Pracownia dyplomowa III rok Ochrona rodowiska Licencjat (OI)

wiczenie 1 Analiza jakociowa w chromatografii gazowej Wstp

Chromatografia jest metod fizykochemiczn metod rozdzielania skadnikw jednorodnych mieszanin w wyniku ich rnego podziau midzy faz ruchom (poruszajc si w okrelonym kierunku) a faz nieruchom (stacjonarn) ukadu chromatograficznego. Rny podzia skadnikw mieszaniny pomidzy obie fazy powoduje zrnicowanie prdkoci migracji i rozdzielenie skadnikw (Rys. 1).

Rys. 1. Mechanizm procesu chromatograficznego. Substancje zrnicowanymi wspczynnikami retencji k.

charakteryzuj si

Faza ruchoma porusza si wewntrz kolumny, natomiast faza stacjonarna stanowi wypenienie kolumny lub jest osadzona na wewntrznych ciankach kolumny.

W chromatografii gazowej (GC - gas chromatography) faz ruchom jest gaz; faz stacjonarn moe by: ciao stae: adsorbent, wtedy mamy do czynienia z chromatografi adsorpcyjn (GSC - gas-solid chromatography), ciecz osadzona na staym noniku w postaci jednorodnego filmu (warstwy), wtedy mamy do czynienia z chromatografi podziaow (GLC - gas-liquid chromatography).

Zwizki chemiczne z wikszym powinowactwem do fazy stacjonarnej s selektywnie zatrzymywane przez faz nieruchom i poruszaj si wzdu kolumny znacznie wolniej. Zwizki z mniejszym powinowactwem do fazy stacjonarnej poruszaj si wzdu kolumny szybciej i tym samym opuszczaj kolumn, czyli eluuj z kolumny, jako pierwsze. Rwnowaga podziau pomidzy fazy ma charakter dynamiczny, czyli czsteczki substancji nieustannie przechodz od fazy ruchomej do stacjonarnej i z powrotem. Podstawowym parametrem okrelajcym podzia substancji X pomidzy dwie fazy jest staa podziau K, ktr mona wyrazi rwnaniem Nernsta:
cs (1) cm gdzie: cs oznacza stenie substancji X w fazie stacjonarnej, cm oznacza stenie K =

substancji X w fazie ruchomej. Innym wanym parametrem jest wspczynnik retencji k, ktry jest miar czasu, w jakim substancja X przebywa w fazie stacjonarnej, w stosunku do czasu, w ktrym przebywa ona w fazie ruchomej. Okrela on, ile razy duej dana substancja jest zatrzymywana przez faz stacjonarn ni potrzebowaaby na przejcie przez kolumn z prdkoci poruszania si fazy ruchomej. Zwizki chemiczne charakteryzujce si rnymi wspczynnikami retencji mog zosta rozdzielone na kolumnie chromatograficznej (Rys. 1).
k

liczba moli substancji X w fazie stacjonarnej liczba moli substancji X w fazie ruchomej

(2)

Efekt rozdziau chromatograficznego jest wykrelany w postaci chromatogramu, ktry przedstawia wykres wskaza sygnau uzyskanego w detektorze w funkcji czasu lub w funkcji objtoci fazy ruchomej. Zapis stenia pojedynczej substancji w funkcji czasu ma posta krzywej Gaussa i nosi nazw piku (ang. peak czyli szczyt). Typowy chromatogram przedstawiony jest na Rys. 2.

Rys. 2. Chromatogram i sposb pomiaru podstawowych wielkoci chromatograficznych

Moemy okreli na nim: czas retencji tR - czas mierzony od momentu wprowadzenia prbki na kolumn do momentu pojawienia si na wyjciu z kolumny maksimum stenia danego zwizku chemicznego czyli maksimum piku
tR = L u x (1 + k ) (3)

gdzie: L - dugo kolumny chromatograficznej, u - rednia, liniowa prdko przepywu gazu nonego, k - wspczynnik retencji,

zerowy czas retencji tM (czas martwy) - czas przebywania w kolumnie substancji, ktra
nie ma powinowactwa do fazy stacjonarnej np. metanu; czas zerowy jest rwny czasowi przepywu fazy ruchomej przez kolumn,

zredukowany czas retencji tR - jest rnic pomidzy czasem retencji a zerowym czasem
retencji

= tR tM tR
wspczynnik retencji k
k=

(4)

tR tM (5) tM szeroko piku mierzon u podstawy piku w lub szeroko piku mierzon na okrelonej
wysokoci piku np. w poowie wysokoci w1/2h,

liniow prdko przepywu fazy ruchomej u przez kolumn mona atwo wyznaczy
eksperymentalnie poprzez analiz chromatograficzn substancji niezatrzymywanej na kolumnie np. metanu i zmierzenie czasu przejcia jej przez kolumn czyli czasu zerowego (tM).

u =

L tM

(6)

Wielko, ktr mona atwo wyznaczy, a ktra zaley od rodzaju rozdzielanych substancji i rodzaju fazy ruchomej jest retencja wzgldna ra,s (zwana inaczej wzgldnym

czasem

retencji).

