions and other unidentified metabolites extracted from the calli
evaluated in this work.
It was also evaluated the presence of myrosinases in the calli studied, and it was found
positive bands either in callus as in maca hypocotils.
ABSTRACT
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 7
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
8 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
1. INTRODUCCIN
Lepidium peruvianum Chacn, "maca", es una crucfera calificada como una de las races
y tubrculos andinos (RTA) de ms alto contenido proteico. Crece entre los 3,500 y 4500
m.s.n.m (King, 1988). Originaria de la meseta del Bombn, entre los departamentos de
Junn y Pasco, es la nica Brassicacea domesticada de los andes y el nico cultivo que
reemplaza el cultivo de las papas amargas en esas altitudes (regiones suni y puna de los
departamentos de Junn y Pasco), soportando condiciones ambientales extremas, como
cambios de temperatura de 18 C a - 10 C en un solo da, fuertes vientos, y poca
disponibilidad de agua. La maca es una pequea planta arrosetada de hojas postradas,
cuya raz tuberosa es rica en azcares, otros carbohidratos, protenas y minerales
esenciales, lo que la convierte en una excelente fuente alimenticia, siendo utilizada
principalmente por las poblaciones rurales de la sierra central, mientras que fuera de su
rea de cultivo tradicional an no es conocida completamente (Aliaga 1999, National
Research Council. 1989)
En la ltima dcada del siglo XX, la maca que se consideraba como un cultivo en
proceso de extincin (Castro de Len 1990) ha empezado a cobrar importancia gracias al
redescubrimiento de su alto valor nutritivo, energtico y medicinal. Una de las principales
propiedades medicinales atribuidas a la maca es la de potenciador de la fertilidad, y su
accin sobre la conducta sexual, propiedad por la que ya era usada en el incanato
(Johns, 1980).
Se han realizado muchos estudios sobre la actividad fertilizante de la maca,
hallndosele propiedades como potenciador de la fertilidad en ratas (Chacn, 1961 y
1. INTRODUCCIN
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 9
Ninanya 1995), propiedades estrognicas marcadas, (Lamas y Upumayta, 1993), como
potenciador de la actividad espermtica (Yauri y Valerio, 1991). Estos efectos estn
relacionados a la presencia de glucosinolatos aromticos (Johns, 1980), y de alcaloides
en la planta (Chacn, 1992). Sin embargo los metabolitos de "maca no han sido
estudiados a profundidad, desconocindose las propiedades de muchos de ellos.
Los glucosinolatos han sido descritos desde hace mucho tiempo, junto con las
mirosinasas (las enzimas que los degradan) como un sistema caracterstico del orden de
las Capparales. Este sistema est involucrado en la defensa de la planta contra insectos
y patgenos. Adems, los productos de la degradacin de los glucosinolatos estn
relacionados con efectos negativos en el ser humano, como la probable inhibicin del
yodo en la tiroides producida por los tiocianatos, derivados de la hidrlisis de los
glucosinolatos por accin de la mirosinasa (Daxenbichler y colb., 1964). Pero otro lado,
recientemente estos metabolitos han adquirido inters debido a sus propiedades
anticarcinognicas (Quiros, 1999).
Anteriores estudios realizados en los alcaloides de Lepidium peruvianum Ch.
muestran que estos compuestos tienen efectos estimulantes sobre la fertilidad femenina
(Chacn, 1990). Por lo descrito anteriormente se eligieron pues los alcaloides y
glucosinolatos para evaluar la posibilidad de utilizar el cultivo de tejidos vegetales para la
produccin y estudio de los metabolitos secundarios de maca, debido a que los cultivos
de tejidos y suspensiones celulares pueden ser manipulados para obtener una gran
variedad de productos naturales usados en las industrias de alimentos y farmacutica. De
hecho esta tcnica ya ha sido utilizada a escala industrial en la produccin de metabolitos
secundarios (Nuez y Ochoa, 2000).
1.1. OBJETIVOS
1.1.1. GENERALES
Evaluar la produccin de metabolitos secundarios de Lepidium peruvianum Ch. bajo
condiciones de cultivo in vitro.
1.1.2. ESPECFICOS
Determinar la composicin de un medio de cultivo ptimo para la induccin de callos
en diferentes explantes de L. peruvianum Ch.
Determinar la presencia de glucosinolatos y alcaloides en callos de L. peruvianum
Ch.
Comparar la presencia de glucosinolatos y alcaloides en callos de L. peruvianum Ch.
con la que se presenta in vivo.
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
10 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
Determinar la presencia de mirosinasas en callos de L. peruvianum Ch. y compararla
con la que se presenta in vivo.
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 11
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
12 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
2. ANTECEDENTES
2.1. DESCRIPCIN DE LA PLANTA
El gnero Lepidium incluye aproximadamente 175 especies, distribuidas en
prcticamente todos los continentes, excepto la Antrtida, siendo uno de los ms grandes
dentro de las crucferas. Las especies de Amrica del Norte, Australia y Europa han sido
estudiadas extensamente, pero se sabe muy poco de las especies endmicas Andinas
(Quiros 1999).
Gloria Chacn (1990) menciona que en el Per, de acuerdo a Ferreira (1986),
existan 11 especies clasificadas del gnero Lepidium a la que agrega Lepidium
peruvianum Chacn como una nueva especie.
De acuerdo a Rea (1992, citado por Quiros y colb. 1996) la maca fue domesticada
hace cerca de 2000 aos en San Blas, Junn. Siendo, segn Bonnier (1986, citado por
Chacn 1990), una de las primeras plantas domesticadas en el Per.
La maca parece haber jugado un papel importante en la economa prehispnica, y
durante los primeros cien aos de la colonia form parte de los tributos exigidos por el
Encomendador (Chacn, 1990).
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 13
2.1.1. CLASIFICACIN TAXONMICA
Divisin: Angiospermae
CIase: Dicotyledoneae
SubcIase: Archichlamydeae
Orden: Papaverales
FamiIia: Brassicaceae
Genero: Lepidium
Especie: Lepidium Peruvianum Chacn. Sp. Nov. Antes L. Meyenii Walp.
Nombre Comun: Maca, Maca-Maca, Maino, Ayak Chichira, Ayac Willku, Ginseng
Peruano.
2.1.2. DESCRIPCIN BOTNICA
La maca, segn Aliaga (1988), es una planta de comportamiento bienal en la sierra alta,
(no se tienen referencias respecto a su comportamiento en menores altitudes) siendo
autgama, cleistgama, con una fase reproductiva de 5 meses con una floracin que
dura dos meses. Las flores se abren en series sucesivas, presentando cuatro etapas: flor
cerrada con anteras sin dehiscencia, flores cerradas con anteras con dehiscencia, flor
abierta con estructuras florales en pleno desarrollo, flor abierta con estructuras florales
entrando en senescencia. Esta fase reproductiva es precedida por una fase vegetativa de
8 meses, que se inicia con la siembra de la semilla, en la que se produce el
ensanchamiento de los hipoctilos. El cultivo de estas dos fases se da generalmente
entre los meses de setiembre y junio en dos aos consecutivos (Aliaga, 1999).
La raz es napiforme (Beltrn y colb. Citado por Obregn, 1998), descrita como
tubrculo hipocotleo por Pias (1994) recibiendo tambin el nombre de hipoctilo (Aliaga
1995, 1997; Tello y colb. 1992; Quiros, 1996), segn Len (1964), ste es un eje carnoso
derivado del hipoctilo cuya parte superior termina en una superficie plana de la que
brotan de 6 a 15 hojas; mientras la inferior es cnica y se alarga en una raz ancha y
fuerte con dos reas irregulares en la mitad inferior, de donde nacen las raicillas.
Los colores de maca ms frecuentes son: amarillo, morado, medio morado (la parte
superior morada y la inferior blanca) y negro (Len, 1964) pero se pueden encontrar
tambin maca de color rosado, crema-morado, amarillo-negro, plomo, y raras veces
morado-negro (Aliaga, 1999), el color preferido por los campesinos y el mercado es el
color amarillo (Len, 1964 y Aliaga, 1999).
El tallo es acaule, mientras las hojas son arrosetadas, pecioladas, compuestas
bipinnatisectas, con foliolos opuestos y dimrficas: En la fase vegetativa son grandes (10
15 cm de largo) y muy reducidas (menos de 5 cm) en la fase reproductiva (Tello y colb.
1992 y Aliaga, 1999).
La inflorescencia es un racimo compuesto, raramente simple (Pias 1994), con el eje
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
14 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
floral corto. Las flores, pequeas y blancas, son perfectas, con cuatro spalos, cuatro
ptalos, 2 estambres frtiles y cuatro estaminodios y un ovario spero bicarpelar y
bilocular, con un vulo en cada lculo de placentacin axilar. Su frmula floral es:
K
4
C
4
A2-4G
2
(Len, 1964 y Aliaga, 1995).
El fruto es una silcula de dehiscencia longitudinal con 2 semillas ovoides de 2-3 mm
de ancho y 4 5 mm de largo (Beltrn y colb. Citado por Obregn, 1998) el color de las
semillas vara del amarillo-naranja al marrn oscuro (Aliaga, 1999).
2.1.3. NMERO DE CROMOSOMAS
Tello y colb. (1992) sugirieron que la maca era un hexaploide de n = 8 con 54 56
cromosomas, pero en 1996, Quiros y colb. observaron, en clulas madres de plantas en
floracin, 32 pares de cromosomas; concluyendo que la maca es un poliploide dismico
del nmero cromosmico bsico del gnero: n = 8, siendo as un octoploide: 2n x 8 = 64
cromosomas.
2.1.4. DISTRIBUCIN GEOGRFICA
A pesar que la maca crece a altitudes mayores de los 3500 m.s.n.m e inclusive en
regiones en las que ni siquiera las papas amargas pueden sobrevivir, altitudes que se
encuentran a lo largo de la Cordillera de los Andes (National Research Council. 1989); el
cultivo de la maca (luego de la colonia), estuvo restringido a los departamentos de Junn y
Pasco, en las regiones suni y puna, principalmente en las laderas circundantes al lago de
Junn; a altitudes de 4100 4450 m.s.n.m. (Tello 1992); y en menor grado en otras
localidades de estos departamentos desde los 3400 m.s.n.m.
Los datos de los cronistas y las memorias de tributos, sugieren que la distribucin del
cultivo era amplia en los territorios altoandinos, pero el rea de cultivo de la planta
disminuy progresivamente hasta que entre 1777 y 1778, Hiplito Ruiz lo circunscribe la
regin de Chinchaycocha (Castro, 1990). Esta tendencia se mantuvo hasta la dcada de
los ochenta, en la que el rea de cultivo de la planta era de apenas 25 Has (Aliaga, 1999).
En la dcada de los 90 esta tendencia se revirti al crecer la demanda de la planta, y su
cultivo se extendi a otros departamentos del Per, de tal manera que actualmente la
maca se est cultivando en Puno, Ayacucho, Huancavelica, Hunuco y Apurmac (Aliaga,
1999).
2.1.5. IMPORTANCIA NUTRICIONAL
La maca es la nica especie del gnero Lepidium cuya raz es utilizada como alimento,
aunque las hojas de otras especies son usadas como verduras (National Research
Council. 1989), adems, dentro de los tubrculos y races andinos, es una de las
especies con mayor valor alimenticio; con un alto contenido de aminocidos esenciales,
comparables con los recomendados por la FAO OMS, siendo altos sus valores de
lisina, tirosina y fenilalanina. La fraccin grasa es rica en cido linoleico utilizado por el
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 15
organismo para la biosntesis de cidos grasos esenciales. Por otro lado, los niveles de
minerales de la planta son altos comparados con otras especies (Pizza y colb. 1998). (Ver
apndice)
2.2. METABOLITOS SECUNDARIOS
Se definen como metabolitos secundarios a aquellos compuestos que no tienen una
funcin reconocida en el mantenimiento de los procesos fisiolgicos fundamentales de los
organismos que los sintetizan (Robert y colb. 1991).
Entre las funciones que cumplen estos metabolitos estn: proteger la planta de los
depredadores, competir ventajosamente con otras plantas, atraer polinizadores y
simbiontes y brindarles proteccin contra diferentes tipos de estrs a los que se vean
sometidas (Loyola y Vargas, 1985, citados por Robert y colb. 1991). Las evidencias de
una estricta regulacin metablica de estos productos nos indicara que cumplen un rol
importante en la sobrevivencia de las plantas.
2.2.1. GLUCOSINOLATOS
Los glucosinolatos son una clase tioglucsidos restringidos a las dicotiledneas limitados
a pocas familias y en algunos casos a ciertos gneros y especies (Kjaer, 1973), los que
son almacenados en diferentes tejidos de la planta, siendo una fuente significativa del
contenido de azufre y minerales de la planta (Josefsson, 1970; citado por Rodman, 1981),
se encuentran en muchos cultivos comerciales y junto con la enzima que los degrada, la
mirosinasa, conforman un sistema que define fitoqumicamente al orden de las
Capparales (Hegnauer, 1986; citado por Bones y Rossiter, 1996); estando presente en
muchas brassicaceas econmicamente importantes, como la mostaza, calabazas,
brcoli, nabo, etc. El dao mecnico, infecciones o ataque de pestes produce, como una
respuesta de defensa de la planta, el rompimiento celular que exponen los glucosinolatos
almacenados a la accin de las enzimas que los degradan, las mirosinasas, produciendo
isotiocianatos, nitrilos, cianoepitioalcanos y tiocinatos dependiendo del pH y/u otros
factores (Fig 1) (Bones y Rossiter, 1996). Estos compuestos disminuyen la palatibilidad
de las hojas para herbvoros no especficos como aves y babosas, pero aumenta la
susceptibilidad del tejido a insectos especficos como los escarabajos alados, (Mithen y
col. 1995)
La primera revisin de la presencia de glucosinolatos en varias especies fue hecha
por Kjaer en 1960, con actualizaciones peridicas (Xenophon y colb., 1981), en 1973,
Kjaer puntualiz: "entre el vasto nmero de productos secundarios vegetales, aquellos
que presentan una distribucin discontinua junto con un llamado inmediato a los sentidos
humanos (olor, sabor, color) han adquirido, por razones obvias, una posicin prominente
en discusiones acerca de los mritos de tales productos para propsitos de clasificacin
y, ms fundamentalmente, consideraciones filogenticas. Los glucosinolatos...
constituyen un grupo con algunas de las caractersticas anteriores." ... "La complejidad
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
16 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
sistemtica de numerosos taxa productores de glucosinolatos, por ejemplo dentro de
Cruciferae, es un reto para nuestro entendimiento de la posicin biolgica e importancia
de este grupo de constituyentes vegetales qumicamente bien definido y en constante
crecimiento".
Hace ya varias dcadas, se ha deseado reducir el contenido de tioglucsidos en
Brassicceas mediante mtodos de cultivo, pues la presencia de algunos de ellos son
indeseables por algunos efectos txicos de los productos de su degradacin (Josefsson,
1967), tales como nitrilos, isotiocianatos, tiocianatos, epitionitrilos y vinil oxazolidinetionas
(Bones y Rossiter, 1996), as como por su sabor; mientras que otros vienen siendo
estudiados por sus propiedades teraputicas. Actualmente, la concentracin de
glucosinolatos puede ser manipulada genticamente, disminuyndola para mejorar la
palatabilidad del cultivo, como en el caso de la colza, o, aumentndola como se trata de
hacer en brcoli con el glucosinolato glucorafanina, que al hidrolizarse forma sulfurofano
con actividad anticancergena (Quiros, 1999).
