UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTN

DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

GUA DE PRCTICA
BIOQUMICA APLICADA

AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
Ing. Karina Morn Medina
Mg. Liz Andrea Gutierrez Quequezana
Mg. Jakeline Zanabria Galvez

AREQUIPA PER
2012

PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Gua de Prctica con el objeto de hacer llegar al

interesado los alcances actuales de la bioqumica aplicada en el laboratorio.
Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano tienen como base el
desarrollo de la biologa molecular, lo que a su vez ha generado el desarrollo de la
bioqumica como consecuencia natural.
La aplicacin de los nuevos conocimientos de la bioqumica han determinado el
gran impulso que la bioqumica aplicada ha dado a la nueva tecnologa de los bioprocesos.
Todos los avances de la biotecnologa tienen como sustento el conocimiento previo
de la biologa y de la bioqumica aplicada.
La presente Gua de Prcticas brinda a los estudiantes de Ingeniera Qumica las
destrezas bsicas para el empleo de los diferentes instrumentos requeridos para el estudio
prctico de la bioqumica.

Los Autores

NDICE
PROLOGO
NDICE
PRCTICA 1: DETERMINACIN
PROTENAS.
PRCTICA 2: CONCENTRACIN
DILISIS.

ESPECTROFOTOMTRICA
DE

EXTRACTOS

PROTEICOS

DE
POR

PRCTICA 3: DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICRO-KJELDAHL.

PRCTICA 4: SEPARACIN EN
AMINOCIDOS.

CAPA

FINA

DE

UNA

MEZCLA

DE

PRCTICA 5: REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS.

PRCTICA 6: DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS
PROTENAS.
PRCTICA 7: METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIN.
PRCTICA 8: INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION
DE ETANOL POR Saccharomyces cerevisiae INMOVILIZADA.
PRCTICA 9: EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALES.
PRCTICA 10: DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA.
PRCTICA 11: CINETICA ENZIMATICA EN UREASA.
PRCTICA 12: EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO.

PRCTICA 1
DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE PROTENAS
I.
II.

OBJETIVO
Determinar la concentracin de una solucin de protenas mediante la reaccin de
Biuret y el espectrofotmetro
FUNDAMENTO:
La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del
Biuret. El reactivo Biuret contiene CuSO4 en solucin alcalina. La reaccin se basa en
la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo
de coordinacin entre los iones Cu (+2) y los pares de electrones no compartidos del
nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.

Los compuestos que contienen 2 o ms enlaces peptdicos producen un color violeta

caracterstico con soluciones diluidas de sulfato de cobre (CuSO4) en solucin alcalina.
El color se debe al compuesto de coordinacin formado al existir enlaces qumicos
entre los pares de electrones libres del tomo de nitrgeno presente en los enlaces
peptdicos de las cadenas proteicas con el ion cobre.
Los espectros de absorcin de los complejos entre los iones de Cu+2 y las diferentes
protenas son similares pero no idnticas por lo tanto, se puede utilizar una protena
como patrn de calibracin. La curva de calibracin obtenida por este mtodo, se

har utilizando como patrn solucin de extracto de levadura, cuya concentracin es

de 8 mg/mL preparada con agua destilada.
Espectrofotometra. Principios bsicos
La reaccin de biuret es cuantificable, es decir a mayor concentracin de protenas,
mayor intensidad de color violeta, estas reacciones en las que el color formado es
proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimtricas.
Midiendo la intensidad de color se podra conocer la concentracin de la sustancia que
lo produce. Para ello se aplican tcnicas fotomtricas, empleando un aparato llamado
colormetro (si mide slo un determinado color) o espectrofotmetro (si realiza una
medida de todo el espectro de colores).
La luz es parte de la radiacin electromagntica, que se propaga de forma ondulatoria.
Las distintas radiaciones luminosas se diferencian unas de otras por sus longitudes de
onda que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre
380-750 nm, que corresponden a los colores del arcoris, de tal forma que cada color
corresponde a una radiacin con una longitud de onda especfica. El
espectrofotmetro dispone de una lmpara que emite luz monocromtica, de una
longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de
un detector, que medir la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para
cada sustancia determinada, se utilizar la radiacin de longitud de onda a la que
absorba ms cantidad de luz ( a la longitud de onda de mxima absorbancia).
Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert: la fraccin de luz incidente que
es absorbida por una solucin es proporcional a la concentracin de soluto y al
espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relacin entre luz incidente (Io) y la
reflejada (I) dar una idea de la cantidad de radiacin que ha sido absdorbida por la
muestra. Esto es lo que se denomina Absorbancia (Abs)DensidaOptica (DO)
Laley de Beer-Lambert se formula como:
Abs (DO) =e x C x 1
Siendo e el coeficiente de extincin molar (especfico para cada sustancia a una
longitud de onda y en unas condiciones determinadas (M-1, cm-1), C es la
concentracin de la muestra a medir (M), 1 el espesor de la muestra. La mayora de los
espectrofotmetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de espesor, por lo que 1
se puede ignorar. As la concentracin desconocida de la sustancia ser:
C = Abs /e

III. MATERIALES Y EQUIPO

Espectrofotmetro
Gradilla para tubos de ensayo
Tubos de ensayo
Vasos de precipitado
Probetas, Pipetas
Materiales: extracto de levadura, reactivo biuret
IV. PROCEDIMIENTO
Realizacin de una curva patrn: Como se desconoce el coeficiente de extincin molar
() de las protenas coloreadas con el reactivo biuret, se proceder a construir una curva
patrn, midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones conocidas de
protena, para sobre ella interpolar el valor de Abs de la solucin problema y determinar
su concentracin grficamente y tambin por regresin lineal.Para ello se dispone de una
solucin de 10 mg/ml de protena (extracto de levadura) a partir de ella se realizan
diluciones conocidas aplicando la frmula:

Ci x Vi = Cf x Vf
Donde:
Ci = concentracin de la solucin madre inicial
Vi = volumen a tomar de la solucin madre inicial
Cf= concentracin final de la solucin a preparar
Vf= volumen total final de la solucin a preparar
En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solucin madre (Ci=10 mg/ml) las
soluciones de la tabla.

Tubo
Blanco
1
2
3
4
5
6
7
8
Muestra

ConcFnal.Sol.a Volumen
preparar
Sol.
Madre
inicial
Mg/ml
ml

Volumen Volumen
agua
Rx.Biuret

Volumen Abs
Final
570nm

ml

ml

ml

0,0

4,0

0,5

3,5

1,0

3,0

1,5

2,5

2,0

2,0

2,5

1,5

3,0

1,0

3,5

0,5

4,0

0,0

4,0

0,0

Al aadir el reactivo biuret dejar reposar 10 minutos y leer la absobvancia.

Medicin de la absorbancia en el espectrofotmetro:
a) Seleccionar la longitud de onda, 570 nm ( longitud de mxima absorbancia para la
reaccin del biuret)
b) Poner en la cubeta del espectrofotmetro el contenido del tubo blanco, secarla y
limpiarla bien por fuera e introducirla en el espectrofotmetro.
c) Ajustar la lectura a 100 de transmitancia y 0 de absorbancia.
d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la absorbancia de las soluciones de
los otros tubos, comenzando por el de menor concentracin.
e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del tubo muestra.
f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco (Abs=0), se construye una
recta en papel milimetrado, representando las concentraciones en el eje de abscisas y
las Abs. en las ordenadas.
g) Interpolar la Abs de la protena problema en la grfica y calcular su concentracin.
h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin y
que la relacin es lineal: Y = a + b X
(Y = A + B x Conc.). Utilizando
regresin lineal se obtiene el valor de los coeficientes A y B y se puede despejar
concentracin que en este caso es de la muestra desconocida.

V.
5.1

CUESTIONARIO
Cul es la concentracin de protenas de la muestra?

5.2

Se podra determinar la concentracin de cualquier muestra de protenas con esta

curva patrn?

5.3

Los aminocidos y los dipptidos daran positiva la reaccin del Biuret?

5.4

Investigue si existe alguna protena en la que no est presente ninguna aminocido

con anillo bencnico en su cadena lateral, e indique que consecuencias tendra sobre
la determinacin espectrofotomtrica

VI.

OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

VII.

CONCLUSIONES

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
VIII. BIBLIOGRAFA
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

PRCTICA 2
CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR
DILISIS
I.

OBJETIVO
Aumentar la concentracin de las protenas en un extracto o solucin que las contenga.