Okrela

si

jako

stosunek

retencji

dwch

substancji

chromatografowanych, z ktrych jedna jest wzorcem (s), a retencja drugiej (a) jest zbliona do retencji wzorca:

ra,s = tRa / tRs = ka/ ks

dwie substancje rozdzielaj si.

(7)

Warto ra,s moe by wiksza lub mniejsza od 1. Im bardziej ra,s jest rne od 1, tym lepiej Kolejnym wanym parametrem chromatograficznym jest wspczynnik rozdzielania

(zwany take wspczynnikiem selektywnoci), ktry jest miar rozdzielenia dwch ssiednich pikw na chromatogramie, dla ktrych tR2 > tR1: K 2 k 2 t R2 t M = = K1 k 1 t R1 t M

(8)

Wspczynnik rozdzielania ma zawsze warto wiksz od 1.

1.2. Analiza jakociowa

Analiza jakociowa dotyczy identyfikacji sygnaw chromatograficznych odpowiadajcych poszczeglnym skadnikom prbki i opiera si na: a) wielkociach retencyjnych, b) fizykochemicznego badania frakcji z zastosowaniem detektorw jakociowych c) wydzieleniu poszczeglnych skadnikw mieszaniny (chromatografia preparatywna) w celu ustalenia ich struktury innymi metodami (metoda najrzadziej stosowana).

1.2.1. Analiza jakociowa w oparciu o wielkoci retencyjne

W trakcie analizy jakociowej opartej na wielkociach retencyjnych porwnuje si czas retencji piku identyfikowanej w substancji z czasem retencji zwykle piku wzorca, na

chromatografowanych

jednakowych

warunkach.

Badania

polegaj

potwierdzeniu lub wykluczeniu obecnoci danego zwizku w analizowanej mieszaninie. Jeeli na chromatogramie substancji badanej nie wystpuje pik o czasie retencji rwnym retencji substancji wzorcowej oznacza to i zwizek wzorcowy jest nieobecny w analizowanej mieszaninie. Z kolei jeli taki sygna wystpuje obecno substancji wzorcowej nie jest przesdzona, gdy wiele zwizkw nalecych do rnych klas zwizkw chemicznych moe mie identyczny lub prawie identyczny czas retencji. Potwierdzeniem obecnoci takiego zwizku wzorcowego w analizowanej mieszaninie jest wykonanie analizy na innych wypenieniach kolumn.

Innym dogodnym rozwizaniem jest korzystanie ze wzgldnych czasw retencji, opisanych wzorem (7). Wzgldny czas retencji zmienia si tylko ze zmian temperatury lub fazy stacjonarnej, ale jest niezaleny od wielu warunkw eksperymentu. Najkorzystniej gdy analit i wzorzec wystpuj w tej samej prbce. Wad powyszych metod jest to, e niektre wzorce mog by trudno dostpne.

Czsto do analizy jakociowej uywa si indeksw retencji zwanych indeksami Kovtsa. Indeks retencji Kovtsa substancji badanej jest rwny 100 x liczba atomw wgla hipotetycznego n-alkanu majcego taki sam zredukowany czas retencji jak badana substancja (wzr 9 i 10). Zgodnie z konwencj alkany maj w kadej temperaturze i dla kadej fazy ciekej indeks rwny licznie atomw wgla x 100, a wic np. dla n-pentanu 500, n-oktanu 800. Do okrelenia indeksw retencji zwizku wybiera si dwa n-alkany, ktrych czasy retencji le poniej i powyej czasu retencji nieznanej substancji. Te alkany dodaje si nastpnie do prbki i razem z ni analizuje. Jeeli analiza alkanw i prbki musi przebiega oddzielnie, naley przeprowadza obydwa badania bezporednio jedno po drugim. Indeks retencji Kovtsa substancji analizowanych w warunkach izotermicznych oblicza si zgodnie z poniszym rwnaniem:
RI X = 100 z + 100 gdzie : tR(x) zredukowany czas retencji substancji badanej tR(z) zredukowany czas retencji n-alkanu o (z) atomach wgla w acuchu tR(z+1) zredukowany czas retencji n-alkanu o (z+1) atomach wgla w acuchu Z wzoru wynika, e tR(z) < tR(x) < tR(z+1) Indeks retencji w programowanej temperaturze oblicza si stosujc ponisze rwnanie: LTPRI X = 100 z + 100 t ' R ( X ) t ' R ( z ) t ' R ( z +1) t ' R ( z ) (10) log t ' R ( X ) log t ' R ( z ) log t ' R ( z +1) log t ' R ( z ) (9)

