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UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMDICAS


TTULO:
ESTUDIO DE LOS EFECTOS DE LOS CANABINOIDES
EN LA UNIN NEUROMUSCULAR DE LA RANA


Tesis para obtener el grado de:
Doctor en Ciencias Fisiolgicas con Especialidad en Fisiologa

Presenta:
M. en C. Enrique Alejandro Snchez Pastor

ASESOR:
Dr. Miguel Huerta Viera

COASESOR:
Dra. Xchitl A. R. Trujillo Trujillo


Colima, Col. Mayo de 2006.


i
DEDICATORIA

A Mara Fernanda y Elin Alejandro.



AGRADECIMIENTOS

A mis padres, por su cario y por todo el apoyo que me han brindado.

A la Dra. Xchitl Trujillo y al Dr. Miguel Huerta, por guiarme durante todo el
tiempo que he estado integrado a su laboratorio.

A la Dra. Elena Castro por su apoyo para realizar la parte de Biologa
Molecular en su laboratorio.

A los integrantes del jurado, por todas sus sugerencias para enriquecer el
presente trabajo.

A Mara Felipa, por todo su apoyo durante mi estancia en el laboratorio.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) por el apoyo
econmico durante mis estudios de Doctorado.

Para la realizacin de este trabajo se recibi apoyo de CONACyT (Proyecto
43446-M) otorgado a Miguel Huerta.





ii
NDICE GENERAL


NDICE DE TABLAS Y FIGURAS 1

RESUMEN 3

ABSTRACT 4

INTRODUCCIN 5
Unin neuromuscular 5
Participacin del Calcio en la liberacin de transmisor en la unin neuromuscular 6
Mecanismo de liberacin de transmisor y la generacin del potencial de placa
terminal 7
Principales canales inicos en las terminales nerviosas motoras 9
A) Los canales de Ca
2+
9
B) Los canales de K
+
11
C) Los canales de Na
+
12
D) Los canales de Cl
-
13
Caractersticas de las fibras musculares esquelticas 13
Canabinoides y liberacin de transmisor 14
Receptores a Canabinoides 15
Endocanabinoides 17
Ligandos que se unen a los Receptores a Canabinoides 19
Activacin de los Receptores a Canabinoides 20

ANTECEDENTES INMEDIATOS 22
Los canabinoides y la unin neuromuscular 22

JUSTIFICACIN 25

iii
HIPTESIS 27

OBJETIVOS 28

METODOLOGA 29
A) Diseccin 29
B) Deteccin de ARNm para el receptor CB
1
29
1.- Extraccin de ARN 30
2.- RT- PCR 30
3.- Transfeccin en Clulas HEK293 32
C) Efecto de los Canabinoides sobre la transmisin sinptica 33
1.- Registro del potencial miniatura de placa terminal 33
2.- Accin de los canabinoides 33
3.- Efecto de la toxina pertussis 33
4.- Efecto de bloqueadores de canales de Ca
2+
34
5.- Soluciones 34
6.- Medicin y anlisis 34

RESULTADOS 36
Deteccin de ARNm para CB
1
por RT-PCR convencional y RT-PCR Tiempo Real
36
Efecto de canabinoides sintticos sobre la liberacin espontnea de transmisor
en la unin neuromuscular de rana 39
Curva dosis efecto obtenida con WIN 55,212-2 39
Efecto del WIN 55,212-2 40
Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de PTX 41
Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de AM630 42
Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de AM281 43
Curva dosis efecto obtenida con ACPA 46
Efecto del ACPA 46
Efecto del ACPA en presencia de PTX 48
iv
Efecto del ACPA en presencia de AM281 50
Histogramas de distribucin de los potenciales miniatura 53
Efecto de bloqueadores de canales de Ca
2+
sobre la liberacin espontnea de
transmisor 56
Nifedipina 56
-conotoxina-GVIA 57
Efecto de ACPA sobre la liberacin espontnea de transmisor despus de
bloquear los canales de Ca
2+
tipo N, con -conotoxina-GVIA 60

DISCUSIN 62

CONCLUSIONES 67

PERSPECTIVAS 68

MANUSCRITOS EN PREPARACIN 69

TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS 70


REFERENCIAS 71

ABREVIACIONES 85









1
NDICE DE TABLAS Y FIGURAS


Tabla 1.- Clasificacin de los canales de calcio activados por voltaje. 10
Figura 1.- unin entre una terminal nerviosa motora y una fibra muscular. 5
Figura 2.- Ilustracin de registros representativos de los Potenciales miniatura en la
unin neuromuscular de la rana. 6
Figura 3.- Acople excitacin-contraccin. 8
Figura 4.- Representacin esquemtica de los canales de Ca
2+
dependientes de
voltaje. 10
Figura 5.- Estructura qumica del principal componente activo de la marihuana, el -
9-tetrahidrocanabinol. 15
Figura 6.- Esquema de los receptores a canabinoides CB
1
y CB
2
. 16
Figura 7.- Estructuras qumicas de cinco endocanabinoides identificados. 18
Figura 8.- Estructuras qumicas del delta-9 tetrahidrocanabinol y otros agonistas de
receptores a canabinoides. 19
Figura 9.- Estructuras qumicas de algunos antagonistas de los receptores sensibles
a canabinoides. 20
Figura 10.- Representacin esquemtica de las vas de activacin de CB
1
y CB
2
por
canabinoides. 21
Figura 11.- Gel representativo en el que se corrieron muestras de ADN de -actina
(control) y de CB
1
. 36
Figura 12.- Promedios de la expresin de ARNm para CB
1
en clulas HEK293,
HEK293 transfectadas con CB
1
, los msculos EDL y cruralis de rana. 37
Figura 13.- Expresin de ARNm para CB
1
RT-PCR Tiempo Real. 38
Figura 14.- Curva dosis-efecto del canabinoide sinttico WIN55,212-2. 39
Figura 15.- Efecto de WIN (10 M) sobre los potenciales miniatura. 40
Figura 16.- Efecto de WIN (10 M) despus de incubar el msculo con Toxina
pertussis (2 g/ml.) durante 22-24 horas a 4
o
C. 41
Figura 17.- La presencia de WIN en un msculo tratado con Toxina pertussis no
provoca cambios significativos sobre los PMPT. 42
2
Figura 18.- Efecto de WIN (10 M) en presencia de AM630 (1 M) sobre los
potenciales miniatura. 43
Figura 19.- Efecto de WIN (10 M) en presencia de AM281 (1 M) sobre los
potenciales miniatura. 44
Figura 20.- Resumen del efecto de WIN sobre los potenciales miniatura. 45
Figura 21.- Curva dosis-efecto con el agonista selectivo de CB
1
ACPA. 46
Figura 22.- Efectos de ACPA (1 M) sobre los potenciales miniatura. 47
Figura 23.- Grfica de Probabilidad acumulativa para ACPA. 48
Figura 24.- Efecto de ACPA en presencia de PTX sobre los potenciales miniatura. 49
Figura 25.- Grfica de Probabilidad acumulativa para ACPA en presencia de PTX. 50
Figura 26.- Efecto de ACPA en presencia de AM281 sobre los potenciales miniatura.
51
Figura 27.- Grfica de Probabilidad acumulativa para ACPA en presencia de AM281.
52
Figura 28.- Resumen del efecto de ACPA sobre los potenciales miniatura. 53
Figura 29.- Histogramas representativos de experimentos realizados en presencia de
canabinoides. 54
Figura 30.- Histograma representativo de un experimento realizado en un msculo
previamente incubado con PTX. 55
Figura 31.- Registro de potenciales miniatura en presencia de Nifedipina. 56
Figura 32.- Grfica de Probabilidad acumulativa para Nifedipina. 57
Figura 33.- Efecto de la -conotoxina-GVIA (5 M) sobre la amplitud y la frecuencia
de los potenciales miniatura. 58
Figura 34.- Grfica de Probabilidad acumulativa para -conotoxina-GVIA. 59
Figura 35.- Efecto de bloqueadores de canales de Ca
2+
sobre los potenciales
miniatura. 59
Figura 36.- El bloqueo de los canales de Ca
2+
tipo N con -conotoxina-GVIA evita el
efecto de ACPA sobre los potenciales miniatura. 60
Figura 37.- Grfica de Probabilidad acumulativa para ACPA en presencia de -
conotoxina-GVIA. 61

3
RESUMEN

Los canabinoides, derivados de la marihuana, interactan con receptores sensibles a
canabinoides (CB
1
y/o CB
2
) presentes en la membrana de las clulas causando
efectos psicoactivos y motores cuando se consume esta planta. En el msculo
esqueltico podra residir parte de los efectos motores de los canabinoides
reportados en estudios clsicos, como la reduccin de la actividad locomotora. De
esta manera, con el fin de explorar el efecto de los canabinoides sobre la liberacin
espontnea de transmisor y determinar si ste es mediado por CB
1
y/o CB
2
, se
registraron potenciales miniatura de placa terminal (PMPT) en la placa
neuromuscular del msculo cutaneous pectoris de la rana en presencia de agonistas
(WIN 55212-2 y ACPA) y antagonistas (AM281 y AM630) de los receptores sensibles
a canabinoides. Con el propsito de investigar si estos efectos estn mediados por
las protenas G
i/o
exploramos los PMPT en presencia de un bloqueador del acople-
activacin de estas protenas (toxina pertussis, PTX), junto con canabinoides. El
registro de los PMPT en presencia de WIN (0.1-50 M) o de ACPA (0.01-50 M)
muestra que estos agonistas disminuyen la frecuencia de aparicin y la amplitud de
los PMPT dependiendo de la concentracin, siendo estos efectos antagonizados por
el AM281 1 M, lo que sugiere que sus efectos son mediados por CB
1
. Adems, en
msculos incubados previamente con PTX, estos canabinoides no ejercen ningn
efecto, indicando as que el mecanismo involucra protenas G
i/o
. Estos resultados nos
indican que el efecto de los canabinoides en la unin neuromuscular de la rana es a
travs de CB
1
. Adems, el bloqueador de canales de Ca
2+
tipo N -conotoxina GVIA,
disminuye la frecuencia de aparicin de los PMPT, y cuando estos canales de Ca
2+

son bloqueados previamente con -conotoxina GVIA, la presencia de ACPA en el
bao no ocasiona un efecto inhibitorio adicional sobre la frecuencia de los PMPT, sin
embargo, s disminuye la amplitud de los PMPT, lo que sugiere un efecto
postsinptico. Estos resultados sugieren que los canabinoides activan a los
receptores CB
1
, y stos, a travs de protenas G
i/o
, inhiben a los canales de Ca
2+
tipo
N, ocasionando as la disminucin en la liberacin de transmisor.
Palabras clave: Canabinoides, msculo esqueltico, unin neuromuscular.
4
ABSTRACT

Cannabinoids, the active components of Cannabis sativa (marijuana), cause
psychoactive and motor effects when this plant is consumed. Effects are produced by
interaction of these compounds with membrane receptors named CB
1
and CB
2
.
Although it is known that cannabinoids reduce motor activity at the central nervous
level in humans as in others mammals, few information exists about their effects on
skeletal muscle. Therefore, the aim of this study was to investigate the function of the
cannabinoid receptor in the neuromuscular junction of the frog (Rana pipiens). The
miniature end-plate potentials (MEPPs) were recorded using the intracellular
electrode recording technique in the cutaneous pectoris muscle in the presence of the
cannabinoid agonists WIN55,212-2 and ACPA, and the cannabinoid antagonists
AM281 and AM630. Adding WIN to the external medium decreased the frequency
and amplitude of the MEPPs; the WIN EC
50
value was 5.8 1.0 M. Application of
ACPA, a selective agonist of CB
1
, also decreased the frequency of the MEPPs; the
ACPA EC
50
value was 115.5 6.5 nM. The CB
2
antagonist AM630 did not inhibit the
effects of WIN, indicating that its action is not mediated through the CB
2
receptor.
However, the CB
1
antagonist AM281 inhibited the effects of WIN and ACPA,
suggesting that their actions are mediated through the CB
1
receptor. Pretreatment
with the Pertussis toxin inhibited the effects of WIN and ACPA, suggesting that their
effects are mediated through G
i/o
-protein activation. Aditionally, the N-type Ca
2+
-
channel blocker -conotoxin GVIA diminished the frequency of the MEPPs. Blocking
the N-type Ca
2+
-channels with -conotoxin GVIA before addition of ACPA in the bath
had no additional inhibitory effect on the MEPPs frequency; however the MEPPs
amplitude is diminished indicting a postsynaptic effect of ACPA. These results
suggest that cannabinoids activate CB
1
cannabinoid receptors in the nerve ending,
and through the G
i/o
proteins they inhibit the N-type Ca
2+
-channels and thus they
modulate transmitter release in the endplate of the frog neuromuscular junction.


Keywords: Cannabinoids, skeletal muscle, neuromuscular junction
5
INTRODUCCIN


Unin neuromuscular

La unin entre la terminal de una neurona motora y una fibra muscular se
llama unin neuromuscular, tambin conocida como placa terminal (Figura 1). Los
impulsos propagados a travs de las motoneuronas que inervan las fibras
musculares esquelticas causan que stas respondan con una contraccin. La
terminal presinptica contiene cientos de vesculas sinpticas, que almacenan al
neurotransmisor acetilcolina (ACh). Estas vesculas se agrupan en regiones
especficas de la terminal llamadas zonas activas. El espacio que separa la terminal
nerviosa (axnica) de la clula muscular (membrana postsinptica) se denomina
hendidura sinptica o espacio sinptico. Este espacio sinptico est compuesto de
una matriz fibrosa que contiene acetilcolinesterasa, una enzima que hidroliza a la
acetilcolina una vez que sta es liberada al espacio sinptico (Byrne, 1992).