Las especies del gnero Lepidium son usualmente ricas en bencil isotiocianatos
(Daxenbichler y colb., 1964) y en el caso de la maca, Jonhs (1981), sugiere que las
propiedades potenciadoras de la fertilidad se deben a los productos de los glucosinolatos
de maca, los isotiocianatos aromticos, bencilisotiocianato y el p-metoxibencil
isotiocianato, el ltimo de los cuales tambin se encuentra en mashua.
Qumicamente, los glucosinolatos son compuestos hidrosolubles, tienen el mismo
ncleo el cual consiste en un tioglucsido unido al carbn de una oxima sulfonada y un
grupo funcional R que deriva de aminocidos siendo ste el carcter variable (Bones y
Rossiter, 1996) y de cuya estructura depende la actividad biolgica del glucosinolato al
determinar la naturaleza de los productos resultantes del dao de los tejidos de la planta,
(Mithen y colb., 1995). La naturaleza de este grupo R los divide en dos grupos: los
glucosinolatos aromticos (alquil, alquenil, hidroxialquenil, w- metiltioalkenil) y los
alifticos (bencil, bencil sustituido), el grupo sulfato le imparte fuertes propiedades cidas,
por lo que los glucosinolatos se presentan como aniones contrabalanceados por un
catin, la glucosa y sus formas aninicas, los hacen compuestos no voltiles e
hidroflicos, se han identificado ms de 100 glucosinolatos; todos ellos se diferencian slo
en la cadena lateral R. (Bones y Rossiter, 1996). Por el gran nmero de glucosinolatos,
se usan nombres semisistemticos, en los que el nombre de la cadena R es seguido por
el sufijo "glucosinolato.
Los glucosinolatos provienen del metabolismo de los d- aminocidos, Valina, Alanina,
Leucina, soleucina, Fenilalanina, Tirosina y Triptofano (Kjaer, 1973), en una serie de
reacciones en las que el grupo carboxilo se pierde y el carbn d se transforma en el
carbn central del glucosinolato (Larsen, 1981), aunque solo siete corresponden a
aminocidos proteicos (antes mencionados), los restantes derivan de modificaciones de
la cadena lateral, que probablemente a nivel de glucosinolato o derivan de aminocidos
no proteicos (Chapple, y colb., 1994 y Larsen, 1981).
Para el aislamiento y anlisis de los glucosinolatos se han desarrollado muchas
tcnicas, como la cromatografa en papel Kjaer 1970, cromatografa de capa fina,
cromatografa de gases, adems de procesos que involucra el estudio de los productos
de la degradacin enzimtica, aunque la gran variabilidad de los productos de la
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 17
degradacin enzimtica pueden causar resultados errneos, (Larsen, 1981).
El tratamiento de los glucosinolatos con AgNO3 o Hg(Oac)2 resulta en la produccin
de -D-glucosa y derivados de la plata o el mercurio los que nuevamente pueden ser
descompuestos en nitrilos, (Larsen, 1981)
Los glucosinolatos se encuentran usualmente en toda la planta en vacuolas
celulares, pero presumiblemente en las semillas maduras y dormantes ricas en
glucosinolatos y que presumiblemente no presentan vacuolas acuosas an no se ha
definido su localizacin celular (Rodman, 1981).
Lockwood y Belkhiri, (1991), revisaron la clasificacin de crucferas de Argelia, de
acuerdo a sus glucosinolatos, reclasificando el gnero satis y reubicando el gnero
Sinapsis fuera de Brassicaria, esto demuestra pues, el valor taxonmico de estos
compuestos.
2.2.1.1. EL SISTEMA MIROSINASA - GLUCOSINOLATO
Las enzimas que hidrolizan los glucosinolatos son las mirosinasas y estas estn
invariablemente depositadas en toda la naturaleza con el sustrato. (Kjaer, 1973), as, sin
excepcin conocida, los glucosinolatos estn acompaados en la planta por esta enzima.
Las mirosinasas se encuentran en idioblastos especializados ricos en protenas llamados
clulas de mirosina (Rodman, 1981) que se encuentran en el tejido parenquimtico
(Bonnes y Rossiter, 1996), stos se tien de rojo intenso con el reactivo de Millon. (Fahn,
1979; citado por Rodman, 1981) de tal manera que los dos componentes se encuentran
separados hasta que se produce dao tisular o autolisis, generando durante la
masticacin los productos de defensa de la planta (Purrington, 2000).
Este sistema fue observado por primera vez en semillas de mostaza, (Kjaer, 1968)
posteriormente fue encontrado en todas las Brassicceas, y en la familias Caparaceae,
Tropaeolaceae, Caricaceae, entre otras. Por otro lado se ha encontrado en los hongos
Aspergillus sydowi y Aspergillus niger, en la bacteria Enterobacter cloacae, en tejidos de
mamferos y en los fidos que atacan crucferas Lipaphis erisimi y Brevicoryne brassicae.
Pero estas enzimas parecen no estar relacionadas con las enzimas de las plantas (Bones
y Rossiter, 1996)
Fuente: Bonnes y Rossiter. 1996. The Myrosinase Glucosinolate System, its
Organization and Biochemistry. Physiologia Plantarum. 97:194 -208
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
18 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
La degradacin de los glucosinolatos mediada por la mirosinasa puede producir: a)
isocianatos, cuando la hidrlisis se produce en un pH normal; b) nitrilos, cuando la
hidrlisis ocurre a pH cido; c) cianoepitioalcanos, cuando la mirosinasa se presenta con
una pequea protena conocida como protena epitioespecificadora; d) tiocianatos, que
son producidos solo por tres de los glucosionatos que se dan en la naturaleza, los allyl,
bencil, y 4-(metiltio) butilglucosinolatos.
MacGibbon y Allison en 1970 detectaron por electroforesis en gel separando varias
isoenzimas de mirosinasas, ellos trabajaron con 7 especies de Rhoeadales, cada especie
tenia un patrn diferente con 1 a 4 bandas. Tambin encontraron que este patrn variaba
de acuerdo a la parte de la planta de la cual se hicieran los extractos.
Diferentes estudios de las mirosinasas demuestran que el patrn de estas enzimas
puede variar no solo de acuerdo a la especie, sino tambin de acuerdo al rgano y edad
de la planta, pero se sabe poco de la razn fisiolgica de esta diferencia.(Bonnes y
Rossiter, 1996). Se ha postulado que las isoenzimas particulares corresponden a
condiciones endgenas encontradas en las plantas, o al organismo blanco o a los
glucosinolatos que predominan en el tejido.(Bonnes y Rossiter, 1996).
2.2.2. ALCALOIDES
Los alcaloides forman una amplia y variada familia de metabolitos secundarios de
molculas no relacionadas entre s, siendo de gran importancia econmica debido a sus
propiedades farmacolgicas, las mismas que han sido usadas desde la prehistoria hasta
la actualidad. Son los metabolitos mas frecuentes en el reino vegetal, habindose
encontrado cerca de 10,000 alcaloides en aproximadamente 20 por ciento de plantas con
flores, principalmente dicotiledneas herbceas (Hopkins, 1999).
Se clasifican como alcaloides a aquellas sustancias bsicas con uno o ms tomos
de nitrgeno en su sistema cclico, que manifiestan actividad farmacolgica (Lock, 1994)
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 19
La mayora de los alcaloides provienen del metabolismo de los aminocidos,
principalmente tirosina, triptofano, arginina y lisina, y aunque algunos alcaloides se
encuentran en varios gneros o an en una familia, la mayora de las especies presentan
un patrn nico, genticamente determinado. Por otro lado su distribucin est restringida
a determinados rganos de la planta, como races, hojas o frutos jvenes (Hopkins,
1999).
No se ha determinado an cual es la funcin de los alcaloides en la planta, aunque
se le asignan rol defensivo, debido a que la mayora son amargos, lo cual es considerado
universalmente como un carcter repelente. Todos son biolgicamente activos, muchos
significativamente txicos y otros con propiedades antibiticas. Frecuentemente los
tejidos que acumulan alcaloides son los ms vulnerables, o son tejidos perifricos que
pueden ser atacados por herbvoros (Hopkins, 1999), pero el hecho que cerca de 80% de
las plantas no contienen alcaloides hace suponer que estos no son vitales para todos los
organismos vivientes (Lock, 1994).
Para la extraccin de alcaloides se aprovecha su carcter bsico, utilizando
soluciones acuosas o alcohlicas ligeramente cidas, para obtener el extracto crudo de
alcaloides; pudiendo previamente liberarlos con soluciones de amoniaco y carbonato de
sodio, para extraerlos luego con solventes orgnicos.(Lock, 1994)
Las tcnicas de separacin de alcaloides ms comunes son la cromatografa de capa
fina o delgada aunque en los noventa se generaliz el uso de Sephadex LH-20 por
elucin y la cromatografa lquida de alta perfomance (HPLC). Los sistemas solventes son
muy variados y el agente revelador de uso general es el reactivo de Dragendorff, cuya
aplicacin produce manchas generalmente de color naranja (Lock 1994).
La Dra. Gloria Chacn, (1961, 1990) demostr la presencia de alcaloides en
Lepidium peruvianum, para demostrar la accin fecundadora del extracto alcaloideo de
maca, lo inocul en ratas obteniendo una marcada estimulacin de la maduracin los
folculos de Graaf y engrosamiento del endometrio. Posteriormente Yllesca, (1994), en un
estudio fitoqumico de la planta encontr 3 alcaloides en los extractos metanlico y
butanlico de maca de los ecotipos amarillo, rojo y negro. En 1993, Garr y col.
obtuvieron cuatro fracciones de alcaloides por cromatografa de capa fina. Por otro lado
Dini y colb., (1994), detectaron por cromatografa de capa fina de un extracto alcalino de
polvo de maca realizado en cloroformo 3 fracciones positivas al reactivo de Dragendorff.
Sin embargo la presencia de alcaloides en maca an es discutida y no se ha determinado
su estructura.
2.3. CULTIVO DE TEJIDOS
El cultivo de tejidos como tcnica consiste en aislar una porcin de planta y
proporcionarle las condiciones apropiadas para que las clulas expresen su potencial
intrnseco o inducido. Es en realidad un conjunto de diversas tcnicas mediante las
cuales un explante, es decir una parte separada de la planta, se cultiva aspticamente en
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
20 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
un medio de composicin definida y se incuba en condiciones ambientales controladas.
(Roca y Mroginski, 1991).
Los principios de esta tcnica estn contenidos en la teora celular de Schleiden y
Schwann (1839, citados por Gautheret, 1982) que postula que la clula es capaz de tener
autonoma y totipotencia, lo que fue demostrado en clulas somticas con la observacin
de la formacin y cicatrizacin de callos en reas donde la planta sufre cortes (Gautheret,
1982).
Los primeros intentos de establecer cultivos de tejidos vegetales fueron realizados
por el botnico alemn G. Haberlandt (1902, citado por Gautheret 1982), quien trabaj
con clulas de palizada, pelos glandulares y pelos de estambres de Tradescantia; pero
aunque logr que las clulas sobrevivieran entre 20 a 27 das, no tuvo crecimiento
celular, probablemente debido a que eligi nutrientes relativamente simples y a que eligi
clulas altamente diferenciadas (Dodds y Roberts, 1982). Recin en 1934, mucho
despus que en 1912 Carrel diseara el mtodo para cultivar clulas animales; que
Gautheret logra los primeros resultados exitosos en el cultivo de tejidos del cambium en
Acer pseudoplatanus, Salix capraea y Sambucus nigra (Gautheret 1982) y White
demuestra el crecimiento ilimitado de las puntas cortadas de races de tomate (Dodds y
Roberts 1982).
Los primeros logros del cultivo de tejidos fueron los de formacin de callos
indiferenciados, que podan crecer ilimitadamente a travs de subcultivos, por lo que se
puso mucho nfasis en la determinacin de los requerimientos nutricionales para el
crecimiento sostenido (Dodds y Roberts 1982). Para entonces ya se haba descubierto la
auxina AA (Went, 1926, citado por Gautheret, 1982) y en las dcadas siguientes se
estudiaron diversas sustancias que favorecan el crecimiento celular de los tejidos
cultivados in vitro (Gautheret 1982) se descubri la kinetina y otras hormonas que
recibieron el nombre de citoquininas (Dodds y Roberts 1982) , hasta que en 1962,
Murashigue y Skoog propusieron una solucin de minerales asociada a auxinas y
citoquininas que permite el crecimiento de la mayora de tejidos (Gautheret 1982).
Tambin se inici una serie de estudios en organognesis e histognesis, que
sentaron las bases de la micropropagacin cuando Ball en 1946 descubri el principio de
la propagacin vegetativa determinando cuales eran los tipos de meristemos que eran
capaces de generar plantas completas. En 1964, Morel aplic estos principios en la
propagacin clonal de orqudeas. (Gautheret 1982).
Muir (1953 1954, citado por Dodds y Roberts 1982) encontr que los callos que
eran trasladados a un medio lquido se convertan en suspensiones celulares,
desarrollndose luego muchas tcnicas de cultivo de clulas aisladas y de otro tipo de
cultivos, como el de anteras, de microsporas, el aislamiento y cultivo de protoplastos y
otros. (Dodds y Roberts 1982).
Actualmente el cultivo de tejidos se aplica entre otros:
a) Estudios bsicos de fisiologa, gentica, bioqumica y ciencias afines.
b) Bioconversin y produccin de compuestos tiles.
c) ncremento de la variabilidad gentica.
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 21
d) Obtencin de plantas libres de patgenos.
e) Propagacin de plantas.
f) Conservacin e intercambio de germoplasma.
2.3.1. CULTIVO DE CALLOS
El establecimiento del cultivo de tejidos depende del tipo de explante usado, y la eleccin
de ste depender del objetivo perseguido y la especie vegetal utilizada. Para la
obtencin de callos se puede utilizar cualquier tipo de explante que contenga clulas
nucleadas, y ste se seleccionar en funcin a razones prcticas como disponibilidad,
facilidad de manipulacin, homogeneidad, baja contaminacin, respuesta in vitro; esta
respuesta puede variar con el genotipo de las plantas, su estado de desarrollo, edad
ontognica y tamao del explante (Roca y Mroginski, 1991). A las dos o tres semanas de
incubacin empieza a formarse, en las regiones de corte, el callo, una masa amorfa
desdiferenciada de clulas parenquimticas de pared delgada (Dodds y Roberts 1982), y
sigue creciendo cubriendo el explante en unos casos, y en otros desintegrndose a
medida que el callo crece (Nuez y Ochoa, 2000). Este crecimiento depende de la
relacin entre la planta de origen, el medio de cultivo, las condiciones ambientales y el
tiempo de incubacin; algunos callos crecen fuertemente lignificados y de textura dura,
mientras otros se rompen fcilmente en pequeos fragmentos, estos callos son llamados
friables (Dodds y Roberts, 1995), estos callos son los mejores para la iniciacin de
cultivos celulares.