II. FUNDAMENTO
La dilisis es una tcnica que separa las molculas de acuerdo a su tamao usando
membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones menores que las
macromolculas que se deseen separar como las protenas, los poros permiten la difusin
de las molculas de solventes, sales y otras molculas pequeas, pero bloquean el paso de
protenas por su gran tamao.
Se usan membranas de celofn (acetato de celulosa), nitrocelulosa, colodin, u otras de
naturaleza semipermeable.
Los mecanismos de transporte son: osmosis, y difusin por diferencia de concentracin.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
01 pliego de papel celofn.
1Kg de azcar.
Solucin de extracto proteico al 0.5%.
Pipeta de 10 ml.
Vaso de precipitados.
Piceta.
IV. MTODO
Preparar una bolsa con el papel celofn, de modo que no se presenten fugas al llenarla
con una solucin.
Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solucin de protena al 0.5%.
Comprobar la concentracin de protena con el espectrofotmetro a 280 nm.
Llenar la bolsa de celofn con 50 ml de solucin proteica, usando para tal fin la pipeta
de 10 ml., y sellar luego la bolsa de modo que no presente fugas.
Preparar un tazn con azcar, y colocar all la bolsa de celofn conteniendo la
solucin proteica.
Untar toda la bolsa de celofn, con el azcar, cubrindola por completo.

 Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azcar, observando los cambios ocurridos.
Medir el volumen de lquido que qued en la bolsa de celofn y comparar con el
volumen inicial.
Mediar nuevamente la concentracin de protenas en el espectrofotmetro a 280 nm.
V. CUESTIONARIO
Seale las principales tcnicas de separacin de solutos por membrana, y las
principales aplicaciones de cada una de ellas.
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Investigue la composicin qumica de la membrana utilizada y explicar las razones
de su porosidad.
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Efecte los clculos de variacin en el volumen y la concentracin de la protena en
solucin.

Indique el principio y la ecuacin bsica del transporte de solventes por osmosis.

_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Indique el principio y la ecuacin bsica del transporte de solutos por difusin
debida a diferencias de concentracin.

_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
VI. OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
VII. CONCLUSIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
VIII. BIBLIOGRAFA
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

PRCTICA 3
DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICRO-KJELDAHL
I.

OBJETIVO.
Determinar indirectamente el contenido de protenas totales en una muestra desconocida.

II. FUNDAMENTO
El mtodo de micro-kjeldahl es una simplificacin hecha por HACH en el proceso
Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo anlisis en un tiempo corto y con pequeas
muestras.
Se funda en la transformacin del nitrgeno presente en las protenas a nitrgeno
inorgnico. Para ello se siguen tres etapas claramente diferenciadas
1. En la primera, se digiere el material por accin del cido sulfrico en presencia de
oxidantes fuertes (perxido de hidrgeno), de esta manera todo el carbono presente se
libera como CO2 y nitrgeno como NH3, luego este se combina con el exceso de
cido sulfrico para dar sulfato de amonio.
2. En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la accin de un lcali
fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se recibe en una solucin de cido dbil en
presencia de colorante indicador.
3. En la tercera se titula la solucin con un cido fuerte cuantificando el nitrgeno
presente.
Luego se aplica la relacin siguiente:
%N = ml.N.fc.meq.100
peso de muestra
donde: ml.N.fc.meq = peso de nitrgeno en la muestra
ml = gasto de cido sulfrico en la titulacin (ml)
N. normalidad del cido
Fc. Factor de correccin del cido
meq.= peso del miliequivalente del nitrgeno
Suponiendo que la muestra solo contiene protenas simples con 16% de N, el
porcentaje de protenas ser:
Protena = 6.25xN
III. PROCEDIMIENTO
El proceso de determinacin se hace en tres etapas:

DIGESTIN.
Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es slido) y colocar en el matraz de
digestin
Agregar 4 ml de cido sulfrico concentrado al matraz
Verificar que el control automtico del digestor este en 440C y que haya
succin en la columna de fraccionamiento.
Digerir la muestra por 4 min despus de haber alcanzado la temperatura
indicada.
Aadir 10 ml de perxido de hidrgeno al 50% a la muestra a travs de un
embudo de la columna de fraccionamiento. Si el digesto no se torna incoloro,
aadir porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se aclare.
Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar la columna de
fraccionamiento, y colocar el matraz sobre un bloque y tapar hasta que se haya
enfriado.
Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.
DESTILACIN
El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un baln de destilacin.
Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de cido borrico al 4% (en
volumen) adicionndole indicador azul de metileno y rojo de metilo, dando una
coloracin violeta.
El baln de destilacin que contiene el digesto se aade 13 a 15 ml de hidrxido
de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de zinc.
Conectar el equipo de destilacin y destilar el digesto durante unos 10 a 20 min
(hasta que el vaso receptor tenga una coloracin verdusca y su volumen sea ms
o menos 3 veces del volumen inicial)
TITILACIN.
Preparar una solucin de cido sulfrico 0.1 N y valorizarla.
Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violeta
IV. CUESTIONARIO
Explique la diferencia entre protenas simples y conjugadas.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

Indique ejemplos y estructuras primarias de dos protenas simples y dos protenas

conjugadas

Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el proceso de
determinacin del nitrgeno

Efectu los clculos y determine el contenido de protenas en la muestra

Indique que tipo de enlaces de una protena se rompen durante la etapa de digestin

Explique el objetivo de la etapa de destilacin.

_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
Explique porque la titulacin se hace con cido sulfrico y no con un lcali.
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________

V. OBSERVACIONES
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
VI. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
VII. BIBLIOGRAFA

PRCTICA 4
SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE
AMINOCIDOS
I.

OBJETIVO:
Aplicar la tcnica de cromatografa en capa fina para la identificacin de aminocidos
presentes en una muestra biolgica.

II. FUNDAMENTO TERICO:

AMINOCIDOS
Los aminocidos son las unidades estructurales de las protenas.
Por lo tanto, si a una determinada protena se le somete a una hidrlisis ya sea cida o
alcalina; ste proceso rendir una mezcla de sus aminocidos constituyentes, los cuales
pueden ser susceptibles de ser analizados o identificados por mtodos cromatogrficos.
Todas las protenas son polmeros y los monmeros que se cambian para
formarlos son los a -aminocidos.

Los diferentes aminocidos se diferencian por sus cadenas laterales.

In vivo el pH fisiolgico es prximo a la neutralidad.
El pKa de los grupos carboxlo y amino de los alfa -aminocidos es
aproximadamente 2 y 10 respectivamente.
Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo carboxilato habr
perdido un protn y el grupo amino habr captado un protn para dar la forma
ZWITTERION.
En los genes, de todos los organismos estn codificados 20 aminocidos que se
incorporan a las protenas.
Todos los aminocidos son enantimeros (L)
Existen otros aminocidos (no proteicos) y tambin hay aminocidos
modificados que se hallan en las protenas.

 La variedad de las cadenas laterales (hidroflicas, hidrfobas, cidas, bsicas,

neutras) permite una gran complejidad funcional en las protenas.
CROMATOGRAFA
Mtodo de Separacin
Permite separar, aislar e identificar componentes estrechamente relacionados
presentes en mezclas complejas.
En estos mtodos se emplea:
- Fase estacionaria

: Slido/lquido

- Fase mvil

: liquido/gas

Los componentes de una mezcla se transportan a travs de una fase

estacionaria por medio de una fase mvil que fluye.
Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migracin entre los
componentes de la muestra.
Cromatografa en Capa Fina
Tiene 2 partes: Fase mvil y Fase estacionaria.
El soporte o Fase Estacionaria.
Es un slido poroso capaz de retener solvente y slido pueden ser.

El soporte poroso est adherido a la base, est pegado gracias a la presencia de SO4Ca
que ayuda a pagar el soporte.
En las leyendas de las placas de slica se encuentran como:

El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay alguna marcha de la
migracin de muestra o estndares esta marcha ya no es verde sino violeta.
III. PROCEDIMIENTO:
Primer Proceso: Sembrado de la muestra
Se siembra los estndares y la muestra con un capilar bastante fino.
Tener precaucin de que en el sembrado se intenta tener una mancha entre 1 y
2 mm de dimetro.
La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-7mm
aproximadamente.
Segundo Proceso: Elusin
Una vez sembrada la muestra se procede a la fase mvil con la ayuda de un
solvente de elusin.
Para ello se coloca dentro de una cmara de elusin

El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra.

El solvente comienza a subir por capilaridad.
Las muestras se comportan diferente segn el solvente utilizado y sus
componentes algunos migrarn rpidamente otros no.
Tercer Proceso: Visualizacin o Revelado
El producto puede verse:
Por s mismo porque tiene color.

 Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple vista.

Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna donde est la mancha dando
coloraciones amarillas profundas.
Usando mtodos qumicos, usando una sustancia qumica como revelado, ( en este caso
ninhidrina en butanol)
Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

Se describe la trayectoria de un soluto particular en funcin de su factor de retardo RF que se

define como:

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una sustancia

patrn en idnticas condiciones.
La razn de estas distancias se designa por Rstd
IV. PARTE EXPERIMENTAL:
Sembrado de estndares de aminocidos y muestras
Corrida cromatogrfica. Elusin
Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)

Tapar hermticamente y dejar que proceda el desarrollo de la separacin cromatogrfica,

hasta que el solvente haya alcanzado el frente trazado en la parte superior de la placa.
Revelado del cromatograma
-

Una vez que haya alcanzado el frente del solvente.