Figura 1.- Muestra la unin entre una terminal nerviosa motora y una fibra muscular (unin
neuromuscular). Adems, se observan la hendidura sinptica, las vesculas, las zonas activas y los
receptores a acetilcolina en la membrana postsinptica (modificado de www.bioon.com/book/ biology).
6
La acetilcolina se libera de la terminal presinptica por exocitosis membranal
(en forma de paquetes) al espacio sinptico, donde cada paquete de transmisor
produce en la fibra muscular un potencial llamado potencial sinptico unitario o
potencial miniatura (Ver Figura 2). Fatt y Katz (1952), al hacer registros en la
membrana postsinptica de la unin neuromuscular de rana, encontraron que sin
estimulacin de la terminal presinptica aparecan potenciales espontneos de
aproximadamente 0.5 mV de amplitud, similares a los presentados en la Figura 2. En
condiciones normales un potencial de accin, al propagarse a la terminal sinptica,
causa que se liberen sincrnicamente varios paquetes que contienen acetilcolina,
generando as el potencial de placa.


Figura 2.- Ilustracin de registros representativos de los Potenciales miniatura en la unin
neuromuscular de la rana (Modificado de Matthews, 2000).



Participacin del Calcio en la liberacin de transmisor en la unin
neuromuscular

Para que el transmisor (acetilcolina) sea liberado de la terminal presinptica se
requiere la entrada del in calcio, el cual fluye al interior de la terminal a travs de los
canales de calcio dependientes de voltaje situados en la zona activa de la terminal
7
nerviosa. Estos canales de Ca
2+
se abren con la despolarizacin que ocurre con la
propagacin del potencial de accin en la terminal axnica. En reposo, la
concentracin intracelular de Ca
2+
([Ca
2+
]
i
) es muy baja (~10
7
M), pero con la
despolarizacin, esta concentracin se incrementa substancialmente (> 200 M)
(Meir y cols., 1999). Adems de la entrada de Ca
2+
, tambin puede haber liberacin
de Ca
2+
de los almacenes intracelulares (mitocondrias y retculo endoplsmico,
principalmente) afectando la [Ca
2+
]
i
(Meir y cols., 1999). El incremento en la [Ca
2+
]
i

causa la unin de los iones calcio a sensores especiales de la [Ca
2+
]
i
. La
sinaptotagmina I es uno de los principales sensores de calcio en la terminal
presinptica (Bommert y cols., 1993; Debello, Betz y Augustine, 1993; Nishiki and
Augustine, 2004). Las sinaptotagminas son una gran familia de protenas de
membrana con regiones citoplsmicas que contienen dominios de unin al Ca
2+

llamados dominios C2 (Chapman y cols., 1996; Sugita, Hata y Sdhof, 1996; Sdhof,
2002). Estos dominios C2 operan en coordinacin con fosfolpidos membranales
para conferir la capacidad de unin del Ca
2+
a la sinaptotagmina (Brose y cols., 1992;
Sutton y cols., 1995; Fernndez y cols., 2001). Aunque ambos dominios C2 son
capaces de unir Ca
2+
, el segundo dominio C2 (C2B) parece tener un papel ms
importante como sensor de Ca
2+
(Fernndez-Chacn y cols., 2002; Mackler y cols.,
2002; Stevens y Sullivan, 2003). La unin del Ca
2+
dispara cambios rpidos en las
propiedades bioqumicas de la sinaptotagmina, causando una rpida unin a varios
componentes moleculares involucrados en la fusin con la membrana, incluyendo
protenas SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein
receptor) y lpidos de membrana (Davis y cols., 1999; Bai y cols., 2004).



Mecanismo de liberacin de transmisor y la generacin del potencial de placa
terminal

Con la despolarizacin y la entrada de Ca
2+
a la terminal nerviosa, varias de
las vesculas que se encuentran en su interior se fusionan con la membrana de la
8
terminal nerviosa (Figura 3) y liberan su contenido hacia la hendidura sinptica,
frente a un rea especializada de la membrana postsinptica que contiene un grupo
de canales-receptores transmembranales (receptores a acetilcolina nicotnicos). Los
receptores sensibles a acetilcolina se encuentran formados por 5 subunidades: 2 , 1
, 1 y 1 . Este receptor presenta dos sitios de unin a acetilcolina. Al unirse la
acetilcolina liberada por las vesculas, se abre el canal permitiendo la entrada de
iones Na
+
y la salida de iones K
+
, y causando una despolarizacin de la membrana
conocida como potencial de placa terminal (Kandel, 2000). El potencial de placa
terminal representa la suma de todos los potenciales unitarios; generalmente es de
aproximadamente 50 mV de amplitud y cuando es mayor que el nivel umbral (-55
mV) de los canales de Na
+
dependientes de voltaje, se genera el potencial de accin
y en consecuencia se produce la contraccin muscular.


Figura 3.- Acople excitacin-contraccin: a) llegada del potencial de accin a la terminal axnica
motora; b) apertura de canales de Ca
2+
dependientes de voltaje; las vesculas sinpticas se movilizan
hacia la membrana presinptica y se fusionan con ella liberando su contenido; c) la acetilcolina se une
al receptor a acetilcolina, lo que origina la apertura del poro y la entrada de Na
+
y salida de K
+
; se
genera el potencial de placa, y cuando es mayor que el umbral del potencial de accin, ste se genera
conllevando a la contraccin muscular. Finalmente, la acetilcolinesterasa hidroliza a la acetilcolina a
colina y cido actico
(http://www.frontrangecommunitycollege.com/images/pages/Neuromuscular_Junction.jpg).

9
El potencial de placa terminal es un evento transitorio que persiste por
aproximadamente 10 ms (Byrne, 1992), restaurndose en un breve periodo (1-2 ms).
El potencial de membrana de la fibra muscular (aproximadamente -85 mV) se
reestablece por la salida de iones de K
+
; ste es el llamado periodo refractario.



Principales canales inicos en las terminales nerviosas motoras

En las terminales nerviosas se han descrito diferentes canales inicos. Los
canales inicos son mquinas moleculares (protenas) muy simples que existen en
dos principales estados: abierto y cerrado. Cuando los canales inicos, de acuerdo a
su gradiente electroqumico, se abren y fluyen iones a travs de ellos, ocurren tres
cambios principales: 1) hay cambios en la concentracin de los iones relevantes
dentro de la terminal nerviosa y en el espacio extracelular; 2) hay un cambio en el
potencial de membrana, y 3) hay un cambio en la resistencia de la membrana (Meir y
cols., 1999). A continuacin se describen los principales canales inicos presentes
en las terminales nerviosas:

A) Los canales de Ca
2+

Los iones de calcio tienen varias funciones en las neuronas, incluyendo el
disparo rtmico, el crecimiento neuronal, la expresin gnica y la liberacin de
transmisor (Clapham, 1995). Existe una gran diversidad de canales de Ca
2+
en el
sistema nervioso y stos se distinguen por sus distintas propiedades a la regulacin
por voltaje, por su sensibilidad especfica a los bloqueantes farmacolgicos y por su
actividad fisiolgica especfica.
En cuanto a los canales de Ca
2+
activados por voltaje (VGCC, por sus siglas
en ingls), fueron primeramente clasificados de acuerdo a sus propiedades
biofsicas, en canales activados por bajo y alto voltaje (LVA y HVA, respectivamente)
[Carbone y Lux, 1984]. Los VGCC son heteromultmeros compuestos por una
subunidad
1
y tres subunidades,
2
-, y (Figura 4).
10

Figura 4.- Representacin esquemtica de los canales de Ca
2+
dependientes de voltaje. Estos
canales estn formados por diferentes subunidades, una subunidad
1
y tres subunidades: a
2
-, y
(modificada de Stotz y cols., 2004).

En 1994 se adopt una nueva nomenclatura en la cual las subunidades
1

fueron referidas como
1S
, por ser la isoforma presente en el msculo esqueltico y

1A
a
1E
a las que se descubrieron posteriormente (Birnbaumer y cols., 1994). En
2000 se adopt otra nomenclatura (Ertel y cols., 2000) basada en la nomenclatura de
los canales de potasio. Los canales de Calcio fueron llamados empleando su smbolo
qumico (Ca), con el principal regulador fisiolgico (voltaje) indicado como subndice
(Ca
V
). El identificador numrico corresponde a la subfamilia del gen de la subunidad

1
(1-3) y al orden de descubrimiento de la subunidad
1
en cada subfamilia. De
acuerdo a esto, en la tabla 1 se resume la nomenclatura de los VGCC (Catterall y
cols., 2005).

Canal Tipo Subunidad
1
Localizacin Bloqueador
Ca
V
1.1
Ca
V
1.2

Ca
V
1.3
Ca
V
1.4
L
L

L
L

1S

1C

1D

1F

Msculo esqueltico
Msculo cardiaco y liso, clulas
endocrinas, neuronas
Clulas endocrinas, neuronas
Retina, mdula espinal
Dihidropiridinas,
Fenilalkilaminas y
Benzotiazepinas

Ca
V
2.1
Ca
V
2.2
Ca
V
2.3
P/Q
N
R

1A

1B

1E

Neuronas
Neuronas
Neuronas
-Agatoxina IVA
-Conotoxina GVIA
SNX-482
Ca
V
3.1
Ca
V
3.2
Ca
V
3.3
T
T
T

1G

1H

1I

Neuronas, msculo cardiaco
Neuronas, msculo cardiaco y liso
Neuronas, msculo liso

Tabla 1.- Clasificacin de los canales de calcio activados por voltaje (modificado de Catterall y cols.,
2005).
11
Los tipos de VGCC difieren entre especies biolgicas y tambin en su
localizacin anatmica. En terminales nerviosas motoras, se han encontrado casi
todos los tipos de canales de Ca
2+
(L, N, P/Q) en diferentes especies. En las
terminales nerviosas los canales de Ca
2+
, caracterizados a la fecha, son activados
por la invasin de un potencial de accin a la terminal nerviosa. En las terminales
nerviosas motoras de la rana se han encontrado los tipos L y N (Kerr y Yoshikami,
1984; Feng y Dai, 1990; Hattori y Maehashi, 1991; Robitaille, Adler y Charlton, 1993;
Robitaille, Garca, Kaczorowski y Charlton, 1993; Arenson y Hill, 1996).
Respecto al bloqueo de canales de Ca
2+
existen toxinas naturales muy tiles
como bloqueadores de los diferentes tipos de canales de Ca
2+
(Tabla 1). Los canales
tipo N pueden ser bloqueados por la -conotoxina-GVIA, una toxina del caracol
marino Conus geographus (McCleskey y cols., 1987). Los canales tipo P/Q son
inhibidos por la -agatoxina-IVA, una toxina de la araa Agelenopsis aperta (Protti y
Uchitel, 1993). Estas dos toxinas se unen irreversiblemente o son reversibles muy
lentamente (Olivera y cols., 1994) y bloquean la liberacin de transmisor en la unin
neuromuscular de la rana y de mamfero, respectivamente, donde son los canales
tipo N y P los que permiten la entrada de Ca
2+
para liberar al transmisor (Meir y cols.,
1999). Por otra parte, los canales de Ca
2+
tipo L son bloqueados por las
dihidropiridinas como la Nifedipina (Lacinova, 2005; Triggle, 2006).

B) Los canales de K
+

Una de las funciones de los canales de potasio es contribuir al mantenimiento
del potencial de membrana en reposo en la terminal nerviosa, y son los encargados
de la repolarizacin de la membrana durante los potenciales de accin. Tambin
participan en la posthiperpolarizacin y modulan la velocidad de disparo. Como
resultado de esas acciones, los canales de potasio estn involucrados en la
regulacin de la liberacin del transmisor (Meir y cols, 1999).
Los diferentes tipos de canales de K
+
se distinguen por sus propiedades de
apertura, y los que se encuentran en terminales nerviosas principalmente son:
canales de potasio rectificadores tardos, canales de potasio tipo A, canales de
12
potasio activados por calcio (K
Ca
) y canales dependientes de ATP (K
ATP
) (Meir y cols,
1999).
Los tipos de canales de K
+
que han sido encontrados en las terminales
nerviosas motoras de rana son los canales de potasio rectificadores tardos (Hevron,
David, Arnon y Yaari, 1986; Miralles y cols., 1994; Shakiryanova y cols., 1994) y los
canales de potasio activados por calcio (Anderson y cols., 1988; Katz y cols., 1995).
Los canales de potasio rectificadores tardos pueden ser bloqueados por
tetraetilamonio (TEA) y por 4-aminopiridina (4-AP) aplicados externamente. Por su
parte, los canales de potasio activados por calcio pueden ser bloqueados por TEA
aplicado extracelular o intracelularmente (Blundon y cols., 1995) y por toxinas como
la caribdotoxina (Anderson y cols., 1988; Blundon y cols., 1995; Katz y cols., 1995).
Adems, se cree que los canales de potasio tipo A estn presentes en la
mayora de las terminales nerviosas. Estos canales son activados por voltaje,
originando con ello una corriente llamada transitoria de salida, que se activa y
desactiva ms rpido que en otros canales de K
+
. Estos canales contribuyen al
funcionamiento de las neuronas regulando la frecuencia de disparo, los periodos de
latencia y contribuyendo a la repolarizacin del potencial de accin (Elphick y
Egertov, 2001).

C) Los canales de Na
+

La principal funcin de las terminales nerviosas presinpticas en la unin
neuromuscular es liberar el transmisor cuando llega una seal, la cual en la mayora
de los casos es el potencial de accin. En prcticamente todas las terminales, el
potencial de accin es generado por canales de sodio dependientes del voltaje.
Adems de la generacin del potencial de accin, los canales de sodio tambin
tienen un papel en la determinacin de la concentracin de Na
+
intracelular, la cual
afecta a su vez la [Ca
2+
]
i
debido a la existencia del intercambiador Na
+
/Ca
2+
(Luther y
cols., 1992; Meir y cols., 1999).
Los canales de sodio han sido encontrados en las terminales nerviosas de
casi todas las preparaciones estudiadas. Fueron encontrados primeramente en la
sinapsis neuromuscular de la rana por Katz y Miledi (1967a). Entre las toxinas que
13
bloquean a los canales de sodio se encuentra la tetrodotoxina (TTX). El efecto
bloqueante de la TTX en las terminales nerviosas se conoce desde hace ms de 30
aos (Nishi y Sato, 1966; Katz y Miledi, 1967a).