El establecimiento de un callo a partir de un explante, puede dividirse en tres fases
de desarrollo: nduccin, en la que el metabolismo es estimulado antes de la mitosis;
divisin celular en el que las clulas del explante revierten a un estado meristemtico; y
por ultimo diferenciacin celular y expresin de algunas vas metablicas que llevan a la
formacin de metabolitos secundarios (Dodds y Roberts, 1995).
La formacin de callos en plantas intactas, normalmente est controlada por
hormonas endgenas, las auxinas y citoquininas, por lo que para su induccin in vitro en
explantes vegetales sin causar estrs, depende de la introduccin de reguladores de
crecimientos en el medio de cultivo (Nuez y Ochoa, 2000).
Los otros factores ms importantes para el xito de esta tecnologa son: el explante y
el medio de cultivo, es decir, los componentes esenciales y opcionales que contenga. Los
nutrientes esenciales consisten en las sales inorgnicas, fuentes de carbono y energa,
vitaminas y fitohormonas (Gamborg y Shyluk, 1981). Otros componentes como
compuestos nitrogenados, cidos orgnicos y sustancias complejas pueden ser
importantes pero son opcionales.
Despus de que el callo ha crecido por un tiempo en asociacin con el tejido original,
es necesario subcultivar el callo a medio fresco. El crecimiento en el mismo medio por un
tiempo prolongado lleva al agotamiento de los nutrientes, a la gradual desecacin del
agente gelificante y a la acumulacin de metabolito que pueden resultar txicos para el
callo (Dodds y Roberts, 1995).
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
22 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
Los subcultivos sucesivos usualmente son llevados a cabo cada seis semanas, con
cultivos mantenidos en medio agar a 25C o ms, pero en realidad este tiempo vara con
la tasa de crecimiento del callo (Dodds y Roberts, 1995).
Carhuaz en 1997 (comunicacin personal), indujo callos en maca, utilizando un
factorial de cuatro citoquininas (BAP, KN, ZEA y 2ip) y cuatro auxinas (A, BA, NAA y
2,4-D) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0, 100 M, concluyendo que el 2,4-D en el rango
de 0.1 10.0 M el regulador ms efectivo para promover la formacin de callos,
coincidiendo con Gamborg y colb. (1981), quienes indican un rango ptimo de 1- 5 M
para la accin del 2,4-D y con Flick y colb. (1983), que tambin sealan al 2,4-D y a la
kinetina como los reguladores ms efectivos para la induccin de callos en Brassicceas.
2.3.2. HORMONAS Y REGULADORES DE CRECIMIENTO
Se llama hormona o fitohormona a aquellas sustancias orgnicas naturales que a bajas
concentraciones ejercen una profunda influencia en los procesos fisiolgicos de la planta
(Hopkins, 1999), mientras que las sustancias sintticas con las mismas propiedades son
llamadas reguladores de crecimiento, y no son consideradas como hormonas vegetales
(Dodds y Roberts, 1995).
Se conocen cinco grupos de hormonas: auxinas, giberelinas, citoquininas, cido
abscico y etileno (Hopkins, 1999). De estas las auxinas y citoquininas son las mas
usadas en el cultivo de callos, mientras las giberelinas son usadas con poca frecuencia y
generalmente en cultivos de meristemos apicales. De igual modo el cido abscico y el
etileno se usan con poca frecuencia (Dodds y Roberts, 1995).
En la familia Brassicaceae se encuentran muchas especies econmicamente
importantes, en muchas de ellas se han inducido callos, incluyendo a Brassica oleracea,
B. napus y Arabidopsis thaliana, los requerimientos para inducir callos en esta familia
pueden ser cubiertos con muchas hormonas, con un amplio rango de concentraciones,
estas concentraciones y la hormona a ser elegida, as como la respuesta de crecimiento
vara con la especie y el genotipo. Sin embargo, usualmente se utiliza una auxina y una
citoquinina, (Flick y colb., 1983), dentro de las citoquininas la ms usada es la Kinetina,
mientras que la auxina utilizada con ms frecuencia es 2,4-D, de igual modo, la relacin
auxina:citoquinina ms eficiente para la induccin de callos es de 1 (Flick y colb. (1983).
2.3.2.1. AUXINAS
Las auxinas (del griego auxein = incrementar) fueron identificadas por primera vez por
Went en 1926, quien describi la accin elongadora del AA en coleptidos de avena.
Posteriormente se hallaron mas auxinas naturales, de las cuales la ms usada en cultivo
de tejidos es el AA, y otras sintticas o reguladores de crecimiento de las cuales las ms
usadas son el 2,4-D, el NAA y el BA (Krikorian, 1991).
Los efectos de las auxinas ms importantes para el cultivo de tejidos son el
crecimiento celular y la elongacin celular. Algunos tejidos slo forman callos en
respuesta a una auxina en particular, siendo a veces necesario utilizar altas
concentraciones de auxina para la iniciacin del callo, aunque en el caso del 2,4-D, se ha
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 23
observado efectos inhibitorios a concentraciones mayores a 1 mg/litro. Este regulador es
la auxina ms efectiva para la proliferacin de callos usndose a concentraciones de 10
-7
10
-5
M y an en ausencia de una citoquinina exgena (Yeoman y Forche, 1980).
Adems de inducir la proliferacin celular, el 2,4-D tiende a suprimir la morfognesis
del callo, por lo que su uso no es recomendado para estudios de diferenciacin (Yeoman
y Forche, 1980). En Arabidopsis thaliana, la brassicacea mas estudiada, la auxina mas
usada en la obtencin de callos en diferentes explantes es el 2,4-D, sea junto a una
citoquinina o a leche de coco (Morris y Altmann, 1994).
2.3.2.2 CITOCININAS
En 1954 Skoog y Miller descubrieron un compuesto muy activo en la promocin de la
citocinesis, el que se formaba por la descomposicin parcial de ADN, llamndolo cinetina
(Kinetina, KN) y propusieron el trmino cinina para denominar las sustancias naturales y
sintticas que presentaban el mismo tipo de actividad biolgica. Posteriormente para
evitar confusiones con la sustancia usada en cultivo de tejidos animales, se opt por el
nombre citocinina para estas sustancias (Krikorian, 1991).
Las citoquininas se caracterizan por su habilidad para estimular la divisin celular en
el cultivo de tejidos cultivo, induciendo la divisin celular sincrnica a las 18 h
(Szweykowska, 1974), y, en presencia de una auxina, estimular la formacin de brotes e
inhibir el enraizamiento (Dodds y Roberts, 1995).
Las citoquininas mas usadas son la kinetina y la zeatina, siendo compuestos
sintticos, mientras la zeatina es una citoquinina natural (Dodds y Roberts, 1995).
Hay excepciones en el requerimiento de auxinas y citoquininas, as algunos cultivos
no requieren de una auxina exgena y otros requieren de una auxina y no de una
citoquinina (Dodds y Roberts, 1995). Se ha observado adems que en todos los casos
las citoquininas a altas concentraciones (10 25 mg/l) inhiben la formacin de callos
(Yeoman y Forche, 1980).
En Lepidium peruvianum, Carhuaz (1997, comunicacin personal) utiliz un factorial
de medios con cuatro auxinas (AA, BA, NAA, y 2,4-D) y cuatro citoquininas ( BAP, KN,
ZEA, Y 2ip) a concentraciones de 0.1, 1.0, 10.0 y 100 M, utilizando como explantes, la
raz, hoja, peciolo e hipoctilo.
2.3.3. EL EXPLANTE
Los requerimientos hormonales para la iniciacin del callo dependen del origen del tejido
aislado (explante), los explantes que contienen clulas del cambium pueden formar callos
sin adicin de reguladores de crecimiento; pero la mayora de los explantes requiere de
uno o ms reguladores de crecimiento para iniciar la formacin de callos (Dodds y
Roberts, 1995). Esta respuesta tambin depende del estado fisiolgico del tejido y del
tiempo de escisin, (Yeoman y Forche, 1980).
Los explantes pueden ser clasificados de acuerdo a sus requerimientos exgenos de
la siguiente manera: 1) auxinas 2) citoquininas 3) auxinas y citoquininas 4) extractos
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
24 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
naturales complejos (Dodds y Roberts, 1995).
2.3.4. CULTIVO DE TEJIDOS Y METABOLITOS SECUNDARIOS
Las plantas siguen siendo una importante fuente comercial de metabolitos secundarios,
pero en algunos casos estas plantas no han sido sujetas a programas intensivos de
mejoramiento gentico y se presentan adems problemas tcnicos y econmicos para su
cultivo (Dodds y Roberts, 1995).
El cultivo de tejidos puede ser una alternativa para producir metabolitos secundarios
cuya extraccin a partir de las plantas que los producen puede resultar difcil o
econmicamente inviable, sea por el largo tiempo de espera necesario, por el riesgo de
sobreexplotacin al que se expone el cultivo; por las pequeas cantidades de compuesto
presente en la planta o por los controles a los que se someten a las plantas productoras
(Robert y colb., 1991). Por otro lado el cultivo de tejidos puede ser utilizado para mejorar
el cultivo de estas plantas (Dodds y Roberts, 1995).
La nocin de que una lnea celular altamente productiva poda ser seleccionada para
generar compuestos tiles fue introducida en la dcada de 1970, en la dcada de los
ochenta, las Universidades de Kyoto y Kitasato en cooperacin con la industria privada,
produjeron shikonina de Lithospermum erythrorhyzon y saponinas de ginseng
respectivamente (Hara, 1996).
La produccin de shikonina, un pigmento que se extrae de las races de la planta
asitica Lithospermum erythrorhyzon es un ejemplo de la efectividad del uso del cultivo
de tejidos vegetales en la produccin de metabolitos secundarios. En la planta el
rendimiento de shikonina, adems de ser muy bajo, depende de la distribucin geogrfica
y el clima, habiendo sufrido una rpida disminucin en su poblacin. Luego de establecer
una estrategia de produccin in vitro, la empresa petroqumica Mitsui del Japn logr la
primera produccin industrial del compuesto, vendiendo a 4000 dlares el kilo de
shikonina producida in vitro (Robert y colb., 1991).
En la dcada de los noventa el nmero de compuestos producidos por cultivo de
tejidos aument y la mejora de la tecnologa Hara permiti obtener compuestos raros en
los recursos vegetales naturales. Un ejemplo de esta tecnologa es la produccin
comercial, por Kao, de un polisacrido tuberoso usado en cosmticos (Hara, 1996).
Actualmente existen al menos tres programas de bsqueda de compuestos con
actividad biolgica, llevados a cabo por las industrias farmacuticas, cada ao varios
cientos de plantas son colectados y se intenta en ellas la induccin de callos, con un xito
de cerca al 50%. Cerca del 10% de los callos muestra alguna forma de actividad (
Schripsema, y colb., 1996).
Todo el proceso desde la coleccin hasta la obtencin de un compuesto puro es
estimado entre los 2 y 4 aos. Algunos resultados de estas bsquedas han sido
publicados y patentados, como el alcaloide jatrorrhizina y los dehidrodiconiferil alcohol
glucsidos aislados de cultivos celulares de Plagiorhegma dubium Maxim (Schripsema y
colb., 1996).
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 25
La bsqueda de nuevos compuestos a nivel de callos tiene la ventaja de reducir el
nmero de cultivos de inters, muchas veces el paso de callos a suspensiones celulares
representa una reduccin considerable de los niveles de ciertos metabolitos secundarios,
ocurriendo algunas veces la prdida completa de productividad para ciertos productos, lo
que no significa que los cultivos celulares no sean capaces de producir compuestos de
inters, por el contrario, Ruyter y Stckingt (1989 citados por Schripsema y colb., 1996)
demostraron que los cultivos celulares son una excelente fuente de nuevos compuestos.
Las ventajas esperadas del cultivo de tejidos en la produccin de metabolitos
secundarios son las siguientes:
Produccin a escala industrial
Produccin de sustancias difciles de obtener por extraccin o por sntesis qumica
Reduccin de los costos de produccin a largo plazo
Eliminacin de la dependencia en materia de importacin
Produccin continua y controlada de sustancias independientemente de los factores
del medio ambiente.
Precios estables
Posibilidad de realizar la produccin cerca de las fbricas de procesamiento final y de
los mercados.
Se ha estudiado tambin la posibilidad de aumentar significativamente la productividad
del cultivo usando un medio de induccin (para la produccin de los metabolitos
secundarios) (Becker, 1987).
2.4. CROMATOGRAFA
La cromatografa es la tcnica analtica usada para la separacin de mezclas y
sustancias, por adsorcin selectiva (Microsoft Encarta Online Encyclopedia 2001) y
fue descubierta por el botnico ruso Michael Tswett en 1903, quien descubri que los
pigmentos de las plantas podan separarse al filtrarlos con ter de petrleo a travs de
una columna de carbonato de calcio. Pero el desarrollo de esta tcnica empieza
realmente en 1931, cuando, posteriormente otros investigadores introducen otros
materiales como las columnas de silicagel, papel (Randerath, 1968).
Actualmente se usa un amplio rango de tcnicas cromatogrficas de acuerdo a los
adsorbentes usados, la cromatografa de columna utiliza slica, almina y slica gel; en la
cromatografa de capa fina el adsorbente se encuentra sobre un vidrio o una pelcula
plstica, mientras que en la cromatografa de papel, una muestra lquida fluye sobre el
papel adsorbente. Otras tcnicas cromatogrficas son: la cromatografa gas-lquida, que
permite la separacin de sustancias que pueden ser volatizadas; la cromatografa inica
donde un gas puede ser descompuesto en iones que interactan con el adsorbente; la
cromatografa de permeacin de gel usa un adsorbente con poros de tamao uniforme, y
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
26 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
finalmente, la cromatografa lquida de alto perfomance (HPLC) donde el adsorbente es
lquido, esta tcnica es ampliamente usada actualmente (Microsoft Encarta Online
Encyclopedia 2001).
2.5. ELECTROFORESIS EN GEL
La electroforesis en gel es un mtodo de separacin, en el que las partculas cargadas
migran hacia un electrodo de carga opuesta bajo la influencia de un campo elctrico
aplicado externamente. Este movimiento se realiza en interaccin con la matriz
circundante, la cual acta como un filtro molecular, generndose como consecuencia,
tasas diferenciales de migracin para las protenas contenidas en una muestra (Garfin,
1990).
Los primeros trabajos de electroforesis fueron realizados en soportes de papel y
acetato de celulosa, y se utilizaron principalmente para separar aminocidos, pptidos y
mezclas proteicas mal separadas por cromatografa (Freifelder, 1979), los soportes
pueden ser relativamente inertes, como papel, acetato de celulosa, silicagel, almina y
celulosa y actuar como tamices moleculares como son los geles de almidn, agarosa y
poliacrilamida (Hames, 1981, citado por Glvez, 1990).
El mtodo ms utilizado es la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), por
proporcionar un tamao de poro controlable, ser repetible y de alta resolucin (Garfin,
1990).