Destapar la cmara y retirar con cuidado la placa de vidrio. - Secar la placa con ayuda
de una secadora de cabello.

Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en butanol sobre la placa. Secar la
placa con una secadora.

Identificacin
Luego proceder a identificar las manchas existentes que debern corresponder a
aminocidos para ello se debern hacer los clculos de los Rfde los estndares y luego los
Rf correspondientes a las manchas de las muestras.
Rx. Ninhidrina es la reaccin que identifica aminocidos a travs de una coloracin azul
violeta.
V. CUESTIONARIO:
5.1.

Haga un esquema de los resultados observados.

5.2.

Calcular los Rf de los estndares y muestras.

5.3.

Identificar que aminocidos estn presentes en las muestras problemas.

5.5.

Qu es la cromatografa de exclusin molecular y la cromatografa de intercambio

inico y cules son sus aplicaciones.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________

5.6.

Qu mtodos existen para el anlisis de aminocidos de las protenas.

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________

5.7.

Indicar tipos de solventes de elusin para la fase mvil tanto para silica y almina.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________

5.8.

Haga el mecanismo de reaccin de la Ninhidrina con los aminocidos.

5.9.

La cromatografa en capa fina separa las sustancias segn su peso molecular.?

Fundamente.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________________________________________

VI. OBSERVACIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
VII. CONCLUSIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

VIII. BIBLIOGRAFA
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

PRCTICA 5
REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS
I.

OBJETIVOS:

Reconocer los principios inmediatos de los carbohidratos.

Diferenciar experimentalmente monosacridos, disacridos y polisacridos.
Familiarizarse con la clasificacin de los hidratos de carbono en reductores y no
reductores.
Estudiar las propiedades del almidn.

II. FUNDAMENTO TERICO:

Se denominan carbohidratos o glucsidos los derivados aldehdicoscetnicos, reales o
potenciales de alcoholes polivalentes o sus productos de condensacin segn la cantidad
de glucsidos o azcares sencillos que se obtengan por hidrlisis de los policarbohidratos.
Se les clasifica como:
Polisacridos (celulosa, almidn)
Trisacridos (rafinosa)
Disacridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y
Monosacridos
Los monosacridos por el grupo carbonilco pueden ser aldosas o cetosas por el. nmero
de tomos de oxigeno, pueden ser hexoaas (glucosa, galactona, manosa, fructosa), pentosa
(arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa), terrosas (treosa y eritrosa).
Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones carbonilo y oxhidrilo y,
adems, algunas especficas. Todos son ptimamente activos. Por el calor y la accin de
cidos fuertes se deshidratan, dando en algunos casos derivados del furfural.
Los hidratos de carbono ms abundantes de la bisfera estn constituidos por el almidn
y celulosa que son polmeros de glucosa presentes en plantas.
El almidn est distribuido ampliamente en las plantas que lo almacenan en granos y en
tubrculos como reserva alimenticia para el momento de la germinacin. Todos los tipos
de almidn producen un color azul con el yodo, lo cual sirve de indicador cualitativo
sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidn.
La hidrlisis del almidn catalizada por cidos lo convierte en varias clases de dextrinas, en
maltosa y por ltimo en D (+) glucosa.
El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrlisis puesto que la
coloracin va cambiando de azul a rojo a medida que decrece el peso molecular
delcompuesto orgnico.
Los grupos funcionales existentes en el almidn y en la celulosa son los grupos hidroxilo y
acetal. Estos polisacridos tienen diferente configuracin, siendo el almidn un glucsido
y la celulosa un f -glucsido. Tambin difieren en el tamao teniendo lacelulosa un peso
molecular medio mucho mayor que el del almidn.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Reactivo Molisch

Tubos de ensayo

Reactivo Fehling

Pipetas

Reactivo Tollens

Bao de agua hirviente

Reactivo Seliwanoff

Pinzas

Reactivo Barfoed

Bao hirviente

Sol. glucosa 1%

Vaso de precipitados

Sol. fructuosa 1%

Luna de reloj

Sol. sacarosa 1
Sol. lactosa 1%
Sol. almidn 1%
Sol. sacarosa 5%
Sol. HCl

10%

Sol. NaOH 10%

Sol. yodo - yodurado
IV. PROCEDIMIENTO:
Reacciones genricas de los carbohidratos
Reaccin de Molisch
En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una solucin de glucosa al1%,
1 ml. de solucin de fructuosa o levulosa al 1%, 1 ml. de una solucin de sacarosa al
1%, 1 ml. de una solucin de lactosa al 1%, 1 ml. de una solucin de almidn al 1% y
en el ltimo 1 ml. de agua (testigo). A cada una agrguele 2 gotas
de reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por las paredes 2 ml. de cido
sulfrico concentrado.
Observe el color violceo del anillo formado en la interfase entre los dos lquidos.
Anote aquellas soluciones que den positiva la prueba.
Reacciones Especficas
Reacciones de Fehling
En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solucin A de Fehling con 0.5
ml. de la solucin B de Fehling, agrgueles 1 ml. de la solucin de los carbohidratos
utilizados en el experimento anterior.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay cambios de color, formacin
de precipitados.

 Reaccin de Tollens
En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de Tollens recientemente
preparado, aadir a cada uno 2 ml. de las soluciones de carbohidratos utilizados
anteriormente.
Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay formacin de espejo de
plata y cuales carbohidratos dan negativa esta reaccin.
Realice una comparacin de estos resultados con los de la prueba de Fehling.
Reaccin de Seliwanoff
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanoff, luego aada 3 gotas de
solucin de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego lleve los tubos a bao
hirviente. Anote el tiempo en que se colorea cadaa tubo y el color adquirido.
Reaccin de Barfoed
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego aada 1 ml. de
solucin de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego llevar los tubos a bao
hirviente y observar la formacin de un precipitado de color rojo ladrillo, lo que
indicar la presencia de monosacridos.
Los disacridos tambin precipitan xido cuproso, pero muy lentamente.
Hidrlisis de la Sacarosa
En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solucin de sacarosa al 5%, llvelos a bao
hirviente y a cada tubo aada volmenes iguales de agua para el primer tubo, cido
clorhdrico al 10% en el segundo tubo, e hidrxido sdico acuoso al 10% en el
tercero.
Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a continuacin la reaccin de una
porcin de cada mezcla con la solucin de Fehling. Qu conclusiones deduce?
Ensayo del Almidn frente al Iodo
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solucin de almidn al 1%, aada una gota de
solucin de Iodo - lodurada, observe el color de la solucin. Luego caliente la
solucin coloreada a ebullicin y observe el efecto, observe tambin qu efecto
produce el enfriamiento de la solucin.
Hidrlisis del Almidn
En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solucin de almidn al 1%, aada 1 ml
de cido dorhdrico concentrado. Hierva la solucin y retire muestras de Y ml. a
intervalos prximos, ensayando su reaccin frente al iodo. Anote el color en los
diferentes ensayos.
Cuando la solucin ya no produzca coloracin con el iodo, neutralcela y ensaye la
reaccin de una muestra frente al Fehling. Formule estructuralmente los productos
finales de la hidrlisis del almidn (un disacrido y un monosacrido).

V. CUESTIONARIO:
5.1. Indique la composicin de los reactivos utilizados en la prctica (R. Molish, R.
Seliwanoff, R Barfoed, R Fehling).

5.2. Elabore un diagrama de flujos del proceso de produccin de la glucosa a nivel

industrial.

5.3. A qu se debe la coloracin azul del iodo sobre las muestras de almidn?
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
5.4. Cmo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrlisis del almidn?
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
VI. OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_________________________________________________________________
VII. CONCLUSIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
VIII. BIBLIOGRAFA
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

PRCTICA 6
DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS
PROTENAS
I.

OBJETIVOS:
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de describir y demostrar de manera
cualitativa las propiedades qumicas de las protenas en base a los siguientes aspectos:
Solubilidad de las protenas.
Las propiedades electroqumicas de las protenas.
El efecto cido-bsico en la solubilidad de las protenas.