D) Los canales de Cl
-

Los canales de Cl
-
estn involucrados en: 1) la regulacin del pH intracelular
(Brown y Dudley, 1996), 2) el volumen celular (Nilius y cols., 1996), 3) la excitabilidad
nerviosa y 4) contribuyen a la determinacin del potencial de reposo (Albertson y
cols., 1996).
El in cloro es el anin fisiolgico extracelular ms abundante. Los canales de
cloro contribuyen a mantener el potencial de reposo de las terminales nerviosas
dependiendo de su nmero relativo y conductancia; adems se ha encontrado,
sobretodo en el sistema nervioso central, que estos canales de Cl
-
tambin estn
involucrados en la inhibicin presinptica (Dudel y Kuffler, 1961). El incremento en la
conductancia de estos canales conduce a una reduccin en la amplitud del potencial
de accin y, de esta manera, a la liberacin del transmisor (Graham y Redman,
1994). Un bloqueador de los canales de Cl
-
es el cido 5-Nitro-2-(3-fenilpropilamino)
benzoico (NPPB) (Kirkup y cols., 1996).



Caractersticas de las fibras musculares esquelticas

En cuanto a las fibras del msculo esqueltico, existen dos tipos: las rpidas y
las lentas o tnicas (Kuffler y Vaughan-Williams, 1953a, b; Stefani y Steinbach, 1969;
Huerta y Stefani, 1981). Las fibras musculares rpidas son las responsables de los
movimientos fsicos (rpidos) y las fibras musculares lentas o tnicas participan en el
mantenimiento de la postura y, junto con las fibras rpidas, son responsables de los
movimientos finos, como los que realizan por ejemplo los msculos extraoculares.
Por lo general, los msculos esquelticos presentan ambos tipos de fibras, las cuales
se encuentran entremezcladas; sin embargo, las fibras rpidas pueden encontrarse
14
en msculos como el posterior latissimus dorsi de las aves, el extensor digitorum
longus, el sartorio y el cutaneous pectoris de los anfibios. En contraste, las fibras
musculares lentas se encuentran abundantemente en los msculos extraoculares de
los mamferos y en fascculos tnicos de los msculos cruralis y piriformis de la rana.
La actividad conjunta de ambos tipos de fibras musculares rpidas y lentas coordina
el movimiento y determina la velocidad de contraccin del msculo completo.
En la rana, las fibras musculares lentas constituyen un grupo de fibras
fcilmente distinguible de las fibras rpidas por ciertas caractersticas mecnicas,
bioqumicas, morfolgicas y elctricas. Las fibras rpidas, por lo general, poseen una
placa terminal nica que recibe inervacin de una sola motoneurona, cuyos axones
motores son gruesos y su estimulacin genera potenciales de accin en la fibra
muscular. Estos potenciales son seguidos de una sacudida rpida; adems, al ser
baadas en solucin con alto contenido de K
+
generan una contractura transitoria que
relaja espontneamente. En contraste, las fibras musculares lentas o tnicas cuentan
con una inervacin mltiple establecida por axones motores delgados y, en
particular, estas fibras son incapaces de producir potenciales de accin y generar
sacudidas por carecer de canales de Na
+
dependientes de voltaje. Otra caracterstica
es que las fibras tnicas (lentas) mantienen la tensin durante despolarizaciones
prolongadas con soluciones de alto K
+
(Stefani y Steinbach, 1969; Elizalde, Huerta y
Stefani, 1983; Lipsk y cols., 1998). As, los dos tipos de fibras musculares
esquelticas difieren en las propiedades electrofisiolgicas de su membrana y
tambin de los axones motores que las inervan.



Canabinoides y liberacin de transmisor

Los canabinoides son derivados de la marihuana (Cannabis sativa), una de las
primeras drogas consumidas por los adolescentes en Mxico y que es considerada
como la va de acceso a otro tipo de drogas mayormente nocivas, como la cocana y
las metanfetaminas (Medina-Mora y cols., 1998). Los canabinoides son los
causantes de los efectos psicoactivos y motores producidos por el consumo de esta
15
planta, siendo el principal componente activo el -9-tetrahidrocanabinol (Gaoni y
Mechoulam, 1964) (Figura 5).

Figura 5.- Estructura qumica del principal componente activo de la marihuana, el -9-
tetrahidrocanabinol (Gaoni y Mechoulam, 1964).


Se ha descubierto que la accin de los canabinoides disminuye la liberacin
de transmisor en diferentes modelos experimentales (Engler y cols., 2006; Liang y
cols., 2004; Schlicker y Kathmann, 2001; Szabo y cols., 2004; Szabo y Schlicker,
2005). En este sentido, se han propuesto 3 mecanismos por los cuales los
canabinoides pueden influenciar la liberacin de transmisor: mediante la activacin
de canales de potasio tipo A, el bloqueo de canales de Ca
2+
dependientes de voltaje
(Elphick y Egertov, 2001; Diana y cols., 2002), y por inhibicin directa de la
maquinaria de liberacin vesicular (Takahashi y Linden, 2000).



Receptores a Canabinoides

Los canabinoides ejercen sus efectos al interactuar con receptores presentes
en la membrana de las clulas (Begg y cols., 2001). A la fecha, se han identificado
dos tipos de receptores a canabinoides: los CB
1
y los CB
2
(Howlett y cols., 2002), de
las siglas en ingls cannabinoid brain, mientras que los nmeros 1 y 2
corresponden al orden en que fueron descubiertos. Fueron llamados receptores
sensibles a canabinoides porque responden al unirse a canabinoides, como el -9-
tetrahydrocannabinol y a sus anlogos sintticos biolgicamente activos. Estos
receptores a canabinoides pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a
16
protenas G, por lo que constan de 7 regiones transmembranales. La distincin entre
estos receptores est basada en sus diferencias en la secuencia de sus aminocidos
(Figura 6), en los mecanismos de sealizacin, en su distribucin en los tejidos y en
su sensibilidad a ciertos agonistas y antagonistas.


Figura 6.- Esquema de los receptores a canabinoides CB
1
y CB
2
. Los crculos negros ejemplifican
cada aminocido que conforma al receptor CB
1
mientras que los crculos blancos corresponden a
cada uno de los aminocidos que constituyen a CB
2
(modificada de Watson y cols., 2000).


Los receptores CB
1
han sido clonados del sistema nervioso central de rata
(Matsuda y cols., 1990), ratn (Chakrabarti y cols., 1995) y tejidos humanos (Grard
y cols., 1990) y exhiben entre un 97-99% de homologa entre las distintas especies.
Adems, estos receptores se han encontrado en el sistema nervioso perifrico y en
ciertos tejidos no neuronales, como en clulas del sistema inmune.
En el cerebro, los receptores CB
1
estn altamente localizados en el
hipocampo, cerebelo y sustancia nigra (Glass, Dragunow y Faull, 1997) y tambin
han sido localizados en nervios perifricos que inervan al intestino, vaso deferente y
vejiga (Pertwee y cols., 1996). Tambin han sido descritos receptores CB
1
en la
retina de diferentes animales, como el mono Rhesus, el ratn, la rata, el pollo, el pez
dorado (Straiker y cols., 1999) y en el anfibio (salamandra) (Soderstrom y cols.,
17
2000), as como en msculo liso (Filipeanu y cols., 1997) y en ciertas clulas del
sistema inmune (Parolaro, 1999).
Por su parte, los receptores CB
2
han sido encontrados principalmente en
clulas del sistema inmune y en algunos tejidos como el hgado (Di Marzo y Deutsch,
1998a). Este tipo de receptores ha sido clonado y exhiben el 44% de similitud en la
secuencia de aminocidos con los receptores CB
1
(Figura 6) (Munro y cols., 1993;
Howlett y cols., 2002).
Tambin se ha encontrado una variante del Receptor CB
1
, el CB
1A
(Rinaldi-
Carmona y cols., 1996; Shire y cols., 1995). El CB
1A
tiene 61 aminocidos menos que
el CB
1
. Adems, el ARNm de CB
1A
se ha encontrado en los mismos tejidos que CB
1
,
pero su nivel de expresin es menor al 20% de CB
1
. El Receptor CB
1A
exhibe todas
las propiedades del CB
1
, pero un poco atenuadas (Rinaldi-Carmona y cols., 1996).



Endocanabinoides

El hallazgo de los receptores a canabinoides y de la existencia de potentes y
selectivos canabimimticos condujo a la rpida identificacin de una familia de
transmisores lipdicos, que sirven como ligandos naturales para los receptores a
canabinoides y fueron llamados Endocanabinoides (De Petrocellis, Cascio y Di
Marzo, 2004). Se encontr que las propiedades farmacolgicas de los
endocanabinoides son muy similares a las de los canabinoides sintticos. Los
endocanabinoides ms conocidos son la araquidoniletanolamida (anandamida,
derivado del cido araquidnico) (Devane y cols., 1992) y el 2-araquidonil glicerol (2-
AG) (Mechoulam y cols., 1995; Sugiura y cols., 1995), dos compuestos que pueden
servir como neuromoduladores o neurotransmisores (Di Marzo y cols., 1998b;
Mechoulam y cols., 1996; Pertwee, 2001).
La Figura 7 muestra la estructura qumica de 5 endocanabinoides: la
anandamida, el 2-AG, la virodamina (Porter et al., 2002), el noladin ter (Hanus et al.,
2001) y el N-araquidonil-dopamina (Bisogno y cols., 2000). Todos estos
18
endocanabinoides han sido encontrados en el cerebro, en plasma y en tejidos
perifricos como nervio vago, tracto gastrointestinal, tejido adiposo e hgado (Matas
y cols., 2006).



Figura 7.- Estructuras qumicas de cinco endocanabinoides identificados (Modificado de De
Petrocellis, Cascio y Di Marzo, 2004).


La descripcin subsecuente de una va bioqumica compleja para la sntesis,
liberacin (Di Marzo y cols., 1994; Cadas y cols., 1996), transporte (Beltramo y cols.,
1997) y degradacin (Cravatt y cols., 1996) de los endocanabinoides completa la
cascada de un nuevo sistema de sealizacin llamado sistema endocanabinoide.
Desde el descubrimiento de la anandamida, se han explorado ampliamente los
aspectos principales del sistema endocanabinoide. Este sistema acta como un
modulador de las funciones, no slo del sistema nervioso central sino tambin del
sistema nervioso autnomo, del sistema endocrino, del sistema inmune, del tracto
gastrointestinal, del sistema reproductor y acta tambin en la modulacin de la
microcirculacin (Di Marzo y cols., 1998b).

19
Ligandos que se unen a los Receptores a Canabinoides

Se han reportado cuatro clases de agonistas de los receptores sensibles a
canabinoides (Figura 8) (Pertwee, 1999). Estos son: 1) los canabinoides clsicos
(por ejemplo, el delta-9 tetrahidrocanabinol); 2) los canabinoides no clsicos (como el
CP55940); 3) los aminoalquilindoles (como el WIN 55212-2); y, 4) los eicosanoides
(como la anandamida y el ACPA). De stos, el delta-9 tetrahidrocanabinol y el
CP55940 presentan poca diferencia en sus afinidades por los receptores CB
1
y CB
2
;
en contraste, la anandamida presenta cierta selectividad por los receptores CB
1
;
mientras que el WIN 5521-2 presenta una modesta selectividad por los receptores
CB
2
. Por su parte, la metanandamida presenta una mayor selectividad y mayor
afinidad por los receptores CB
1
(Pertwee, 2001). El ACPA es un agonista con mayor
afinidad y selectividad por los receptores CB
1
(Hillard y cols., 1999).



Figura 8.- Estructuras qumicas del delta-9 tetrahidrocanabinol y otros agonistas de receptores
sensibles a canabinoides (Modificado de Howlett y cols., 2002).


Respecto a los antagonistas de los receptores sensibles a canabinoides
existen dos clases: 1) los diarilpirazoles (como el SR141716A) (Figura 9) y, 2) los
que pertenecen a otras series qumicas, tales como los benzofuranos (como el
20
LY320135) y los aminoalquilindoles (como el AM630). El SR141716A es un potente y
selectivo antagonista de los receptores CB
1
y 2 anlogos de ste compuesto (el
AM251 y el AM281), tambin bloquean los efectos mediados por los receptores CB
1
.
El AM281 tiene 350 veces mayor afinidad por los receptores CB
1
que por los CB
2
. De
la misma manera, el AM251 presenta mayor selectividad por los receptores CB
1

(Howlett y cols., 2002). El AM630 es un potente antagonista de los receptores CB
2

presentando 165 veces mayor afinidad que para el CB
1
(Ross y cols., 1999).



Figura 9.- Estructuras qumicas de algunos antagonistas de los receptores sensibles a canabinoides
(Modificado de Howlett y cols., 2002).



Activacin de los Receptores a Canabinoides

Los dos subtipos de receptores a canabinoides previamente mencionados
alteran la actividad celular a travs de la activacin de protenas G del subtipo G
i/o

sensibles a la toxina pertussis (Figura 10) [Soderstrom y cols., 2000]; aunque en
algunos reportes se sugiere que tambin puede activar a la adenilil ciclasa a travs
de protenas G
s
(Howlett, 1985; Bayewitch y cols., 1995; Calandra y cols., 1999;
Glass y Felder, 1997).
La activacin del sistema de protenas G (G
i/o
) por los receptores CB
1
y CB
2

conduce a la disminucin en la actividad de la enzima adenilil ciclasa, y esto a su vez
a reducir los niveles intracelulares de AMPc, lo que da por consecuencia una
21
disminucin en la fosforilacin de protenas por la proteincinasa A, entre ellas las de
canales inicos (Soderstrom y cols., 2000). Tambin la activacin de las protenas G
por los receptores a canabinoides ha sido implicada en la modulacin de la va de
sealizacin de la proteincinasa activada por mitgeno (MAPkinasa) [Bouaboula y
cols., 1995; 1996]. Adems, se ha mostrado que la activacin de CB
1
est acoplada
negativamente a travs de G
i/o
a canales de calcio tipo L, N y P/Q neuronales, y
positivamente acoplada a canales de potasio rectificadores entrantes (Mackie y Hille,
1992; Mackie y cols., 1995; Twitchel y cols., 1997; Guo e Ikeda, 2004).



Figura 10.- Representacin esquemtica de las vas de activacin de CB
1
y CB
2
por canabinoides.
Los detalles de la figura se describen en el texto. Los signos negativo y positivo indican inhibicin y
activacin de la va, respectivamente (Modificado de Henderson y cols., 1999).