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin del monmero de
acrilamida y un co-monmero de ligamiento cruzado, la N,N'-metilen-bisacrilamida. Esta
polimerizacin es catalizada por un sistema generador de radicales libres, compuesto por
persulfato de amonio, que acta como iniciador, y un acelerador, el
tetrametiletilendiamida TEMED, que causa la formacin de radicales libres a partir del
persulfato de amonio, los que a su vez catalizan la polimerizacin del gel (Garfin, 1990).
Otro agente donante de radicales libres es la riboflavina, pero a diferencia del persulfato
de amonio requiere de luz y oxgeno, agentes que convierten la convierten a su forma
leuco, la cual inicia la polimerizacin (Glvez, 1990)
Los poros se forman por la naturaleza del enlace cruzado entre la acrilamida y la
bisacrilamida, y su tamao disminuye a medida que la concentracin de acrilamida
aumenta, determinando sus propiedades como tamiz.
La separacin por electroforesis en gel esta basada en los tamaos, formas y cargas
netas de las macromolculas, los sistemas diseados para protenas nativas se utilizan
principalmente para separar y categorizar mezclas de protenas; pero no para medir la
pureza de una preparacin o el peso molecular de una muestra desconocida, pues estos
sistemas no diferencian entre los efectos del tamao, forma y carga en la movilidad
electrofortica, debido a que protenas con diferentes pesos moleculares pueden tener la
misma movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante
(SDS PAGE)(Garfin, 1990).
2. ANTECEDENTES
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 27
La separacin por electroforesis en gel esta basada en los tamaos, formas y cargas
netas de las macromolculas, los sistemas diseados para protenas nativas se utilizan
principalmente para separar y categorizar mezclas de protenas; pero no para medir la
pureza de una preparacin o el peso molecular de una muestra desconocida, pues estos
sistemas no diferencian entre los efectos del tamao, forma y carga en la movilidad
electrofortica, debido a que protenas con diferentes pesos moleculares pueden tener la
misma movilidad; para diferenciar estos efectos se utiliza la electroforesis denaturante
(Garfin, 1990), en la cual se utilizan detergentes inicos como el SDS (sodium dodecyl
sulfato) el mismo que neutraliza la cargas de la protena de tal forma que las protenas
migran por efecto de su peso molecular, las muestras en este caso deben ser tratadas
con SDS y un tiol, como el mercaptoetanol. (Glvez, 1990).
El mtodo ms popular es el SDS-PAGE desarrollado por Laemmli en 1970 (Garfin,
1990), el cual consiste en un mtodo discontinuo con dos tipos de geles: un gel de
separacin y uno de concentracin, ambos geles tienen diferentes porosidades y pH,
sirviendo el segundo como un medio anticonvectivo, donde la muestra se apila antes de
pasar al gel de separacin que se halla inmediatamente debajo y que posee un tamao
de poro ms pequeo. Adems, se utilizan diferentes buffers para el gel y los electrodos,
esta discontinuidad permite concentrar grandes volmenes de muestra en el gel de
concentracin, resultando en una mejor resolucin (Laemmli, 1970).
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
28 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
3. MATERIAL Y MTODOS
3.1. INDUCCIN DE CALLOS
Para la induccin de callos se sigui un protocolo en base al trabajo realizado por
Carhuaz en 1997 (comunicacin personal) segn se describe a continuacin.
3.1.1. MATERIAL VEGETAL
Se utilizaron plntulas de maca amarilla, morada y negra, germinadas in vitro en medio
Murashigue y Skoog (1962), sin hormonas, suplementado con vitaminas, mioinositol,
pantetonato de calcio, 20% de sucrosa, y 2% de gelrite.
Las semillas fueron gentilmente proporcionadas por el ng. Rolando Aliaga (CMA
UNA) y provinieron de la comunidad de Huayre-Junn.
3.1.1.1. DESINFECCIN
La desinfeccin de las semillas se realiz adecuando el protocolo de desinfeccin de
rutina usado en el LRGB, de la manera siguiente:
nmersin en alcohol al 70%: 1 minuto
3. MATERIAL Y MTODOS
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 29
nmersin en hipoclorito de Na al 2%: 10 minutos
Enjuague con agua destilada estril: 1 minuto, cuatro veces
3.1.1.2. CONDICIONES DE CULTIVO
Las condiciones del cuarto de cultivo fueron: 18C, 1,500 Lux, fotoperodo de 16 h de luz.
A los 40 das, las plntulas tuvieron el tamao de hoja necesario para obtener dos
explantes: apical y proximal.
Los colores del ecotipo de maca correspondiente a cada plntula de origen fueron
denominados utilizando la siguiente nomenclatura:
M1 = Ecotipo amarillo, M2 = Ecotipo morado, M3 = Ecotipo negro.
3.1.2. EXPLANTES
Los explantes obtenidos fueron los siguientes:
E1: Regin apical de la hoja (Aprox. 0.5 cm de longitud x 0.5 en la base).
E2: Regin proximal de la hoja del mismo tamao que el explante anterior. Los
bordes de las hojas fueron cortados para obtener una mayor rea de induccin de
callos.
E3: Porcin de peciolo aprox. 1 cm de longitud.
E4: Hipoctilo completo, incluyendo la roseta meristemtica, la mayora de ellos
meda tuvieron aproximadamente 0.4 cm.
E5: races segmentos sin puntas de aprox.1 cm se escindieron de la regin proximal.
3.1.3. MEDIO DE CULTIVO PARA LA INDUCCIN DE CALLOS
Se utilizaron dos hormonas vegetales para la induccin de callos, una auxina (2,4-D) en
concentraciones de 0, 0.1, 0.5, 1 y 10 M y una citoquinina (kinetina) en concentraciones
de 0, 0.1, 0.5, 1 y 10 M; como medio bsico se utiliz el medio descrito por Murashige y
Skoog (1962) al que se le agregaron mioinositol 100 ppm, pantotenato de calcio 2 ppm,
vitaminas: tiamina 2 ppm, piridoxina 0.5 ppm, cido nicotnico 0.1 ppm y glicina 0.5 ppm;
2% de sucrosa y 0.2% de gelrite, tal como se utiliza en rutina en el LRGB, obtenindose
un factorial de 17 medios de induccin semislidos con diferentes concentraciones de
hormona incluyendo el control negativo.
3.1.4. INDUCCIN DE CALLOS
Se sembraron los explantes en placas petri descartables con 25 ml de medio de
induccin, haciendo cinco repeticiones por cada medio de induccin. Las placas se
mantuvieron en oscuridad a 25C. realizndose evaluaciones a partir de los 25 das de
siembra con un intervalo de 10 das por evaluacin durante dos meses, estas
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
30 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
evaluaciones fueron cualitativas para confirmar el crecimiento de los callos.
A los dos meses de crecimiento se hizo el primer subcultivo en placas petri
descartables con medios de induccin frescos, a los cuatro meses se evalu el material
midiendo el rea ocupada por cada callo sobre una cuadrcula milimetrada, para
determinar as la masa relativa de los mismos y por consiguiente el medio con mayor
rendimiento en masa. Seguidamente, se realiz el subcultivo de todos los callos en el
medio K (ver apndice), a partir de entonces se realizaron subcultivos cada dos meses
hasta los ocho meses cuando se cosecharon los callos para la extraccin de metabolitos
secundarios.
3.2. DETECCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS
Se realizaron cromatografas de papel para la deteccin de glucosinolatos y
cromatografas de capa fina ascendente para la deteccin de alcaloides tanto en los
callos obtenidos como en los controles, no se utiliz una sola lnea celular debido a la
pequea cantidad de materia seca obtenida de los callos como consecuencia de su alto
porcentaje de humedad. Para la extraccin de los metabolitos se utilizaron 30 mg muestra
estabilizada.
La estabilizacin se realiz secando los callos en una estufa a 37 C por 36 horas
para luego molerlos y guardar los frascos en un lugar seco y sin luz. Como control, se
usaron muestras de hipoctilos amarillos morados y negros provenientes de la localidad
de Huayre y estabilizadas en las mismas condiciones que los callos. Los callos se
clasificaron de acuerdo al color y naturaleza del explante del que provenan, as un callo
proveniente de la zona apical de la hoja de ecotipo amarillo se denomin M1E1 y as
sucesivamente (ver apndice). Esta clasificacin nos facilit el manejo de las muestra en
las cromatografas.
Antes de la pulverizacin de las muestras se determin el % de humedad.
3.2.1. EXTRACCIN Y DETECCIN DE GLUCOSINOLATOS
Para la extraccin y cromatografa de glucosinolatos se adecu el protocolo de rutina
utilizado por el Dr. Csar Fuertes en el nstituto de Qumica Orgnica Aplicada a la
Farmacia, en la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad Nacional Mayor de
San Marcos (ver apndice), como se describe a continuacin:
Para la extraccin etanlica se tomaron 30 mg de cada tipo de callo y se pusieron a
macerar en 2 ml de etanol al 96% durante dos semanas. Se sembraron, 100 alicuotas de
cada uno de estos extractos en hojas de papel Wathman N 1 de 11 x 29 cm y se
colocaron en un tanque de cromatografa de papel descendente, dejndose desarrollar
por 22 horas.
Como sistema solvente se us una solucin de n-butanol:etanol:agua (4:1:4) descrito
por Kjaer en 1968.
3. MATERIAL Y MTODOS
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 31
Despus de retirar los papeles del tanque de cromatografa se secaron a
temperatura ambiente e inmediatamente se revelaron para lo cual se pulverizaron
primero con una solucin de nitrato de plata:acetona 15 mg/ml, y luego de dejar secar por
unos minutos, con una solucin de KOH:Etanol 20 mg/ml. Se dejaron secar las hojas de
papel unos minutos y se colocaron en una estufa caliente. Una vez obtenidas las
manchas indicadoras, se colocaron los cromatogramas en una solucin decolorante de
hiposulfito de potasio al 5%, durante 20 hrs.
3.2.2. EXTRACCIN Y DETECCIN DE ALCALOIDES
Se utilizaron 30 mg de cada muestra, las que se pusieron a macerar en ter etlico,
realizndose tres extracciones sucesivas.
La cromatografa de capa fina se realiz de acuerdo a la tcnica descrita por Stahl
(1958 y 1965), en cromatofolios de silicagel GF254 ( para las cromatografas preliminares
se usaron cromatofolios de 2 x 10 cm) y cromatoplacas Kieselgel 60 G F254 (Merck) de
20 x 20 cm.
En las cromatografas preliminares se realizaron con las muestras de hipoctilos de
maca (controles) y se probaron las siguientes soluciones para el sistema solvente:
Benzol: ter dietlico: metanol: amoniaco (75: 75: 6: 0.7);
Cloroformo: metanol: amoniaco (2: 0.12: 0.02);
Cloroformo: metanol (2: 1), (2: 0.25), (2: 0.15) y (2: 0.12), siendo esta ltima la que se
utiliz en la estandarizacin de la cromatografa.
Se desarrollaron cromatografas de muestras acidificadas y sin acidificar.
Para el revelado de las placas se utiliz el reactivo de Dragendorff y posteriormente
el reactivo yodoplatinato de potasio.
Antes de revelar las placas se observaron en el espectro de luz UV.
En vista de la ausencia de resultados congruentes en la primera cromatografa, se
procedi a estandarizar la extraccin en una muestra de hipoctilos de varios colores, la
cantidad de metabolitos no deseables para la cromatografa fue bastante alta por lo que
se procedi a lavar el extracto acidificando el extracto etreo con HCl acuoso,
recuperndose la fase acuosa a la cual, luego de ser alcalinizada con NaOH
concentrado, se le agreg dos volmenes de ter etlico para recuperar la fase orgnica.
Se cromatografi este extracto en una cromatoplaca Kieselgel 60 F F254 (Merck) de 20 x
20 cm. Se revelaron los bordes de la placa con el reactivo de Dragendorff modificado por
Munnier (1955) y el reactivo yodoplatinato de potasio, aislando luego las regiones
correspondientes a las manchas positivas.
Una vez obtenidas las fracciones positivas para alcaloides, se cromatografiaron los
extractos de callos y los controles, junto con el extracto etreo y sus cuatro fracciones, las
que se usaron como un control extra.
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
32 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
3.3. DETECCIN DE MIROSINASAS
3.3.1. ELECTROFORESIS
Se utiliz la electroforesis en geles de policrilamida (PAGE) para separar las mirosinasas,
los geles y buffers fueron preparados de acuerdo al sistema de Laemmli (1970), pero
eliminando el uso de SDS y mercaptoetanol tanto de las soluciones de los geles como de
las de los buffers para obtener una PAGE en condiciones no denaturantes. La
concentracin de los geles fue de 8.6 y 7.5%.
Las corridas en los geles se llevaron a cabo con una corriente constante de 30 mA, el
voltaje inicial fue de 80 V y el final de 250V. La duracin de las corridas fue de 5 horas.
3.3.2. EXTRACCIN DE LAS MUESTRAS
Se llev a cabo adaptando el protocolo de MacGibbon y Allison (1964): 0.5g de muestra
fueron molidos en un mortero fro con 2 ml de buffer Tris-Cl pH 6.8, se centrifug a 10,000
rpm por 4 min, se tomaron 80 l del sobrenadante a los que se aadieron mercaptoetanol
5 l, glicerol 10 l y 5l de un stock de azul de bromofenol preparado para los
procedimientos de rutina del LRGB. Se colocaron 50 l de muestra en cada pocillo del
gel.
Se utilizaron hipoctilos y hojas de campo.
3.3.3. DETECCIN DE ACTIVIDAD
Se adapt la modificacin del mtodo de deteccin de actividad basado en la formacin
de bandas de BaSO
4
, descrito por MacGibbon y Allison (1970), esta modificacin fue
gentilmente proporcionada por el Dr. Atle Bones en una comunicacin personal (1999).
Para adaptar este protocolo se utiliz un extracto etanlico de semillas de mostaza,
preparado moliendo 100 g de semillas y macerndolas en 250 ml de alcohol etlico al
96%.
Cuando los geles fueron removidos, fueron colocados entre dos placas de vidrio e
incubados a 50C en una solucin acuosa de cido ascrbico 1mM; Acetato de Bario
10mM; Buffer Tris-Cl 0.5 M; pH 6.8 200 ml/L; extracto etanlico de semillas de mostaza
300 ml/L.
Cuando se hicieron evidentes las bandas, los geles fueron fotografiados con una
cmara digital DAGEMT CCD100 en blanco y negro.
3. MATERIAL Y MTODOS
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 33
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
34 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
4. RESULTADOS
4.1. INDUCCIN DE CALLOS
En la primera evaluacin, realizada a los 25 das de la incubacin (Foto nro. 1), se
observ la turgencia de las zonas del explante en donde se formarn los callos y la
formacin de pequeos callos en varias zonas de los cortes. La tabla Nro. 1 muestra la
presencia de callos en los explantes (+).