II. PRERREQUISITOS:
1. Salting In y Salting Out.
2. Agentes precipitantes de protenas.
3. Propiedades fisicoqumicas del agua.
4. Ecuacin de Henderson-Hasselbach.
III. INTRODUCCIN:
Se considera a las protenas como polmeros biolgicos de aminocidos. En las protenas
existen 20 tipos de aminocidos diferentes los cuales estn en un nmero y secuencia
determinados por el cdigo gentico.
Con respecto a su tamao, las protenas van desde un peso molecular de 6000 Dalton hasta
varios millones de Dalton con una considerable variacin de formas y estructuras. Para su
estudio se consideran cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la ms simple la
estructura primaria y la ms compleja la estructura cuaternaria cuya conformacin depende
de diferentes fuerzas qumicas de atraccin y repulsin que son ejercidas sobre la estructura
molecular de la protena y por lo tanto son responsables de su estabilidad.
Por convencin se acepta dividir a las protenas en dos grupos: protenas simples y
conjugadas, las cuales presentan diferencias en sus propiedades qumicas y fsicas. Sin
embargo, para los fines que se persiguen en esta prctica se les mencionara en forma
general.
Los factores que pueden afectar la solubilidad de una protena son: La fuerza inica del
medio, el pH. la temperatura y la constante dielctrica del solvente. Cuando hay un cambio
de cualquiera de estos factores, la protena responde con una intensidad proporcional al
cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteica de una manera superficial o lo hace
tan drsticamente que desnaturaliza a la protena. Por fortuna, en nuestro organismo, la
variacin de tales factores es mnima por lo que son imperceptibles los cambios en la
protena.

IV. MATERIAL:
13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm
1 pipeta de 10 ml
5 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 5 ml
1 gradilla
V. METODOLOGA:
En esta prctica se trata de provocar cambios de solubilidad en protenas que se encuentran
en el organismo, mediante la modificacin las propiedades de los solventes, para establecer
una relacin con los efectos que se pueden presentar en el organismo.
Fundamento Qumico:
Las protenas poseen cargas positivas y negativas dependiendo del pH de la solucin
en la cual se encuentran; cuando se neutralizan, se presenta precipitacin proteica.
La adicin de una sal a una solucin proteica modifica la constante dielctrica del solvente
permitiendo una mayor solubilidad de la protena. Sin embargo, cuando se aade exceso de
una sal, se neutralizan las cargas de la protena y sta tiende a precipitar. Este mismo efecto
ocurre al aadir sales metlicas cargadas electropositivamente. Con la adicin de un cido o
una base a una solucin proteica se alcanza un estado en que hay el mismo nmero de
aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la protena y tiende a precipitar.
El pH que determina el nmero igual de cargas de signos opuestos se denomina punto
isoelctrico.
Experimento No. 1
Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido.
Preparar una solucin de caseinato de sodio, tomando 250 mg de casena, 20 mLde agua
destilada y 5 mL de NaOH 1N. Cuando la solucin sea perfecta, se agregan 5 mL de cido
actico 1 N. Mezclar bien, diluir a 50 mL con agua destilada. Si la solucin no est
suficientemente clara, se puede filtrar.
Preparar los siguientes tuboscomo se indica a continuacin
Tubo pH Agua
destilada
1
8.38
2
7.75
3
8.75
4
8.5
5
8.0
6
7.0
7
5.0
8
1.0
9
7.4
10
5.8

Ac. Acetico
0.01N
0.62
1.25
0
0
0
0
0
0
0
0

Ac.
Acetico 0.1
0
0
0.25
0.5
1.0
2.0
4.0
8.0
0
0

Ac. Acetico
1.0N
0
0
0
0
0
0
0
0
1.6
3.2

Caseinato
de Sodio
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0

Mezclar bien , esperar 30 minutos y observar los cambios que presente la solubilidad de la
casena en cada tubo. Reportar el punto isoelctrico correspondiente al tubo donde se
presenta la mayor precipitacin.
Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuacin de Hendersosn-Hasselbach.
Experimento No. 1
Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido.
Tubo
pH
Solubilidad
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Cul es el punto isoelctrico de la protena ?
____________________________________________________________________
VI. CUESTIONARIO:
6.1.

De qu factores depende la solubilidad de una protena en el agua.

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
___________________________________________________

6.2.

Explique en trminos fisicoqumicos el efecto que provoca la adicin de un cido o

una base fuerte.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
___________________________________________________

6.3.

Explique cmo afecta un cambio en la constante dielctrica del agua a la solubilidad

de una protena.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

6.4.

Qu es el Salting in y qu tipo de compuestos pueden promoverlo.

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

6.5.

Qu es el Saltingout y qu tipo de compuestos pueden promoverlo.

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

6.6.

Qu relacin existe entre el punto isoelctrico y la solubilidad de una protena.

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

6.7.

Qu es la ecuacin de Henderson-Hasselbach y en que casos est indicado utilizarse.

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

6.8.

Mencione que propiedades fisicoqumicas de la albmina le permiten interaccionar y

transportar cualquier compuesto incluyendo hidrofbicos a travs de un medio
acuoso.
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
____________________________________________________________

VII. OBSERVACIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
VIII. CONCLUSIONES
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
________________________________________________________________
IX. BIBLIOGRAFA
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
________________________________________________________________

PRCTICA 7
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIN.
I.

OBJETIVOS
1) Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin celular anaerbica
(fermentacin) en levaduras.
2) Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la respiracin celular.
3) Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no
competitivos, oxido-reduccin, modificacin de pH e inhibidores en la interpretacin
de sus resultados.

II. ACTIVIDADES
Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).
La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin:
C6H12O6 2CO2
2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede
medir la fermentacin por la produccin de CO2.
III. PROCEDIMIENTOS.
3.1. Complete la siguiente batera de tubos:
Tubos

Suspensin de 1 ml
levadura 7%

1 ml

1 ml

1 ml

Sol. Glucosa

1 ml

1 ml

1 ml

Sol. NaF

1 ml

Agua
2 ml
destilada(43C)

1 ml

Sol.Rojo
Neutro

1 ml

Agitar por inversin para homogenizar el contenido de cada tubo.

3.2. Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido, presionndolo girar
rpidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco. Marcar el
nivel de la burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un elstico los 4
frascos, ponerlos a incubar en un bao de agua a 43C.

3.3. Al cabo de 30 min. Marque el nivel final de la solucin en el tubo y mida el volumen
de gas producido con una pipeta con agua.
3.4. Cul es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH.
3.5. Anote y discuta sus resultados.

Soluciones:
1.

Solucin de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura en 10 ml de agua

destilada a 43C y completar a 100 ml con agua destilada a 43C.

2.

Solucin de glucosa 0,1 M

3.

Solucin de NaF0,1 M

4.

Solucin rojo neutro 0,02 M

Papel pH.
IV. OBSERVACIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

V. CONCLUSIONES
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
________________________________________________________________
VI. BIBLIOGRAFA
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
________________________________________________________________

PRCTICA. 8
INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL
POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA.
I.- OBJETIVOS
1) Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.
2) Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.
3) Evaluar por refractometra el grado alcohlico del producto de la fermentacin
II.- ACTIVIDADES
Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).
La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin:
C6H12O6 2CO2
2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede
medir la fermentacin por la produccin de CO2 y por la concentracin del producto
formado o por la disminucin de la concentracin del sustrato (en grados Brix)
III.- MATERIALES.
- Material biolgico: Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas
- Reactivos: Agar-agar, solucin de glucosa 5%
- Material: balones, probetas, pipetas, baguetas, hipodrmicas de 20cc, esptulas, picetas,
papel toalla.
- Equipos: Balanza, refractmetro, bao mara.
IV.- PROCEDIMIENTO
Acondicionamiento de materiales:
Solubilizar la levadura comercial de panificacin en 50 ml de agua destilada.
En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada, con calentamiento y
agitacin constante.
Calibrar el bao de mara a 40C, para mantener dentro del agar licuado.
Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla en refrigeracin
(aproximadamente 4C), por 30 minutos.
Inmovilizacin de la enzima:
Mezclar 50 ml de la suspensin de levaduras y 50 ml de agar agar licuado y homogenizar.
Tomar con una hipodrmica de 20 ml un volumen de la mezcla y dejar caer gota a gota en la
probeta que contiene el aceite vegetal refrigerado.
Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.
Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con movimientos rotatorios suaves.
Secar los pellets en papel toalla.

Obtencin del mosto de uva:

Obtener por prensado 50ml de mosto de uva.
Filtrar con una gasa el jugo obtenido.
Tomar una alcuota y leer los grados brix o porcentaje de azcar en el refractmetro.
Obtencin de etanol:
Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50ml de mosto de uva, (o 50ml de una
solucin de glucosa al 5%). To0mar una alcuota, considerando la muestra a tiempo cero y leer
los grados brix o porcentaje de azcar en el refractmetro.
Agitar la mezcla por 45 minutos. Tomar alcuotas cada 15 minutos. Leer los grados brix en el
refractmetro para cada alcuota.
V .- CUESTIONARIO.
1.-Indique la importancia de la inmovilizacin de enzimas y/o clulas.
Las enzimas inmovilizadas presentan varias ventajas sobre su contraparte en solucin. Permiten un uso
continuo, reutilizacin y control de las concentraciones de protena empleada. Asimismo, es viable
mejorar la estabilidad y actividad de la enzima en funcin del pH y la temperatura, adems, al ser
inmovilizadas quedan protegidas ante enzimas proteolticas, aumentando as la eficiencia del sistema. Sin
embargo, la inmovilizacin tambin puede presentar ciertas desventajas, por ejemplo, la actividad de la
enzima puede verse afectada por el proceso de inmovilizacin, adems, la velocidad de reaccin puede
estar limitada por la velocidad de difusin de sustratos y productos hacia dentro y fuera del sistema.

