PRLOGO

Durante los ltimos decenios el conocimiento sobre las protenas, principales constituyentes de las clulas y tejidos de la materia viva, se ha incrementado de una manera notable. Son numerosos los textos generales y artculos especficos sobre la estructura y diversas FUNCIONES biolgicas, enzimticas, hormonales o inmunolgicas de las protenas. La alimentacin en el mundo actual plantea problemas de preocupacin general, debido al aumento de la poblacin el que no va acompaado de un crecimiento paralelo de aportes alimentarios, especialmente proteicos. De aqu el inters por el desarrollo de nuevas fuentes de protenas y su distribucin. Tanto la ingeniera gentica y como la ingeniera industrial con tcnicas recientes de cultivo de clulas y de tejidos, ofrecen nuevas perspectivas para una mayor produccin cuantitativamente mejorada de protenas animales, vegetales y microbianas. Las protenas, por otro lado, tienen adems funciones muy importantes en los alimentos, que se indicaran en los captulos respectivos.

INTRODUCCIN

La primera tarea de un pas pobre es mejorar la cantidad y calidad de su nutricin no solo en agricultura, sino tambin en economa y tecnologa de alimentos. NEVIS S. SCRIMSCHAW En los vegetales y animales se encuentra una sustancia que, sin lugar a dudas, es la ms importante de todas las conocidas de la materia viva, sin la cual sera imposible la existencia del hombre y de los animales. A esta sustancia se la denomina PROTENA. El origen etimolgico de la palabra "protena" proviene de "Proto" que significa de primera categora y fue sugerida por jns Jacob Berzelius y empleada por primera vez por el qumico holands Mlder en 1838. Su inters por ellas se justifica por ser entre las tres sustancias nutritivas (protenas, lpidos a hidratos de carbono), las nicas que aportan nitrgeno en ntima relacin con el papel plstico que desempean en la sntesis de las protenas tisulares. Las protenas no solo son constituyentes esenciales y universales de las clulas, sino adems, son unas de las pocas fuentes de las cuales el hombre y los animales pueden reemplazar el nitrgeno perdido durante los procesos metab6licos (Fruton, Sj., 1975), (Ronsivalli et al., 1992). Las protenas representan aproximadamente la mitad del peso seco del cuerpo (alrededor del 70% del cuerpo es agua). Del total de la protena corporal ms del tercio se encuentra en los msculos; la misiona es la protena que forma las fibras que constituyen los elementos contrctiles fundamentales en los movimientos musculares. Los huesos y cartlagos contienen otro 20%; aqu la protena conocida como colgeno contribuye a la estabilidad estructural del esqueleto. La piel tiene alrededor de un 10% de protena, sirviendo la queratina como protectora de los tejidos internos y de las agresiones del medio externo (Whitaker y Tannenbaun, 1977). Una gran parte de la poblacin del mundo sufre principalmente de carencia de protenas, mal conocido como Kwashiork. Esta palabra tomada de una tribu de frica, se refiere al trastorno nutricional del hombre ms grave y extendido en todos los pases de las zonas tropicales del mundo. En la mayora de las hortalizas y otros alimentos vegetales el contenido de protenas es bajo en cantidad y pobre en calidad, siendo los alimentos de origen animal excelentes fuentes de protenas de alto valor biolgico. Segn la FAO, en la actualidad unos 800 millones de personas padecen de desnutricin crnica, situacin que podra empeorar en las prximas dcadas. Esto motiva la necesidad de plantear un uso ms eficiente de las fuentes alimenticias que ayuden a solucionar el problema. Un progreso prometedor es el estudio que se lleva a cabo en la obtencin de aminocidos esenciales. En los Estados Unidos ya se suministra a los animales metionina sinttica a gran escala. La adicin de lisina a la harina de trigo o al pan, puede aumentar el factor de aprovechamiento de la protena de trigo desde 1/2 a 2/3 y la treonina puede convertir las protenas de los cereales en un material casi tan completo y aprovechable como las protenas de la carne y de la leche.

