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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA IZTAPALAPA

i l - 9 T-

Desnaturalizacin de protenas
inducida por temperatura y

desestabilizantes qumicos

PROYECTO TERMINAL DELA LIC. EN QUIMICA

POR: MISAELA FRANCISCOMARQUE2

MAYO DEL 99

Este trabajo se realiz bajo la direccin de la Dra. Silvia Sols Mendiola en Area Biofisicoqumica de el
(R-209),

Departamento Qumica, deUniversidad Autnoma Metropolitana - Iztapalapa, Divisin deCBI.

INDICE

INTRODUCCION 1. Protenas
1

2. Caricana, lisozima y tripsina


3. Dicrosmo Circular

8
1 2 12 13 1 4 16
30

4. Desnaturalizacin trmica
5. Desnaturalizacin por agentes orgnicos

6. Objetivos
7. Mtodo experimental

8. Resultados y discusin
9. Conclusiones

1 O.

Bibliografa

32

INTRODUCCION

l. Protenas
Las protenas son sustancias macromoleculares presentes en

todos los organismos vivos. Propiamente la palabra protena deriva del griego proteicos, que significa primero. Las protenas son poliamidas, las cuales por hidrlisis dan aminocidos.

O II

O 11

H20,H

{-NHCHC-NHCHC-} I I

+
calor

HNCHCOH + HNCHCOH I I R R

etc.

Por lo comn, slo se encuentran veinte

aminocidos en las para originar

protenas en plantas y animales, sin embargo estosveinte aminocidos se pueden combinar enunagranvariedaddeformas, anticuerpos y muchas hormonas. Las masas moleculares de las protenas van desde 10,000 hasta ms de 50 millones (I), sepuedenclasificardeacuerdo funcin que desempean. Estas clases se resumen en al tipode la tabla 1. Las msculos, tendones, piel, uas, plumas, seda, hemoglobina, enzimas,

funcin que desempean. Estas clases se resumen en

la tabla 1. Las e

protenas fibrosas (llamadas tambin protenas estructurales) estn compuestas por molculaslargascomohilo,quesonresistentes insolubles. Otro tipo de protenassonlasglobulares.Estassonprotenas pequeas, algo esfricas a causadeplegarselascadenassobre mismas. Las protenas globulares son hidrosolubles diversas funciones en el organismo.

y desempean

Por ejemplo, la hemoglobina las protenas

transporta oxgeno a las clulas, la insulina ayuda al metabolismo de


los hidratos de carbonos;
los anticuerpos inactivan

extraas;elfibringeno(soluble)puedeformarfibrasinsolubles,que hacenquelasangresecoagule, travs de todo el cuerpo.


y lashormonas llevan mensajes a

Las protenas conjugadas, protenas conectadas a una gran parte no proteica tal como un azcar, desempean diversas funciones en el cuerpo. Un modo comn de unin entre la protena y la no proteica se efecta por medio de una funcin de la cadena lateral de la protena

-OH de una molculade azcar. puede formar un ster con un grupo

TABLA 1 CLASESDEPROTEINAS

CLASE

COMENTARIOS

Fibrosas o estructuras insolubles conectivo; tejido Forman comprenden 30% de las protenas carecen de de los mamferos; ricas en cistena y triptfano; hidroxiprolina. Elastinas Queratinas Albminas Forman tendonesy arterias. Forman pelo, pluma, uas; ricas en cistena y cistina. Ejemplos albmina de huevo albmina del suero. Globulinas Histonas Un ejemplo globulinadel suero. Se encuentran en los tejidos de las glndulas
y

en

los

cidos

nucleicos; ricas en lisina y argina. Protaminas Asociadas con cidos nuclecos; no contienen cistena, metionina,

tirosina, triptfano, ricas en argina.

Los elementos presentes ms abundantes en


(16%). En la mayorpartedelasprotenasseencuentra

las protenas son presente el

carbono (50 a 55%), el hidrgeno (7%), el oxgeno (23%) y el nitrgeno azufre, en una cantidad que va de 1 a 2%. El fsforo casi siempre esta presente.

Los aminocidos que se encuentran en las protenas son cidos a-amino carboxlicos. La variacin en las estructuras de estos monmeros ocurre en la cadena lateral.