Indeks retencji Kovtsa jest w znacznym stopniu niezaleny od warunkw analizy i przez to jest parametrem charakterystycznym dla danego zwizku w danej temperaturze i w obecnoci okrelonej fazy ciekej. Podczas wyznaczania indeksw retencji naley zachowa stay przepyw gazu nonego, nisk temperatur pocztkow oraz stosowa tak ilo dozowanej prbki, aby pik analitu by symetryczny. W przypadku wyznaczania indeksu w programowanej temperaturze wielko ta zaley jedynie od fazy stacjonarnej, a nie zaley od parametrw kolumny, czasu retencji analitu, zakresu programowania temperatury i natenia przepywu gazu nonego. Warunki chromatograficzne: pocztkowa i kocowa temperatura kolumny, warto liniowego narostu temperatury oraz natenie przepywu gazu

nonego, powinny by tak dobrane, aby odstpy czasowe pomidzy kolejnymi n-alkanami byy jednakowe. Praktyka laboratoryjna wskazuje, e wartoci indeksw Kovatsa wyznaczone dla substancji na fazach niepolarnych rni si o 1 jednostk, podczas gdy z zastosowaniem faz polarnych o 2 - 3 jednostki, a nawet 5 dla faz najbardziej polarnych. Bdy te wynikaj gwnie z ograniczonej stabilnoci faz ciekych. W szeregach homologicznych obserwuje si zaleno pomidzy parametrami retencji i wielkociami takimi jak liczba atomw wgla, liczba grup CH2 i temperatura wrzenia. Jeeli wykreli si zaleno logarytmu zredukowanego czasu retencji w funkcji liczby atomw wgla, to otrzymane proste s charakterystyczne dla kadego szeregu homologicznego zwizkw analizowanych w warunkach izotermicznych w danej temperaturze i dla danej fazy ciekej (Rys. 2). W przypadku analiz w programowanej temperaturze zachodzi prostoliniowa zaleno zredukowanego czasu retencji w funkcji liczby atomw wgla.

Rys. 2. Zaleno pomidzy zredukowanym czasem retencji i liczb atomw wgla w szeregu homologicznym.

W sprzyjajcych warunkach, na podstawie wyznaczonego indeksu substancji badanej, mona przyporzdkowa nieznany zwizek do danego szeregu homologicznego, a tym samym dokona jego identyfikacji. Pewno wyniku mona osign przez porwnanie uzyskanych wartoci retencji z wynikami otrzymanymi na kolumnie o innej polarnoci. Wykonujc analiz jakociow naley pamita, e retencja moe zmienia si nawet przy maych zmianach warunkw analizy. W niektrych przypadkach zmiana ta nie jest jednakowa dla wszystkich skadnikw prbki i pooenie jednych w stosunku do drugich 6

moe ulega zmianie. Analizujc nowe prbki trzeba mie pewno, e wszystkie skadniki poprzednio chromatografowanej prbki zostay usunite z kolumny. Piki takich substancji mona atwo rozpozna, poniewa s znacznie szersze ni piki ssiednie. Piki odpowiadajce substancjom, ktre nie wystpuj w badanej prbce, mog pochodzi z zanieczyszcze ukadu chromatograficznego lub rozpuszczalnika uytego do sporzdzenia roztworu prbki. W tym ostatnim przypadku naley sprawdzi czysto rozpuszczalnika, analizujc jego ilo odpowiadajc tej, ktr wprowadza si do kolumny z prbk.