Las protenas poseen una extraordinaria diversidad de funciones y a esta circunstancia debe corresponder una diversidad de estructura qumica. El nmero de protenas identificadas es muy grande y va en aumento rpidamente. Estudiar las protenas presentes en los sistemas vivientes, investigar su estructura qumica y explicar su papel biolgico en funcin de esta estructura, son problemas fundamentales de la bioqumica moderna. Las protenas pueden clasificarse, arbitrariamente, en tres grupos principales: - protenas de estructura - protenas con actividad biolgica - protenas alimenticias Las protenas estructurales (queratina, colgeno, elastina) estn presentes en los tejidos, como msculos, huesos, piel, rganos internos, lquidos intracelulares. Su funcin depende principalmente de su estructura fibrosa. Las protenas con propiedades biolgicas tienen un papel activo en todos los procesos biolgicos, siendo las enzimas las ms importantes de este grupo; entre otras se encuentran las hormonas, que regulan las funciones metablicas, como por ejemplo, la insulina. Las protenas alimenticias no constituyen un grupo nico a causa del hecho que muchas protenas estructurales o biolgicamente activas, son protenas alimenticias. stas son simplemente aquellas que resultan sabrosas, no txicas y econmicamente utilizadas por el hombre (Braverman, 1980).

Captulo I CARACTERSTICAS GENERALES DE LAS PROTENAS

1. QU SON LAS PROTENAS? Las protenas son las molculas ms abundantes en el interior de las clulas. Son fundamentales en cuanto a su estructura y funcin, puesto que son los instrumentos moleculares mediante los cuales se expresa la informacin gentica; adems, desempean importantes funciones como la catlisis, la regulacin metablica y los procesos contrctiles. Las protenas son macromolculas que contienen carbono, nitrgeno oxgeno y, casi todas, azufre. En algunas se ha encontrado fsforo, hierro, zinc y cobre (Robinson, 1991). Sus pesos moleculares son muy elevados y mediante la hidrlisis cida dan una serie de compuestos orgnicos sencillos, de bajo peso molecular, llamados aminocidos. El nitrgeno representa entre un 12 y un 19% de la molcula, constituyendo sto la caracterstica principal de una protena. El factor de conversin de nitrgeno, obtenido segn Kjeldhal es diferente segn el alimento: - semillas de oleaginosas, frutos con cscara y derivados - gelatina - trigo y derivados, fideos, pan 5.30 5.55 5.70

- soya y derivados - panes de diversas harinas - avena, cebada, centeno, productos integrales - arroz y derivados - carnes, pescados, maz y derivados, verduras y frutas (excepto las con cscara) leguminosas (excepto soja) levadura y derivados - leche FUENTE: (Schmidt-Hebbel,1981).

5.71 5.77 5.83 5.95 6.25 6.38

2. CONFORMACIN DE LAS PROTENAS

Cada tipo de molcula proteica posee una organizacin tridimensional conocida como su conformacin. Segn sea la conformacin, las protenas se dividen en dos tipos: 2.1 Protenas fibrosas Las protenas fibrosas son fsicamente resistentes, insolubles en agua o en soluciones salinas diluidas. Estn formadas por cadenas polipeptdicas ordenadas en paralelo a lo largo de un eje comn lineal, formando fibras o lminas largas. Ejemplos de los elementos bsicos estructurales del tejido conjuntivo son el colgeno de los tendones, la matriz de los huesos, la alfa-queratina del pelo, piel, uas y plumas y la elastina del tejido conjuntivo elstico. 2.2 Protenas globulares Estas protenas estn constituidas por una o varias cadenas polipeptdicas plegadas, adoptando formas esfricas o globulares compactas. Algunas molculas poseen a la vez propiedades fibrosas y globulares (actina, fibringeno) (Braverman,1980). Forman especialmente las protenas de las enzimas, las hormonas y anticuerpos con actividad biolgica (Cheftel et al.,1992).