CO H I H N-C-H

R
El

la

aminocido ms sencillo es

el

cido

aminoactico, lateral y por

(H2NCH2C02H),llamado glicina, que no tiene cadena consiguiente no contiene carbono quiral.

Los aminocidos se clasifican de acuerdoa su cadena lateral, los que contienen grupos carboxlos se les llama aminocidos cidos y los que tienen grupos amino, se clasifican como bsicos. laterales cidas y bsicas ayudan Estas cadenas a determinar la estructura y

reactividad de stas. El resto se les conoce como neutros, algunas de


las cadenas contienen -OH, -SH u otros grupos polares, que pueden

aceptar enlaces de hidrgeno

A continuacin se da la lista completa de los veinte aminocidos, en la tabla 2. TABLA 2 AMINOACIDOS

Aminocidos Grupos R apolares alifticos Glicina Alanina Valina Leucina lsoleucina Prolina Grupos R aromticos

Nombres abreviados

GlY Ala Val Leu Ile Pro Phe TYr T rp

G
V L I P

5.97 6.01 5.97 5.98 6.02 6.48

Fenilalanina Tirosina Triptfano Grupos R polares sin carga Serina Treonina T Cistena Metionina M Asparagina Glutamina Grupos R cargados negativamente Aspartato Glutamato Grupos R cargados positivamente Lisina Arginina Histidina

F Y

5.48 5.66 5.89

Ser Thr CYS Met Asn Gln

S C

Q
D E

5.68 5.87 5.07 5.74 5.41 5.65 2.77 3.22 9.74 10.76 7.59

ASP Glu

LYS Arg His

K R H

La disposicin o secuencia de los aminocidos a lo largo de la cadena determina la estructura primaria de una protena y su identidad nica (1,2,3), esto se refiere al esqueleto covalente de la cadena polipeptdica. Muchas de las propiedades se deben a la orientacin de la molcula como un todo, en la ordenacin regular y peridica de una direccin. La forma de hlice que adopta se le llama estructura secundaria, la forma general de la protena determinado por todos los pliegues, vueltas y bastn recibe el nombre de estructura terciaria. Se podrasuponerqueunamolculadeprotenalargaycompleja,es capaz de adoptar cualquier forma bajo una serie de condiciones ms baja determinadas, pero este no es el caso. Algunos de

los pliegues de la
La estructura el espaciolas

cadena de la protena dan lugar a disposiciones de energa (ms estable) que otros patrones de plegamiento. cuaternaria pone demanifiestocomosedisponeen una cadena. La combinacin de las estructuras, primarias, secundarias terciarias es la conformacin de una protena.

cadenas individuales polipeptdicas de una protena que posee ms de

Es la ordenacin

espacial de los grupos sustituyentes que son libres de adoptar muchas posiciones diferentes sin que se produzca ruptura de enlaces, debido a la posibilidad de rotacin alrededor de molcula
los enlaces simples de la

2. Caricana, lisozima y tripsina

La caricana, quimopapana y papana (4) se obtiene por ejemplo, en proteinasas para uso industrial, ablandadoresdecarne bebidas. Tambin, las proteinasas han sido de gran mdica, por ejemplo en el tratamiento del prolapso de vertebrales. Lacaricanaeseltercerconstituyenteproteoltico papaya. Tiene 216 residuos de aminocidos no

del ltex de la de las la proteccin de importancia los discos

fruta de la papaya (Carica papaya), ha sido usado como fuente

y prevencindelaformacindeturbidezen

de ltex de contiene ningn

carbohidrato unido a su cadena polipeptdica y contiene 7 residuos de cistena de los cuales se forman 3 puentes disulfuro, (Cys-22-63, 56-95 y 153-204) y un residuo de cistena libre (Cys-25) que es esencial para la actividad cata1tica. La lisozima provienen del huevo de gallina

(lo), es una protena


se estabiliza la

pequea con 129 residuos de aminocidos, la estructura por cuatro puentes de disulfuro, stos se mantienen durante desnaturalizacin, adems esta protena es reversible O). (1 La tripsina esdeorigenanimal(bovino)