La Tabla Nro. 2 muestra los resultados obtenidos en cada medio en los tres colores
de maca. Como muestra el grfico Nro. 1 (apndice) el medio K es el que produjo una
mayor rea de callos callos y los medios y M los que no produjeron callos. Las
variaciones de respuesta de cada ecotipo, pueden verse en el grfico Nro. 2 (apndice)
TABLA Nro. 2. rea ocupada por Ios caIIos (mm
2
) en una cuadrcuIa miIimetrada
4. RESULTADOS
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 35
COLOR
MEDIO DE
CULTIVO
AMARILLO MORADO NEGRO TOTAL
(mm)
A 15 37 46 98
B 701 640 1416 2757
C 2610 2438 1977 7025
D 1894 2445 2984 7323
E 13 45 68 126
F 1079 1445 719 3243
G 1338 1461 1468 4267
H 1295 1622 1512 4429
0 0 0 0
J 1286 725 779 2790
K 3831 3608 2913 10352
L 2090 2225 2458 6773
M 0 0 0 0
N 816 962 492 2270
O 1428 1807 1474 4709
P 1550 1631 1878 5059
Q 2357 2249 2489 7095
El mayor nmero de callos en total, se obtuvo con el medio D, como se puede ver en
la Tabla Nro 3. El ecotipo negro como se puede ver en esta tabla rindi el mayor nmero
de callos. El grfico Nro. 3 (apndice) muestra las variaciones de respuesta de cada
ecotipo.
TABLA Nro. 3. Nmero de caIIos obtenidos 2 meses despus deI primer subcuItivo
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
36 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
COLOR
MEDIO DE CULT. AMARILLO MORADO NEGRO TOTAL
A 2 3 5 10
B 13 22 22 57
C 19 12 22 53
D 23 28 25 76
E 2 6 5 13
F 18 19 17 54
G 19 19 24 62
H 24 24 19 67
0 0 0 0
J 14 14 14 42
K 25 23 22 70
L 19 29 22 70
M 0 0 0 0
N 11 13 9 33
O 22 24 25 71
P 14 15 18 47
Q 21 23 27 71
TOTAL 246 274 276 796
La Tabla Nro. 4 muestra el nmero de callos por explante en el ecotipo amarillo. El
mayor nmero de callos se logr en el medio K, mientras que en los medios y M no se
obtuvieron callos (grfico Nro. 4, apndice).
La Tabla Nro. 5 muestra el rea total obtenida en cada medio por cada explante en el
ecotipo amarillo. Siendo el medio K el que produjo una mayor rea (grfico Nro. 5).
La Tabla Nro. 6 muestra el nmero de callos por explante en el ecotipo morado. El
mayor nmero de callos se logr en el medio L, mientras que en los medios y M no se
obtuvieron callos (grfico Nro. 6).
La Tabla Nro. 7 muestra el rea total obtenida en cada medio en cada explante en el
ecotipo morado. Siendo el medio K el que produjo una mayor rea (grfico Nro. 7).
La Tabla Nro. 8 muestra el nmero de callos por explante en el ecotipo negro. El
mayor nmero de callos se logr en el medio Q, mientras que en los medios y M no se
obtuvieron callos (grfico Nro. 8).
La Tabla Nro. 9 muestra el rea total obtenida en cada medio en cada explante en el
ecotipo negro. Siendo los medio D y K los que produjeron una mayor rea (grfico Nro.
9).
En 10 de los medios se obtuvieron callos friables, como puede verse en la Tabla Nro.
10, el medio en el que se logr mayor cantidad de callos friables fue el medio K y el
explante en el que se obtuvo mayor cantidad de callos friables fue la raz (E5), tanto en el
4. RESULTADOS
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 37
ecotipo amarillo y morado como en el negro. (Grfico Nro. 10)
Se observ que algunos callos presentaban zonas pigmentadas de negro. El mayor
nmero se present en los explantes E5 (races) tanto en el ecotipo amarillo y morado
como en el negro; y en el medio L, como se puede apreciar en la Tabla Nro. 11.
En los medios C, D, K, L y O se observaron algunos callos completamente negros
tabla Nro. 12 y 12A, grfico Nro. 11 (apndice)
4.2. DETECCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS
Los callos mostraron un porcentaje de humedad de 94%.
4.2.1. GLUCOSINOLATOS
La presencia de las fracciones se observ como una mancha negra como puede
apreciarse en las fotografas. Se observaron dos fracciones que se nominaron como
fraccin 1 y fraccin 2 (Fotografas 2 6).
En 13 de las muestras se observaron dos fracciones de glucosinolatos. En las siete
muestras restantes (M1E2, M1E3, M2E2, M2E3, M2E5, M3E3, y callo negro), se observ
la presencia de la fraccin 1, como puede apreciarse en la Tabla Nro. 13.
4.2.2. ALCALOIDES
En las cromatografas preliminares se observ la separacin de cuatro fracciones al usar
como solvente la solucin Cloroformo:metanol 2:0.12. Las muestras acidificadas
desarrollaron una sola fraccin, mientras que las sin acidificar mostraron cuatro
fracciones.
Los resultados de la primera cromatografa (de todas las muestras) se observan en la
fotografa Nro. 7.
En el extracto lavado de hipoctilos de maca se obtuvieron cuatro fracciones que
fueron positivas tanto para el reactivo de Dragendorff.
Estas fracciones tambin fueron positivas para el reactivo yodoplatinato de potasio,
la fraccin N1 de color amarillo fue la de mayor Rf, y se present en la mancha ms
grande, la fraccin N 2 de color plomizo debajo de sta se halla en cantidades
pequeas. La fraccin N 3 present un color marrn oscuro. La fraccin N 4 que se
encontr en el punto de siembra present un color azul cemento (Fotografa Nro 8).
En la segunda cromatografa de todas las muestras, se observ la presencia de las
fracciones 1, 3 y 4, la segunda fraccin no se observ en ninguna de las muestras,
incluyendo el extracto patrn, (fotografa Nro.9).
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
38 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
Al observar la cromatoplaca en la lmpara de luz ultravioleta, los patrones de
extractos de callos presentaron una gran cantidad de fracciones de metabolitos
mostrando patrones diferentes para cada muestra (Fotografa Nro 10). Las fracciones
correspondientes a los alcaloides no mostraron fluorescencia.
4.3. DETECCIN DE MIROSINASAS
Se observ un patrn de una sola banda por muestra (foto), las bandas se observaron
demasiado cerca del borde superior del gel por lo que no se midieron los Rf.
4. RESULTADOS
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 39
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
40 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
5. DISCUSIN
5.1. INDUCCIN DE CALLOS
1. La respuesta a las diferentes concentraciones de hormonas fue variable. La mayor
produccin de callos se obtuvo con los medios K,( 0.5/0.5 M 2,4-D/M KN), D ( 1/0 M
2,4-D/M KN) y Q (10/10 M 2,4-D/M KN) los medios C ( 0.5/0 M 2,4-D/M KN), L (
1/0.5 M 2,4-D/M KN) y P ( 1/1 M 2,4-D/M KN) tuvieron una respuesta menor a los
anteriores pero superior a los dems. Del mismo modo los medios M ( 0/1 M 2,4-D/M
KN) e ( 0/0.5 M 2,4-D/M KN) no produjeron ninguna respuesta callognica, mientras
que el medio E ( 0/0.1 M 2,4-D/M KN) produjo una bajsima respuesta. De todo esto y
de la observacin del comportamiento de los explantes en los dems medios, podemos
inferir que la presencia del 2,4-D es de mayor importancia para la induccin de callos que
la KN, siendo inclusive suficiente para la callognesis. Esta observacin es congruente
con el anlisis estadstico realizado para esta prueba, el cual nos muestra que el 2,4-D
tiene un efecto estadsticamente significativo en la induccin de callos. Siendo su
significancia mayor que la de la auxina y la interaccin de ambas hormonas. Este
dominancia ya fue seala da en otras ocasiones, Dodds ( 1982) hace referencia a su uso
junto con el agua de coco para inducir la proliferacin celular, al parecer esta alta
eficiencia del 2,4-D en la induccin de callos se debe a la alta disponibilidad de auxinas
en los tejidos de la mayora de las dicotiledneas ( Jacobsen, 1983)
5. DISCUSIN
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 41
2. En crucferas, los callos son generalmente iniciados y mantenidos en medios que
presentasn una relacion auxina, citoquinina mayor que 1. en nuestro caso en presencia
de la KN, la concentracin de 2,4-D que dio mejores resultados fue la de 0.5 M, ya que
en concentraciones mayores el rendimiento del medio disminuye, aun cuando la relacin
con la citoquinina es 1/1. Por otro lado, podemos ver que la presencia de la KN potencia
la efectividad del 2,4-D siempre y cuando su concentracin no exceda la del 2,4-D, pues
en estos casos el rendimiento del medio disminuye. Esta disminucin de la actividad
podra estar relacionada a la toxicidad del 2,4- D, pues como reportan Carew y Krueger
(1977, citados por Yerman. 1980 ) tiene efectos inhibitorios a concentraciones de 1 mgr.
por litro. De la misma la disminucin en la produccin de callos cuando la relacin
auxina/citoquinina disminuye pueden explicarse por la actividad inhibitoria que tienen las
citoquininas cuando se presentan en altas concentraciones (Yeoman y Forsche, 1980).
3. El medio que produjo mayor nmero de callos fue el medio D, seguido por los
medios O, Q, K y L, el rendimiento de masa en los medios D y Q est relacionado al
nmero de callos generado ms que al tamao de los mismos. La significancia de cada
una de las hormonas en el nmero de callos producidos es mayor para el 2,4-D que para
la KN, sin embargo la combinacin de ambas hormonas no tiene un efecto significativo
en el nmero de callos obtenidos. (ver apndice: anlisis estadstico) lo cual nos indicara
que cuando el objetivo es lograr un mayor nmero de lneas celulares quiz sera
conveniente experimentar con una sola hormona, especialmente el 2,4 D.
4. La mayor efectividad del 2,4 D corresponde a la esperada, pues es congruentes
con los resultados obtenidos por Carhuaz en Lepidium peruvianum (1997, sin publicar) y
por los resultados obtenidos en el cultivo de tejidos de diferentes especies de la familia
Cruciferae. (Flick y colb. 1983)
5. La respuesta de los ecotipos a cada uno de los medios de cultivo no fue uniforme,
como puede observarse en los grficos 2C, 2D y 2E, siendo el ecotipo negro el que
presento mayor diferencia, sin embargo estas diferencias no son demasiado grandes.
6. La masa de callos obtenidas en cada uno de los ecotipos fue mayor en el medio K
en todos los casos, mientras que los medios con los que se obtuvo un mayor nmero de
callos fue diferente para cada ecotipo (K, L y Q para amarillo, morado y negro
respectivamente) lo que nos muestra que la respuesta de los explantes respecto al
nmero de callos por explante no es uniforme. Al analizar la respuesta de los explantes
por ecotipo, se ha observado que las races tienen una respuesta significativamente
diferente a los otros explantes. Mientras que para la respuesta de los explantes en
relacin del rea ocupada por los callos se observa una respuesta descendente de raz a
hoja. Es as que en ambos casos las races son los tejidos de mayor potencial
callogentico.
7. El medio A no contiene hormonas, sin embargo en este medio se produjo una
pequea cantidad de callos, estos podran deberse a la presencia de hormonas
endgenas en este explante que permiten la callognesis como respuesta al corte, esto
sera coherente con la observacin de que este es el explante que produce mayor
nmero y masa de callos en todos los ecotipos y medios y al hecho de que en las races
se producen auxinas endgenas (Hopkins 1999).
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
42 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
8. No se observaron diferencias significativas entre los dos tipos de explantes de
hoja, lo cual es coherente con los resultados obtenidos en otros trabajos, de otro lado el
medio Q fue el que produjo el mayor nmero de callos en estos explantes.
9. Los peciolos e hipoctilos tuvieron una respuesta mucho mayor a los tratamientos
siendo el hipoctilo el ms susceptible de los dos, esto tendra relacin con la presencia
de tejido meristemtico en este explante.
10. El medio que produjo mayor cantidad de explantes friables fue el medio K,
aunque la cantidad obtenida de este tipo de callos fue bastante pequea, lo cual se
podra deber a una predisposicin de la especie o al tipo de actividad de las hormonas
usadas, de todos modos a diferencia del nmero de callos obtenido y el rea ocupada por
los callos, en este caso puede observarse que la interaccin de las hormonas tiene un
efecto ms significativo que el de las hormonas solas.
11. Los explantes que produjeron la mayor cantidad de callos friables fueron los
provenientes de las races, mientras que los provenientes de los hipoctilos produjeron
menor cantidad de callos friables que los pecolos, siendo igual que en los explantes de la
regin terminal de la hoja. En este caso no se observaron diferencias significativas entre
los explantes de hoja terminal y proximal, aunque el menos susceptible fue el explante
proximal. Si bien la raz y el hipoctilo produjeron mayor nmero de callos friables, la
diferencia entre ambos explantes no fue significativa.
12. El efecto del color del ecotipo en la obtencin de callos friables fue
significativamente diferente para el color amarillo, mientras que entre el ecotipo morado y
negro, las diferencias no fueron significativas.
13. La presencia de callos con pigmentacin negra puede explicarse por la presencia
de metabolitos secundarios en los callos, el nmero obtenido en los explantes
provenientes del ecotipo amarillo fue similar al obtenido del ecotipo negro, y ambos
fueron superiores a la cantidad obtenida en el ecotipo morado, por otro lado la cantidad
de callos totalmente negros obtenido en el ecotipo morado fue mucho mayor que en los
ecotipos negro y amarillo. Esto nos indicara que esta pigmentacin no est relacionada
con el color del ecotipo del que proviene el explante.
5.2. DETECCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS
14. Los callos de Lepidium peruvianum Ch. s producen glucosinolatos. Pero la
produccin de estos metabolitos vara de acuerdo al callo, pudiendo ser mayor o menor.
Se encontraron callos en los que se formaron solo una de las fracciones. Esto demuestra
que el cultivo de callos de maca, puede ser utilizado para hallar lneas que produzcan un
solo tipo de glucosinolato, o los produzcan en cantidades mayores a las obtenidas en
campo.
15. Los explantes provenientes de peciolo(E3) y de la parte proximal de la hoja (E2)
mostraron una sola fraccin de glucosinolatos en casi todos los casos, esto sugerira que
el origen de los explantes estara involucrado en la cantidad y tipo de glucosinolatos
5. DISCUSIN
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 43
producidos. Para poder comprobar esta posibilidad se tendra que realizar pruebas con
un tamao de muestra estadsticamente significativa.
16. El origen de los explantes no parece ser la causa de la variabilidad de la
produccin de callos. Pues los callos con diferentes patrones cromatogrficos provienen
de diferentes tipos de explante y de plntulas de diferentes ecotipos. Sin embargo en este
caso tambin se observa una variabilidad alta en el explante E5.
17. Los Rf de cada una de las fracciones es muy similar pero no igual para cada
extracto, esto puede deberse a que, por el tamao de la cmara, las muestras no se
pudieron desarrollar en una sola cromatografa por lo que no estuvieron sujetas a
condiciones idnticas.
18. El mayor tamao de las manchas de glucosinolatos en los extractos de callo,
indican una mayor concentracin del metabolito en stos. Esto nos brinda muy buenas
expectativas para su produccin in vitro.
19. En los cromatogramas de glucosinolatos se observan manchas dbiles a lo largo
del cromatograma, estas manchas fueron asumidas como porciones de glucosionatos la
por la mirosinasa, (Kjaer, 1970). Sin embargo, Genyi y col. reportaron en el ao 2001, la
presencia de otros glucosinolatos en maca, si bien en pequeas cantidades. Debido a
esto estas no podemos asegurar que manchas correspondan a artefactos o a esos
glucosinolatos.
