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Pruebas Bioqumicas

Determinan la actividad metablica de una cepa pura. Son empleadas principalmente la identificacin y clasificacin de bacterias y hongos.

Pruebas Bioqumicas

E + S ES E + P
Se pueden resumir en los siguientes puntos:

Sustrato (contenido en el medio de cultivo) Enzima o va metablica (secretada o en el interior del


microorganismo)

Producto Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)


Los fundamentos completos de estas pruebas y dems informacin pueden encontrarlos en el libro: Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica de Jean F. MacFaddin, Editorial Mdica Panamericana.

Hidrlisis del Almidn


El almidn es producido principalmente por plantas superiores, est compuesto de amilosa y amilopectina. Diversas enzimas amilolticas hidrolizan almidn y sus productos.

Prueba negativa

Prueba positiva

Agar Almidn Sustrato: Almidn (polmero de glucosa). Enzima: Amilasa (exoenzima). Producto: Glucosa. Revelador: Lugol. El lugol con el almidn forman un complejo color caf-prpura que desaparece cuando el almidn ha sido degradado.

Degradacin de la casena
Agar Leche Descremada Sustrato: Casena (protena). Enzima: Caseinasa (Proteasa, exoenzima). Producto: Aminocidos. Revelador: No requiere.

Prueba negativa

Prueba positiva

Las proteasas son excretadas al medio para la degradacin de protenas, la casena es la protena de la leche que le confiere el color blanco, cuando la casena es hidrolizada desaparece el color blanco alrededor del crecimiento microbiano.

Hidrlisis de la lecitina y reduccin del telurito


Agar yema de huevo/Agar Baird Parker Sustrato: Lecitina. Enzima: Lecitinasa. Producto: Fosforilcolina. Revelador: No requiere. Algunos microorganismos producen lecitinasa que hidroliza la lecitina (fosfolpido). Se utiliza el agar yema de huevo. Las colonias productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su alrededor. El medio de Baird Parker es empleado para el aislamiento y cuantificacin de estafilococos cuagulasa positivos, al que se adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias tpicas de S. aureus son oscuras por la reduccin del telurito, adems presentan el halo de hidrlisis de la lecitina.

Licuefaccin de la gelatina
Gelatina Nutritiva Sustrato: Gelatina (protena). Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima). Producto: Aminocidos. Revelador: No requiere o puede emplearse el carbn activado en polvo.
Prueba negativa Prueba positiva

La gelatina es una protena que tiene la capacidad de gelificar, cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los aminocidos que la componen pierde su caracterstica de gelificar. Se pueden emplear varios medios que permiten la visualizacin macroscpica como la gelatina adherida a carbn activado.

Fermentacin de carbohidratos
Medio base rojo de fenol ms carbohidrato o polialcohol, con campana de fermentacin (Durham). Sustrato: Carbohidrato o polialcohol. Va: Fermentativa. Producto: cidos orgnicos. Indicador: Cualquier indicador de pH.
Negativo/Positivo(A)/Positivo(AG)

Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes) deben ser incorporados, algunos requieren de ser degradados en monmeros y transportados a la clula para posteriormente en condiciones anaerobias ser metabolizados por la va fermentativa. La fermentacin (degradacin) de un compuesto orgnico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la formacin de gas capturado en la campana de fermentacin.

Oxidacin/Fermentacin
Hugh and Leifson Sustrato: Carbohidratos. Vas: Fermentativa y/u Oxidativa. Producto: Acido pirvico. Indicador: Azul de bromotimol u otro indicador cido/base. Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos metablicos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la necesidad de oxgeno atmosfrico y una fosforilacin inicial. Por prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxgeno. La fermentacin requiere de una fosforilacin inicial, utiliza las vas de la Gluclisis (Embden-Meyerhof-Parnas EMP), de las Pentosas fosfato y Entner-Doudoroff.