(19),estaprotenaes

reversible a pH 3.0 y a temperaturas bajas, sin embargoa temperaturas altas a un pH de 8.0 es irreversible, adems pierde enzimtica a concentracionesaltasdedesnaturalizante
7

su actividad tal como la

urea y clorhidrato de guanidina (GuHCI), se dice que alrededor de una concentracin de urea 4M retienen un
50% de su actividad. La tripsina
115-216; 122-1 89;

tiene 6 puentes dedisulfuro(Cys-13-143;31-47;

154-168 y 179-203) y tiene 229 residuos de aminocidos. TABLA 3 ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS Muestra Referencia Masa Coeficiente Punto de extincin
(E M)

molecular (Da) 24,000 14,300 24,000

isoelctrico

(PI)
11.0

caricana lisozima tripsina

1.85 2.65 1.48 10.1

(4) 11.0 (4Y 10)


(1Y W

3. Dicrosmo Circular

Dicrosmo Circular (DC) es una tcnica (4) que de una macromolcula, por resulta apropiado para estudiar

nos sirve para

observar los cambios fsicos como la estructura secundaria y terciaria lo tanto este mtodo espectroscpico

los cambios conformacionales que

ocurren durante la desnaturalizacin de una protena. En molculas hay por lo menos tres clases de asimetra que pueden producir actividad ptica (8):
1. La estructura primaria puede ser asimetra. Por ejemplo, las

prximos transiciones de los electrones


8

a los carbonos a de

aminocidos y poliptidos sern pticamente activas a causa de la asimetra inherente en este punto;
los carbonos a de muchos

aminocidos tienen cuatro sustituyentes diferentes.


2. Las

estructuras secundarias de muchos biopolmeros son

helicoidales. Esto puede producir actividad ptica en las transiciones electrnicas, tanto de la cadena como de dispuestos helicoidalmente.
3. Las estructuras terciarias de una macromolcula puede

los grupos laterales

ser tal que

un grupo intrnsecamente simtrico est situado en un entorno asimtrico. Por ejemplo, las transiciones de los electrones del anillo en la tirosina son normalmente poco activas pticamente, pero en algunas protenas globulares los alrededores de una tirosina situada en el interior son tales que pueden producir electrnicos asimtricos alrededor del anillo. Estos pueden desviarse del desplazamiento del electrn en transicin hasta producir fuerteactividad ptica.

Hasta la fecha el tipo de asimetra que ha recibido mayor atencin es el segundo; la influencia de la estructura secundaria helicoidal en la actividad ptica.
A continuacin se muestra un diagrama esquemtico de un

espectropolarmetro (5).

MC

M0

' M

m==
R

F fuente P prisma

MC monocromador

M0 modular
M muestra

I incidente haz D detector

R registrador

y SE sistema electrnico.

10

La radiacin de una fuente muy estable y de gran intensidad (F) pasa a travs de un monocromador (MC) y es polarizada en un plano por un prisma (P). A continuacin,elmodulador retardador de la fase de uno de variacin en la fase depende de
(MO) acta como

los componentes de la radiacin, la

la seal elctrica de alta frecuencia

que el sistema electrnico (SE) del aparato emite y que es recibida por el modulador. De esta forma, el haz incidente (I) est alternativamente formado por luz circularmente polarizada a la derecha y a la izquierda.
El haz atraviesa la muestra (M) y al emerger es convertido en una seal

elctrica por el detector (D). El sistema electrnico calcula la diferencia entre la absorcin de la radiacin circularmente polarizada en sentidos, convirtindola en el valor numrico de graficndola contra la longitud de onda en el registro(R) ambos la elipticidad y

Para determinar la elipticidad por residuo medio,

[e] se

calcul

utilizando una masa molecular de 110 g mol- por residuo, determinada


por la secuencia de aminocidos de acuerdo a la siguiente relacin:

[O] = 8 X 100 / c X I (grados cm2decimol-)

donde

[e]= elipticidad molar por residuo


8 = elipticidad en grados

c = concentracin molar de residuos


I = longitud de recorrido ptico, en cm.
1 1

4. Desnaturalizacin trmica

Muchas molculas proteicas slo retienen su actividad biolgica dentrodeunafluctuacinmuylimitadadetemperatura temperaturas elevadas que consiste en estructura nativa, caracterstica de cadacadena molculas. La consecuencia ms significativa de es que lasprotenaspierdensuactividadenzimtica y depH, a la el desplegamiento de

polipeptdica delas la desnaturalizacin y uncambio

conocido como desnaturalizacin, el efecto ms visible consiste en un descenso de la solubilidad, pues los grupos hidrofbicos ubicados en el interior de la molcula quedan expuestoal solvente acuoso puesto que qumicos covalentes del esqueleto en los enlaces sehallegado a la conclusinquelaestructura peptdico de las primaria permanece protenas no se rompe durante este tratamiento relativamente suave,

intacta. La mayor parte delasprotenasglobularesexperimentanel proceso de desnaturalizacin cuando se calienta arriba de 60 y 70 "C (5Y 9).
5. Desnaturalizacin por agentes orgnicos

Soluciones orgnicas como la urea o el clorhidrato de guanidina (GuHCI) (2,3,4), son agentes desnaturalizantes de desplegamiento est acompaado por la interaccin la protena, el no covalente del

agente desnaturalizante con las molculas de protena.

12

La desnaturalizacinnecesitaunaaltaconcentracindeurea que las interacciones no pueden ser ni fuertes ni especficas. desnaturalizacin es entonces una consecuencia particular de fenmeno termodinmico general, preferencial, que se une preferencialmente a balance entre las afinidades de protena la con desnaturalizantes. la unin preferencial de componentes del solvente a la protena, es decir, una solvatacin

y
La un
los

clorhidrato de guanidina (6 M de GuHCl y 8 M de urea), lo que indica

la protena. En

consecuencia la accindelagentesedefineexclusivamenteporel

los agentes

6. Objetivos

a). Aislar y purificar la caricana b). Realizar estudios de desnaturalizacin trmica por dicrosmo circular de la caricana, lisozima y tripsina.

c).Realizarestudiosdedesnaturalizacinconurea guanidina(GuHCI) por dicrosmocircularde tripsina.

y clorhidratode

la caricana,lisozima y

13

7. Mtodo experimental

Para seguir la desnaturalizacin de la caricana, lisozima y tripsina se utiliz un espectropolarmetroJASCO J-500 A con celda de 1 mm de trayectoria ptica, con chaqueta de circulacin de aguaconectada a un bao de agua HAAKE NK-22. La temperatura se registr directamente en la celda ptica con un termmetro digital COLE-PARMER8402-20.
.

Se utiliz quimopapana parcialmente purificada.. Se aislaron por cromatografa lquida de intercambio catinico de alta resolucin, y caricana. (HPLC) Varian 9012/9050, las muestras de quimopapana Despus se dializ la caricana, para eliminar todas

las molculas pura se midi la

pequeas, una vez que qued totalmente absorbencia a 280 nm y elcoeficientedeextincin determinar la concentracin de la caricana.

concentracin, con la ayuda de un espectrofotmetro, dondese midi la

1.85, para

Se realizaronestudiosdedesnaturalizacin

con. la caricana a

diferentes valores de pH (2.0, 2.5, 3.0, 3.5, y 3.9). Se colocaron en la celda ptica 0.87 ml de la muestra y 1.23 ml de regulador de glicina 0.05M, para obtener una concentracin aproximada de 0.1 1 mg/ml. Se hicieron barridos de 260 a 190 nm a temperatura ambiente y a 60 C. Posteriormente se prepararon muestras de lisozima y tripsina a

las mismas concentraciones, repitiendo los mismos experimentos a pH constante de 2.5, sin embargo para la lisozima tambin sehicieron a-un pH de 2.9.
14

Despus se realizaron estudios con la caricana en presencia de agentes desnaturalizaste como la urea acuerdo con la siguiente tabla: y clorhidrato de guanidina, de

TABLA 1

Muestra

pH (regulador glicina 0.05M)

I
I

caricana caricana caricana

3.0 3.9

6y8M 6y8M

Los

espectros de dicrosmo

circulador se obtuvieron a

temperatura ambiente antes y despus de agregar la urea. Con la lisozima y tripsina sehizoel tabla 2.
TABLA 2

mismo tratamiento conel

mismo agente desnaturalizante a pH constante como se muestra en la

pH (regulador glicina 0.05M)