La inmovilizacin de clulas es la unin o su incorporacin e

n unsistema de fase slida especfica que permite el interca
m b i o d e sustratos, productos, inhibidores, etc. Pero, al mismo tiempo, separa la
biomasa celular cataltica de la fase que contiene los sustratos y
productos.L a t e c n o l o g a d e i n m o v i l i z a c i n c e l u l a r d i s m i n u y e l a m a y o r a d e
l o s problemas que plantea la fermentacin utilizando clulas libres. Estesistema
tiene la ventaja de poder manejar la densidad celular, previa alinicio de la fermentacin.
Adems, facilita el sistema de operacin delp r o c e s o d e f e r m e n t a c i n c o n t i n u a ,
evitando

el

paso

de

eliminar

lasc l u l a s d e l f e r m e n t a d o r . L a i n m o v i l i z a c i n c e l u l a r d e s a c
opla elcrecimiento microbiano de los procesos metablicos
d e i n t e r s industrial. Es as, que diversos grupos de investigacin han
empleadoeste

sistema

de

clulas

inmovilizadas

para

la

obtencin

de

variadosproductos de inters industrial, como asimismo, en el tratamiento

dedesechos de residuos lquidos y slidos.

2- Cul es el fundamento de la inmovilizacin de levaduras en agar?.

P o r s u s p r o p i e d a d e s d e a c c i n p r o t e c t o r a , s u t e x t u r a , e l a s t i c i d a d , tra
nsparencia relativa y reversibilidad es muy empleado como agentede
suspensin, estabilizacin y espesamiento.Por existir muy pocos microorganismos que
metabolizan el Agar-Agar oque elaboran enzimas capaces de degradarlo, le
confiere una mayorestabilidad, con respecto a geles de otros coloides
naturales,

que

loh a c e n m u y t i l c u a n d o e s u s a d o c o m o m e z c l a c o n o t r o
s g e l e s , polisacridos y protenas, en el sentido que la degradacin marcada
noo c u r r e c u a n d o s u s d i s p e r s i o n e s s o n m e z c l a d a s . U n g e l
c o n u n a concentracin

de

1,5% en

peso,

funde

entre

60C

y 97C.Una

caracterstica muy importante en la calidad del Agar-Agar, es suresistencia a

ser vencido, en estado de gel, por la presin. Esta fuerzade gel debe ser medida bajo
ciertas condiciones y se define como lapresin en gr/cm2 de superficie que
resiste un gel, de concentracin1,5% en peso y durante 20 segundos a 20C.
3.- Explique las caractersticas coagulantes del agar-agar.
Por sus propiedades de accin protectora, su textura, elasticidad, transparencia relativa y
reversibilidad es muy empleado como agente de suspensin, estabilizacin y espesamiento.
Por existir muy pocos microorganismos que metabolizan el Agar-Agar o que elaboran enzimas
capaces de degradarlo, le confiere una mayor estabilidad, con respecto a geles de otros
coloides naturales, que lo hacen muy til cuando es usado como mezcla con otros geles,
polisacridos y protenas, en el sentido que la degradacin marcada no ocurre cuando sus
dispersiones son mezcladas. La temperatura de fusin de un gel es funcin de la
concentracin y del peso molecular. Un gel con una concentracin de 1,5% en peso, funde
entre 60C y 97C.
La viscosidad de las dispersiones de Agar-Agar es altamente influida por el tipo de alga
y las condiciones del proceso utilizado. La viscosidad de una dispersin de Agar a 45C
permanece relativamente constante, entre pH 4,9 y 9,0, que no es muy afectada por el
tiempo, ni por la fuerza inica, cuando el pH est entre 6,0 y 8,0. Sin embargo, cuando
comienza la gelificacin, la viscosidad aumenta con el tiempo, a temperatura constante.

4.- Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las clulas de levadura, si estas
estn atrapadas en la matriz de agar-agar.
Se ha descubierto que en algunos casos es mejor inmovilizar (reducir el

movimiento) de

algunas levaduras para que pueda atacar enzimticamente mejor y con mayor eficiencia
sobre el substrato de hidratos de carbono evitando que los microorganismos se difundan
facilitando su recuperacin (los biocatalizadores suelen ser caros), para ello se emplean
'fijadores' como agar, alginato

de calcio, astillas de madera de blsamo, etctera.14

5- Presente al menos un caso detallado de aplicacin de la inmovilizacin de enzimas.

Aplicaciones mdicas
Existen muchas enfermedades causadas por una alteracin o carencia de una determinada enzima.
Tambin hay enzimas con actividad antitumoral, cicatrizante y con otras acciones teraputicas. El
tratamiento con estas enzimas inmovilizadas permitira una accin ms prolongada, ya que seran ms
resistente a la accin de las proteasas. Por ejemplo, la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de
leucemias y cnceres diseminados que requieren asparragina para desarrollarse. En la actualidad se ha
diseado un hemodializador de fibra hueca que contiene asparaginasa inmovilizada (19). La tripsina o
la colagenasa se utilizan para eliminar los tejidos muertos de heridas, quemaduras, lceras, etc.; para
acelerar el crecimiento de nuevos tejidos e injertos de piel, y tambin para inhibir el crecimiento de
algunos microorganismos contaminantes. Este tipo de enzimas se pueden inmovilizar en celulosas o
fibras que formarn parte del tejido de apsitos y vendas (20).

Aplicaciones en la Industria Alimentaria

Son muchas las enzimas que se emplean en el procesado, la preparacin y la conservacin de los
alimentos. Normalmente, las enzimas solubles aadidas son inactivadas por calentamiento una vez que
el tratamiento ha concluido. En ocasiones se permite que contine su actividad para que los alimentos
desarrollen el aroma y la textura deseados, pero nunca se reutilizan. La inmovilizacin permite que las
enzimas puedan ser reutilizadas repetidamente en operaciones continuas o discontinuas. De todas
maneras, existen limitaciones a su empleo relacionadas con los requisitos econmicos y sanitarios
inherentes al procesado de alimentos (28). A continuacin se resumen algunas de las aplicaciones
conocidas de las enzimas inmovilizadas en la industria alimentaria:
1) En la hidrlisis de protenas:
Las enzimas proteolticas se emplean en la modificacin del contenido proteico de los alimentos.
De esta forma se han conseguido hidrolizados de protenas de trigo mediante el uso de pepsina y
proteasa coinmovilizadas en chitosan (21). Otras proteasas inmovilizadas han sido empleadas en la
disminucin del contenido de lactoglobulina en la leche (29), en la industria quesera y en la solubilizacin
de concentrados protenicos de pescado.
En la obtencin de edulcorantes y aditivos alimentarios (21):
En la obtencin industrial del cido L-mlico interviene la fumarasa de Brevibacterium flavum
atrapada en k-carragenato. Este es un aditivo importante para zumos de frutas, refrescos, mermeladas
y dulces. Tambin, las enzimas inmovilizadas permiten la obtencin industrial de edulcorantes alimentarios
como el aspartamo, fructooligosacridos, diversos dipptidos, etc.

6- Qu otros mtodos para la inmovilizacin se utilizan?

2.1 Clasificacin de mtodos de inmovilizacin
Los mtodos de inmovilizacin de enzimas se clasifican en dos rubros: mtodos reversibles y mtodos

irreversibles (Gupta y Mattiasson, 1992).

2.1.1 Mtodos de Inmovilizacin Irreversibles
El concepto de inmovilizacin irreversible implica el enlace del biocatalizador a un soporte de manera
permanente, por lo cual el biocatalizador no puede ser liberado sin destruir o modificar su actividad
biolgica o el soporte. Los procedimientos ms comunes de inmovilizacin irreversible son el enlace
covalente, enlace cruzado, atrapamiento y micro encapsulado.
a) Formacin de enlaces covalentes
La inmovilizacin de protenas por mtodos basados en la formacin de enlaces covalentes estn entre
los ms usados. La ventaja de estos mtodos estriba en la naturaleza estable de los enlaces formados
entre las enzimas y el soporte. De igual manera, las enzimas en este mtodo no son liberadas en la
solucin en uso. Sin embargo, para lograr altos niveles de enlace, los residuos de aminocidos
esenciales para la actividad cataltica no deben involucrar un enlace covalente con el soporte aunque
esto puede resultar difcil de lograr en algunos casos. Los mtodos covalentes de inmovilizacin son
empleados cuando existe un requerimiento estricto de ausencia de enzimas en el producto.