3. CLASIFICACIN DE LAS PROTENAS

Las protenas se dividen en dos grandes grupos basndose en su composicin: 3.1 Protenas simples Son aquellas que por hidrlisis completa originan slo aminocidos. Contienen un 50% de carbono, 7% de hidrgeno, 23% de oxgeno, 16% de nitrgeno y 0 a 3% de azufre (Robinson,1991). Las protenas simples se dividen en: a) Albminas: son solubles en agua, en soluciones salinas diluidas. Se encuentran ampliamente distribuidas en la materia viviente. b) Globulinas: son solubles en soluciones salinas diluidas y escasamente solubles en agua destilada o insolubles. Constituyen un grupo importante de protenas de amplia distribucin en el reino animal y vegetal. c) Prolaminas: son insolubles en agua, solubles en soluciones acuosas de etanol al 70% y tambin en soluciones acuosas de otros alcoholes de bajo peso molecular. d) Glutelinas: corresponden a unas de las protenas ms pequeas, siendo ricas en arginina y aminocidos bsicos; no contienen azufre y su carcter bsico les permite formar sales, tendencia a unirse con protenas acdicas y a cidos nucleicos. e) Histonas: estas protenas contienen gran cantidad de aminocidos bsicos. Se encuentran combinadas con cidos nucleicos en los ncleos de las clulas somticas de muchos organismos. f) Escleroprotenas: son insolubles en agua y en la mayora de los solventes orgnicos. Forman parte de la estructura corporal como el colgeno y la queratina. 3.2 Protenas conjugadas Estas protenas producen por hidrlisis compuestos orgnicos o inorgnicos. La fraccin no aminoacdica se conoce como "grupo prosttico". Este tipo de protenas se puede clasificar de acuerdo a la naturaleza qumica de sus grupos prostticos como: a) Nucleoprotenas: resultan de la asociacin entre una protena de carcter bsico y un cido nucleico. b) Fosfoprotenas: tienen un grupo prosttico correspondiente a una molcula de cido fosfrico. Ejemplos tpicos son: la casena de la leche, la vitelina del huevo y muchas enzimas capaces de asociar reversiblemente molculas de ortofosfato. c) Cromoprotenas: estn formadas por una protena, generalmente una globulina y una estructura coloreada; ejemplo la homocianina, citoctomos y flavoprotenas. d) Lipoprotenas: estn constituidas por una protena y un lpido. Son protenas tpicamente estructurales y se las encuentra como componentes importantes de la membrana celular, mitocondrias, etc. (Yez, 1983; Lehninger,1985).

4. ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS

Es evidente que la forma de la molcula proteica es el resultado de una alta estructuracin interna que ha sido motivo de muchos estudios fsico-qumicos, especialmente por Linus Pauling (1955) y sus colaboradores. Como resultado de estas investigaciones, fue posible asignar a las protenas cuatro niveles de estructura: Nivel 1. Estructura primaria Esta estructura est conformada por la secuencia lineal de los aminocidos, esto es, por el orden en que se encuentran ellos al unirse entre s mediante enlaces peptdicos. Las distintas cadenas peptdicas de una molcula tienen un aminocido C-terminal, portador de un grupo carboxilo (Braverman, 1980; Cheftel,1992). Las distintas cadenas polipeptdicas que forman parte de la molcula proteica suelen estar unidas por puentes dislfuro de restos de cistina (aminocido azufrado). Estos puentes son inestables a la mayor parte de las condiciones hidrolticas y sufren fcilmente numerosas reacciones de reorganizacin. Actualmente se conoce la estructura primaria de numerosas protenas (hormonas, enzimas) y su conocimiento ha significado un valioso aporte, ya sea para la interpretacin del mecanismo de accin de estas protenas o para la realizacin de su sntesis qumica. Nivel 2. Estructura secundaria Linus Pauling (1955) observ que si se haca pasar un haz de luz polarizada por una solucin de protenas, se produca una desviacin en el plano de la luz polarizada. Este fenmeno fue interpretado de la siguiente manera: la unin entre los aminocidos mediante el enlace peptdico para formar la estructura primaria, no forma una estructura lineal en el espacio, sino que va describiendo un giro sobre s mismo, adquiriendo una forma helicoidal (alfa-hlice) y es tpica de las protenas globulares. Se han descrito aproximadamente 3.6 restos de aminocidos por tipo de estructura fibrosa. El alfa-hlice de una protena est sustentado por la formacin de puentes de hidrgeno entre el grupo carboxilo de un residuo de aminocido (proveniente del grupo carboxilo antes de la formacin del enlace peptdico) y el grupo imino (- NH -) del tercer residuo del aminocido siguiente en la estructura primaria. Si bien el puente de H en s es una interaccin muy dbil, la formacin de un gran nmero de estas interacciones en la estructura aminoacdica proporciona estabilidad al alfa-hlice. Nivel 3. Estructura terciaria Las protenas deben estabilizarse respecto a su estructura, adoptando la forma termodinmica ms estable. Esta estructura se forma por plegamiento de la cadena aminoacdica, de manera que se establezca el mayor nmero de interacciones aminoacdica-aminocido y aminocido-solvente. La protena adopta una forma globular caracterstica, donde los radicales de aminocidos son capaces de interaccionar con el solvente quedando hacia afuera y los radicales de aminocidos hidrfobos quedan hacia el interior de la estructura de la protena. La estructura terciaria resulta, por lo tanto, del plegamiento de la cadena polipeptdica y estabilizada a travs de diversos tipos de uniones.