22
ANTECEDENTES INMEDIATOS


Los canabinoides y la unin neuromuscular

Para caracterizar los mecanismos celulares que se producen una vez
activados los receptores sensibles a canabinoides, se han utilizado varios modelos
animales y ms recientemente, ya clonados los receptores CB
1
y CB
2
, las lneas
celulares establecidas (Vsquez y cols., 2003). Como se mencion anteriormente, la
accin de los canabinoides ha sido implicada en la disminucin de la liberacin de
transmisor en diferentes modelos experimentales (Engler y cols., 2006; Liang y cols.,
2004; Schlicker y Kathmann, 2001; Szabo y cols., 2004; Szabo y Schlicker, 2005), y
se ha propuesto que los mecanismos por el cuales los canabinoides influyen en la
liberacin de transmisor son: la activacin de canales de potasio tipo, por el bloqueo
de canales de Ca
2+
dependientes de voltaje (Elphick y Egertov, 2001; Diana y cols.,
2002), y por inhibicin directa de la maquinaria de liberacin vesicular (Takahashi y
Linden, 2000; Szabo y Schlicker, 2005). Por ejemplo en las preparaciones nervio-
msculo liso (vaso deferente de ratn e leo de cobayo), las cuales responden a
agonistas de los receptores a canabinoides con una inhibicin de la contraccin. Se
cree que esta inhibicin es el resultado de una disminucin en la liberacin de
transmisor (Pertwee, 1992; Ishac y cols., 1996).
En la unin neuromuscular (msculo sartorio) de la rana, Kumbaraci y Nastuk
(1980) reportaron que el delta-9 tetrahidrocanabinol (30 M) disminua la frecuencia
de aparicin de los potenciales miniatura y que se modificaba el contenido cuntico
de las vesculas sinpticas, siendo esto un efecto a nivel presinptico. Sin embargo,
la amplitud de los potenciales miniatura se increment en presencia de este
canabinoide, sugiriendo un efecto a nivel postsinptico. Ms tarde, Turkanis y Karler
(1986) reportaron en este tipo de unin neuromuscular que los canabinoides
causaban cambios en la liberacin del neurotransmisor, encontrando que el delta-9
tetrahidrocanabinol 0.1 M aumentaba la frecuencia de aparicin de los potenciales
miniatura, mientras que el 11-hidroxitetrahidrocanabinol (0.1-1 M) no causaba
23
cambios significativos. En contraste, el canabidiol (0.1-1 M) causaba una
disminucin de la frecuencia de aparicin de estos potenciales. Adems, la amplitud
de estos potenciales fue reducida en presencia de los tres canabinoides estudiados.
Tambin reportaron que, inicialmente, el contenido cuntico que da origen al
potencial de placa aumentaba (a los 20 minutos de incubacin) y despus se reduca
(50 minutos de incubacin) cuando se usaban el -9 tetrahidrocanabinol y el 11-
hidroxitetrahidrocanabinol, mientras que con el canabidiol slo haba una reduccin
del potencial de placa terminal. Estos autores coinciden con Kumbaraci y Nastuk
(1980) en atribuir el cambio en la frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura
y en el contenido cuntico a un efecto presinptico de los canabinoides, mientras que
los cambios en la amplitud de estos potenciales se atribuyen a un efecto
postsinptico.
Por su parte, Van der Kloot (1994) encontr en el mismo tipo de unin
neuromuscular de rana, que utilizando el endocanabinoide anandamida (2 M) se
inhiba el incremento del contenido cuntico producido por soluciones hipertnicas.
Tambin encontr que la anandamida reduca la frecuencia de aparicin de los
potenciales miniatura despus de que fue aumentada por un agonista del AMPc (Sp-
cAMPS) permeante. Este autor fue el primero en sugerir la presencia de receptores a
canabinoides en la terminal nerviosa motora y postular que la accin de la
anandamida al unirse al receptor era bloquear a la enzima adenilil ciclasa. Sin
embargo, otros autores (Elphick y Egertov, 2001) consideran que no hay suficientes
evidencias de que los receptores a canabinoides sean expresados en las neuronas
motoras o clulas musculares que median el control voluntario del msculo
esqueltico.
Por otro lado, se ha observado que algunos canabinoides sintticos como el
WIN 55212-2, aplicado directamente al msculo, reduce la tensin producida por
potasio o cafena en las fibras musculares lentas (Vsquez y cols., 2000) y en las
fibras rpidas de la rana (Velasco, 2002). En fibras lentas, el WIN 55212-2 redujo la
tensin hasta en un 20%, mientras que en las fibras rpidas se redujo alrededor del
10%. Estos efectos sugieren la presencia de receptores sensibles a canabinoides en
la membrana de las fibras musculares esquelticas rpidas y lentas; sin embargo,
24
an se desconocen muchas de las acciones directas e indirectas de los canabinoides
en el msculo esqueltico.





























25
JUSTIFICACIN


Hasta ahora, a pesar del considerable avance en el conocimiento de la accin
de los canabinoides, para el caso del msculo esqueltico su mecanismo de accin
es poco comprendido, siendo un tejido en el cual podran residir parte de los efectos
motores de los canabinoides reportados en estudios clsicos como es la reduccin
de la actividad locomotora; un efecto que tambin ha sido descrito en ratones
(movimiento reducido) donde se ha expuesto a los individuos (primates, seres
humanos) en forma aguda a extractos de marihuana (Dewey, 1986; Hollister, 1986;
Saudo-Pea y cols., 2000). Adems, existen estudios en los cuales se ha visto que
los canabinoides sintticos reducen el temblor y la espasticidad (Baker y cols., 2000;
Baker y cols., 2001) y mejoran la coordinacin motora (Arvalo-Martn y cols., 2003)
en modelos animales de miastenia gravis.
Por otra parte, hasta ahora los resultados experimentales de los estudios del
efecto de los canabinoides en la unin neuromuscular son contradictorios y se
realizaron antes de que se tuviera conocimiento de los dos tipos de receptores
sensibles a canabinoides (CB
1
y CB
2
) y de que se sintetizaran agonistas y
antagonistas especficos para cada uno de los dos tipos de receptores a
canabinoides. Por lo tanto, resulta interesante caracterizar la accin de algunos
agonistas de los receptores a canabinoides sobre la liberacin del neurotransmisor
en la unin neuromuscular, empleando el msculo cutaneous pectoris (rpidas), y
usando como modelo animal la rana y adems, determinar la presencia del receptor
en las fibras musculares esquelticas, tanto lentas como rpidas. Sin duda, esto
constituye un estudio interesante para comprender mejor las acciones asociadas al
efecto motor producido por los canabinoides. Por otro lado, mediante el uso de
antagonistas selectivos para cada tipo de receptor sensible a canabinoides se
posibilita determinar su presencia en un estado tnicamente activo, de manera
similar a como ha sido descrito en otros tejidos. En este sentido, el uso de
antagonistas como el AM281 (CB
1
) y el AM630 (CB
2
) contribuira a complementar la
26
descripcin de la accin de los agonistas de receptores sensibles a canabinoides en
el msculo esqueltico.





























27







HIPTESIS


Los canabinoides modifican la liberacin de transmisor en la unin
neuromuscular de la rana, a travs de los receptores sensibles a canabinoides
asociados a protenas G.


















28
OBJETIVOS


Objetivo General

Caracterizar los efectos de los canabinoides sobre la transmisin sinptica en
la unin neuromuscular y determinar la presencia de receptores sensibles a
canabinoides en las fibras musculares esquelticas de anfibio.


Objetivos especficos

1.- Identificar la presencia de ARNm que codifica para el receptor a canabinoides
(CB
1
) en fibras musculares rpidas y lentas de la Rana.
2.- Investigar el efecto de los agonistas de los receptores a canabinoides WIN55212-
2 (CB
1
y CB
2
) y ACPA (CB
1
), sobre la frecuencia de aparicin y la amplitud de los
potenciales miniatura, en la preparacin neuromuscular del msculo cutaneous
pectoris de la rana.
3.- Conocer si el efecto de los agonistas de los receptores a canabinoides es inhibido
por antagonistas selectivos, tanto para el receptor CB
1
(AM281) como para el
receptor CB
2
(AM630).
4.- Estudiar si el efecto de los canabinoides es a travs de protenas G
i/o
, estudiando
los canabinoides en msculos previamente tratados con la toxina pertussis, que se
conoce bloquea estas protenas.
5.- Estudiar el efecto de bloqueadores de canales de Ca
2+
sobre la frecuencia de
aparicin y la amplitud de los potenciales miniatura en la unin neuromuscular de la
rana, en conjunto con los canabinoides, para dilucidar si el mecanismo de accin de
los canabinoides ocurre a travs del bloqueo de los canales de Ca
2+
de la terminal
presinptica.


29
METODOLOGA


Para determinar la presencia del receptor a canabinoides CB
1
en fibras
musculares esquelticas, se utilizaron en los experimentos clulas cultivadas
HEK293 y ranas adultas de la especie Rana pipiens. Las ranas fueron utilizadas de
acuerdo a las normas para el manejo de animales del Institute for Laboratory Animal
Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De las ranas
una vez sacrificadas, se disecaron los msculos cruralis (fibras lentas) y el extensor
digitorum longus (fibras rpidas). Para explorar el efecto de los canabinoides sobre la
liberacin de transmisor (potenciales miniatura) se utiliz la unin neuromuscular del
msculo cutaneous pectoris.


A) Diseccin: Las ranas fueron sacrificados por decapitacin, disecando los
msculos de inters de acuerdo a Huerta y Stefani (1986). Los msculos (cutaneous
pectoris) fueron colocados en una caja de Petri con fondo de resina transparente
(Sylgard) e inmersos en solucin Ringer normal (ver soluciones ms adelante). Los
msculos fueron fijados con alfileres entomolgicos al fondo de la caja de Petri y bajo
microscopio estereoscpico se obtuvieron las preparaciones libres de fascia y tejido
conectivo mediante diseccin fina.



B) Deteccin de ARNm para el receptor CB
1
: En los mtodos de extraccin de
ARN que se utilizaron, las soluciones y los materiales estaban totalmente libres de
ARNasas. Por ello, se trataron todos los recipientes con NaOH 0.2 M por un tiempo
mnimo de 15 minutos, y posteriormente fueron lavados con agua milliQ libre de
ARNasas. Se utilizaron guantes durante todo el proceso de la extraccin.

30
1.- Extraccin de ARN: Para la extraccin de ARN los msculos fueron congelados
con nitrgeno lquido, pulverizados en un mortero con pistilo y colocados en 1 ml de
Trizol (Tiocianato de Guanidinio y Fenol, Invitrogen Life Technologies, USA)
[Chomczynski y Sacchi, 1987]. Posteriormente se agregaron 0.2 ml de cloroformo, se
agit en vrtex por 30 segundos a mxima velocidad, se incub a temperatura
ambiente por 3 minutos y se centrifug a 10,000g/15 min/4
o
C (12,000 rpm). La fase
acuosa fue transferida a un tubo nuevo y se agregaron 0.5 ml de isopropanol. Se
agit por inversin e incub a temperatura ambiente por 10 minutos. Despus de
centrifugar a 13,000g/10 min/4
o
C (16,000 rpm) se elimin el sobrenadante por
decantacin y se lav con 0.5 ml de etanol al 75%. Finalmente, se elimin el etanol
con un sistema de vaco, el ARN total se resuspendi en 50 l de agua tratada con
dietilpirocarbonato (H
2
O-DEP), y se cuantific en un Biofotmetro eppendorf (Ausubel
y cols., 2003).


2.- RT- PCR: La presencia de ARNm que codifica para el receptor CB
1
fue
determinada por RT-PCR convencional y Tiempo Real empleando el kit
SuperScript One-Step RT-PCR (Invitrogen Life Technologies, USA). Primeramente
se disearon primers en nuestro laboratorio tomando las secuencias de Entrez
Nucleotide del National Center of Biotechnology information (NCBI) con clave de
acceso AY098532. Posteriormente los primers fueron construidos por GibcoBRL/Life
Technologies. Los primers diseados para reconocer la secuencia de CB
1
son los
siguientes:

Primer sentido: 5-GCAGTGTAATTTTTGTCTACAG-3
831-850
Primer antisentido: 5-GAGGGCCCCAACAAATGATT-3
1390-1409



31
Para realizar la RT-PCR, cada una de las muestras de ARN total fue colocada
en un cctel que contena lo siguiente:
Componentes Volumen/50 l Concentracin final
Reaction Mix 2X 25 l 1X
RNA total 2 l 1 g
Primer sentido 1 l 0.2 M
Primer antisentido 1 l 0.2 M
RT/Platinum

Taq mix 1 l ---------


MgSO
4
5 mM 1 l ---------
Agua destilada autoclave a 50 l ---------


Luego, el contenido de este cctel se mezcl asegurndose que todos los
componentes se encontraban al fondo del tubo. Para realizar la RT-PCR
Convencional se emple un Termociclador (Bio-Rad mod. iCycler) y para la RT-PCR
Tiempo Real un Termociclador (Rotor-Gene 3000). El termociclador se program
para que la sntesis de cDNA fuera seguida inmediatamente por la amplificacin con
PCR de manera automtica. Para sintetizar y predesnaturalizar el cDNA. Se ejecut
un ciclo durante 30 minutos a 50
o
C seguido de un ciclo por 2 minutos a 94
o
C.
Luego, se aplicaron 40 ciclos para la amplificacin del cDNA. Cada ciclo consisti en
lo siguiente: 15 s a 94
o
C, 30 s a 50
o
C y 1 min a 72
o
C, con un ciclo de extensin
final de 8 minutos a 72
o
C. Con el producto de la amplificacin se realiz
electroforesis en gel de agarosa al 1 %. El cDNA amplificado se mezcl con el buffer
de carga (Ficoll 20 %, EDTA 500 mM pH 8.0, Azul de Bromofenol 0.05 % y Azul de
Xilencianol 0.1 %) y se corrieron los geles durante 2 horas a 110 V en una cmara
horizontal, emplendose como buffer de corrimiento TBE 1X (Tris base 50 mM,
H
3
BO
3
50 mM, EDTA 2.5 mM, pH 8.3). El tamao esperado para el ARNm de CB
1

fue de 579 pb y se compar con el de -actina de 1053 pb. Los geles fueron teidos
con Bromuro de Etidio (10 mg/ml) y las imgenes fueron adquiridas con un
transiluminador UV con el programa Gel doc (Bio-Rad, USA) y analizadas utilizando
32
el software Quantity One versin 9.2.1 (Bio-Rad, USA). En la RT-PCR Tiempo real se
utilizaron muestras de ARNm de concentracin conocida para calcular la
concentracin de ARNm de CB
1
de cada una de las muestras. Mediante el software
Rotor Gene 5 se realiz el anlisis para obtener la concentracin de dichas muestras.