Figura 1. Enzimas inmovilizadas en un soporte fsico por

enlace covalente, las enzimas se encuentran orientadas
espacialmente en el soporte
b) Formacin de enlaces cruzados
Con esta tcnica los soportes no son necesarios, ya que la inmovilizacin se da por un enlace directo entre
enzimas, que puede ser mediado o no por un agente de unin. Generalmente se aade el agente de bajo peso
molecular (ej. glutaraldehdo) a la enzima en solucin, uniendo covalentemente los grupos funcionales de las
enzimas para formar agregados (Figura 2). Este mtodo tiene como ventaja su sencillez, sin embargo, es
susceptible a cambios pequeos de pH y temperatura en las condiciones de operacin (Gdia-Casablancas,
2005).

Figura 2. Enzimas inmovilizadas por enlaces cruzados (lneas negras).

c) Atrapamiento
El mtodo de atrapamiento est basado en la oclusin de las enzimas dentro de una red polimrica que
permite al sustrato y a los productos pasar a travs de ellos y retener las enzimas (ODriscoll, 1976).
Este mtodo difiere de los mtodos de acoplamiento covalente descritos anteriormente, ya que las
enzimas no estn enlazadas a la matriz o soporte. Existen diversos mtodos de atrapamiento de
enzimas como el de gel (Bernfeld y Wan, 1963) o atrapamiento por fibras (Dinelli et al, 1976),
microencapsulado (Wadiack y Carbonell, 1975) y por inclusin. El uso prctico de estos mtodos es
limitado debido a la baja transferencia de masa a travs de las membranas o geles. Atrapamiento por
inclusin. Con este mtodo la enzima queda atrapada dentro de una matriz de gel que permite una fcil
difusin de productos.

Figura 3. Enzimas inmovilizadas por inclusin dentro de una matriz de gel.

A) gel hmedo. B) esferas del gel seco y triturado.
2.1.2 Mtodos de Inmovilizacin Reversible
En el mtodo de inmovilizacin reversible, las enzimas inmovilizadas pueden ser desprendidas del soporte
bajo condiciones no extremas. El uso de mtodos reversibles para la inmovilizacin de enzimas es altamente
atractivo, principalmente por razones econmicas debido a que el soporte puede regenerarse y recargarse con
enzimas nuevas cuando la actividad enzimtica decae. Existen distintos mtodo de inmovilizacin reversible,
que a continuacin se describen:
Por adsorcin
El mtodo de adsorcin emplea soportes orgnicos o inorgnicos que presentan un adsorbente activo
(monocapastiol auto ensambladas, oro, entre otros) en los cuales, las enzimas son atradas y retenidas por
medio de interacciones inicas o fuerzas dbiles (puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals,
interacciones hidrofbicas) (Figura 5) (Wood et al., 1997). Este mtodo consiste en poner en contacto la
enzima en solucin acuosa con un soporte adsorbente por un lapso de tiempo dado (2-48 h), para despus
lavar el soporte y eliminar la enzima que no fue inmovilizada. Presenta la ventaja de mantener intacta la
actividad de la enzima, ya que la unin es dbil y no afecta su conformacin, sin embargo, esta caracterstica
hace que al mismo tiempo la unin sea reversible y sensible a cambios de pH y temperatura.

Figura 5. Enzimas inmovilizadas en un soporte fsico. A) Por adsorcin, la

regin positiva de la protena interacta
con el soporte negativo.
Adsorcin no especfica. El mtodo de inmovilizacin reversible ms simple es la adsorcin no especfica, el
cual se basa en la adsorcin fsica o enlace inico (Messing, 1976; Woodward, 1985). En la adsorcin fsica
las enzimas son unidas a la matriz a travs de puentes de hidrgeno, fuerzas de van der Waals, o interacciones
hidrofbicas; mientras que enlaces inicos de enzimas son producidos a travs de uniones con sales. La
naturaleza de las fuerzas involucradas en la inmovilizacin no covalente resulta en un proceso que puede ser
reversible cambiando las condiciones que influyen en la resistencia de la interaccin (ej. pH, resistencia
inica, temperatura y polaridad del solvente). La inmovilizacin por adsorcin es fcil de realizar y
usualmente preserva la actividad cataltica de la enzima. Dichos mtodos son, por lo tanto, atractivamente
econmicos, pero pueden presentar problemas como la liberacin de enzimas cuando las interacciones son
relativamente dbiles. De igual forma es difcil encontrar condiciones bajo la cuales las enzimas permanecen
enlazadas fuertemente y activas.
Adsorcin hidrofbica. Otro mtodo es el uso de interacciones hidrofbicas, donde la adsorcin hidrofbica
ha sido utilizada como un principio cromatogrfico por ms de 3 dcadas. Consiste en variables
experimentales conocidas como el pH, concentracin de sales, y la temperatura (Porath, 1987). La resistencia
de las interacciones radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la protena. La hidrofobicidad del
adsorbedor puede ser regulada por el grado de sustitucin del soporte y por el tamao de la molcula ligante
hidrofbica. El xito de la inmovilizacin reversible de la -amilasa y amiloglucosidasa en soportes de
hexilagarosa ha sido reportada (Caldwell et al 1976; Caldwell et al, 1982). Muchos otros ejemplos de enlace
reversible con adsorbedores hidrofbicos ha sido tambin
mostrado en la literatura. (Cashion, 1982; Yon, 1974; Dixon, 1979).
Quelacin o enlace metlico. Sales de metales de transicin o hidrxidos depositados en la superficie de
soportes orgnicos han podido ser enlazados gracias a la coordinacin de los grupos nucleoflicos en la
matriz. Se utilizan principalmente sales de titanio y circonio, siendo este mtodo conocido como
inmovilizacin por enlace metlico (Cabral, 1991; Cabral, 1986; Kennedy, 1985). La sal metlica o el
hidrxido es precipitado en el soporte (ej. celulosa, quitina, acido algnico y bases de slice) por calentamiento
o neutralizacin. Debido a los factores estricos es posible para la matriz ocupar todas las posiciones de
coordinacin del metal, por lo tanto algunas de las posiciones permanecen libres para coordinarse con grupos
de enzimas.
La elusin de protenas enlazadas puede ser fcilmente lograda por competencia con ligantes solubles o
disminuyendo el pH. El soporte es subsecuentemente regenerado lavndolo con un fuerte quelante como el
cido etilendiaminotetraactico (EDTA). Estos soportes metlicos han sido utilizados ampliamente en
cromatografa de protenas (Porath, 1992; Kagedal, 1998).

Formacin de enlaces disulfuro. Estos mtodos son nicos, porque aunque se forma un enlace covalente
estable entre la matriz y la enzima, es posible que se rompan los enlaces por medio de una reaccin utilizando
agentes apropiados como el dithiotreitol (DTT) bajo suaves condiciones. Adems, debido a que la reactividad
de los grupos tiol pueden ser modulados mediante la alteracin del pH, la actividad es alta para mtodos que
usan enlaces disulfuro, con la condicin de que el apropiado tiol adsorbente con alta especificad sea utilizado
(Carlsson, 1998). Puntos crticos. Cabe mencionar que aunque la inmovilizacin sea dirigida a un sitio y/o por
un mtodo especfico, los enlaces qumicos y las interacciones entre la enzima y el soporte son complejos, y
un mtodo de estabilizacin nico no asegura que las interacciones sean 100% propias del mtodo (Wood et
al., 1997).

VI.- OBSERVACIONES Y COMENTARIOS

C u l
e s
e l
f u n d a m e n t o
d e l
r e f r a c t m e t r o ?
Lo que hace el refractmetro es utilizar una muestra (en nuestro casode mosto) para
proyectar la curva que produce la luz en una retculaque contiene una escala
permitiendo determinar el ngulo que forma
lal u z . E s t e v a l o r e s t r e p r e s e n t a d o e n g r a d o s B r i x y n o s i n d i c a
e l porcentaje de sacarosa presente en la muestra

VI.- CONCLUSIONES
RESULTADOS Y DISCUSIN:
-La primera medida de azcar realizada nos da como resultado
1 2 grados Blix.- L a s e g u n d a m e d i d a r e a l i z a d a l u e g o
d e m e d i a h o r a n o s d a c o m o resultado 10,6 grados Blix.- L a t e r c e r a
m e d i d a r e a l i z a d a a l d a s i g u i e n t e , l u e g o d e 1 7 h o r a s , n o s da como
resultado 8,8 grados Blix.- A l p a r e c e r e n u n p r i m e r m o m e n t o s e
c o n s u m i g r a n c a n t i d a d d e azcar y se produjo etanol, pero en
d e t e r m i n a d o m o m e n t o e s t e consumo se redujo.
CONCLUSIONES:

-Los pellets producidos en el laboratorio favorecen la fermentacin.-Al medir

la cantidad de azcares consumidos podemos determinar lacantidad de alcohol
etlico producido.