I

Urea

lisozima

2.5

6y8M 6y8M
I

2.5

1 s

Parafinalizarsehicieronestudiosdedesnaturalizacindelas protenas, enpresenciadelclorhidratodeguanidina(GuHCI) acuerdo a la tabla 3. 6M de

TABLA 3

Muestra

pH (regulador glicina
0.05M)

(GuHCI) 6M 6M
6M

caricana caricana caricana lisozima tripsina


8. Resultados y discusin

2.5
3.0

3.9

2.5
2.5

6M 6M

Se obtuvieron los espectros por dicrosmo circular a temperatura C , en ambiente y posteriormente a una temperatura aproximada de 60 O regulador de glicina 0.05 M a diferentes valores de pH: 2.0, 2.5, 3.0, 3.5
y 3.9, en el intervalo de 190 a 260 nm.

En la figura 1 se observan cinco pares de grficas que tienen misma tendenciaenelestadonativo


y enestadodesnaturalizado,

la a

pesar de la variacin del pH, con esto podemos decir que el efecto de la variacin de pH no desestabilizaa la macromolcula.

16

A temperaturaambiente,todos

los espectrostienen la forma y

magnitud caracterstica de la conformacin nativa de la enzima (2 y 9), a temperatura alta en las curvas se observa un mnimo alrededor de los
200 nm que es caracterstico de

la aparicin de estructuras

desordenadas. La diferencia entre los dos espectros es que en estado protenatienenformaglobular,dondeposeetodas la temperatura stasevaabriendopoco nativo la

sus propiedades

biolgicas as como su estructura, sin embargo a medida que aumenta a poco para adquirir una la protenaha

conformacin aleatoria.Enelestadodesnaturalizado,

perdido su estructura secundaria, terciaria y tambin su actividad, pero su estructura primaria probablemente queda intacta por el tratamiento trmico relativamente suave (3 y 9). La figura 2 muestra los espectros de dicrosmo temperaturas de 25 y 60 O C , enreguladorde valores de pH 2.5 y 2.9, si observamos stas que en enzima. los dos estados nativo comportamiento y nuevamenteelefectodel circular a

glicina 0.05 M, a dos curvas podemos decir mismo la pH nodesestabiliza

y desnaturalizado siguen el

A temperaturaambiente,todos

los espectrostienen

la forma y a
los 200

magnitud caractersticadelaconformacinnativa nm (12).

de laprotena,

temperatura alta, tambin se observa un mnimo alrededor de

17

CARICAINA
O
-2000 -4000

-m
-8000

-loo00
-12000 -14000 O -2000 -4000 -6000
3

-8Ooo

. d

-loo00 O
-2000 -4000

2 b13

m O

-m
-8000

-loo00 O
-2000 -4000

-m
-8000
-loo00

O
-2000 -4000
-6Ooo

-8000
-loo00

-12000
190

200

2 IO

220 230 240

250 260

grafica 1

LONGITUD DE ONDA (nm )

-2000
-4000

-6000
-8000

- 1O000

- 12000
O -2000

-4000
-6000 -8000

- 1O000 - 12000
21 200 190 O 220 230 240
250

260

LONGITUD DE ONDA (nm)


Figura 2: Desnaturaiizacin trmica de la lisozima por dicrosmo circular, en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5 (LN) lisozima nativa, (LD) lisozima desnaturalizada.

19

Lafigura

3 muestra los espectros de dicrosmo circular de la

caricana, lisozima y tripsina, en regulador de glicina 0.05 M, a pH 2.5, a temperatura ambiente y 60 'C. A temperatura ambiente los espectros obtenidos en la regin del UV lejano (1 90-260 nm) tienen la forma y magnitud caracterstica de la conformacin nativa de cada una de las enzimas (7, 12 y 14). Por otro lado, a temperaturas superiores la forma de las curvas de elipticidad es semejante entre ellas, donde se observa un mnimo alrededor de los 200 nm, el cual nos indica la aparicin de estructura desordenada en elipticidad son semejantes a la cadena polipeptdica. Las curvas de la observada con otras protenas

desnaturalizadas trmicamente (1 3 y 14).

A continuacin tenemos la desnaturalizacin de

la caricana por
y 5, en regulador

agentes qumicos, como se muestra en las figuras 4 de glicina 0.05 M a diferentes valores de temperatura ambiente, las desnaturalizaciones se

pH 2.5, 3.0 y 3.9, a hicieron con

desestabilizantes fuertes, urea6 y 8 M y con GuHCl 6.