3.- Transfeccin de Clulas HEK293 con CB
1
: En la determinacin del ARNm para
CB
1
se emplearon como control negativo clulas HEK293 y como control positivo las
mismas clulas, pero transfectadas con CB
1
(Donado por la Dra. Deborah Lewis,
Medical College of Georgia, Augusta, GA, USA). Antes de transfectar las clulas
HEK293 amplificamos el plsmido con el fin de tener la cantidad suficiente para la
transfeccin. Para esto se emple el Kit Invitrogen S.N.A.P.

MidiPrep. Para la
transfeccin, las clulas fueron cultivadas en cajas de Petri con medio de cultivo
completo de Dubbelco (DMEM, GibcoBRL) adicionado con 10% de suero bovino fetal
(GibcoBRL) y mantenidas a 37
o
C en una atmsfera de 95% O
2
y 5% CO
2
. Las
clulas fueron transfectadas (va precipitacin con CaCl
2
) con CB
1
humano insertado
en el vector de expresin de mamfero PCI (Promega, Madison, Wis, USA) y
expresado bajo el control de un promotor citomegalovirus (CMV). Primero, se
precipit el DNA con acetato de sodio y etanol permitiendo secarse perfectamente.
La pastilla de DNA se resuspendi en un ml de HBS estril con vrtex. Se
adicionaron 62 ml de CaCl
2
2 M y se incub 30 minutos a temperatura ambiente, sin
mover. A las clulas HEK293 en monocapa se les retir el medio de cultivo y se
adicion la mezcla de transfeccin gota a gota. Se dej incubar 30 minutos a
temperatura ambiente y se agregaron 5 ml de medio completo. Nuevamente se
incub durante 4 horas a 37
o
C y finalmente se les cambi el medio de cultivo e
incubaron a 37
o
C durante 3-4 das para verificar la transfeccin mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1 %.




33
C) Efecto de los Canabinoides sobre la transmisin sinptica

1.- Registro del potencial miniatura de placa terminal: Se utiliz un amplificador
corriente-voltaje (Axoclamp 2B, Axon Instruments, Foster City, CA, USA) y, a travs
de un microelectrodo de vidrio (A-M Systems, Inc., Sequim, WA, USA) lleno de KCl
3M e insertado en la regin de la placa terminal del msculo cutaneous pectoris de la
rana, se registraron los potenciales generados espontneamente por la liberacin
cuntica del transmisor antes y despus de la aplicacin de las drogas de prueba. El
recambio de las soluciones se realiz a travs de una llave de tres vas y las
soluciones fueron retiradas de la cmara a travs de un sistema de succin. Las
seales se digitalizaron a travs de una interfase analgico-digital (Digidata 1322A,
Axon Instruments). Los registros eran visualizados y almacenados en una
computadora (HP, Pentium III) para su posterior anlisis. Para adquirir los registros
se emple la subrutina Clampex y para el anlisis la subrutina Clampfit del programa
pClamp (versin 9.2 de Axon Instruments).


2.- Accin de los canabinoides: Se prob la accin de los canabinoides ACPA y
WIN 55212-2 (Tocris Bioscience, Ellisville, MO, USA) con concentraciones variables
para construir una curva dosis-respuesta, explorando rangos desde 0.01 a 50 M y
se explor tambin el efecto de los antagonistas AM281 y AM630 (Tocris Bioscience)
a una concentracin de 1 M. En todos los experimentos en que se emple el ACPA,
una vez que lo adicionamos a la preparacin, continuamos el experimento en
oscuridad debido a que este canabinoide es fotosensible.


3.- Efecto de la Toxina pertussis: Los msculos fueron incubados en solucin
Ringer normal que contena toxina pertussis (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 2 g/ml
durante 22 a 24 horas a 4
o
C (Sigiura y Ko, 1997). A esta temperatura las fibras
musculares se conservan en mejor estado que a temperatura ambiente. Despus de
la incubacin, se realizaron experimentos en presencia de los canabinoides.
34
4.- Efecto de bloqueadores de canales de Ca
2+
: Se utiliz la -conotoxina-GVIA
(Sigma) preparada en solucin acuosa 0.5 mg/ml, a una concentracin de 5 M para
bloquear los canales de Ca
2+
tipo N y la Nifedipina (Sigma) 10 M para bloquear los
canales de Ca
2+
tipo L. Para el caso de la Nifedipina, su manipulacin y aplicacin a
la preparacin fueron realizadas en oscuridad, ya que esta droga tambin es
fotosensible, realizando el resto del experimento en las mismas condiciones.


5.- Soluciones: En los experimentos se utilizaron las siguientes soluciones:
La solucin Ringer normal tena la siguiente composicin (en mM): NaCl,
117.5; KCl, 2.5; CaCl
2
, 1.8. El pH fue ajustado a 7.4 con Imidazol-Cl (2mM).
A la solucin anterior se le agreg el volumen necesario de los agonistas a
canabinoides ACPA y WIN 55212-2, as como de los antagonistas AM281 y AM630,
para obtener las concentraciones requeridas de cada uno de ellos. Estas drogas
fueron preparadas previamente como soluciones madre 10 mM, diluidas en
dimetilsulfxido (DMSO) o etanol, siendo la concentracin de estos diluyentes
<0.01% (Velasco y cols., 2003). Las soluciones fueron almacenadas a 20

C hasta
su uso. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (22-24

C).
En cuanto a los bloqueadores de canales de Ca
2+
, se prepar una solucin
stock de Nifedipina a una concentracin de 100 mM en etanol. La -conotoxina-GVIA
fue preparada a una concentracin de 0.5 mg/ml. Estas drogas fueron adicionadas a
la solucin Ringer normal para obtener las concentraciones requeridas de cada una
de ellas.
La toxina pertussis fue preparada en albmina de suero bovino (Sigma) 5
mg/ml, a una concentracin de 50 g/ml y se adicion a la solucin Ringer normal
para obtener la concentracin requerida para los experimentos (2 g/ml).


6.- Medicin y Anlisis: En los registros de potencial miniatura se midi la amplitud,
as como la frecuencia de aparicin de estos potenciales antes y despus de la
aplicacin de las drogas, utilizando la subrutina Clampfit de pClamp 9.2 (Axon
35
Instruments). Se elaboraron las grficas del efecto de cada uno de los frmacos
probados con respecto al tiempo utilizando el programa Sigmaplot 9.0. Para realizar
la curva dosis-respuesta se utiliz el programa Origin 6.0 y los datos se ajustaron a la
ecuacin de Hill:

I=Imax/(1+(EC
50
/x)
h
)

Donde I es el porcentaje de inhibicin, Imax es el valor mximo de inhibicin, EC
50
es
la concentracin efectiva media, x es la concentracin de la droga y h representa el
coeficiente de Hill. En el caso de la frecuencia de aparicin de los potenciales
miniatura, se prob la significancia de los promedios mediante la prueba t de student,
considerando como significativos aquellos valores de p < 0.05 en los efectos antes y
despus de la aplicacin de cada uno de los canabinoides. En el caso de la amplitud
se elaboraron histogramas de amplitud acumulativa para determinar la distribucin
de los potenciales miniatura empleando la subrutina Clampfit 9.2 y se realiz el
anlisis estadstico de estos datos empleando la prueba de Kolmogorov-Smirnov,
considerando una p < 0.05 (Liang y cols., 2004; Szabo y cols., 2004).














36
RESULTADOS

Deteccin de ARNm para CB
1
por RT-PCR convencional y RT-PCR Tiempo Real
Mediante la tcnica RT-PCR convencional determinamos la presencia de
ARNm para el receptor CB
1
en las fibras musculares esquelticas rpidas y en las
fibras musculares lentas de rana. De igual manera, luego de haber transfectado
clulas HEK293 con ADNc de CB
1
, stas expresan el ARNm para dicho receptor. En
la Figura 11 se muestra la imagen de un gel de agarosa representativo de un
experimento, en el cual se corrieron los productos de la RT-PCR. En la lnea 1, se
observa el marcador de pares de bases empleado ( DNA/Hind III); en las lneas 2 y
3, clulas HEK293 sin transfectar y transfectadas, respectivamente; y en las lneas 4
y 5, los msculos rpido (EDL) y fascculo lento (cruralis). Para comprobar el buen
estado de nuestras muestras, el cctel para la RT-PCR contena los primers para -
actina. En el gel podemos observar que en todas las muestras se encuentra la banda
correspondiente a la -actina. Adems, en las clulas HEK293 sin transfectar (lnea
2) no se observa la banda que correspondera a CB
1
. Se puede apreciar tambin que
la intensidad de la banda de CB
1
, correspondiente a las clulas HEK293
transfectadas, es muy parecida a la banda que corresponde a las fibras musculares
rpidas. El tamao esperado para el ADN del receptor CB
1
fue de 579 pb y el de -
actina 1053 pb.

Figura 11.- Gel representativo en el que se corrieron muestras de ADN de -actina (control) y de CB
1

en: 1) DNA/Hind III, 2) clulas HEK293, 3) HEK293 transfectadas con CB
1
, 4) los msculos EDL y 5)
cruralis de rana.
23130
9416
6557
4361
2322
2027
564
-Actina
CB
1
37
En la Figura 12 se muestra la grfica obtenida de la relacin de ARNm de
CB
1
/ARNm de actina para cada una de las muestras, obtenida sta del anlisis de
los geles de agarosa al 1%. En las clulas HEK293 no transfectadas, la relacin dio
un valor de 0.11 0.04, mientras que en las clulas transfectadas con el CB
1

humano esta relacin fue mayor: 0.96 0.01. En las muestras de rana, en las fibras
rpidas (EDL) y lentas (cruralis) observamos una relacin 2:1 aproximadamente, 0.99
0.03 y 0.51 0.10, respectivamente (n = 6).

0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
E
x
p
r
e
s
i

n

A
R
N
m

C
B
1
/
E
x
p
r
e
s
i

n

A
R
N
m

a
c
t
i
n
a
HEK293 HEK293
Transf
EDL Cruralis


Figura 12.- Promedios de la expresin de ARNm para CB
1
en clulas HEK293, HEK293 transfectadas
con CB
1
, de los msculos EDL y cruralis de rana.


Se realiz un experimento empleando la tcnica de RT-PCR Tiempo Real. En
la grfica de la Figura 13 se muestran los resultados del experimento con el equipo
de RT-PCR Tiempo Real. La lnea superior corresponde a la muestra de msculo
rpido de rana, y se observa que alrededor del ciclo 25 comienza a aparecer la
fluorescencia que nos indica el inicio del proceso de multiplicacin del ADN. La lnea
inferior corresponde a la muestra del msculo lento de rana. Para esta muestra, la
fluorescencia aparece alrededor del ciclo 27. De esta manera, el hecho de que
aparezca fluorescencia primero en la muestra del msculo rpido, nos indica que hay
una mayor concentracin de ARNm de CB
1
que en el msculo lento. Los valores
38
obtenidos de concentracin de ARNm fueron de 5.07 g/l para el msculo rpido y
2.60 g/l para el msculo lento o tnico de la rana. Estos valores nos indican una
relacin aproximada de 2:1, lo que concuerda con los resultados semicuantitativos
obtenidos por RT-PCR convencional.



Figura 13.- Expresin de ARNm para CB
1
RT-PCR Tiempo Real. El trazo superior corresponde a la
expresin de ADNc del receptor CB
1
en el msculo EDL. El trazo inferior corresponde a la expresin
de ADNc del receptor CB
1
en el msculo cruralis. La expresin de ADNc en el EDL fue
aproximadamente el doble que en el cruralis.











Fluorescencia
Ciclo
39
Efecto de canabinoides sintticos sobre la liberacin de transmisor en la unin
neuromuscular de rana

Curva dosis efecto obtenida con WIN 55,212-2
Al estudiar el efecto de WIN 55,212-2 sobre la frecuencia de aparicin y
amplitud de los potenciales miniatura registrados en la unin neuromuscular del
msculo rpido cutaneous pectoris, observamos una disminucin en ambos
parmetros, siendo este efecto dependiente de la concentracin. El rango de
concentracin explorada fue entre 0.1 y 50 M. El efecto de este canabinoide
comenz a una concentracin de 1 M, llegando a un efecto mximo con 50 M. Al
realizar la curva dosis-efecto encontramos un valor de EC
50
(Concentracin efectiva
media) de 5.8 1.0 M, de acuerdo a la ecuacin de Hill (Figura 14). El Imax
obtenido con esta ecuacin fue de 52.68 3.26 M y la constante de Hill 0.96 0.11.
Se utiliz una sola dosis en cada experimento. El nmero de experimentos fue entre
4 y 6 para cada una de las dosis exploradas.















Figura 14.- Curva dosis-efecto del canabinoide sinttico WIN55,212-2. La EC
50
calculada con la
ecuacin de Hill fue de 5.8 1.0 M. La Imax fue de 52.68 3.26 M y la constante de Hill 0.96
0.11.
0,01 0,1 1 10 100
0
10
20
30
40
50
I
n
h
i
b
i
c
i

n

d
e

l
a

F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

(
%
)
Concentracin de WIN55,212-2 (M)
I = Imax/(1+(EC
50
/x)
h
)
40
Efecto del WIN 55,212-2
Para ver el efecto de WIN 55,212-2 se realiz el registro de potenciales
miniatura cada 5 minutos. Primeramente se registraron estos potenciales durante 15
minutos en solucin Ringer normal; posteriormente se agreg WIN a concentraciones
de 0.1-50 M y se continu registrando cada 5 minutos durante media hora. Se utiliz
una sola dosis en cada experimento. En la Figura 15 (A y B) se muestran las grficas
de los datos obtenidos al registrar los potenciales miniatura en ausencia y presencia
de WIN 10 M.