Nivel 4. Estructura cuaternaria Muchas protenas terciarias ya formadas son capaces de unirse entre s, formando una estructura cuaternaria. Las interreacciones que permiten la formacin de este tipo de estructura son similares a aquellas que intervienen en la estabilizacin de la estructura terciaria. Cada estructura proteica que integra una estructura cuaternaria constituye una sub-unidad, de modo que una protena formada por dos sub-unidades (de igual o diferente estructura), constituye un dmero, y una de tres unidades un trmero. En muchos casos las protenas con estructura cuaternaria son fcilmente disociadas en sus subunidades por agentes capaces de terminar con las interreacciones que forman esta estructura, que la presentan protenas de mucha importancia biolgica, como la hemoglobina (Robinson,1991; Cheftel et al.,1992).

5. UNIDADES ESTRUCTURALES DE LAS PROTENAS

Los aminocidos

Los aminocidos derivan de la frmula general:

y se han descrito 20 de ellos; son cidos alfa aminocarboxlicos, en los cuales el grupo carboxilo y el amino estn unidos al carbn alfa (Yez et al.,1983). En las protenas, los aminocidos estn unidos mediante el enlace peptdico; -CO-NH, es decir el grupo carboxilo de un aminocido forma un enlace con el grupo amino de un segundo aminocido, con eliminacin de una molcula de agua (Lehninger, 1985; Belitz et al.,1985). Las protenas cuando se hidrolizan con cidos minerales o por medio de enzimas, se descomponen liberando los aminocidos. Durante la digestin de las protenas por el hombre y los animales, los enlaces peptdicos son atacados rpidamente en el estmago y en el intestino delgado por las enzimas proteolticas especficas del estmago y del pncreas, que catalizan esta reaccin, de manera que los aminocidos y los pptidos pequeos liberados pasan a la sangre de la vena porta, principalmente desde el intestino delgado. En cuanto al punto de vista nutricional, las necesidades no son de protenas, sino de aminocidos, que el hombre y los animales utilizan para la biosntesis de las enzimas, protenas estructurales y compuestos no proteicos, como los cidos nucleicos.