VIII.- BIBLIOGRAFA
http://html.rincondelvago.com/agar-agar.html
http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM/No.%206/5.html
http://tuinventas.com/attachments/article/1582/arroyo.pdf

PRCTICA 9
EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALES
I.

OBJETIVO.
Extraer la enzima Ureasa de la cscara de frejol y comprobar su actividad cataltica.

II. FUNDAMENTO.
Las enzimas son protenas con accin cataltica.
Las protenas se encuentran en el interior de las clulas en un estatus particular, a pH
fisiolgico, y con estructura nativa estabilizada por diversas mezclas de sustancias.
La extraccin de enzimas debe realizarse de modo que conserven las caractersticas
estructurales y las propiedades funcionales de las mismas.
Las leguminosas son conocidas por su alta actividad uresica, debido a la enzima ureasa
presente en la cscara.
La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato rea provoca la hidrlisis de esta con la
consiguiente liberacin de amoniaco y anhdrido carbnico, segn la siguiente reaccin.
NH2
O=C

H2O ----------

2NH3 + CO2

NH2
La actividad uresica se puede comprobar haciendo reaccionar el amoniaco liberado con
el Reactivo de Nessler (K2Hg14). Este reactivo es el Yoduro doble de Mercurio y Potasio,
que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da productos de color amarilloanaranjado (complejo cuya frmula se supone sea HgONH2I), cuya intensidad de color
puede medirse a longitudes de onda de 405 a 420 nm.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
150 gr. De cubierta de frejol, solucin de rea0.3 M, agua destilada
Buffer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler.
Espectrofotmetro, Bao Mara, Balanza, Equipo de filtracin, papel filtro, Gradilla
de tubos, 02 fiolas de 100ml,04 tubos de ensayo de 10 ml. Baln de 500ml. Vaso de
precipitados de 500 ml.
IV. PROCEDIMIENTO.
Extraccin de la Enzima.

 Remojar 200 gr. De frejol en 500ml de agua destilada o (agua hervida fra) ,
despus de 24 horas remover la cscara por friccin, y proceder a escurrir el
agua.
Preparar 200 ml. De buffer fosfato de sodio 0.005 M.( PO4HNa2) , y 200ml. De
solucin EDTA 0.001 M. Usando en ambos casos agua destilada fra, mezclar
ambas soluciones, y enfriar a 4C. En un baln de 500 ml.
Pesar 20 gr de cscara de frejol y colocarlo en un vaso de precipitados de 500 ml.
Agregar 90 ml. De buffer fosfato previamente preparado, y licuar cuidando se
mantenga baja la temperatura.
Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml. De agua destilada.
Centrifugar la suspensin a 14,000 g. Por 10 min. o pasar la solucin por un
filtro rpido y enjuagar el papel filtro con 10 ml. De agua destilada.
Separar el sobrenadante y medir el volumen final del extracto obtenido, llevar a
refrigeracin.
Preparar un cuadro de resultados.
CASCARA BUFFER AGUA EXTRACTO FINAL (ml)

Determinacin de
espectrofotometra.

presencia

de

protenas

en

el

extracto

por

Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de reactivo biuret.

Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado, 1 ml de agua y 4 ml de
reactivo biuret.
Calibrar el espectrofotmetro y leer la absorbancia a 570 nm. Para comprobar la
presencia de protenas.
Anotar la lectura de Absorbancia.
Comprobacin de La actividad enzimtica.
Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como
tubo de blanco.
En ambos tubos agregar 0.2 ml de solucin de rea al 0.3 M y 1.5 ml de buffer
fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubacin a 37C por 3 min.
Agregar al tubo muestra 1.0 ml. del extracto y 4.8 ml de agua, al tubo blanco
5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubacin en bao mara a 37C por 15 min.
Despus de incubar los tubos, adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml
a cada tubo. Volumen total 8 ml.

 Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.

Calibrar el espectrofotmetro a 420 nm.
Medir la absorbancia. La muestra de extracto dar coloracin y un alta
absorbancia por el amoniaco liberado.
V. CUESTIONARIO.
Explique por qu es necesario licuar la cscara durante la extraccin de la enzima ureasa.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Diga que pruebas se tienen de haber extrado realmente enzimas vegetales.
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
________________________________________________________________
Haga los clculos de reactivos para las soluciones que se prepararon.

Explique el papel que juegan en la extraccin el buffer fosfato y la refrigeracin.

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

Haga un diagrama de flujo cuantitativo del proceso de extraccin utilizado en laboratorio.

VI. OBSERVACIONES
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
VII. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
VIII.

BIBLIOGRAFA
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
________________________________________________________________

PRACTICA 10
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA
I.

OBJETIVO
Determinar la capacidad cataltica o actividad enzimtica de la enzima ureasa.(enz. Ureaamidohidrolasa EC.3.5.1.5)

II. FUNDAMENTO.
La actividad enzimtica (U) es la expresin del poder cataltico de la enzima y se obtiene
midiendo la velocidad de la reaccin que cataliza.
La actividad enzimtica (U) se define como la cantidad de enzima contenida en 1 ml de
solucin que transforma o produce 1 mg de sustrato producto por minuto medidas en
las condiciones optimas de operacin de la enzima.
La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos vivos, mas no en el
organismo humano. Algunas fuentes comunes son las bacterias, o la cscara de frejol.
La ureasa cataliza la descomposicin de la rea segn la reaccin:
CO

NH2

+ H2O

2NH3 + CO2

NH2
La velocidad de una reaccin enzimtica como la velocidad de cualquier reaccin puede
ser determinada midiendo:
1. la cantidad de sustrato transformado en un determinado tiempo de reaccin
2. la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.
Para el caso de la reaccin catalizada por ureasa se puede hacer el ensayo midiendo la
cantidad de urea en el tiempo, o midiendo cualquiera de los productos (CO2 NH3)
producidos en un tiempo determinado.
Por facilidad se medir la cantidad de amoniaco formado, lo cual se hace por medios
espectrofotomtricos utilizando el reactivo Nessler que es un ioduro doble de mercurio y
potasio que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma un complejo de color
anaranjado castao.
2K2HgI4 + NH3 + 3KOH

HgONH2I + 7KI + 2H2O

La intensidad del color formado ser directamente proporcional a la cantidad de

amoniaco presente en cada tubo y se medir la absorbancia de cada tubo a 420 nm (filtro
morado).
III. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
Materiales.
Preparar 50 ml de solucin de urea 0.3 M.

 Preparar 100 ml buffer fosfato 0.05M de pH=7.4, con EDTA 0.001M

Reactivo Nessler.
50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/ml en buffer fosfato pH, 7.4 ( a 4C)
100 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M (5x10-4milimoles/ml)
Material de vidrio.
02 fiolas de 50 ml.
02 fiola de 100ml.
08 tubos de ensayo.
01 gradilla para tubos.
01 espectrofotmetro.
bao de hielo.
Incubadora a bao mara.
Determinacin de la curva de calibracin.
Se preparan en los tubos de ensayo soluciones de sulfato de amonio segn la tabla
siguiente:
Patrn Concentracin SO4(NH3)2 ml
de Buffer Nessler Volumen Absorbancia
N
(NH3) mol/ml nmol/ml
SO4(NH3)2 (ml)
(ml )
final ml
420 nm.
Blanco 00

0.0

0.0

7.50

0.5

8.0

5.0

0.01

7.49

0.5

8.0

10

0.02

7.48

0.5

8.0

15

0.03

7.47

0.5

8.0

20

0.04

7.46

0.5

8.0

25

0.05

7.45

0.5

8.0

30

0.06

7.44

0.5

8.0

Con los datos obtenidos se construye la curva de equivalencia o curva de calibracin.

Medida de la actividad ureasica.
Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como tubo
de blanco.
En ambos tubos agregar 0.2 ml de solucin de rea al 0.3 M y 1.5 ml de buffer
fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubacin a 37C por 3 min.

Agregar al tubo muestra 1.0 ml. de solucin de ureasa y 4.8 ml de agua, al tubo
blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubacin en bao mara a 37C por 15 min.
Despus de incubar los tubos,Sacar el tubo de incubacin e introducir en bao de
hielo para detener la reaccin.
Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo). Volumen total 8 ml,
agitar.
Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
Leer la absorbancia a 420 nm.
IV. CUESTIONARIO
1.- Efecte los clculos para completar los datos de la tabla.

2.- Calcule la cantidad de NH3 producido en la reaccin enzimtica.