En la figura 4 semuestran

los espectros de DC, adiferentes


llev a cabo a dos

valores de pH, donde la desnaturalizacin se

diferentes concentraciones de urea 6 y 8 M,como podemos obsenrar en los espectros a medida que se aumentala concentracin de urea, la desnaturalilzacin tambin aumenta. En ambas concentraciones de

20

urea, las curvastienenunmnimoalrededor concentracin de 8 M disminuye la magnitud de

de 210 nm, pero a la

los espectros, lo cual

nos indica la desnaturalizacin completa de la caricana. La figura diferentes valores de pH,


5 muestra los espectros de

DC de la caricana a
6 M. En

a temperatura ambiente, donde la

desnaturalizacin se realiz con clorhidrato de guanidina

presencia de GuHCl las curvas tienen un mnimo alrededor de 215 nm y disminuyenotablemente la magnitudde los espectros, lo cual nos indican la desnaturalizacin de la caricana a menor concentracin (6

M) Las figuras 4 y 5 muestran los espectrosde llevan la misma tendencia en estado el nativo, en urea y con clorhidrato de guanidina, donde podemos observar el distinto comportamiento de los desestabilizantes orgnicos, lo que nos indica que la (GuHCI) tiene una capacidad desnaturalizante mayor a la urea (18). la caricanaque el estado

desnaturalizado existen diferencias en los espectros con presencia de

21

O
-2000 -4000

-6Ooo
-8000

-loo00
O

-2000 -4000

-m
-8000

-loo00
-12000 O
-2000 -4000

-m
-8000

-loo00

1 9 0 200 210 220 230

240 250 260

LONGITUD DE ONDA ( nm )

Figura 3: Desnaturalizacin trmica de las tres protenas, en nativa, (CD) regulador de glicina 0.05M a pH 2.5. (CN), caricana (LN) lisozima nativa, (LN) lisozima caricana desnaturalizada, desnaturalizada, (TN) tripsina nativa y (TD) tripsina desnaturalizada.
22

[O] grados cm*decirnol-*

#
--"m

YD

/--

h ,

2000
O

7.

-2000 -4000 -8000

-m
-loo00
M

2000

. M

8 Td

O
-2000 -4000
I

p H 3.0

O -2000 -4000 -6Ooo -8000

-loo00
-12000 1 9 0 200 210 220

230 240 250 260

LONGITUD DE ONDA ( nm )

Figura 5: Desnaturalizacindelacaricana con clorhidrato de 0.05M, adiferentes pH. guanidina (GuHCI) 6M, reguladordeglicina (CN) caricana nativa y (CD) caricana desnaturalizada.

24

Las figuras 6 y 7 muestran los espectros de dicrosmo circular, en reguladorde glicina 0.05 M a pH 2.5, a temperatura ambiente, la

caricana, lisozima y tripsina se desnaturalizaron con urea 6 y 8 M y con clorhidrato deguanidina estado
6 M, respectivamente. Los espectrosenel

nativo diferentes las de enzimas siguen el

mismo

comportamiento de la conformacin nativa de cada enzima.

En la figura 6 se muestran los espectros de dicrosmo circular de la caricana, lisozima y tripsina, donde la desnaturalizacin se llev a cabo a diferentes concentraciones de urea (6 y 8 M) para cada una de las enzimas. Podemos observar en los espectros que conforme la magnitud de cada

aumenta la concentracin de la urea disminuye

una de ellas, pero difieren en su forma, teniendo un mnimo alrededor de 210, 205 y 215 nm, respectivamente para la caricana, lisozima y

tripsina. En la figura 7 se muestran los espectros de DC de las mismas enzimas, donde la desnaturalizacin se realiz con clorhidrato de guanidina 6 M, si observamos los espectros desnaturalizados con guanidina podemos decir que disminuye notablemente la magnitud de
25

estos y difieren en su forma pero todos tienen un mnimo alrededor de


215 nm.