Oxidacin/Fermentacin
La oxidacin de la glucosa produce cido pirvico por una va de derivacin (Shunt), ocurre en condiciones aerobias y no requiere de fosforilacin inicial. La produccin de cido se observa por el vire del indicador al amarillo. En los tubos positivos puede haber generacin de gas.
Reaccin Oxidacin Fermentacin Ni fermentacin, ni oxidacin Fermentacin y oxidacin Tubo con reaccin positiva Abierto Sellado Ninguno Ambos Tubo abierto Amarillo (+) Verde Azul o verde Amarillo Tubo sellado Verde (-) Amarillo Verde Amarillo

Rojo de Metilo/Voges Proskauer


Caldo RM/VP Sustrato: Glucosa. Vas: Fermentacin cida o neutra. Producto: Acido orgnicos o acetona. Reveladores: Solucin de Rojo de Metilo, Alfa Naftol y KOH 40%.

Fermentacin cido mixta: Los productos finales son cidos orgnicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del medio (viraje del indicador de amarillo pH por encima de 5,1) y rojo (pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 molculas de piruvato formadas, reducen dos a cido lctico y dos las metabolizan para formar cido actico y frmico; parte del acetato pasa a etanol y parte del frmico a CO2 y H2 en cantidades iguales.

Rojo de Metilo/Voges Proskauer


Fermentacin butilengliclica: en sta, parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de cido lctico, frmico y actico, la mayor parte del piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,3-butilenglicol, productos que son neutros.

Para determinar la presencia de los productos neutros (prueba de Voges-Proskauer): Se agrega un poco de -naftol al 5% en etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le aade (KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita fuertemente. (Prueba positiva color rosado - violceo en la parte superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloracin).

Utilizacin de citrato
Medio de Citrato de Simmons Sustrato: Citrato de sodio. Va: Varias dependientes del pH del medio. Producto: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO2, lactato/Acetona y CO2 en condiciones cidas. Indicador: Azul de bromotimol.

Prueba negativa

Prueba positiva

Un microorganismo que puede utilizar el citrato como nica fuente de carbono tambin utiliza las sales de amonio del medio como nica fuente de nitrgeno. La extraccin de nitrgeno de las sales de amonio producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.

Agar Hierro de Kligler (KIA)


Agar hierro de Kligler Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y Tiosulfato o grupos SH de la cistena. Va: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasaProductos: cidos mixtos y H2S. Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+ .

En presencia de tiosulfato en el medio o la degradacin de protenas liberando aminocidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasa. El gas incoloro H2S se forma en condiciones cidas y reacciona con el citrato de amonio frrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metlico.

Agar Hierro de Kligler (KIA)


No fermentadores
No fermenta pH = 7.4 Pptidos Aminas O2

Pico de flauta alcalino y fondo alcalino

No fermentadores de lactosa
Glucosa O2 cidos Mixtos Pptidos Aminas

Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que alcalinizan todo el medio. Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente tambin utilizan aerbicamente la glucosa. Debido a la baja concentracin de glucosa (0.1%), metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio. Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa 0.1% y al trmino de esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la acidificacin completa del medio.

Reaccin inicial: Pico de flauta cido y fondo cido

Glucosa O2 cidos Mixtos Pptidos Aminas

Reaccin final: Pico de flauta alcalino y fondo cido

Fermentadores de lactosa
Glucosa + Lactosa Pptidos Aminas O2

Pico de flauta cido y fondo cido

cidos Mixtos

Agar Hierro de Kligler (KIA)


El medio de Kligler est diseado para la identificacin de enterobacterias y otras bacterias Gram negativas.