3.- Calcule la actividad enzimtica de la solucin de ureasa en nmol de NH3

producido/min.

4.- Explique por qu durante la reaccin debe incubarse a 37C

5.- Realizar los clculos de micromoles de sulfato, amoniaco, y urea para cada tubo
patrn usados en la construccin de la curva de calibracin.

6.- Encontrar la equivalencia por el clculo del factor de equivalencia y por la

determinacin analtica de la ecuacin de la curva.

7.- Diga si la curva de calibracin obtenida obedece a la ley de Beer. Explique por qu.

8.- Explique por qu es necesario contar con un blanco en las determinaciones de

actividad enzimtica.

9.- Explique la diferencia entre actividad enzimtica y actividad especfica.

I.

OBSERVACIONES

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

II. CONCLUSIONES

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

III. BIBLIOGRAFA

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

PRACTICA 11
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA
I.

OBJETIVO.
Verificar la variacin de la velocidad de las reacciones enzimticas con la concentracin
del sustrato.

II. FUNDAMENTO.
La rea puede descomponerse por accin de la enzima Ureasa, para formarse amoniaco y
bixido de carbono segn la siguiente ecuacin.
NH2
CO

+ H2O

2NH3 +

CO2

NH2
Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por espectrofotometra a =
420 nm, si previamente se le compleja con reactivo Nessler.
Cintica de MichaelisMenten.
La velocidad de las reacciones enzimticas varan con la concentracin del sustrato
segn una cintica autosaturante que se describa por la Ec. DeMichaelis-Menten.
V = Vmax. [S]
Ks + [S]
La representacin grfica de tal ecuacin tiene la forma:

La ecuacin de Michaelis-Menten se puede resolver haciendo uso de la

Linearizacin de Lineweaver-Burk, en cuyo caso toma la forma.

Donde los parmetros anteriores se relacionan por la ecuacin de una recta.

1

[S]

vVmaxKs
III. MATERIALES Y EQUIPOS
Materiales.
20 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M
50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/l. En buffer fosfato de pH=7.4, con EDTA, 0.5
nM.
Agua destilada.
reactivo Nessler.
Bao de hielo.
Equipos y material de vidrio.
fiolas de 50 y 100 ml.
07 tubos de ensayo de 10 ml.
02 matraz de 100 ml.
pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml.
Equipo de bao mara.
01 espectrofotmetro Espectronic 20D+
01 termmetro de 0- 100 C
IV. PROCEDIMIENTO.
Preparacin de muestras.
Hacer los clculos y preparar la solucin patrn de sulfato de amonio al 5x10 -4
M
Hacer los clculos y preparar la solucin de urea 0.3 M
Calibracin del Espectrofotmetro.
A fin de transformar los valores de intensidad de color en valores de concentracin
del producto formado (NH3), y por tanto de actividad de la enzima se trazar una
curva de equivalencia de Densidad ptica (Abs) vs. Concentracin. Con ese fin se

preparan soluciones de amoniaco de concentracin conocida, las que se neutralizan

con reactivo Nessler, para obtener diversas intensidades de color. Por la dificultad
del uso del NH3 se usar soluciones de sulfato de amonio.
Preparar solucin madre de SO(NH4)2, al 5x10-4 M
Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles de Sulfato de Amonio,
calcular las nmol de NH3 que liberan cada una y su equivalencia con nmol de
rea. Completar la siguiente tabla.
Tabla N 1
PATRON n

Sol.
sulfato(ml)

de Contenido nmol Contenido nmol Equivalencia en

de sulfato
de NH3
nmol de rea

50

100

150

200

250

300
Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibracin de la prctica anterior.
Completar la siguiente tabla.
Tabla N 2

Muestra N

Volumen de sulfato NH3 en la muestra Absorbancia

tomado ( ml)
(nmol)

Blanco
1
2
3
4
5
6
Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuacin que relaciona DO vs
[NH3], haciendo los tratamientos estadsticos que sean necesarios.
Pruebas cinticas.
A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6 muestras y un blanco
para completar la tabla 3 como se muestra.

 Preparar solucin madre de ureasa 6gr/l en buffer fosfato

Tabla N 3
Tubo

Urea

Urea Buffer Incubar Ureasa Incubar Bao Nessler Reposar Volumen Abs
37C
hielo ml
final
Mol o.3M fosfato 37C
ml
5 min.
420
ml
ml
3 min
15 min
ml
nm.

Blanco 0

7.0

0.5

0.5

60

0.2

6.8

0.5

0.5

120

0.4

6.6

0.5

0.5

180

0.6

6.4

0.5

0.5

240

0.8

6.2

0.5

0.5

300

1.0

6.0

0.5

0.5

360

1.2

5.8

0.5

0.5

Calcular la cantidad de NH3 formado y de urea que reacciona ( de la curva de

calibracin), y completar la tabla 4

Muestra
1
2
3
4
5
6
Blanco

Tabla N 4
[urea]
en Densidad ptica Nmol de NH3 Nmol de urea
nmol/ml x10-2
(Abs)
producidos
que reaccionan
0.1
1.0
3.0
4.0
5.0
6.0
-

Tratamiento de datos.
Para cada muestra calcular la velocidad de reaccin mediante la relacin v =
P/t, donde (p) es nmol de NH3 producidos, y (t) es el tiempo de reaccin
enzimtica ( 15 min.) y completar la siguiente tabla.

Tabla 5
Muestra

[S] nmol/ml.

1/[S]

V(nmol/min.)

1
2
3
4
5
6
Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante.

Estimar el valor de Vmax.

Graficar 1/v vs. [S] y ajustar a una lnea recta.

Determinar grficamente los valores de Vmax. Y Ks.

1/v

 Escribir la ecuacin que representa a esta reaccin enzimtica.

V. OBSERVACIONES
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

VII. BIBLIOGRAFA
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

PRACTICA 12

EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO

I.

OBJETIVO
Extraer ADN de un tejido animal

II.

MARCO TEORICO
El ADN y ARN son biomolculas que intervienen en el almacenamiento y la
transferencia de la informacin gentica. Son componentes fundamentales de la clula
y constituyen en conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco.
Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando ncleo protenas, ya
que suelen unirse a determinados tipos de estas, como las histonas.
El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el ncleo , mitocondrias y
cloroplastos, mientras que el ADN se sita fundamentalmente en el ncleo de la clula
y tambin cloroplastos y mitocondrias en pequeas cantidades.
Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos dirigen y llevan a cabo la
sntesis de protenas, y por tanto de las enzimas necesarias para el funcionamiento
celular.
Por otra parte el ADN es el vehculo de la herencia que se transmite de padres a hijos
de generacin en generacin.

III.

FUNDAMENTO:
El ADN se puede aislar mediante una tcnica relativamente sencilla, consiste en
primer lugar en romper las membranas celulares para liberar los ncleos, para ello se
tritura el hgado de pollo en un mortero.
Al aadir una solucin hipertnica, como el NaCl 2M, se produce el estallido de los
ncleos, el detergente forma un complejo con las protenas y las separa del ADN, El
alcohol tiene como funcin precipitar el ADN que se va agrupando para dar lugar a la
formacin de unas fibras blancas visibles a simple vista, que se pueden colorear
mediante un colorante selectivo para ADN como el anaranjado de acridina.

IV.

MATERIALES

V.

Hgado de pollo 10 gr
Cloruro de sodio 2M
Etanol 96|
SDS 20%
Arena
Varilla de vidrio
vasos de precipitados
Mortero
Embudo
Pipetas
Probetas
Gasa

METODOLOGA
1.- Triturar 10 gr de hgado de pollo, dentro de un mortero, con la adicin de 5gr de
arena lavada, para promover el rompimiento de las membranas celulares.
2.- Aadir al triturado de hgado 50 ml de agua destilada hasta obtener una papilla.
3.- Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando separar los restos de tejido
que quedaron sin romper membranas.
4.- Medir el volumen del filtrado final.
5.- Aadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo todo a un vaso de
precipitados.
6.- Aadir 1 ml de SDS 20%.
7.- Aadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol fro, por las paredes, logrando se
formen dos capas, en la interface precipita el ADN.
8.- Con la ayuda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la misma direccin
tratando de hilar las fibras de ADN; sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras
blancas de ADN visibles a simple vista, que es el resultado de la agrupacin de
muchas fibras de ADN.

VI.

CUESTIONARIO
1. De qu est formada la cromatina?
2. Durante la extraccin del ADN Cul es la razn de triturar el hgado?, para qu
aadimos arena al triturado?
3. Por qu crees que estallan los ncleos al aadir NaCl 2M?
4. Qu accin tiene el ADN sobre la cromatina?
5. Durante la extraccin del ADN se utiliza un detergente y etanol, con que finalidad

VIII. OBSERVACIONES
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

IX. CONCLUSIONES

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________

X. BIBLIOGRAFA

________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________