6. PROPIEDADES GENERALES DE LOS AMINOCIDOS

Estructura general y clasificacin Los aminocidos son los monmeros de la molcula proteica. Cada uno de ellos contiene una cadena lateral (R) que influencia sus propiedades fsicas y qumicas y por lo tanto las propiedades de las protenas que las contienen (Cheftel et al.,1992, Yez et al., 1983). Segn la polaridad de esta cadena lateral, es posible clasificar los aminocidos en cuatro grupos:

6.1 Los aminocidos con cadenas laterales sin carga (no polares) como la glicina, la alanina, la valina, la leucina, la isoleucina, la prolina, la fenilalanina, el triptofano y la metionina. 6.2 Los aminocidos con cadenas laterales cargadas positivamente, como la lisina, la arginina e histidina. 6.3 Los aminocidos con cadena lateral cargada negativamente, como los cidos asprtico y glutmico. 6.4 Los aminocidos con cadenas laterales sin carga, que tienen grupos funcionales neutros y polares como la serina, la treonina, la cistena, la tirosina, la asparragenina y la glutamina. Desde el punto de vista de la fisiologa y la nutricin, los aminocidos se clasifican en dos grupos: a) Aminocidos esenciales: valina, leucina, isoleucina, triptofano, fenilalanina, treonina, histidina (esencial para lactantes), lisina, arginina, metionina, cistena que el organismo no sintetiza en cantidad suficiente. b) Aminocidos no esenciales: glicina, alanina, cistina, tirosina, serina, glutamina y cidos glutmico y asprtico (Belitz et al.,1985). Algunas de las propiedades de los aminocidos como punto de fusin, solubilidad enagua, momentos dipolares y constante dielctrica en solucin acuosa se deben a la distribucin dispar de sus cargas elctricas en soluciones acuosas. As todos los aminocidos en solucin acuosa a pH prximo a la neutralidad, estn bajo la forma de "Zwitteriones" (iones hbridos)

Cuando el aminocido est disuelto en el agua, se puede comportar segn sea el pH:

En otros trminos, estas molculas son anfteras (Braverman 1980), actan como cidos en solucin alcalina y como lcalis en soluciones cidas. Los aminocidos presentan una serie de reacciones debido a la funcin amino y cido o a las dos. Adems, si poseen una cadena lateral reactiva tienen reacciones especficas, entre ellas la de producir color, til para detectar y valorar en forma cuantitativa las protenas y los aminocidos. Por otra parte las reacciones que ocurren en las cadenas laterales de los aminocidos se utilizan para modificar qumicamente las protenas (Cheftel et al.,1992). Todos los aminocidos no necesariamente se encuentran en una protena determinada y tambin algunos de ellos pueden estar presentes muchas veces en la misma molcula proteica. Los aminocidos no esenciales se sintetizan a partir de intermediarios metablicos mediante 1 2 reacciones bioqumicas catalizadas por enzimas. Los grupos -NH2 de la mayora de estos

aminocidos se obtienen a partir de transmisin catalizada por diversas transaminasas (Lehninger, 1985).

7. DESNATURALIZACIN DE LAS PROTENAS

La conformacin de una protena basada en sus estructuras secundarias y terciarias la hace muy frgil. Las protenas sufren un proceso conocido como desnaturalizacin, en la cual se altera la disposicin espacial de las cadenas polipeptdicas dentro de la molcula y transformndose la estructura tpica de ella, en otra ms desordenada (Lehninger, 1985). Esta modificacin no va acompaada por la ruptura de los enlaces peptdicos implicados en la estructura primaria (Fig. 1). Muchas molculas proteicas slo retienen su actividad biolgica dentro de una fluctuacin muy limitada de temperatura y de pH. La exposicin de las protenas globulares a pH extremos o a temperaturas muy altas les hace experimentar un cambio conocido, como ya se dijo: la desnaturalizacin. Los efectos de la desnaturalizacin son numerosos y entre ellos se. pueden destacar: 1. descenso de la solubilidad, resultado del desbloqueo de grupos hidrfobos. 2. alteracin en la capacidad de retencin de agua. 3. prdida de la actividad biolgica (enzimas, hormonas). 4. aumento de la sensibilidad al ataque de proteasas, debido al desbloqueo de los enlaces peptdicos correspondientes a los sitios de accin especfica de las proteasas Figura 1 PROTENA NATIVA Y DESNATURALIZADA