A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
WIN 10 M
* *
*
*
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
WIN 10 M
* *
* *
*


C


Figura 15.- Efecto de WIN (10 M) sobre los potenciales miniatura. A y B) Grficas de amplitud y
frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura. C) Trazos representativos de los experimentos
realizados en presencia de WIN.
41
Con esta concentracin de WIN, la amplitud disminuy hasta un valor de
89.4% 2.9%, mientras que la frecuencia disminuy hasta un valor de 74.7% 3.2%
con respecto al control. La disminucin en la amplitud fue significativa despus de 15
minutos (P = 0.021), mientras que la disminucin de la frecuencia es significativa a
los 10 minutos (P = 0.001; n = 4). En C, se muestran trazos representativos de estos
experimentos.


Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de PTX
Para determinar si el efecto de WIN era a travs de la activacin de protenas
G se incub el msculo cutaneous pectoris con la toxina pertussis (2 g/ml) durante
22-24 horas a 4
o
C. Despus de esto se realizaron los experimentos en presencia de
WIN (10 M) de la misma manera en que se realizaron los anteriores experimentos,
resultando que el WIN no tuvo ningn efecto significativo sobre la frecuencia de
aparicin ni en la amplitud de los potenciales miniatura (P > 0.05; n = 4). Los valores
de amplitud y frecuencia encontrados a los 30 minutos de registrar datos en
presencia de WIN fueron de 101.3% 6.3% y 101.2% 5.6%, respectivamente
(Figura 16). Esto nos sugiere que el efecto de WIN es mediado por protenas G
i/o
,
puesto que su efecto fue bloqueado al inactivar dichas protenas.

A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
WIN 10 M
PTX 2 g/ml
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
WIN 10 M
PTX 2 g/ml


Figura 16.- Efecto de WIN (10 M) despus de incubar el msculo con Toxina pertussis (2 g/ml)
durante 22-24 horas a 4
o
C.
42
En la siguiente Figura se muestran registros obtenidos durante un experimento
realizado en un msculo tratado previamente con toxina pertussis (2 g/ml).
Podemos observar que tanto la frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura
como su amplitud se mantienen a valores similares 30 minutos despus de la adicin
de WIN (10 M).


Figura 17.- La presencia de WIN en un msculo tratado con Toxina pertussis no provoca cambios
significativos sobre la frecuencia de aparicin ni en la amplitud de los PMPT.


Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de AM630

Para determinar si el efecto de WIN era mediado por los receptores CB
2
, se
emple el AM630 (1 M), un antagonista especfico de estos receptores. Despus de
incubar con AM630 durante 5 minutos previos a la adicin de WIN, no se produjo
ningn cambio significativo en el efecto de WIN. En presencia de este antagonista, el
WIN contina ejerciendo su efecto sobre la amplitud y la frecuencia de los
potenciales miniatura (Figura 18). Los valores de amplitud a los 30 minutos son de
90.8% 3.4% (P = 0.028) y de la frecuencia 75.5% 5.1% (P = 0.023), con respecto
al control (n = 5). Esto nos sugiere que el efecto de WIN no es mediado por los
receptores CB
2
. Adicionalmente, se realizaron experimentos en presencia
nicamente de AM630 a una concentracin de 1 M para determinar su efecto sobre
los potenciales miniatura, y no se observ ningn cambio significativo (datos no
mostrados; P > 0.05; n = 4).
43
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
* *
*
*
WIN 10 M
AM630 1 M

Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
F
r
e
c
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e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
*
*
*
*
*
WIN 10 M
AM630 1 M


C


Figura 18.- Efecto de WIN (10 M) en presencia de AM630 (1 M) sobre los potenciales miniatura. A
y B) grficas de amplitud y frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura. C) Trazos
representativos de estos experimentos. El antagonista de los receptores CB
2
no evita el efecto de
WIN.


Efecto del WIN 55,212-2 en presencia de AM281

Para determinar si el efecto de WIN es mediado por los receptores CB
1
, se
emple el antagonista especfico de estos receptores, el AM281, a una concentracin
de 1 M. Debido a que el AM281 acta como agonista inverso en algunas
preparaciones; es decir, causa un efecto por s mismo contrario al de los agonistas,
primeramente se realizaron experimentos slo con AM281 (1 M) y no observamos
44
ningn cambio significativo sobre los parmetros estudiados (datos no mostrados; P
> 0.05; n = 4). Despus de comprobar que el AM281 a esta concentracin no ejerce
ningn efecto sobre los potenciales miniatura, registramos los potenciales miniatura
en condiciones control y despus incubamos el msculo durante 5 minutos con 1 M
de AM281 y adicionamos WIN (10 M) (Figura 19). En estos experimentos no se
observa una disminucin significativa en la amplitud ni en la frecuencia de los
potenciales miniatura, 98.1% 5.0% y 96.7% 2.8%, respectivamente (P > 0.05; n =
4), lo que nos indica que el efecto de WIN es mediado por los receptores CB
1
.

A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
WIN 10 M
AM281 1 M
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
F
r
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c
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e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
WIN 10 M
AM281 1 M


C

Figura 19.- Efecto de WIN (10 M) en presencia de AM281 (1 M) sobre los potenciales miniatura. A
y B) Grficas de amplitud y frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura. C) Trazos
representativos de esta serie de experimentos. El antagonista de los receptores CB
1
evita el efecto de
WIN anteriormente observado.


45
En la Figura 20 se resumen los resultados obtenidos en los experimentos en
que se explor el efecto de WIN 55,212-2 (10 M). Podemos observar que la
presencia de WIN (10 M) causa una reduccin significativa, tanto de la amplitud
como de la frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura. Estos efectos de
WIN fueron bloqueados tanto por el tratamiento con PTX como por la presencia del
antagonista de los receptores CB
1
(AM281). Mientras que en presencia del
antagonista de CB
2
(AM630), el WIN causa un efecto similar que en ausencia del
antagonista.

A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
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(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
C
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n
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r
o
l
W
I
N

1
0

M
W
I
N

1
0

M

+
P
T
X

2

g
/
m
l
W
I
N

1
0

M

+
A
M
6
3
0

1

W
I
N

1
0

M

+
A
M
2
8
1

*
*
F
r
e
c
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e
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c
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a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
C
o
n
t
r
o
l
W
I
N

1
0

M
W
I
N

1
0

M

+
P
T
X

2

g
/
m
l
W
I
N

1
0

M

+
A
M
6
3
0

1

W
I
N

1
0

M

+
A
M
2
8
1

*
*


Figura 20.- Resumen del efecto de WIN sobre los potenciales miniatura. Se observa el efecto de WIN
tanto en la amplitud como en la frecuencia de los potenciales miniatura. Este efecto fue bloqueado por
el tratamiento con la PTX o la presencia del antagonista de CB
1
AM281. La presencia del antagonista
de CB
2
no bloquea el efecto del WIN.











46
Curva dosis efecto obtenida con ACPA

Cuando estudiamos el efecto de un agonista especfico de los receptores a
canabinoides CB
1
(el ACPA) observamos una disminucin de la amplitud y la
frecuencia de los potenciales miniatura dependiente de la concentracin. El efecto de
ACPA comenz a una concentracin de 20 nM y lleg a un mximo efecto con una
concentracin de 10 M. En la Figura 21 se muestra la curva dosis-efecto con la cual
encontramos un valor de EC
50
de 115.5 6.5 nM, de acuerdo a la ecuacin de Hill. El
Imax obtenido con esta ecuacin fue de 67.94 0.78 M y la constante de Hill 1.40
0.10. En cada experimento se emple solamente una concentracin de ACPA. El
nmero de experimentos fue entre 4 y 6 para cada una de las dosis exploradas.














Figura 21.- Curva dosis-efecto con el agonista selectivo de CB
1
ACPA. La EC
50
calculada con la
ecuacin de Hill es de 115.5 6.5 nM. La Imax fue de 67.94 0.78 M y la constante de Hill 1.40
0.10.


Efecto del ACPA
Para determinar el efecto de ACPA se realiz el mismo procedimiento que
cuando se emple el WIN, registrando los potenciales miniatura cada 5 minutos.
1E-3 0,01 0,1 1 10 100
0
10
20
30
40
50
60
70
Concentracin de ACPA (M)
I
n
h
i
b
i
c
i

n

d
e

l
a

F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

(
%
)
I = Imax/(1+(EC
50
/x)
h
)
47
Despus de registrar los potenciales miniatura durante 15 minutos en solucin Ringer
normal, se agreg ACPA a concentraciones desde 0.01 hasta 50 M y se continu
registrando cada 5 minutos durante media hora. En cada experimento se emple
solamente una concentracin de ACPA. En la Figura 22 se muestran las grficas (A y
B) y trazos representativos (C) de los resultados obtenidos al emplear 1 M de
ACPA. La disminucin, tanto en la amplitud como en la frecuencia de aparicin de los
potenciales miniatura es significativa desde el primer registro (n = 5). Esta
disminucin se vuelve estable a partir de los 30 minutos siendo los valores en la
amplitud de 64.8% 10.1% (P = 0.0049) y en la frecuencia 36.9% 2.9% (P = 1.8 X
10
-6
) con respecto al control.

A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
ACPA 1 M
*
*
*
*
*
*
*
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
ACPA 1 M
*
*
*
*
*
*
*


C

Figura 22.- Efectos de ACPA (1 M) sobre los potenciales miniatura. A) Grficas de amplitud y B)
frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura. Ambos parmetros disminuyen rpidamente al
adicionar el ACPA. C) Trazos representativos de esta serie experimental.
48
En la siguiente Figura (23) se muestra la grfica de probabilidad acumulativa
obtenida de los potenciales miniatura registrados en condiciones control (lnea
continua) y despus de agregar ACPA (lnea punteada). Se puede observar que en
presencia de ACPA hay un desplazamiento de la curva hacia la izquierda, el cual
corresponde a una menor amplitud de los potenciales miniatura registrados en
presencia de este canabinoide (P < 0.001, prueba de KolmogorovSmirnov).

Amplitud (mV)
0 0.5 1
P
r
o
b
a
b
i
l
i
d
a
d

A
c
u
m
u
l
a
t
i
v
a
0
0.5
1


Figura 23.- Grfica de Probabilidad acumulativa para ACPA. La lnea continua representa la amplitud
de los potenciales miniatura en condiciones control. La lnea punteada corresponde a la amplitud en
presencia de ACPA (1 M). En la parte inferior derecha se muestra un potencial miniatura registrado al
tiempo 0 (control, trazo azul) y un potencial miniatura registrado 30 minutos despus de agregar ACPA
(trazo rojo).


Efecto del ACPA en presencia de PTX
Al realizar experimentos despus de incubar con la toxina pertussis (2 g/ml)
para determinar si el efecto de ACPA es a travs de protenas G
i/o
, observamos que
el ACPA no tuvo efecto significativo sobre la amplitud y la frecuencia de aparicin de
los potenciales miniatura (P > 0.05; n = 4), siendo los valores para la amplitud
100.6% 5.8% y para la frecuencia 100.7% 3.6%. En la Figura 24, en A y B se
muestran las grficas de amplitud y de frecuencia, respectivamente, obtenidas con
los datos de estos experimentos y en C se muestran trazos representativos. Estos
resultados indican que el efecto de ACPA es mediado por protenas G
i/o
.

49
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100
120
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T

(
%
)
ACPA 1 M
PTX 2 g/ml

Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
ACPA 1 M
PTX 2 g/ml


C

Figura 24.- Efecto de ACPA (1 M) en presencia de PTX (2 g/ml) sobre los potenciales miniatura. A
y B) Grficas de amplitud y frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura. C) Trazos
representativos de estos experimentos.


A continuacin se muestra la grfica de distribucin obtenida en los
experimentos con ACPA en msculos tratados con PTX (Figura 25). Puede ser
observado que en estos experimentos, el tratamiento previo con PTX bloquea el
efecto del ACPA sobre la amplitud de los potenciales miniatura, de tal manera que no
hay diferencia significativa en la probabilidad acumulativa con respecto al control (P =
0.92, prueba de KolmogorovSmirnov).


50
Amplitud (mV)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
P
r
o
b
a
b
i
l
i
d
a
d

A
c
u
m
u
l
a
t
i
v
a
0
0.5
1


Figura 25.- Grfica de Probabilidad acumulativa para ACPA en presencia de PTX. La lnea continua
representa a la amplitud de los potenciales miniatura en condiciones control. La lnea punteada
corresponde a la amplitud registrada en presencia de ACPA (1 M) en msculos tratados con PTX. En
la parte inferior derecha se muestra un potencial miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y
un potencial miniatura registrado 30 minutos despus de agregar ACPA en un msculo tratado con
PTX (trazo rojo).


Efecto del ACPA en presencia de AM281

Cuando realizamos experimentos con ACPA (1 M) despus de incubar 5
minutos previamente con el antagonista de los receptores CB
1
, el AM281 (1 M), el
efecto de ACPA fue bloqueado casi completamente. La disminucin que permanece
no es significativa (P > 0.05; n = 4). La amplitud promedio tiene un valor de 95.2%
3.2%, mientras que la frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura tiene un
valor de 95.9% 4.1% con respecto al control (Figura 26). De la misma manera, en
las grficas de distribucin de los potenciales miniatura (Figura 27), no se observa
diferencia significativa en presencia de ACPA + AM281 comparado con el control (P
> 0.05, prueba de Kolmogorov-Smirnov).




51
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100
120
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T

(
%
)
ACPA 1 M
AM281 1 M

Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
ACPA 1 M
AM281 1 M



C

Figura 26.- Efecto de ACPA (1 M) en presencia de AM281 (1 M) sobre los potenciales miniatura. A
y B) El antagonista de los receptores CB
1
evita el efecto de ACPA anteriormente observado sobre la
amplitud y frecuencia de los potenciales miniatura. C) Trazos representativos de esta serie
experimental.







52
Amplitud (mV)
0 0.5 1 1.5 2
P
r
o
b
a
b
i
l
i
d
a
d


A
c
u
m
u
l
a
t
i
v
a
0
0.5
1


Figura 27.- Grfica de Probabilidad acumulativa para ACPA en presencia de AM281. La lnea
continua representa a la amplitud de los potenciales miniatura en condiciones de control. La lnea
punteada corresponde a la amplitud en presencia de ACPA (1 M) y AM281 (1 M). En la parte
inferior derecha se muestra un potencial miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y un
potencial miniatura registrado 30 minutos despus de agregar ACPA en presencia del antagonista
AM281 (trazo rojo).