20. Los patrones cromatogrficos de alcaloides muestran una gran variabilidad, as
como los patrones de los metabolitos con fluorescencia a la luz UV, esto nos indicara
que los callos tienen una gran variabilidad respecto a su produccin de metabolitos, lo
que sera de gran utilidad en el caso de necesitarse la explotacin de alguno de estos.
Los extractos que mostraron una presencia notablemente mayor de una de las fracciones
de alcaloides fueron los de los callos M3E3 y M3E4.
21. La fraccin N 2 del extracto de alcaloides, no es detectable cuando se
cromatografiaron cantidades pequeas de extracto, por lo que su ausencia en la
cromatografa de los extractos de callos y controles no indican ausencia necesaria del
metabolito.
22. El hecho de que algunos extractos de callos muestren mayor presencia de
algunas fracciones de callos y dada la pequea cantidad en la que parecen encontrarse
en los hipoctilos, el cultivo de callos o suspensiones celulares puede ser utilizada para
lograr mayores cantidades que permitan el estudio de las propiedades y actividad
biolgica de estos compuestos.
23. La poca cantidad de alcaloides que presenta la planta, puede ser aumenta en el
cultivo de tejidos utilizando callos con mayor tiempo de incubacin, pues, la produccin
de metabolitos secundarios aumenta al iniciarse la fase estacionaria (Yeoman y colb.
1980), y la de los alcaloides es inversamente proporcional a la tasa de crecimiento
(Carew y Krueger, 1977). Esta propiedad debe ser tomada en cuenta tanto en el caso de
desear producir alcaloides como otros metabolitos.
24. El hecho de que en algunos callos se observe manchas mas intensas que en el
hipoctilo y que en otros casos se observen fracciones que no se presentan en las
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
44 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
muestras de hipoctilos, nos indicara el gran potencial de la planta, pues usualmente los
cultivos de tejidos vegetales producen metabolitos en pequeas cantidades (Yanadi y
Fujita, 1983), por otro lado la alta variabilidad de la produccin de metabolitos merece que
se realicen investigaciones posteriores para determinar si estas variaciones son
fisiolgics o genticas, dado del potencial mitognico del 2,4-D y el aumento de la
variabilidad producido por la tcnica de cultivo de tejidos (Reisch, 1983).
5.3. DETECCIN DE MIROSINASAS
25. La deteccin de mirosinasas fue cualitativa, con la finalidad de determinar nicamente
la presencia de mirosinasas en los callos e hipoctilos, pues para una evaluacin
cuantitativa, se requerira de mayores estudios de la presencia de esta enzima en esta
especie.
26. El que las bandas de mirosinasas no migraran mucho ms all de la parte
superior del gel, a pesar de dejarlas correr por encima del tiempo requerido de acuerdo a
la migracin del frente de corrida, nos indicara que estas protenas tienen un gran peso
molecular, esto estara en concordancia con los resultados obtenidos por MacGibbon y
Allison (1970) en otras especies y a la vez nos indicara que la mirosinasas de maca son
mas grandes que las de otras especies estudiadas.
5. DISCUSIN
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 45
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
46 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
6. CONCLUSIONES
1. Lepidium peruvianum es susceptible a la induccin de callos con auxinas y
citoquininas.
2. La auxina 2,4-D es eficiente en la induccin de callos, siendo su concentracin
ptima la de 0.5 M.
3. La relacin ptima 2,4-D/KN es de 1
4. El comportamiento de los callos de L. peruvianum es altamente variable respecto a
la presencia de metabolitos secundarios.
5. Lepidium peruvianum es una especie que presenta condiciones ptimas para
realizar estudios de produccin de metabolitos secundarios in vitro.
6. La enzima mirosinasa s est presente en los callos y plantas de campo de L.
peruvianum. Estas enzimas son de gran tamao molecular.
6. CONCLUSIONES
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 47
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
48 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
7. RECOMENDACIONES
1. Recomendamos iniciar un estudio del metabolismo secundario de callos de L.
peruvianum, "maca que nos permita determinar los factores que induzcan la produccin
de metabolitos in vitro.
2. Tambin es necesario profundizar el estudio de alcaloides de maca, para
determinar la estructura y actividad biolgica de los mismos.
3. Realizar estudios histoqumicos que determinen la distribucin de los
glucosinolatos y mirosinasas en la planta.
4. Sera recomendable realizar la caracterizacin de las mirosinasas de L.
peruvianum y compararlas con las descritas en otras especies.
7. RECOMENDACIONES
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 49
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
50 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
BIBLIOGRAFA
ALIAGA, R. 1995. Biologa Floral de la Maca (Lepidium meyenii Walp.) Tesis
departamento de Horticultura, Facultad de Agronoma, Universidad Nacional Agraria
La Molina. Lima.
ALIAGA, R. 1999. Gua para el cultivo, aprovechamiento y conservacin de la maca
(Lepidium meyenii) Convenio Andrs Bello. Santaf de Bogot.
ARBIZU, C., HERMAN, M. 1995. Algunos factores limitantes en el uso de Races y
Tubrculos Andinos y sus prioridades de investigacin. Taller Internacional sobre el
Agrosistema Andino. Lima, marzo - abril 1992. pp 223 -229.
BECKER, H. 1987. Regulation of secondary metabolism in plant cell cultures. En Plant
Tissue and Cell Culture, (Ed. por C.E.Green, D.A. Somers, W.P. Hackett y D.D.
Biesboer). Alan R. Liss. Inc. New York.
BONES M. Y ROSSITER J. 1996. The Myrosinase - Glucosinolate System, Its
Organisation and Biochemistry. Physiologia Plantarum. 97: 194 - 208.
CASTRO DE LEON, M. 1990. Un Cultivo en Extincin: El Caso de la Maca. Per Indig.
12(28): 85-94.
CHACON, G. 1961. Estudio Fitoqumico de Lepidium meyenii Walp. Tesis de Bachiller
en Ciencias Biolgicas, Facultad de Ciencias de Universidad Nacional Mayor de San
Marcos. Lima.
CHACON DE POPOVICH, G. 1990. La maca (Lepidium peruvianum Chacn sp. nov.) y
BIBLIOGRAFA
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 51
su hbitat. Rev. Per. Biol. 3(2):169-272.
CHAPPLE C., SHIRLEY B., SOOK M., HAMMERSCHMIDT R., SOMERVILLE S. 1994.
Secondary Metabolism in Arabidopsis. En Arabidopsis ( Ed. E. M. Meyerowitz y C.R.
Somerville) Cold Spring Harbor Laboratory Press. Pp 989 1029.
DAXENBINCHLER M., Van ETTEN C.H., BROWN, F. y QUENTIN J. 1964.
Oxazolidinethiones and Volatile Isothiocyanates in Enzyme-Treated Seed Meal from
65 Species of Cruciferae. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 12 (2):127-130.
DINI, A.; MIGLIUOLO, G.; RASTRELLI, L.; SATURNINO, P.; SCHETTINO, O. 1994.
Chemical composition of Lepidium meyenii. Food Chemistry. 49: 347-349.
DODDS, J. H. y ROBERTS, L. W. 1982. Experiments in Plant Tissue Culture.
Cambridge University Press. N. Y.
FLICK, C.E., EVANS, D. A., y SHARP W. R. 1983. Organognesis. En: Handbook of
Plant Cell Culture. Vol. 1. ( Ed. por D. A. Evans, W. R. Sharp, P. V. Amirato,
Y.Yamada). Collier Macmillan Publishers. Londres. Pp. 13 - 81.
FREIFELDER. 1979. Mtodos y tcnicas en bioqumica. Ed. Revert. Barcelona.
GALVEZ M.E. 1990. Electroforesis de isoenzimas y protenas totales en clones de
Ullucus tuberosus Loz. olluco. Informe de prcticas pre-profesionales para optar el
ttulo de bilogo en la especialidad de gentica. UNMSM. Lima.
GAMBORG, L. O. Y SHYLUK J. P. 1981. Nutrition, Media and Characteristics of Plant
Cell and Tissue Culture. En: Plant Tissue Culture. Methods and Applications in
Agriculture. (Ed. T. A. Thorpe). Academic Press. N.Y.
GARFIN, D. 1990. One - Dimensional Gel Electroforesis. En Methods in Enzimology.
Vol 182. Guide to Protein Purification. (Ed. por M. Deutscher). Academic Press.
California.
GARRO, V., LEON, E., JULCA, B. 1993. Extraccin, separacin e identificacin por
cromatografa de alcaloides de Lepidium meyenii Walp. ("Maka"). Instituto de
Qumica Orgnica Aplicada a la Farmacia y Bioqumica. UNMSM. VI Congreso
Peruano de Farmacia y Bioqumica.
GENYI L., AMMMERMANN, U., y QUIROS, C. 2001. Glucosinolate contents in maca
(lepidium peruvianum Chacn) seeds, sprouts, mature plants and several derived
products. Ecomomyc Botany 55 (2):255 262.
GRESSHOFF, P. and MOHAPATRA, S. 1981.Legume Cell and Tissue Culture. En
Tissue Culture of Economically Important Plants. Proceedings Of The International
Symposium Held at National University Of Singapore. Singapore.
HARA, Y. 1996. Research on the Production of Useful Compounds by Plant Cell
Cultures in Japan. En Plant Cell Culture and Secondary Metabolism. CRC Press
HOPKINS, W. 1999. Introduction to Plant Physiology. 2nd Ed. John Wiley & Sons. New
York.
JACOBSEN H.J. 1983. Biochemical mechanisms of plant hormona activity. En:
Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 1. (Ed. por D. A. Evans, W. R. Sharp, P. V.
Amirato, Y.Yamada). Collier Macmillan Publishers. Londres.
JAIME, J.A. 1994. Los tubrculos y granos andinos en el Per. Folleto UNAS. Tingo
Mara.
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
52 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
JOHNS, T. 1980. Ethnobotany and phytochemistry of Tropaeolum tuberosum and
Lepidium meyenii from Andean South America. Faculty of graduate Studies
University of British Columbia.
JOSEFSSON, E. 1967.Distribution of Thioglucosides in different parts of Brassica
Plants. Phytochemistry, Vol. 6. Pp. 1617 1627.
KING. S. R. 1987. Four Endemic Andean tuber Crops: Promising Food Resources for
Agricultural Diversification. Mountain Research and Development. 7(1):43-52.
KING, S. R. 1988. Economic Botany of the Andean tuber Crop Complex: Lepidium
meyenii, Oxalis tuberosa, Tropaeolum tuberosum, and Ullucus Tuberosus. Thesis for
Doctor of Philosophy. NY
KJAER, A. 1968. Glucosinolates in Lepidium bonaeriense L. Phytochemistry 7:1663
-1666.
KJAER, A. 1970. Glucosinolates in Some New World Species of Capparidaceae.
Phytochemistry. Vol 9. Pp 601 602.
KJAER, A. 1970. Glucosinolates in the Caricaceae. Phytochemistry. Vol 9. pp 591- 593.
KJAER, A. 1973. The Natural Distribution of Glucosinolates: A Uniform Group of
Sulphur - Containing Glucosides. Nobel 25. Chemistry in Botanical Classification: 229
- 234.
KRIKORIAN, A. D. 1991. Medios de cultivo: generalidades, composicin y preparacin.
En: Cultivo de Tejidos en la Agricultura. (Ed. por W. M. Roca y L. A. Mroginski). CIAT.
Cali. Pp 41 78.
LAEMMLI, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685
LARSEN, P.O. 1981. The biochemistry of plants. Vol 7. Academic Press. 501 - 525.
LEON, J. 1964. Plantas alimenticias andinas. Bol. Tec. del Instituto Interamericano de
Ciencias Agrcolas Zona Andina. Lima. 6: 43 - 46.
LOCK DE UGAZ, O. 1994. Investigacin fitoqumica. Mtodos en el estudio de
Productos naturales. PUCP. Fondo Editorial. Lima.
LOCKWOOD, G.; y BELKHIRI, A. 1991. Glucosinolate Spectrum of Some Algerian
Cruciferae. Pl. Syst. Evol. 176: 11 20.
MACGIBBON, D.B. y ALLISON, R.M. 1970. A method for the separation and detection
of plant glucosinolases (myrosinases). Phytochemistry. Vol 9: 541 544.
MICROSOFT ENCARTA ONLINE ENCYCLOPAEDIA 2001. "Chromatography,"
http://encarta.msn.com 1997-2001 Microsoft Corporation. All rights reserved.
MITHEN R., CLARKE J., LISTER C. y DEAN C. 1995. Genetics of Aliphatic
Glucosinolates. III. Side Chain Structure of Aliphatic Glucosinolates in Arabidopsis
thaliana. Heredity 74: 210-215.
MORRIS, P y ALTOONA, T. 1994. Tissue Culture and Transformation. En Arabidopsis.
(Ed. Por E.M. Meyerowitz y C. R. Somerville). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Portland Or.
NATIONAL RESEARCH COUNCIL. 1989. Lost Crops of the Incas: Little-known plants
of the Andes with Promise for Worldwide Cultivation. National Academy Press.
BIBLIOGRAFA
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 53
Washington, D.C.
NUEZ, P. y OCHOA, A. 2000. In vitro mass Cultivation of Cells and Tissues. En
Molecular Biotechnology for Plant Food Production. (Ed. por O. Paredes Lpez).
Ed. Technomic. Lancaster.
OBREGON, L. 1998. Maca, Planta Medicinal y Nutritiva. Instituto de Fitoterapia
Americano. Lima.
PETIARD, V.; COURTOIS, D.; GUERITTE, F.; LANCLOIS, N. y MOMPON, B. 1982.
New Alkaloids in Plant Tissue Cultures. 5
th
International Congress of Plant Tissue
and Cell Culture. Tokio.
PIAS, J. 1994. Los Tubrculos y Granos Andinos en el Per. Folleto Universidad
Agraria de la Selva.
PIZZA, C.; DE FEO, V.; DE SIMONE, F. RASTRELLI, L. 1998. Qualita Nutrizionali dei
Tuberi Andini. En La Maca Il Ginseng Delle Ande E Altre Radici E Tuberi Andini.
Contributo alla conoscenza e valorizzazione delle risorse vegetali e animali
dellAmerica Latina. Quaderni IILA . Serie scienza. IILA. Roma.
PURRINGTON, C. 2000. Costs of Resistance. Current Opinion in Plant Biology
3:305-308.
QUIROS, C.; EPPERSON, A; HU, J; y HOLLE, M. 1996. Physiological studies and
determination of chromosome number in maca, Lepidium Meyenii (Brassicaceae).
Economic Botany 50(2):216-223.
QUIROS, C. y ALIAGA, R. 1996. Maca Lepidium meyenii Walpers. En Andean Roots
and Tubers: Ahipa, Arracacha, Maca and Yacn. IPGRI. Roma.
QUIROS, C. 1999. Gentica de la maca y especies relacionadas. Curso Taller
Internacional sobre Maca. Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima Per.
RANDERATH, K. 1968. Thin-layer chromatography. Verlag Chemie Academic Press.