Interpretacin:
Tubo
Fermentacin de Glucosa Produccin de gas de la fermentacin Fermentacin de Lactosa Produccin de H2S

C
-

1
-

2
+ -

3
+ + +

4
+ + + -

4A
+ + + -

5
+ + + +

Medio SIM (Sulfhdrico Indol Movilidad)


Medio SIM (medio semislido) Sustratos: Tiosulfato o grupos SH de la cistena y triptfano. Enzimas: Tiosulfato reductasa, cistena desulfurilasa y tiptofanasa. Producto: H2S e Indol. Revelador: Sales de Fe2+ y p-Dimetilaminobenzaldehdo (DMABA). En presencia de tiosulfato en el medio o la degradacin de protenas liberando aminocidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasa. El gas incoloro H2S reacciona con el citrato de amonio frrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metlico.
Prueba positiva Prueba negativa

Medio SIM (Sulfhdrico Indol Movilidad)


Las enzimas triptofanasas oxidan el triptfano para formar tres metabolitos: indol, metil indol y cido indolactico. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido formado un compuesto quinnico color violeta, que se observa por la aparicin de un anillo en la superficie del medio.
Prueba positiva Prueba negativa

El medio de cultivo tiene consistencia semislida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, ms all de la zona de inoculacin (picadura). Los microorganismos inmviles solo crecern en la zona inoculada.
Prueba negativa Prueba positiva

Ureasa
Caldo urea o agar urea de Cristensen. Sustrato: Urea. Enzima: Ureasa. Producto: Amonaco. Indicador: Rojo de fenol. La hidrlisis de la urea por la enzima ureasa libera dos molculas de amoniaco que alcaliniza el medio, entonces se vira el indicador de pH, en el caso del rojo de fenol una prueba positiva es color bugambilia.

Prueba negativa

Prueba positiva

Reduccin de Nitratos

Caldo nitratos Sustrato: Nitrato de sodio. Enzima: Nitrato reductasa. Producto: Nitritos. Revelador: Reactivos de Griess. Nitrato reductasa (NAR). Nitrito reductasa (NIR). NO reductasa (NOR). N2O reductasa (N2OR).

N03 NO2 NO N2O N2

Reduccin de Nitratos
El nitrito reacciona con dos reactivos: cido sulfanlico y dimetil-a-naftilamina (o a-naftilamina). La reaccin de color se debe a la formacin de un compuesto diazonio, psulfobenceno-azo-naftilamina.
N NH2 HNO2 N + H2 O + +

SO3H
Acido sulfanlico (incoloro)

Acido nitroso

SO3H
Acido sulfanlico diazotizado (sal de diazonio)

NH2
-naftilamina (incolora)

N
Acoplamiento

N + H2 O NH2

SO3H

p-sulfobenceno-azo--naftilamina (colorante rojo azo hidrosoluble)

Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba del zinc para reducir qumicamente los nitratos presentes a nitritos y formar con los reactivos de Griess el compuesto colorido.

Descarboxilasas
Medio base de descarboxilasas u otros medios como LIA o MIO. Sustrato: Aminocidos (lisina, ornitina o arginina). Enzimas: Descarboxilasas. Producto: Amonaco. Indicador: Prpura de bromocresol. Los aminacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en diaminas lo que incrementa el pH del medio y el indicador (prpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son tiles en la diferenciacin de enterobacterias.

Prueba de la coagulasa
Plasma de conejo Sustrato: Factores de la coagulacin. Enzima: Coagulasa (estafilocoagulasa). Producto: Coagulo. Revelador: No requiere.
Prueba positiva Prueba negativa

La enzima producida por S. aureus es excretada al medio extracelular, el mecanismo propuesto es la accin de esta enzima sobre los factores de la coagulacin presentes en el plasma y formar un coagulo visible.

Oxidasa
Cultivo de medio nutritivo Sustrato: Compuesto reducido. Enzima: Oxidasa. Producto: Compuesto oxidado. Revelador: Reactivo de Kovacs, diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TPD) al 1%, solucin incolora. Se basa en la produccin bacteriana de una enzima oxidasa intracelular. Esta reaccin se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno molecular, el que a su vez acta como un aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de electrones. La prueba positiva se observa por la oxidacin del reactivo incoloro en pocos segundos formndose un producto colorido.