1.2.2. Analiza jakociowa oparta na fizykochemicznym badaniu frakcji z zastosowaniem detektorw jakociowych
Poczenie chromatografii gazowej z metodami spektroskopowymi: a) spektrometri mas - zestaw GC-MS b) spektroskopi w podczerwieni IR zestaw GC-IR c) absorpcyjn spektroskopi atomow AAS zestaw GC-AAS, d) emisyjn spektroskopi atomow AES zestaw GC-AES pozwala na identyfikacj zwizkw organicznych (GC-MS, GC-IR) i metaloorganicznych (GC-AAS i GC-AES). Dziki technikom czonym uzyskujemy dodatkow informacj stukturaln np. odpowiednie do danej techniki spektroskopowej widmo substancji badanej. Najprostszym sposobem identyfikacji substancji jest zastosowanie metody poczenia chromatografii gazowej z spektrometri mas (GC-MS). Identyfikacja skadnikw

analizowanej mieszaniny odbywa si wwczas nie tylko na podstawie czasw retencji, ale te na podstawie widm mas analizowanych substancji. Naley zaznaczy, i prbka nie powinna zawiera izomerw, ktre maj czsto zblione lub identyczne widma mas.

2. Cz eksperymentalna
2.1. Cel
Celem wiczenia jest nabycie umiejtnoci obsugi chromatografu gazowego oraz wykonanie analizy jakociowej za pomoc chromatografii gazowej.

2.2. Wykonanie 2.2.1. Analiza chromatograficzna w warunkach izotermicznych

Chromatograf GC z detektorem FID, Kolumna chromatograficzna RTX-5 30 m, 0,25 mm rednica wewntrzna, 0,25 m grubo fazy stacjonarnej, Temperatura kolumny: 120C, Temperatura dozownika: 220C, Temperatura detektora: 7

220C, Dzielnik przepywu: 1:20, Gaz nony: argon, stay przepyw 1 mL/min, Powietrze: 350 kPa Wodr: 35 kPa, Czas analizy: 11 min.

2.2.2. Analiza chromatograficzna w programie temperaturowym

Chromatograf GC z detektorem FID, Kolumna chromatograficzna RTX-5 30 m, 0,25 mm rednica wewntrzna, 0,25 m grubo fazy stacjonarnej, Program temperaturowy: 60 - 126C, narost 3C/min, Temperatura dozownika: 220C, Temperatura detektora: 220C, Dzielnik przepywu: 1:20, Gaz nony: argon, stay przepyw 1 mL/min, Powietrze: 350 kPa, Wodr: 35 kPa, Czas analizy: 22 min.

2.2.3. Ekstrakcja olejku eterycznego ze skrek owocw cytrusowych

Ekstrahowa okoo 0,1 g czci pomaraczowej skrki (nie albedo) za pomoc 3 mL heksanu mieszajc przez okoo 5 min i pozostawi na okoo 5 min a nastpnie zdekantowa. Jeeli bdzie to konieczne to zaty ekstrakt w strumieniu azotu.

2.2.4. Analiza jakociowa poprzez porwnanie czasu retencji analitu z czasem retencji wzorca wyznaczonych w tych samych warunkach chromatograficznych
Naley wykona analiz prbki badanej oraz analiz roztworu wzorcowego. Odczyta z chromatogramw i porwna czasy retencji. Zidentyfikowa analit.

2.2.5. Wyznaczenie indeksw Kovtsa w warunkach programowanej temperatury

Naley wykona analiz prbki badanej oraz analiz roztworu wzorcowego: mieszaniny 5-ciu n-alkanw od n-C8 do n-C12 i wyznaczy indeksy. Wykreli krzyw zalenoci pomidzy zredukowanymi czasami retencji i liczb atomw wgla w szeregu homologicznym nalkanw na podstawie analizy roztworu wzorcowego:

= f (C ) tR

2.2.6. Wyznaczenie indeksw Kovtsa w warunkach izotermicznych

Naley wykona analiz prbki badanej oraz analiz roztworu wzorcowego: mieszaniny 5-ciu n-alkanw od n-C8 do n-C12 i wyznaczy indeksy. Wykreli krzyw zalenoci pomidzy logarytmami zredukowanych czasw retencji i liczb atomw wgla w szeregu homologicznym n-alkanw na podstawie analizy roztworu wzorcowego:

= f (C ) log t R
8

Odczynniki i sprzt laboratoryjny

roztwr wzorcowy mieszaniny n-alkanw: roztwr wzorcowy limonenu, roztwr wzorcowy -pinenu, chlorek metylenu do mycia strzykawki, strzykawka do GC 10 L - 2 szt, zlewka 10 mL 4 szt naczynko zakrcane 1,5 mL 4 szt pipeta 5 mL, pompka do pipet, heksan 50 mL n

n-C8, n-C9, n-C10, n-C11, n-C12,

Literatura 1. Walenty Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej PWN, W-wa, 1996. 2. Ryszard Kocjan (red.). Chemia analityczna. Podrcznik dla studentw. Tom 2. PZWL, W-wa, 2000. 3. Witkiewicz Zygfryd, Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa, 2005.