Weiheim/Bergstr.
REISCH, R. 1983. Genetic variability in regenerated plants. En: Handbook of Plant Cell
Culture. Vol. 1. ( Ed. por D. A. Evans, W. R. Sharp, P. V. Amirato, Y.Yamada). Collier
Macmillan Publishers. Londres.
ROCA, W. M. Y MROGINSKI, L. A. 1991. Establecimiento de un laboratorio para el
cultivo de tejidos vegetales. En: Cultivo de Tejidos en la Agricultura. (Ed. por W.M.
Roca y L.A. Mroginski). CIAT. Cali. 211 238.
ROBERT, M.L.; REYES, J.; LOYOLA, V.M. 1991. Biosntesis y bioconversin de
metabolitos secundarios por clulas cultivadas in vitro. En: Cultivo de Tejidos en la
Agricultura. (Ed. por W.M. Roca y L.A. Mroginski). CIAT. Cali. 211 238.
RODMAN, J. 1981. Divergence, Convergence, and Parallelism in Phytochemical
Characters: the Glucosinolate-Myrosinase System. En Phytochemistry and
Angiosperm phylogeny. (Ed por Young, D. A. y Seijler D.J). Praeyer Publishers. N.Y.
SCHRIPSEMA, J; FUNG, S; y VERPOORTE,R. 1996. Screening of Plant Cell Cultures
for New Industrially Interesting Compounds. En Plant cell culture secondary
metabolism. Toward Industrial Application. (Ed. Por F. Dicosmo y M. Misawa). CRC.
SZWEYKOWSKA, A. 1974. The Role of Cytokinins in the Control of Cell Growth and
Differentiation in Culture. En Tissue Culture and Plant Science. (Ed. Por H.E. Street).
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
54 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
Academic Press. Londres.
TELLO, J., HERMAN, M., Y CALDERON, A. 1992. La maca (Lepidium meyenii Walp);
cultivo alimenticio potencial para las zonas altoandinas. Boletn de Lima. 81: 59 66.
XENOPHON, H; MACLEOD, J y MOREAU, M. 1981. Glucosinolates of Nine Cruciferae
and Two Capparaceae Species. Phytochemistry . Vol 20. Nro. 10. Pp 2355 2358.
YEOMAN, M & FORCHE,E. 1980. Cell Proliferation and Growth in Callus Cultures.
International review of Cytology, Supplement 11A. 1-24.
YLLESCA, M. 1994. Estudio qumico y fitoqumico comparativo de 3 ecotipos de
Lepidium meyenii Walp. "Maca", procedente de Carhuamayo (Junn). Ctedra en
Bromatologa. Facultad de Farmacia y Bioqumica. Universidad Nacional Mayor de
San Marcos. Lima.
BIBLIOGRAFA
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 55
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
56 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
APNDICE
FOTOGRAFA Nro.1. Primera evaluacin de los explantes a los 25 das de incubacin
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 57
FOTOGRAFA Nro. 2. Callo a los dos meses de incubacin
FOTOGRAFA Nro. 3. Callo despus de dos meses del primer subcultivo
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
58 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
FOTOGRAFA Nro.4. Cromatografa en papel de glucosinolatos en las muestras M1E1,
M1E2, M1E3, M1E4.
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 59
FOTOGRAFA Nro. 5. Cromatografa en papel de glucosinolatos en las muestras M2E1,
M2E2, M2E3, M2E4.
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
60 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
FOTOGRAFA Nro. 6. Cromatografa en papel de glucosinolatos en las muestras M3E1,
M3E2, M3E3, M3E4.
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 61
FOTOGRAFA Nro. 7. Cromatografa en papel de glucosinolatos en las muestras M1E5,
M2E5, M3E5, callo negro.
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
62 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
FOTOGRAFA Nro. 8. Cromatografa en papel de glucosinolatos en las muestras de
hipoctilos y callo blanco.
FOTOGRAFA Nro. 9. Cromatografa preliminar de alcaloides.
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 63
FOTOGRAFA Nro. 10. Cromatografa comparada de alcaloides, revelados con el reactivo
de Dragendorff y reactivo yodoplatinado.
FOTOGRAFA Nro. 11. Cromatografa de alcaloides
1 = M1E1, 2 = M1E2, 3 = M1E3, 4 = M1E4, 5 = M1E5, 6 = M2E1, 7 = M2E2, 8 =
M2E3, 9 = M2E4, 10 = M2E5, 11 = M3E1, 12 = M3E2, 13 = M3E3, 14 = M3E4, 15 =
M3E5, 16 = Hipoctilo amarillo, 17 = Hipoctilo morado, 18 = Hipoctilo negro. Callo
negro = callo pigmentado totalmente, callo blanco = callo sin ninguna pigmentacin. E =
extracto etreo de hipoctilos de maca.
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
64 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
FOTOGRAFA Nro. 12. Cromatograma expuesto a la luz uv. mostrando la presencia de
diferentes metabolitos.
1 = M1E1, 2 = M1E2, 3 = M1E3, 4 = M1E4, 5 = M1E5, 6 = M2E1, 7 = M2E2, 8 =
M2E3, 9 = M2E4, 10 = M2E5, 11 = M3E1, 12 = M3E2, 13 = M3E3, 14 = M3E4, 15 =
M3E5, 16 = Hipoctilo amarillo, 17 = Hipoctilo morado, 18 = Hipoctilo negro. Callo
negro = callo pigmentado totalmente, callo blanco = callo sin ninguna pigmentacin. E =
extracto etreo de hipoctilos de maca.
FOTOGRAFA Nro. 13. Patrones de bandas de electroforesis de mirosinasas de callos e
hipocotilos.
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 65
GRAFICO Nro 1. rea total de los callos sobre una cuadricula milimetrada.
GRAFICO Nro 2A. rea total ocupada por los callos sobre una cuadricula segn el medio
de cultivo.
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
66 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
GRAFICO Nro 2B. rea total ocupada por los callos en una cuadricula milimetrada segn
el color.
GRAFICO Nro 3. Numero de callos obtenidos en los diferentes colores de maca.
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 67
GRAFICO Nro 4. Numero de callos obtenidos. ecotipo amarillo.
GRAFICO Nro 5. rea total ocupada por los callos sobre una cuadricula milimetrada.
ecotipo amarillo.
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
68 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
GRAFICO Nro 6. Numero de callos obtenidos. ecotipo morado.
GRAFICO Nro 7. rea total ocupada por los callos sobre una cuadricula milimetrada.
ecotipo morado.
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 69
GRAFICO Nro 8. Numero de callos obtenidos. ecotipo negro.
GRAFICO Nro. 9. Numero de callos friables por explante y color.
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
70 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
GRAFICO Nro. 10. Numero de callos negros obtenidos por explante y ecotipo.
FACTORIAL DE MEDIOS DE CULTIVO.
REGULADORES DE
CRECIMIENTO
KIN
0 M 0.1 M 0.5 M 1 M 10 M
0 M A E M -
0.1 M B F J N -
2.4-D 0.5 M C G K O -
1 M D H L P -
10 M - - - - Q
FACTORIAL DE MEDIOS DE CULTIVO
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 71
2,4-D KIN
(uM) (uM)
A 0.0 0.0
B 0.1 0.0
C 0.5 0.0
D 1.0 0.0
E 0.0 0.1
F 0.1 0.1
G 0.5 0.1
H 1.0 0.1
0.0 0.5
J 0.1 0.5
K 0.5 0.5
L 1.0 0.5
M 0.0 1.0
N 0.1 1.0
O 0.5 1.0
P 1.0 1.0
Q 10.0 10.0
COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG (1962)
CONSTITUYENTES mM Mg/It
MACRONUTRENTES
KNO3 18.8000 1900.00
NH4NO3 20.6000 1650.00
CaCl2.2H2O 3.0000 440.00
MgSO4.7H2O 1.5000 370.00
KH2PO4 1.2500 170.00
MCRONUTRENTES
MnSO4.4H2O 0.1000 22.30
ZnSO4.7H2O 0.0300 8.60
H3BO3 0.1000 6.30
K 0.0050 0.8300
NA2MoO2.2H2O 0.0010 0.2500
CoSO4.6H2O 0.0001 0.0250
CuSO4.5H2O 0.0001 0.0250
FeSO4.7H2O 0.1000 27.80
Na2EDTA 0.1000 37.30
FUENTE: Laboratorio de Recursos Genticos y Biotecnologa - UNMSM.
COMPOSICIN ANALTICA DE MACA
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
72 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
%
Agua 10.4
Protenas 10.2
Lpidos 2.2
Carbohidratos 59
Fibra 8.5
Ceniza 4.9
FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L.1998. ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI
ANDINI. En La maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa
. Serie Scienza 10. Roma
COMPOSICIN MINERAL DE MACA (mg/ 100 g de materia seca)
Mg/100 g
Fe 16.6
Mn 0.8
Cu 5.9
Zn 3.8
Na 18.7
K 2050
Ca 150
FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L. 1998. ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI
ANDINI. En La maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa
. Serie Scienza 10. Roma
COMPOSICIN AMINOACDICA Y CALIDAD PROTEICA DE "MACA"
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 73
Aminocido (Rt,
min)
mg/g protena Aminocidos
esenciaIes patrn de
Ia FAO-OMS 1973
Indice
qumico
mg/g
protena
Acido Asprtico
(2.7)
91.7 - -
Acido Glutmico
(4.0)
156.5 - -
Serina (10.1) 50.4 - -
Histidina (14.2) 21.9 - -
Glicina (15.1) 68.3 - -
Treonina (15.7) 33.1 40 83
Arginina (22.5) 99.4 - -
Alanina (24.5) 63.1 - -
Tirosina (25.2) 30.6
} 60 143
Fenialanina (37.8) 55.3
Metionina (30.8) 28 35 80
Valan (31.3) 79.3 50 158
soleucina (35.7) 47.4 40 118
Leucina (38.1) 91 70 130
Lisina (47.0) 54.5 55 99
Triptofano n.d. 10 n.d.
OH-prolina (33.8) 26.6 - -
Prolina (43.1) 0.5 - -
FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L.1998. ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI
ANDINI. En La maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa
. Serie Scienza 10. Roma
PROTOCOLO DE EXTRACCIN Y CROMATOGRAFA EN PAPEL DE
GLUCOSINOLATOS
Extraccin
Macerar las muestras en etanol al 96% por 3 das como mnimo.
Filtrar
Guardar la solucin y con el residuo hacer una nueva extraccin con etanol.
Filtrar y guardar con la solucin anterior.
Cromatografa en papeI
Cortar las hojas de papel de 11 x 29 cm. Hacer tres dobleces a 2, 4 y cm del borde
del papel para que sirvan de soporte de la hoja en el tanque de cromatografa.
A 5 cm del borde hacer una marca con lpiz y hacer pequeas equis en ella donde se
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
74 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
va a sembrar la muestra.
Colocar una alicuota de cada muestra en cada marca, dejar secar, repetir 40 veces.
Colocar los papeles en las bandejas de soporte del tanque de cromatografa, y
sujetar con las varillas respectivas. Agregar el solvente a las bandejas y tapar
hermticamente el tanque.
Dejar desarrollar durante la noche.
Retirar del tanque de cromatografa y secar.
Pulverizar con una solucin de nitrato de plata: acetona 15 mg/ml, dejar secar unos
minutos
Pulverizar con una solucin de KOH: Etanol 20 mg/ml, dejar secar unos minutos.
Colocar los cromatogramas en una estufa caliente.
Retirar de la estufa cuando se forman las manchas negras, (indicadoras de la
presencia de glucosinolatos).
Sumergir en una solucin de hiposulfito de potasio al 5% por 20 - 24 para decolorar.
Secar
Fotocopiar inmediatamente.
Preparacin deI soIvente
Hacer una solucin de n-butanol:etanol:agua 4:1:4 en una pera de decantacin.
La mezcla se realiza en orden: mezclar primero el n-butanol y el etanol, agitar y
agregar el agua, agitar bien y dejar reposar sin mover 24 hr.
Se obtienen dos fases: una acuosa y una orgnica (superior), desechar la fase
acuosa.
Preparacin deI reveIador
Solucin de nitrato de plata: acetona (para 100 ml.)
Preparar una solucin saturada de nitrato de plata y agua: diluir 1.5 gr. de nitrato de
plata en 0.5 ml. de agua destilada, si no se disuelve calentar ligeramente a bao
Mara
Disolver en 80 ml. de acetona y agregar agua destilada hasta disolver el precipitado
que se haya formado.
Usar inmediatamente.
SoIucin de hidrxido de potasio: etanoI. SoIucin aI 2% (para 100 mI)
Disolver 2 gr de KOH en 0.5 ml de agua destilada y completar a 100 ml con etanol.
Preparacin de la solucin de hiposulfito de sodio al 5% (decolorante)
Disolver 2 gr de hiposulfito de sodio en 400 ml de agua destilada.
PROTOCOLO DE EXTRACCIN Y CROMATOGRAFA DE ALCALOIDES
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 75
Extraccin
A. Extracto crudo:
Colocar las muestra estabilizada en un frasco y humedecer con amoniacoy dejar en
oscuridad por 48 hr.
Agregar ter etlico agitar y reposar varios das.
Filtrar o centrifugar.
B. Extracto lavado:
Macerar la muestra con una solucin de agua: etanol (4:1).
Acidificar hasta pH 3 4 con HCl.
Centrifugar o filtra para recuperar la fase acuosa.
Alcalinizar la fase acuosa con NaOH u otro lcali, hasta pH 8 9.
Poner en una pera de decantacin y agregar una cantidad similar de eter etilico,
agitar y recuperar la fase orgnica.
Repetir esta extraccin.
Cromatografa de capa fina ascendente.
Sembrar las muestras en un cromatograma de silicagel
Colocar el solvente en el tanque de cromatografa de capa fina ascendente, cerrar
hermticamente y dejar saturar.
Colocar la cromatoplaca en el tanque, cerrar hermticamente y dejar desarrollar.
Cuando el solvente llega al tope de la placa, sacar la cromatoplaca del tanque, dejar
secar y pulverizar con el revelador.
Preparacin deI soIvente
Mezclar en el tanque de cromatografa cloroformo:metanol u otra sol en las
proporciones adecuadas en nuestro caso la proporcin fue 2: 0.12.
Preparacin deI reveIador
Reactivo de Dragendorff (modificado por Munnier)
SOLUCN . Disolver 17 gr de subnitrato de bismuto y 200 gr. de cido tartrico en
800 ml de agua destilada.
SOLUCN . Disolver 160 gr de yoduro de potasio en 400 ml de agua destilada.
Mezclar las soluciones y en una proporcin 1: 1
PARA USAR: disolver 100 gr. De cido tartrico en 50 ml de esta mezcla y 500 ml de
agua destilada.
El stock puede almacenarse durante meses. La solucin diluida puede almacenarse
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
76 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
por unas semanas.
Reactivo YodopIatinado
Diluir 3ml de cido cloroplatnico al 10% en 97 ml de agua destilada.
Agregar 100 ml de solucin de yoduro de potasio al 6%.
Este reactivo puede almacenarse por largo tiempo.