Por ltimo tenemos la figura 8, donde presentamos los resultados

de desnaturalizacin de

la caricana a diferentes velocidades de

.O y 1.5 'C/min. Estos estudios se hicieron calentamiento 0.1, 0.3, 0.5, 1

en DC, con regulador de glicina 0.05 M a un pH de 2.5, midiendo de manera continua la temperatura y manteniendo constante la elipticidad de elipticidad, a 220 nm. A partir de los valores stos fueron

transformados a fraccin desnaturalizada de la caricana. Esta grfica muestra la transicin delestadonativo al estadodesnaturalizado, lo

cual es fuertemente afectada por la velocidad de calentamiento, con lo cual se comprob que es un modelo de dos estados.

26

O
-2000

-4000

-m
-8000

-lm
-12000

-8000

-2000 -4000

-m
I I I I

190 200 210 220 230 240 250 260

LONGITUD DE ONDA ( nm )

Figura 6: Desnaturalizacin de las tres protenas a temperatura ambiente con urea 6 y 8M en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5. (CN) caricana nativa, (CD) caricana desnaturalizada, (LN) lisozima nativa, (LD) lisozima desnaturalizada, (TN) tripsina nativa y (TD) tripsina desnaturalizada.

27

2000

II

-4ooo
-6ooo

-8000

loo00
2000
O

I -

-2000 -4000

-m
-8000 -loo00 -12000

- 14000
U

-2000
-4000

-m
190

200 210 220 230 240 250

260

LONGITUD DE ONDA ( nm )

Figura 7: Desnaturalizacin de las tres protenas con (GuHCI) 6M, en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5, A temperatura ambiente (CN) caricana nativa, (CD) caricana desnaturalizada), (LN) lisozima nativa, nativa y (TD) tripsina (LD) lisozima desnaturalizada, (TN) tripsina desnaturalizada.

28

a n a

1.0
L

N 7 0.8

a
CT

a
7

t-

0.6
0.4

w n
7

0.2

o o a
CT LL

0.0

30

40

50

60
(OC)

70

80

TEMPERATURA

Figura 8: Fraccin de la protena desnaturalizada en funcin de la temperatura, con una dependencia de Caricana en regulador de glicina velocidades de calentamiento. la elipticidad a 220 nm.
0.02M y pH 2.5, a diferentes

29

En los procesosdedesnaturalizacinde tripsina,existendiferenciasen poragentesdesnaturalizantes. estudiados, tienden temperaturas, donde menos fuertes. desnaturalizante clorhidrato del guanidina, de urea

la caricana, lisozima y aumenta la la desnaturalizacin a la capacidad


y

los espectros cuandose

temperatura y en los espectros donde se induce a desdoblarse de acuerdo

Por lo tanto,lasprotenasglobulares

altas

los agentes orgnicos son desestabilizantes

fuertes (GuHCI > urea) y las altas temperaturas son desestabilizantes

Debido a lo anterior, podemos concluir que en la desnaturalizacin trmica y la inducidaporagentesqumicosserompenenlacesno covalentes pero en diferentes proporcionesy en el caso de la presencia de los agentes desnaturalizantes el desdoblamiento es completo (16 y
17), y probablemente se rompanpuentesdisulfuro,ademsexisten

interacciones no covalente al desplegamiento de la protena con stos. Para la concentraciones se urea a altas lleva a cabo la desnaturalizacincompleta,resultandosimilar clorhidrato de guanidina. al desdoblamientodel

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9. Conclusiones

La tcnica de dicrosmo circular nos permite seguir fsicamente la desnaturalizacin trmica y la desnaturalizacin con agentes qumicos de la caricana, lisozima y tripsina.
En el proceso de desdoblamiento trmico de la caricana, lisozima y

tripsina, se observa un mnimo alrededor de

los 200 nm que es

caracterstico de la aparicin de estructuras desordenadas. En elestadonativode la caricana,lisozima y tripsina, todos los la variacindelpH, con lo que no

espectros tienen la forma y magnitud caracterstico de la conformacin nativadecadaenzima,apesarde desestabiliza a la caricana. En el proceso de desdoblamiento de la caricana, lisozima y tripsina, inducido por agentes desnaturalizantes existen diferencias en espectrosconureayconclorhidratodeguanidina,dondese a la de la urea. podemos concluir que el efecto del pH, en el intervalo estudiado,

los
puede

corroborar que la GuHCl tienen una capacidad desnaturalizante mayor

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