Regional Distrito Capital Centro Nacional de Hotelera, Turismo y Alimentos

INFORME DE LABORATORIO. MTODO DE LAS DILUCIONES PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Salmonella spp.

APRENDICES: IVON MARITZA SANDOVAL MILENA SALAZAR BUITRAGO NAYIBE CUBIDES PULIDO JUAN PABLO HERNANDEZ MIGUEL GONZALEZ MORALES

INSTRUCTORA: ALEXANDRA CUCAITA

CENTRO NACIONAL DE HOTELERIA TURISMO Y ALIMENTOS TECNOLOGIA EN CONTROL DE CALIDAD DE ALIMENTOS FICHA 433474 NOCHE 2013

1. INTRODUCCION El gnero Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos gram negativos, de 0,7-1,5 x 2-5 m, anaerobios facultativos, no formadores de esporas, generalmente mviles por flagelos pertricos (excepto S. gallinarum). Fermentan glucosa, maltosa y manitol, pero no fermentan lactosa ni sacarosa. Son generalmente catalasa positiva, oxidasa negativa y reducen nitratos a nitritos. Son viables en diferentes condiciones ambientales, sobreviven a la refrigeracin y congelacin y mueren por calentamiento (mayor a los 70 C). La salmonelosis es considerada una zoonosis de distribucin mundial y de origen alimentario. La va de transmisin es fecal-oral a travs de alimentos y agua contaminada con heces humanas o animales, materiales y utensilios de cocina contaminados o por contacto directo de persona a persona. Desde el punto de vista epidemiolgico, puede manifestarse como casos espordicos o brotes con un nmero variable de afectados. La susceptibilidad es universal. La salmonelosis se puede presentar como una enfermedad no sistmica o gastroenteritis que se caracteriza por un perodo de incubacin de 12 a 72 horas. Puede manifestarse en forma aguda con fiebre ligera (resuelve en 2 3 das), naseas, vmitos, dolor abdominal y diarrea durante unos das o una semana. La gravedad de los sntomas puede variar desde ligero malestar a deshidratacin grave y en algunos casos pueden quedar secuelas crnicas (sntomas de artritis que pueden aparecer 3 a 4 semanas despus de los sntomas agudos). 1. OBJETIVOS Emplear el mtodo de las diluciones seriadas y siembra en superficie con estras para la determinacin de Salmonella sp. Determinacin de salmonella sp. en alimentos preparados con pollo o huevo, en el agar Hektoen. Determinacin de flora microbiana acompaante en el medio de cultivo Hektoen.

2. MATERIALES Y MTODOS 2.1 Materiales

Material Cantidad Mechero 1 Tubos de 3 ensayo Frascos de 1 vidrio Cajas petri 6 Esptula 1 Asa 1 bacteriolgica Pipeta 1 Medio de Base de cultivo clculo Hektoen Muestra: 1 Empanada de pollo Agua peptonada (diluyente) peptona Base de clculo NaCl Base de clculo Agua destilada Base de clculo
Tabla 1. Materiales necesarios para el desarrollo de la prctica.

2.2. Metodologa empleada en el laboratorio: Alistar los materiales Realizar los clculos y preparar el agua peptonada Y el medio en el frasco de vidrio schott y en los tubos de ensayo. Homogenizar agua peptonada y el medio. Hervir el medio. Esterilizar en autoclave el agua peptonada, el medio y los materiales a esterilizar. Transcurrido el tiempo deje enfriar un poco los materiales a temperatura ambiente y realice las diluciones. Enfriar el frasco de vidrio schott que contienen el medio de cultivo recin esterilizado, en un bao Mara y esperar que la temperatura descienda hasta unos 35C. Sirva el medio en las cajas de Petri y deje solidificar. Realice la siembra en las cajas de Petri a superficie utilizando el asa bacteriolgica sumergiendo el asa en el tubo de ensayo de la primera dilucin, luego en la segunda y en la tercera dilucin en las respectivas cajas.

Llevar a incubacin a 35C durante 48 horas.

Figura 2. Mtodo para la determinacin de Salmonella sp. Utilizado en el laboratorio.

2.3. MEDIO DE CULTIVO HEKTOEN Se emplea como medio selectivo para el aislamiento y diferenciacin de Enterobacterias patgenas en gran diversidad de muestras. Est indicado para la diferenciacin de Salmonella y Shigella. Este medio fue formulado por King y Metzger, quienes dosificando correctamente los contenidos de hidratos de carbono y peptonas consiguieron contrarrestar el efecto inhibidor de los indicadores y sales biliares. Presenta suficiente efecto represor para la flora acompaante de las Enterobacterias patgenas, pero es menos selectivo que otros medios de aislamiento de Salmonella y Shigella. La formulacin actual es una modificacin de la inicial, en la que se ha suprimido el Sodio Desoxicolato y se ha compensado el medio. Por la presencia de los dos indicadores se diferencian las colonias de bacterias lactosa positivas de las lactosa negativas, las primeras toman un color amarillo anaranjado y las segundas un azul verdoso. Los microorganismos que fermentan la sacarosa y la salicina tambin toman un color amarillo anaranjado. La presencia de sacarosa y salicina evita la seleccin de patgenos falsamente positivos. Con el Sodio Tiosulfato y el Amonio Hierro(III) Citrato se detectan los productores de Hidrgeno Sulfuro por el precipitado negro de Hierro Sulfuro que presentan en el centro de las

colonias. La presencia de sales biliares inhibe el crecimiento de una gran parte de la flora acompaante. Frmula (por litro) Composicin (g/l): Amonio Hierro(III) Citrato................................1,5 Azul de Bromotimol.........................................0,064 Extracto de Levadura......................................3,0 Fucsina Acida..................................................0,1 Lactosa ..........................................................12,0 Peptona de Carne ..........................................12,0 Sacarosa....................................................... 12,0 Sales Biliares...................................................9,0 D(-)-Salicina.....................................................2,0 Sodio Cloruro ..................................................5,0 Sodio Tiosulfato...............................................5,0 Agar.................................................................14,0 pH: 7,50,2

Figura 3. Fotos de determinacin de Salmonella, E. Coli y Shiguella en agar Hectoen.