En la Figura 28 se resumen los datos obtenidos en los experimentos
empleando ACPA (1 M). La primera barra corresponde al control registrado al inicio
de los experimentos, mientras que las otras barras corresponden a los datos
obtenidos en cada una de las diferentes condiciones experimentales en que se
emple el ACPA. La adicin de ACPA al bao caus una disminucin significativa,
tanto en la amplitud como en la frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura.
Este efecto fue bloqueado cuando los msculos fueron tratados con PTX o con el
antagonista de CB
1
(AM281). Sin embargo, la presencia del antagonista de CB
2

(AM630) no bloquea el efecto de ACPA.






53
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
Control
ACPA 1 M ACPA 1 M +
PTX 2 g/ml
ACPA 1 M +
AM281
*
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
*
Control
ACPA 1 M ACPA 1 M +
PTX 2 g/ml
ACPA 1 M +
AM281


Figura 28.- Resumen del efecto de ACPA (1 M) sobre los potenciales miniatura. Se observa la
disminucin significativa en la amplitud y en la frecuencia de los potenciales miniatura en presencia de
ACPA. Este efecto fue bloqueado por el tratamiento con la PTX o la presencia del antagonista de CB
1

AM281. La presencia del antagonista de CB
2
no bloquea el efecto del WIN. Las barras corresponden a
los datos obtenidos a los 30 minutos en cada condicin.



Histogramas de distribucin de los potenciales miniatura

A continuacin, en la Figura 29, se muestran los histogramas de distribucin
de la frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura registrados en diferentes
condiciones experimentales. Al lado izquierdo se muestran los histogramas de
frecuencia obtenidos en un experimento, en el cual se emple ACPA a una
concentracin de 1 M. En A podemos observar la distribucin de los potenciales
miniatura en condiciones control al inicio del experimento. En B se muestra cmo en
presencia de ACPA (1 M), la distribucin de los potenciales se corre hacia la
izquierda de la grfica; adems, podemos apreciar la disminucin en el nmero de
eventos comparado con su control (A). Al lado derecho de la figura se muestran los
histogramas de frecuencia obtenidos en un experimento donde se emple el ACPA
(1 M) en presencia de AM281 (1 M). En C se muestra la distribucin de los
potenciales miniatura al inicio del experimento, y en D despus de 30 minutos de
registrar los potenciales en presencia del ACPA y del AM281. Podemos apreciar que
54
en presencia de ACPA y AM281, la distribucin de los potenciales miniatura se
mantiene similar que en condiciones control.



Figura 29.- Histogramas representativos de experimentos realizados en presencia de canabinoides.



En la siguiente Figura (30) se muestran los histogramas de distribucin de los
potenciales miniatura registrados en un experimento, en el cual se incub el msculo
cutaneous pectoris con toxina pertussis. En A se muestra el histograma
representativo obtenido del anlisis del registro hecho al inicio del experimento, el
cual fue registrado en solucin Ringer normal. En B se muestra cmo despus de
registrar durante 30 minutos en presencia de ACPA (1 M), la distribucin de los
potenciales miniatura se mantiene similar a las condiciones de control.


A C
B D
55


Figura 30.- Histograma representativo de un experimento realizado en un msculo previamente
incubado con PTX.












56
Efecto de bloqueadores de canales de Ca
2+
sobre la liberacin espontnea de
transmisor

Nifedipina
Se estudi el efecto de la Nifedipina (10 M), que se sabe bloquea los canales
de Ca
2+
tipo L (Lacinova, 2005; Triggle, 2006), con el fin de determinar si estos
canales de Ca
2+
participan en el proceso de liberacin espontnea de transmisor.
Con la concentracin empleada no se observa ningn efecto sobre los potenciales
miniatura; tanto la amplitud como la frecuencia se mantienen a valores similares que
en solucin Ringer (P > 0.05; n = 4). Los valores promedio para la amplitud y la
frecuencia despus de registrar durante 30 minutos en presencia de Nifedipina
fueron de 98.6% 5.1% y 102.8% 5.7%, respectivamente (Figura 31).

A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
Nifedipina 10 M

Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
Nifedipina 10 M


C

Figura 31.- Registro de potenciales miniatura en presencia de Nifedipina (10 M). A y B) Grficas de
amplitud y frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura. C) Registros representativos de los
experimentos con Nifedipina.
57
En la Figura 32 se muestra la grfica de distribucin y se puede observar que
no hay diferencias significativas en presencia de Nifedipina, si se compara con las
condiciones control (P > 0.05, prueba de Kolmogorov-Smirnov).

Amplitud (mV)
0 0.5 1 1.5
P
r
o
b
a
b
i
l
i
d
a
d

A
c
u
m
u
l
a
t
i
v
a
0
0.5
1


Figura 32.- Grfica de Probabilidad acumulativa para Nifedipina. La lnea continua representa a la
amplitud de los potenciales miniatura en condiciones control. La lnea punteada corresponde a la
amplitud en presencia de Nifedipina (10 M). En la esquina inferior derecha se muestra un potencial
miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y un potencial miniatura registrado 30 minutos
despus de agregar Nifedipina (trazo rojo).



-conotoxina-GVIA
Para determinar la participacin de los canales de Ca
2+
tipo N en la liberacin
espontnea de transmisor, se emple la -conotoxina-GVIA 5 M, que se sabe
bloquea este tipo de canal de Ca
2+
(Kasai, Aosaki y Fukuda, 1987; McCleskey y
cols., 1987; Stocker y cols., 1997; Tsien y cols., 1988). Despus de registrar los
potenciales miniatura durante 15 minutos, se adicion la toxina y observamos una
disminucin tanto en la amplitud como en la frecuencia de los potenciales miniatura.
A los 30 minutos de exposicin con la conotoxina, la amplitud tiene un valor de
85.9% 4.9% (P = 0.028) y la frecuencia 34.4% 5.2% con respecto al control (P =
1.7 X 10
-5
; n = 4; Figura 33).
58
A B
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
* *
*
*
Conotoxina-GVIA 5 M
Tiempo (min)
0 10 20 30 40 50
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120 Conotoxina-GVIA 5 M
*
*
*
*
*
*
*


C

Figura 33.- Efecto de la -conotoxina-GVIA (5 M) sobre la amplitud y la frecuencia de los potenciales
miniatura.


En la Figura 34 se muestra la grfica de probabilidad acumulativa donde se
observa que no hay diferencias en la distribucin de los potenciales miniatura en
presencia de -conotoxina-GVIA con respecto al control (P > 0.05, prueba de
Kolmogorov-Smirnov), indicando que el cambio observado en la amplitud promedio
en presencia de -conotoxina-GVIA es un efecto secundario a la disminucin en la
frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura.


59
Amplitud (mV)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
P
r
o
b
a
b
i
l
i
d
a
d

A
c
m
u
l
a
t
i
v
a
0
0.5
1


Figura 34.- Grfica de Probabilidad acumulativa para -conotoxina-GVIA. La lnea continua
representa la amplitud de los potenciales miniatura en condiciones control. La lnea punteada
corresponde a la amplitud en presencia de -conotoxina-GVIA (5 M). En la parte inferior derecha se
muestra un potencial miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y un potencial miniatura
registrado 30 minutos despus de agregar al bao -conotoxina-GVIA (trazo rojo).


A continuacin se muestra el resumen de los resultados obtenidos a los 30
minutos en la presencia de los bloqueadores de canales de Ca
2+
. En la grfica se
muestra que la Nifedipina no causa ningn cambio significativo en la frecuencia de
aparicin de los potenciales miniatura. Por su parte, la -conotoxina-GVIA causa una
disminucin significativa en la frecuencia de estos potenciales miniatura con respecto
al control (P = 1.7 X 10
-5
; n = 4).








Figura 35.- Efecto de bloqueadores de canales de Ca
2+
sobre los potenciales miniatura. La Nifedipina
no causa ningn cambio significativo en la frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura. Sin
embargo, en presencia de -conotoxina-GVIA (5 M), la frecuencia de aparicin de los potenciales
miniatura disminuye significativamente hasta valores de 34.4% 5.2% con respecto al control.
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
Control Nifedipina
10 M
Conotoxina
GVIA 5 M
*
60
Efecto de ACPA sobre la liberacin espontnea de transmisor despus de
bloquear los canales de Ca
2+
tipo N con -conotoxina-GVIA

Con el fin de determinar si el ACPA disminuye la liberacin espontnea de
transmisor a travs de un mecanismo que involucre la inhibicin de los canales de
Ca
2+
tipo N presentes en la terminal nerviosa motora, realizamos experimentos en los
cuales primeramente bloqueamos estos canales de Ca
2+
con -conotoxina-GVIA
durante 30 minutos. Posteriormente registramos durante 15 minutos ms para tener
nuestra basal y adicionamos al bao el ACPA (1 M). Los resultados que obtuvimos
se muestran en la Figura 36.

A B












C


Figura 36.- El bloqueo de los canales de Ca
2+
tipo N con -conotoxina-GVIA (5 M) por 45 min, evita
el efecto de ACPA (1 M) sobre los potenciales miniatura. Sin embargo, la amplitud de estos
potenciales miniatura es disminuida por ACPA an estando bloqueados los canales de Ca
2+
tipo N.
Time (min)
0 10 20 30 40 50
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

d
e

P
M
P
T

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
Conotoxin-GVIA 5 M
ACPA 1 M
Time (min)
0 10 20 30 40 50
A
m
p
l
i
t
u
d

d
e

P
M
P
T


(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
*
*
*
*
Conotoxin-GVIA 5 M
*
*
ACPA 1 M
61
En la Figura 36 se observa que despus de 30 minutos en presencia de ACPA
no hubo ningn cambio significativo en la frecuencia de aparicin de los potenciales
miniatura (99.6% 2.05%, P > 0.05). Sin embargo, la presencia de ACPA ocasion
una rpida disminucin significativa en la amplitud de estos potenciales miniatura
(74.6% 3.5%, P = 0.002; n = 4), como se observa en la grfica de amplitud de los
potenciales (A) y en los trazos representativos de estos experimentos (C).


En la Figura 37 se muestra la grfica de probabilidad acumulativa obtenida de
los potenciales miniatura registrados despus de bloquear a los canales de Ca
2+
tipo
N (lnea continua) y despus de agregar ACPA (lnea punteada). Se observa que an
estando bloqueados los canales de Ca
2+
tipo N, la presencia de ACPA en el bao
ocasiona un desplazamiento de la curva hacia la izquierda, el cual corresponde a una
menor amplitud de los potenciales miniatura registrados en presencia de este
canabinoide (P < 0.001, prueba de KolmogorovSmirnov).

Amplitud (mV)
0 0.5 1 1.5
P
r
o
b
a
b
i
l
i
d
a
d

A
c
u
m
u
l
a
t
i
v
a
0
0.5
1


Figura 37.- Grfica de Probabilidad acumulativa. La lnea continua representa a la amplitud de los
potenciales miniatura en condiciones control (Canales de Ca
2+
tipo N bloqueados con -conotoxina-
GVIA). La lnea punteada corresponde a la amplitud en presencia de ACPA (1 M). En la esquina
inferior derecha se muestra un potencial miniatura registrado al tiempo 0 (control, trazo azul) y un
potencial miniatura registrado 30 minutos despus de agregar ACPA en un msculo tratado con -
conotoxina-GVIA (trazo rojo).


62
DISCUSIN


Es conocido que los canabinoides, presentes en la marihuana, son los
causantes de los efectos psicotrpicos y motores producidos por el consumo de esta
planta, y se ha establecido tambin que dichos efectos se presentan al interactuar
estos canabinoides con receptores membranales llamados receptores a
canabinoides CB
1
y CB
2
(Begg y cols., 2001; Howlett y cols., 2002). Hasta la fecha se
ha sugerido que los efectos motores de los canabinoides se deben a la accin que
ejercen stos sobre el SNC (Dewey, 1986; Saudo-Pea y cols., 2000), pero an no
se ha estudiado si dichos canabinoides tienen efecto directo sobre los receptores que
pudieran estar presentes en la unin neuromuscular del msculo esqueltico. Por
otro lado, existen trabajos que reportan que los canabinoides provocan disminucin
en la liberacin del transmisor en diferentes modelos experimentales (Engler y cols.,
2006; Liang y cols., 2004; Schlicker y Kathmann, 2001; Szabo y cols., 2004;
Takahashi y Linden, 2000) y que el Tetrahidrocanabinol modifica la amplitud y la
frecuencia de los potenciales miniatura (Kumbaraci y Nastuk, 1980; Turkanis y
Karler, 1986; Van der Kloot, 1994); sin embargo, los resultados de estos trabajos son
contradictorios; por lo tanto, en la presente tesis exploramos el efecto de
canabinoides sintticos sobre la liberacin del transmisor en la unin neuromuscular
esqueltica de la rana y la presencia de los receptores a canabinoides en dicha
unin.
Un indicio de la presencia de los receptores sensibles a canabinoides es
determinar la presencia de ARNm para dichos receptores. Para determinar si en las
fibras musculares esquelticas rpidas de la rana est presente el ARNm para CB
1
,
empleamos las tcnicas RT-PCR convencional y RT-PCR tiempo real. Tambin se
estudi si en las fibras musculares esquelticas lentas se expresa el ARNm para
CB
1
. Como control negativo empleamos clulas HEK293 y como control positivo
transfectamos clulas HEK293 con ADNc de CB
1
humano (ver metodologa). El
anlisis de los resultados obtenidos mediante RT-PCR convencional nos indica la
presencia de ARNm para CB
1
tanto en las fibras esquelticas rpidas como en las
63
lentas de la rana, y que en las fibras rpidas ste se expresa aproximadamente el
doble que en las lentas. Esto fue confirmado empleando la tcnica RT-PCR tiempo
real (ver resultados).
Durante la diseccin retiramos la mayor cantidad posible de tejido conectivo,
vasos sanguneos y terminales nerviosas presentes. Aunque no podemos descartar
que nuestras muestras tuvieran restos de las terminales nerviosas, pensamos que el
ARNm que detectamos est presente en las fibras musculares, que en proporcin es
muchsimo mayor que algunos restos de tejido nervioso que no se hubieran podido
retirar. Adems, las fibras rpidas generalmente son monoinervadas y las fibras
lentas son multiinervadas, de tal manera que si el ARNm que detectamos se debiera
a la presencia en las terminales nerviosas de las uniones neuromusculares,
esperaramos encontrar mayor expresin en las fibras musculares lentas. Sin
embargo, encontramos el doble de expresin de ARNm en las fibras musculares
rpidas que en las fibras musculares lentas.
Por otra parte, para determinar el efecto de los canabinoides sobre la
liberacin del transmisor en la unin neuromuscular, se registraron potenciales
miniatura en ausencia y presencia de agonistas y antagonistas de los receptores a
canabinoides. El primer canabinoide sinttico que empleamos fue el WIN 55,212-2 y
encontramos que causa una disminucin en la amplitud y la frecuencia de aparicin
de los potenciales miniatura con una EC
50
de 5.8 1.0 M. Este valor de EC
50
es
similar en magnitud al reportado en trabajos recientes realizados con modelos
neuronales para determinar su efecto sobre la liberacin de transmisor, en los que se
observan efectos de WIN, en el rango micromolar, mediados por los receptores CB
1