5. aumento de la viscosidad intrnseca. 6. su capacidad de cristalizar. La desnaturalizacin puede ser reversible o irreversible, pero cuando se rompen los enlaces dislfuros que contribuyen a la conformacin de las protenas, este proceso es normalmente irreversible. Bajo ciertas circunstancias puede ser o no reversible; esto ltimo ocurre, generalmente cuando las condiciones de desnaturalizacin no han sido demasiado drsticas, ni el tiempo necesario. En algunas ocasiones el proceso de desnaturalizacin puede ocasionar otras estructuras diferentes a la de la protena nativa, al establecer interreacciones y enlaces entre regiones de aminocidos diferentes a los originales. Entre los principales agentes de desnaturalizacin de las protenas se encuentran agentes fsicos y agentes qumicos (Leverton, R., et al.,1985).

Reacciones de las protenas durante la preparacin de los alimentos

La preparacin de los alimentos puede tener como consecuencia alteraciones qumicas de las protenas cuyo tipo y magnitud dependen de varios parmetros; por ejemplo, de la composicin del alimento, de las condiciones del proceso tales como tiempo, temperatura, ph, y presencia de oxgeno. El resultado de tales reacciones puede ser una disminucin del valor biolgico de la protena debido por ejemplo a: - Destruccin de aminocidos esenciales. - Transformacin de los aminocidos esenciales en derivados, que no pueden ser utilizados metablicamente. - Disminucin de la digestibilidad por uniones intra o intercatenarias. En los alimentos proteicos en los cuales se producen procesos hidrolticos como en la carne, pescado, queso, los aminocidos liberados pueden contribuir al sabor. La calidad gustativa depende de la configuracin de los aminocidos: los que presentan sabor dulce pertenecen mayoritariamente a la serie D- y los amargos a la serie L-. Los aminocidos con cadenas laterales cclicas son o bien dulces o bien amargos. El cido glutmico en concentraciones elevadas tiene sabor a carne, en tanto la metionina tiene sabor a azufre (Belitz, Grosch,1985). Los aminocidos de las protenas naturales tienen un carbono asimtrico, son pticamente activos y presentan la configuracin L-; en tanto que la configuracin D- se encuentra en los obtenidos por sntesis (Braverman,1880) Tabla N 1 PROPIEDADES DE LAS PROTENAS EN ALIMENTOS Importancia en fisiologa alimentaria - Composicin en aminocidos - Disponibilidad de los aminocidos Importancia tecnolgica - solubilidad - dispersabilidad - coagulabilidad - fijacin de agua - formacin de geles - formacin de masa panificable - elasticidad - viscosidad - adhesividad - formacin de espuma - volumen y estabilidad de espuma - capacidad emulsionante - estabilidad de las emulsiones - extrusin

FUENTE: Belitz, Grosch, 1935; Robinson, 1991.