3. RESULTADOS

DILUCIN

RECUENTO

CARACTERSTICAS DE LAS COLONIAS

IMAGEN

10-1

FORMACIN DE COLONIAS COLOR NARANJA CARACTERSTICA PRESENCIA S DE E.COLI EN DE E.COLI EL MEDIO DE AUSENCIA DE CULTIVO SALMONELLA HEKTOEN.

Figura 4. Placa incubada para determinacin de -1 salmonella en el agar hektoen dilucin 10 .

10-2

FORMACIN DE COLONIAS COLOR NARANJA CARACTERSTICA PRESENCIA S DE E.COLI EN DE E.COLI EL MEDIO DE AUSENCIA DE CULTIVO SALMONELLA HEKTOEN.

Figura 5. Placa incubada para determinacin de -2 salmonella en el agar hektoen dilucin 10 .

10-3

FORMACIN DE COLONIAS COLOR NARANJA CARACTERSTICA PRESENCIA S DE E.COLI EN DE E.COLI EL MEDIO DE AUSENCIA DE CULTIVO SALMONELLA HEKTOEN.

Figura 6. Placa incubada para determinacin de -3 salmonella en el agar hektoen dilucin 10 .

Tabla 2. Resultados obtenidos despus de la incubacin de las diluciones para la determinacin de Salmonella.

Tabla 3. Mtodos horizontales para Salmonella spp. Tomada de la GTC 125.

4. DISCUSIN DE RESULTADOS El medio de cultivo Hektoen, es un medio de cultivo menos selectivo para el crecimiento de Salmonella y Shiguella, que son microorganismos patgenos que se pueden determinar en l, ya que tambin se puede evidenciar el crecimiento de flora acompaante tal como la Enterobacter aerogenes y E. coli, evidencindose en el medio como colonias de color naranja, por el contrario las colonias que evidencian la presencia de salmonella y shiguella son de color azul verdoso. De acuerdo con lo anterior, y revisando la tabla de resultados obtenidos (ver tabla 2.), podemos deducir que no hay presencia de Salmonella ni de Shiguella en la muestra de empanada de pollo que se tom para el anlisis y que por el contrario, si se evidencia la posible presencia de colonias de E.coli y Enterobacter aerogenes, caractersticas de color naranja, este tipo de colonias se evidencian en todas los cultivos de las diferentes diluciones, Sin embargo, debido a que no se aplic la metodologa adecuada para la determinacin de Salmonella, no se debe descartar que haya presencia de esta en el alimento, ya que no se crearon las condiciones adecuadas para el crecimiento de este microorganismo, ni se aplic la metodologa adecuada. Por ello es necesario realizar de nuevo el procedimiento y realizar las pruebas bioqumicas para asegurarse de los resultados obtenidos, para ello es necesario apoyarse de la NTC 4574

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. MTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIN DESALMONELLA SPP. El crecimiento de las colonias naranja, nos indica a su vez la mala higiene y manipulacin que se tuvo durante su elaboracin, procesamiento y almacenamiento del alimento ya que son posibles colonias de E.coli presentes en la muestra, lo que nos muestra que el personal manipulador no est cumpliendo con las buenas prcticas de higiene que se deben exigir para manipuladores de alimentos, de ah la necesidad de reforzar las normas y la exigencias para el personal. 5. CONCLUSIONES El mtodo empleado para la determinacin de salmonella que se describe en este informe, no es el ms adecuado para la determinacin de este microorganismo debido a que este necesita de altas concentraciones de protena par su adecuado crecimiento y en la prueba realizada en el laboratorio no se empleo la cantidad adecuada de muestra , ya que por ser un microorganismo patgeno requiere un tratamiento especial como el que se indica en la NTC 4574, en donde se deben realizar procedimientos de presuncin y posteriormente de confirmacin, para determinar la presencia o ausencia de este microorganismo en la muestra de alimento. Se pudo ver que el medio no es muy selectivo ya que permite el crecimiento de flora acompaante como se puede ver en los resultados obtenidos, donde se evidencia el crecimiento de colonias diferentes a las caractersticas para salmonella. Se evidencia la mala higiene y manipulacin en la preparacin y distribucin del alimento tratado, se muestra por el posible crecimiento de colonias de E.coli indicador de esto.

6. BIBLIOGRAFIA NTC 4574 MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. MTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIN DESALMONELLA SPP. GUIA TECNICA 125. GUIA DE REFERNCIAS DE METODOS HORIZONTALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICOS PARA BEBIDAS, ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU320_SPA.pdf http://www.educa2.madrid.org/web/educamadrid/principal/files/0e8a6 919-7eeb-423f-9fa8-b9c866aab3ff/ManualCultimed_completo.pdf

 http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_alimento
s_Vol_I.pdf