(Kreitzer y Regehr, 2001; Liang y cols., 2004; Szabo y cols., 2004; Takahashi y
Linden, 2000).
Tambin, se conoce que los receptores sensibles a canabinoides, al ser
activados, se acoplan a protenas G
i/o
y stas son bloqueadas por la toxina pertussis
(Bockoch y cols., 1983). La PTX cataliza la ribosilacin de las subunidades de las
protenas G
i
, G
o
, y G
t
. Esto previene la interaccin de los heterotrmeros de las
protenas G con los receptores, bloqueando as su acople y activacin. Esto debido a
que las subunidades G

permanecen en su estado inactivo (unidas a GDP). De esta


64
manera, para determinar si el efecto observado en presencia de WIN es mediado a
travs de protenas G
i/o
se realizaron registros de potenciales miniatura despus de
incubar con la toxina pertussis y observamos que el WIN no ejerce efecto sobre
estos potenciales, lo cual nos indica que el efecto de WIN se da travs de receptores
acoplados a protenas G
i/o
.
Por otro lado, este canabinoide presenta afinidad para ambos tipos de
receptores, los CB
1
y los CB
2
(Howlett y cols., 2002), por lo cual, para establecer si
este efecto es mediado por receptores a canabinoides y determinar cul de los dos
tipos de receptores a canabinoides est ejerciendo dichos efectos, empleamos
antagonistas especficos para cada uno de los dos tipos de receptores. As, al
realizar experimentos con WIN en presencia del antagonista de CB
2
, AM630 (Ross y
cols., 1999), observamos el mismo efecto que slo se da en presencia de WIN.
Cuando registramos los potenciales miniatura en presencia de WIN y del antagonista
de CB
1
AM281 (Howlett y cols., 2002), encontramos que el WIN ya no ejerce efecto
en la amplitud ni en la frecuencia de dichos potenciales. Estos resultados nos indican
que el efecto de WIN s es mediado por receptores a canabinoides y lo hace a travs
de los CB
1
y no por los CB
2
.
Para confirmar que la liberacin de transmisor es disminuida por la interaccin
de los canabinoides con los CB
1
empleamos un agonista selectivo de estos
receptores, el ACPA (Hillard y cols., 1999). Cuando registramos potenciales
miniatura en presencia de este canabinoide encontramos una mayor disminucin en
la amplitud y la frecuencia de estos potenciales que en presencia de WIN. Al igual
que en presencia de WIN, cuando empleamos la toxina pertussis, el ACPA no ejerce
efecto en la amplitud ni en la frecuencia de los potenciales miniatura, indicando que
ste ocurre a travs de protenas G
i/o
. En presencia del antagonista selectivo de CB
1

AM281, el ACPA no ejerce efecto sobre los potenciales miniatura. De esta manera se
confirma que el efecto de estos canabinoides sobre los potenciales miniatura est
mediado por receptores CB
1
.
Debido a que la frecuencia de los potenciales miniatura depende de la
cantidad de transmisor liberado (Fatt y Katz, 1952), el hecho de observar una
65
disminucin en este parmetro en presencia de canabinoides nos indica que stos
provocan la disminucin en la liberacin de transmisor.
Adicionalmente, se conoce que la entrada de Ca
2+
a travs de canales de Ca
2+

dependientes de voltaje es esencial para la liberacin de transmisor (Katz y Miledi,
1967b) (ver introduccin). Para determinar el tipo de canales de Ca
2+
involucrados en
la liberacin espontnea de transmisor en la unin neuromuscular de la rana,
registramos los potenciales miniatura en presencia de dos distintos bloqueadores de
canales de Ca
2+
. En las terminales nerviosas motoras de la rana se han encontrado
los canales de Ca
2+
tipos L y N (Kerr y Yoshikami, 1984; Feng y Dai, 1990; Hattori y
Maehashi, 1991; Robitaille, Adler y Charlton, 1993; Robitaille, Garca, Kaczorowski y
Charlton, 1993; Arenson y Hill, 1996; Meir y cols., 1999), por lo cual empleamos la
Nifedipina para bloquear los canales de Ca
2+
tipo L y la -conotoxina-GVIA para
bloquear los tipos N (Kasai, Aosaki y Fukuda, 1987; McCleskey y cols., 1987;
Plummer y cols., 1989; Regan y cols., 1991; Stocker y cols., 1997; Triggle, 2006). El
hecho de encontrar que la Nifedipina no afecta la frecuencia de aparicin de los
potenciales miniatura, nos indica que el Ca
2+
necesario para la liberacin de
transmisor no fluye a travs de los canales de Ca
2+
tipo L. Sin embargo, el haber
encontrado una clara disminucin en la liberacin de transmisor en presencia de la
-conotoxina-GVIA nos indica la participacin de los canales de Ca
2+
tipo N, lo cual
concuerda con lo reportado por Grinnell y cols. en 1989.
Finalmente, en los experimentos en que se bloquearon los canales de Ca
2+

tipo N y despus se adicion el ACPA, este canabinoide no caus ningn cambio
significativo en la frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura. Estos
resultados nos sugieren que el mecanismo por el cual ACPA ejerce su efecto
involucra el bloqueo de los canales de Ca
2+
tipo N. Sin embargo, aunque la
frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura no fue modificada por el ACPA
en estos experimentos, la amplitud de los potenciales miniatura fue disminuida por el
ACPA, sugiriendo que esta disminucin es debida a un efecto postsinptico.
Se ha propuesto que la disminucin en la liberacin de transmisor ocasionada
por los canabinoides (Schlicker y Kathmann, 2001; Szabo y cols., 2004) es debida al
bloqueo de canales de Ca
2+
dependientes de voltaje. Adems, al encontrar que
66
estando bloqueados los canales de Ca
2+
tipo N con la -conotoxina-GVIA, el ACPA
no ejerce ningn efecto sobre la frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura,
nos permite sugerir que al ser activados los receptores a canabinoides (CB
1
) por los
canabinoides, se acoplan a protenas G
i/o
y esto conduce a la inhibicin de los
canales de Ca
2+
tipo N, lo cual provoca a su vez una disminucin en la liberacin de
transmisor.
En cuanto a las evidencias encontradas en este trabajo acerca de un efecto
postsinptico ocasionado por los canabinoides, se sabe que los receptores a
acetilcolina pueden ser bloqueados por protenas G (Butt y Pitman, 2002); de esta
manera, nuestros resultados nos indican que los canabinoides estaran activando al
receptor CB
1
y se acoplan a protenas G
i/o
, conduciendo a una inhibicin de los
canales-receptores a acetilcolina y causando de esta manera la disminucin en la
amplitud de los potenciales miniatura.


















67
CONCLUSIONES


1.- El ARNm para el receptor CB
1
est presente en los msculos rpidos y lentos o
tnicos de la rana.
2.- El nivel de expresin en las fibras musculares rpidas de la rana es
aproximadamente el doble que en las fibras musculares lentas.
3.- Los canabinoides WIN 55212-2 y ACPA disminuyen la amplitud y la frecuencia de
aparicin de los potenciales miniatura de una manera dependiente de la
concentracin.
4.- El efecto de ambos canabinoides es sensible a toxina pertussis, lo que implica
que el efecto es a travs de protenas G
i/o
.
5.- El efecto de WIN 55212-2 no es antagonizado por el AM630, antagonista
selectivo de CB
2
, lo que implica que el efecto de WIN no es a travs de los
receptores CB
2
.
6.- Los efectos de WIN 55212-2 y de ACPA son antagonizados por el AM281,
antagonista selectivo de CB
1
, lo que sugiere que el efecto de estos canabinoides es
a travs de CB
1
.
7.- ACPA acta como un inhibidor de los potenciales miniatura, ms potente y ms
eficaz que WIN.
8.- El bloqueo de canales de Ca
2+
tipo L no afecta la amplitud ni la frecuencia de
aparicin de los potenciales miniatura.
9.- La presencia de un bloqueador selectivo de canales de Ca
2+
tipo N (Cav 2.2)
provoca una disminucin en la frecuencia de aparicin de los potenciales miniatura,
lo que implica que estos canales de calcio participan en la liberacin espontnea del
transmisor.
10.- Los canabinoides activan a los receptores CB
1
, y stos a travs de protenas
G
i/o
, inhiben a los canales de Ca
2+
tipo N, ocasionando de esta manera la
disminucin en la liberacin de transmisor.
11.- WIN y ACPA producen un efecto postsinptico, sugiriendo la presencia
postsinptica de receptores CB
1
.
68
PERSPECTIVAS


1.- Determinar de manera directa la presencia de los receptores a canabinoides en el
msculo esqueltico mediante el uso de anticuerpos especficos. Para esto,
primeramente debe establecerse el protocolo para la extraccin de protenas de
membrana. Despus, realizar la separacin de dichas protenas de membrana
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, y as transferirlas a una membrana
empleando la tcnica Western blot. Finalmente, se hace la deteccin de la protena
de inters empleando los anticuerpos especficos para dicha protena.

2.- Explorar la localizacin de los receptores a canabinoides en la unin
neuromuscular empleando anticuerpos marcados. El empleo de anticuerpos
marcados permitira ubicar a los receptores a canabinoides y as conocer si estn co-
localizados con la placa terminal, en los tmulos t o en toda la fibra muscular, as
como su localizacin en la terminal presinptica.

3.- Estudiar el efecto de los canabinoides sobre la liberacin del transmisor evocada.
Es conveniente realizar estos experimentos para poder determinar si los
canabinoides causan una disminucin significativa en el potencial de placa.

4.- Estudiar el efecto de los canabinoides sobre la liberacin de calcio del retculo
sarcoplsmico inducida por cafena o midiendo la concentracin intracelular de calcio
en el msculo esqueltico mediante el empleo de la microscopa de fluorescencia y
marcadores de Ca
2+
.






69
MANUSCRITO


Snchez-Pastor, E. A., Trujillo, X., Huerta, M., Vsquez C. Montoya-Prez, R.
y Andrade, F. Effects of cannabinoids on synaptic transmission in the frog
neuromuscular junction. Enviado para publicacin.






















70
TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS


Snchez-Pastor, E, Trujillo, X, Huerta, M, Castro E, Vsquez C, and Andrade
F. Presence of mRNA for Cannabinoid Receptor (CB
1
) in frog and chicken
skeletal muscle fibers. Biophysical Society 48th Annual Meeting.
Baltimore, MD. USA. 2004.
Snchez-Pastor, E, Huerta, M, Trujillo, X, Castro, E, Andrade, F, y Vsquez,
C. Presencia del receptor a canabinoides (CB1) en la unin neuromuscular de
la rana. XLVII Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Ciencias
Fisiolgicas. Veracruz, Ver. 2004.
Snchez-Pastor, E, Trujillo, X, Huerta, M, Vsquez, C, Castro, E, and
Andrade, F. Effects of WIN 55,212-2 and ACPA on frog neuromuscular
transmission. Biophysical Society 49th Annual Meeting, Long Beach, CA,
USA. 2005.
Snchez-Pastor, E, Huerta, M, Trujillo, X, Andrade, F, y Vsquez, C.
Efectos de los canabinoides sobre la transmisin sinptica en la unin
neuromuscular de la rana. XLVIII Congreso Nacional de la Sociedad
Mexicana de Ciencias Fisiolgicas. Guadalajara, Jal. 2005.
Sanchez-Pastor, E, Trujillo, X, Huerta, M, and Andrade, F. Effects of
cannabinoids on synaptic transmission in frog neuromuscular junction.
Society for Neuroscience 35th Annual Meeting, 2005. Washington, DC,
USA.
Snchez-Pastor, E, Trujillo, X, Huerta, M, and Andrade, F. Effects of
cannabinoids on synaptic transmission in the frog neuromuscular junction. 3
d

International Workshop: Ionic Channels: From Structure to
Physiopathology . Centro Universitario de Investigaciones Biomdicas,
Universidad de Colima. Col, Mxico. 2005.



71
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85
ABREVIACIONES


PMPT: potenciales miniatura de placa terminal.
MEPPs: miniature end-plate potentials.
PTX: toxina pertussis.
ACPA: Araquidonil ciclopropil amida.
ACh: acetilcolina.
SNARE: soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor.
VGCC: canales de Ca
2+
activados por voltaje.
LVA: canales activados por bajo voltaje.
HVA: canales activados por alto voltaje.
K
Ca
: canales de potasio activados por calcio.
K
ATP
: canales de potasio dependientes de ATP.
TTX: tetrodotoxina.
NPPB: cido 5-Nitro-2-(3-fenilpropilamino) benzoico.
CB: cannabinoid brain.
2-AG: 2-araquidonil glycerol.
EDL: Extensor digitorum longus.
H
2
O-DEP: agua tratada con dietilpirocarbonato.
RT-PCR: Reverse transcriptase-polimerase chain reaction.
NCBI: National Center of Biotechnology information.
DMSO: dimetilsulfxido.