ANLISIS ESTADSTICO
ANLISIS de varianza para efectos fijo con medidas repetidas
DISEO DE DOS FACTORES
PARA EL EFECTO DE LOS MEDIOS EN LA MASA TOTAL DE CALLOS OBTENIDOS
i Para el factor 2,4-D
Ho:
1=
:
2=
:
3=
:
4=
0
H1:Al menos un i diferentede cero i = 1, 2, 3, 4
i Para el factor KN
Ho
1
=
2
=
3
=
4
=0
H1 Al menos una
i
diferente a cero i = 1, 2,3,4
Para el factor 2,4-D * KN
Ho: ( )ij = 0
H1 Al menos una ( )ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crtico =9.36
Regin crtica
Fcal >F crtico el tratamiento estadsticamente significativo existe efecto
*estadsticamente significativo existe efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NMERO DE CALLOS OBTENIDO
Hiptesis
i Para el factor 2,4-D
Ho:
1=
:
2=
:
3=
:
4=
0
H1:Al menos un i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
i Para el factor KN
Ho
1=
=
2
=
3
=
4
=0
H1 Al menos una
i
diferente a cero i =1, 2, 3,4
Para el factor 2,4-D * KN
Ho: ( )ij= 0
H1 Al menos una ( )ij diferente a cero
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 77
Nivel de significancia d =0.05 F crtico =9.36
Scua gI mcua f
ss2,4-D 3071 3 1024 29.3*
ssKN 112.5625 3 37.5208333317*
ssinter 284 9 94.673611112.705639747
sserrores 11197 32 349.9121094
sst 14665 47
Regin crtica
Fcal >F crtico el tratamiento estadsticamente significativo existe efecto
*estadsticamente significativo existe efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL
ECOTIPO AMARILLO
Hiptesis
i Para el factor 2,4-D
Ho:
1=
:
2=
:
3=
:
4=
0
H1:Al menos un i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
i Para el factor KN
Ho
1=
=
2
=
3
=
4
=0
H1 Al menos una
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KN
Ho: ( )ij= 0
H1 Al menos una ( )ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crtico =9.36
Regin crtica
Fcal >Critico el tratamiento estadsticamente significativo existe efecto
*estadsticamente significativo existe efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL REA OCUPADA POR LOS CALLOS EN
EL ECOTIPO AMARILLO
Hiptesis
i Para el factor 2,4-D
Ho:
1=
:
2=
:
3=
:
4=
0
H1:Al menos un i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
i Para el factor KN
Ho
1=
=
2
=
3
=
4
=0
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
78 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
H1 Al menos una
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KN
Ho: ( )ij= 0
H1 Al menos una ( )ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crtico =9.36
Regios crtica
Fcal >F crtico el tratamiento estadsticamente significativo existe efecto
*estadsticamente significativo existe efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL
ECOTIPO MORADO
Hiptesis
i Para el factor 2,4-D
Ho:
1=
:
2=
:
3=
:
4=
0
H1:Al menos un i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
i Para el factor KN
Ho
1=
=
2
=
3
=
4
=0
H1 Al menos una
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KN
Ho: ( )ij= 0
H1 Al menos una ( )ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crtico =9.36
scua gI mcua f
ss2,4-D 213 3 71 31*
ssKN 8 3 3 1
ssinter 50 9 17 7
sserrores148 32 2
sst 419 47
Regin crtica
Fcal >F crtico el tratamiento estadsticamente significativo existe efecto
*estadsticamente significativo existe efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL REA OCUPADA POR LOS CALLOS EN
EL ECOTIPO MORADO
Hiptesis
i Para el factor 2,4-D
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 79
Ho:
1=
:
2=
:
3=
:
4=
0
H1:Al menos un i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
i Para el factor KN
Ho
1=
=
2
=
3
=
4
=0
H1 Al menos una
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KN
Ho: ( )ij= 0
H1 Al menos una ( )ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crtico =9.36
scua gI mcua f
ss2,4-D 3E+063 875861 14*
ssKN 1E+053 49762 1
ssinter 6E+059 189788 3
sserrores4E+0664 64090
sst 7E+0647
Regin crtica
Fcal >F crtico el tratamiemto estadsticamente significativo exlste efecto
*estadsticamente significativo exlste efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL
ECOTIPO NEGRO
Hiptesis
i Para el factor 2,4-D
Ho:
1=
:
2=
:
3=
:
4=
0
H1:Al menos un i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
i Para el factor KN
Ho
1=
=
2
=
3
=
4
=0
H1 Al menos una
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KN
Ho: ( )ij= 0
H1 Al menos una ( )ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crtico =9.36
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
80 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
scua gI mcua f
ss2,4-D 207 3 69 38*
ssKN 13 3 4 15*
ssinter 17 9 6 4
sserrores927 64 14
sst 1165 47
Region crtica
Fcal >F crtico el tratamiemto estadsticamente significativo exlste efecto
*estadsticamente significativo exlste efecto
EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL REA OCUPADA POR LOS CALLOS EN
EL ECOTIPO NEGRO
Hiptesis
i Para el factor 2,4-D
Ho:
1=
:
2=
:
3=
:
4=
0
H1:Al menos un i diferentede cero i =1, 2, 3, 4
i Para el factor KN
Ho
1=
=
2
=
3
=
4
=0
H1 Al menos una
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KN
Ho: ( )ij= 0
H1 Al menos una ( )ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crtico =9.36
scua gI mcua f
ss2,4-D 2E+06 3E+00 8E+05 60*
ssKN 3E+05 3E+00 1E+05 70*
ssinter 2E+06 9E+00 8E+05 50*
sserrores 9E+05 6E+01 1E+04
sst 6E+06 5E+01
Region crtica
Fcal >F crtico el tratamiemto estadsticamente significativo exlste efecto
*estadsticamente significativo exlste efecto
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NMERO DE CALLOS
OBTENIDOS EN EL ECOTIPO AMARILLO
Multiple Comparisons
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 81
Dependent Variable: TABLA4
Tukey HSD
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
() N (J) N
E1 E2 1.0625 .7611 .632
E3 -.4375 .7611 .978
E4 -.6250 .7611 .923
E5 -1.5625 .7611 .005
E2 E1 -1.0625 .7611 .632
E3. -1.5000 .7611 .290
E4. -1.6875 .7611 .185
E5. -2.6250 .7611 .008
E3 E1. .4375 .7611 .978
E2. 1.5000 .7611 .290
E4. -.1875 .7611 .999
E5. -1.1250 .7611 .000
E4 E1. .6250 .7611 .923
E2. 1.6875 .7611 .185
E3. .1875 .7611 .999
E5. -.9375 .7611 .000
E5 E1. 1.5625 .7611 .005
E2. 2.6250 .7611 .008
E3. 1.1250 .7611 .000
E4 .9375 .7611 .000
* Estadsticamente significativo existe diferencias si p<0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL REA DE CALLOS OBTENIDOS
EN EL ECOTIPO AMARILLO
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA5
Tukey HSD
si p
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
82 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
Mean
Difference
(I-J)
Std. Error p.
() N (J) N
E1 E2 29.4375 91.8309 .998
E3 -92.5625 91.8309 .851
E4 -302.5625 91.8309 .013
E5 -390.0000 91.8309 .001
E2 E1 -29.4375 91.8309 .998
E3. -122.0000 91.8309 .674
E4. -332.0000 91.8309 .005
E5. -419.4375 91.8309 .000
E3 E1. 92.5625 91.8309 .851
E2. 122.0000 91.8309 .674
E4. -210.0000 91.8309 .161
E5. -297.4375 91.8309 .015
E4 E1. 302.5625 91.8309 .013
E2. 332.0000 91.8309 .005
E3. 210.0000 91.8309 .161
E5. -87.4375 91.8309 .875
E5 E1. 390.0000 91.8309 .001
E2. 419.4375 91.8309 .000
E3. 297.4375 91.8309 .015
E4 87.4375 91.8309 .875
Estadsticamente significativo existe diferencias si p<0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NMERO DE CALLOS
OBTENIDOS EN EL ECOTIPO MORADO
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA6
Tukey HSD
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 83
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
p
() N (J) N
E1 E2 -.4375 .7739 .980
E3 -1.4375 .7739 .349
E4 -1.7500 .7739 .169
E5 -2.3750 .7739 .024
E2 E1 .4375 .7739 .980
E3. -1.0000 .7739 .697
E4. -1.3125 .7739 .443
E5. -1.9375 .7739 .000
E3 E1. 1.4375 .7739 .349
E2. 1.0000 .7739 .697
E4. -.3125 .7739 .994
E5. -.9375 .7739 .002
E4 E1. 1.7500 .7739 .169
E2. 1.3125 .7739 .443
E3. .3125 .7739 .994
E5. -.6250 .7739 .003
E5 E1. 2.3750 .7739 .024
E2. 1.9375 .7739 .000
E3. .9375 .7739 .002
E4 .6250 .7739 .003
Estadsticamente significativo existe diferencias <0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL REA DE CALLOS OBTENIDOS
EN EL ECOTIPO MORADO
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA7
Tukey HSD
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
84 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
p
() N (J) N
E1 E2 19.1250 88.6138 1.000
E3 -144.2500 88.6138 .485
E4 -298.7500 88.6138 .010
E5 -419.3125 88.6138 .000
E2 E1 -19.1250 88.6138 1.000
E3. -163.3750 88.6138 .357
E4. -317.8750 88.6138 .005
E5. -438.4375 88.6138 .000
E3 E1. 144.2500 88.6138 .485
E2. 163.3750 88.6138 .357
E4. -154.5000 88.6138 .414
E5. -275.0625 88.6138 .022
E4 E1. 298.7500 88.6138 .010
E2. 317.8750 88.6138 .005
E3. 154.5000 88.6138 .414
E5. -120.5625 88.6138 .654
E5 E1. 419.3125 88.6138 .000
E2. 438.4375 88.6138 .000
E3. 275.0625 88.6138 .022
E4 120.5625 88.6138 .654
Estadsticamente significativo existe diferencias si p<0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NMERO DE CALLOS
OBTENIDOS EN EL ECOTIPO NEGRO
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA8
Tukey HSD
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 85
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
Sig.
() N (J) N
E1 E2 -.1875 .7752 .999
E3 -.9375 .7752 .746
E4 -1.0625 .7752 .648
E5 -2.1250 .7752 .000
E2 E1 .1875 .7752 .999
E3. -.7500 .7752 .869
E4. -.8750 .7752 .791
E5. -1.9375 .7752 .006
E3 E1. .9375 .7752 .746
E2. .7500 .7752 .869
E4. -.1250 .7752 1.000
E5. -1.1875 .7752 .050
E4 E1. 1.0625 .7752 .648
E2. .8750 .7752 .791
E3. .1250 .7752 1.000
E5. -1.0625 .7752 .030
E5 E1. 2.1250 .7752 .000
E2. 1.9375 .7752 .050
E3. 1.1875 .7752 .030
E4 1.0625 .7752 .002
Estadsticamente significativo existe diferencias si p<0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL REA DE CALLOS OBTENIDOS
EN EL ECOTIPO NEGRO
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA9
Tukey HSD
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
86 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
Sig.
() N (J) N
E1 E2 23.8750 87.2393 .999
E3 -65.3750 87.2393 .944
E4 -197.1875 87.2393 .170
E5 -339.3750 87.2393 .002
E2 E1 -23.8750 87.2393 .999
E3. -89.2500 87.2393 .844
E4. -221.0625 87.2393 .094
E5. -363.2500 87.2393 .001
E3 E1. 65.3750 87.2393 .944
E2. 89.2500 87.2393 .844
E4. -131.8125 87.2393 .559
E5. -274.0000 87.2393 .020
E4 E1. 197.1875 87.2393 .170
E2. 221.0625 87.2393 .094
E3. 131.8125 87.2393 .559
E5. -142.1875 87.2393 .483
E5 E1. 339.3750 87.2393 .002
E2. 363.2500 87.2393 .001
E3. 274.0000 87.2393 .020
E4 142.1875 87.2393 .483
Estadsticamente significativo existe diferencias si p<0.05
ANLISIS de varianza para dos efectos fijos
EFECTO DEL MEDIO DE CULTIVO EN LA PRODUCCIN DE CALLOS FRIALES
Hiptesis
i Para el factor 2,4-D
Ho:
1=
:
2=
:
3=
:
4=
0
i Para el factor KN
Ho
1=
=
2
=
3
=
4
=0
H1 Al menos una
i
diferente a cero i =1, 2, 3, 4
Para el factor 2,4-D * KN
Ho: ( )ij= 0
H1 Al menos una ( )ij diferente a cero
Nivel de significancia d =0.05 F crtico =9.36
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 87
scua gI mcua f
ss2,4-D 80 3 48.7430556 12*
ssKN 14 3 34.5763888911*
ssinter 87 9 45.8402778 15*
sserrores119. 32 3.72916667
sst 299.8125 47
Regin crtica
Fcal >F crtico el tratamiento estadsticamente significativo existe efecto
*estadsticamente significativo existe efecto
EFECTO DEL COLOR EN LA PRODUCCIN DE CALLOS FRIABLES
Multiple Comparisons
Dependent Variable: tabla 10
Tukey HSD
Mean
Difference
(I-J)
Std.
Error
.
() (J)
Amarillo Morado .8125 .9009 .002
Negro .8750 .9009 .006
Morado Amarillo -.8125 .9009 .002
Negro 6.250E-02 .9009 .997
Estadsticamente significativo existe diferencias si p<0.05
EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE EN LA PRODUCCIN DE CALLOS FIABLES
Multiple Comparisons
Dependent Variable: TABLA 9
Tukey HSD
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
88 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"
Mean
Difference
(I-J)
Sig.
() N (J) N
E1 E2 23.8750 .999
E3 -65.3750 .944
E4 -197.1875 .170
E5 -339.3750 .002
E2 E1 -23.8750 .999
E3. -89.2500 .44
E4. -221.0625 .094
E5. -363.2500 .003
E3 E1. 65.3750 .944
E2. 89.2500 .044
E4. -131.8125 .049
E5. -274.0000 .024
E4 E1. 197.1875 .170
E2. 221.0625 .094
E3. 131.8125 .049
E5. -142.1875 .483
E5 E1. 339.3750 .002
E2. 363.2500 .003
E3. 274.0000 .024
E4 142.1875 .483
Estadsticamente significativo existe diferencias si p<0.05
COEFICIENTE DE VARIABILIDAD DE LA PRESENCIA DE GLUCOSINELATOS
EN HIPOCOTILOS Y CALLOS DE MACA
Fraccin 1 Fraccin 2
Fraccion 1 Correlation
Coefficient
1.000 .650
Sig.
(2-tailed)
. .600
N 80 80
Fraccion 2 Correlation
Coefficient
.650 1.000
Sig.
(2-tailed)
.600 .
N 16 16
Ho Exite variabilidad
H1 No existe variabilidad
APNDICE
"Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor" 89
Si p<0.05 se rechaza la hiptesis nula
En el presente problema p=0.6>0.05 entonces se concluye que existe variabilidad
BiotecnoIoga y metaboIitos secundarios en Lepidium peruvianum Chacn, "Maca"
90 "Programa Cybertesis PER - Derechos son del Autor"

También podría gustarte