Captulo II LAS ENZIMAS

1. DEFINICIN Y CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS Las enzimas son protenas especializadas en la catlisis de las reacciones biolgicas. Se encuentran entre las ms notables de las biomolculas conocidas, debido a su extraordinaria especificidad y a su poder cataltico, que es mucho mayor que la de los catalizadores preparados por el hombre. Muchas enzimas han sido designadas aadiendo el sufijo asa al nombre del sustrato, es decir, de la molcula sobre la cual la enzima ejerce su accin cataltica. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea con produccin de amonaco y CO 2; la arginasa cataliza la arginina originando ornitina y urea y la fosfatasa hidroliza los steres fosfricos (Schultz,1960; Schmidt-Hebbel, Pennacchiotti,1982). Las enzimas son, por lo tanto, responsables directas de todos los cambios bioqumicos que se suceden dentro de la clula, no slo siendo agentes naturales de cambio de los alimentos, sino que son, adems, potenciales catalizadores para su transformacin o produccin. Hasta hace poco tiempo no haba unanimidad en cuanto a la clasificacin de las enzimas conocidas y por lo general se empleaban diferentes sistemas; algunos las ordenaban segn el tipo de reaccin que catalizan, otros lo hacan segn el sustrato sobre el cual actan las enzimas. Braverman (1980) clasific las enzimas en dos grandes grupos; las enzimas hidrolizantes llamadas hidrolasas y otro grupo conocido como Desmolasas. En un intento de introducir una normalizacin en la nomenclatura de las enzimas la Comisin de Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica, ha propuesto una nueva clasificacin, la cual divide a las enzimas en seis grupos segn el tipo de reaccin que catalizan. 1.1 Oxidorreductasas Son las enzimas comprometidas en la oxidacin de los sistemas biolgicos. En este grupo se incluyen las enzimas conocidas como hidrogenasas, reductasas, oxidasas, oxigenasas, as como las hidroxilasas y la enzima catalasa. 1.2 Transferasas Son las enzimas que catalizan la transferencia de varios grupos qumicos (metilo, acetilo, cetona, amino, fosfato, etc.) de un sustrato a otro. 1.3 Hidrolasas Son las enzimas responsables de la ruptura hidroltica de uniones peptdicas. Su nombre comn se forma mediante el agregado del sufijo asa al nombre del sustrato, ejemplo: las lipasas, proteinasas, pectinoesterasas, amilasas, maltasas, etctera. 1.4 Liasas Estas enzimas tambin catalizan la ruptura de uniones, pero no por hidrlisis. Algunas eliminan grupos de sus sustratos, dejando dobles ligaduras. Entre stas se encuentran las carboxilasas, aldolasas, hidratasas. 1.5 Isomerasas

Transforman a sus sustratos de una forma isomrica a otra. Entre stas se encuentran las racemasas y las epimerasas.

2. INACTIVACIN DE LAS ENZIMAS

Tal como sucede con muchas protenas, las enzimas pueden ser desnaturalizadas por varios medios, entre ellos el calor. La mayora de las enzimas son, por lo tanto termolbiles y generalmente una temperatura de 70 a 80 C durante 2 a 5 minutos basta para inactivarlas. La enzima peroxidasa es particularmente estable y puede llegar a soportar por algunos minutos, temperaturas de hasta 120 "C, sin perder por completo su actividad. 2.1 Agentes desnaturalizantes qumicos Ya que la estructura secundaria de las protenas est sustentada por los puentes de hidrgeno entre carboxilo e imino de los enlaces peptdicos, cualquier agente qumico que pueda competir con estos radicales en la formacin de dichas interacciones va a llevar a una destruccin de la estructura secundaria y terciaria, ya que la formacin de esta ltima depende de la primera. Ejemplos tpicos de estos agentes son la urea y los alcoholes. Los solventes no polares tambin afectan la estructura molecular de la protena, ya que destruyen las interacciones hidrofbicas e impiden la formacin de interacciones polares y puentes de hidrgeno. Los cambios de pH y fuerza inica tambin afectan la solubilidad de las protenas, provocando en determinadas condiciones su precipitacin. En este caso tpico la precipitacin con soluciones concentradas de sulfato de amonio es el procedimiento utilizado en la separacin y purificacin de protenas y enzimas. 2.2 Agentes desnaturalizantes fsicos La temperatura ejerce un efecto desnaturalizante en las enzimas, al desorganizar totalmente la estructura de la macromolcula, provocndole muchos cambios de solubilidad (coagulacin), color, digestibilidad, etctera. Las ondas ultrasnicas as como las radiaciones, tambin provocan la destruccin de las enzimas. Se ha observado que algunas enzimas regeneran su actividad, reapareciendo despus de un tiempo. El caso ms conocido es el de la peroxidasa (leche y vegetales), enzimas pectolticas (jugos ctricos) al no haber sido debidamente inactivadas. Durante siglos la fermentacin, la putrefaccin y la digestin fueron consideradas como procesos idnticos. La palabra fermento con que se design en un principio a estas sustancias proviene del trmino en latn "fermentum" = levadura o (segn otros) de fervere = hervir, debido al desprendimiento de gas que acompaa a los procesos enzimticos, como la fermentacin alcohlica. Sin embargo, hace ms de 100 aos el trmino fermento se ha sustituido a nivel internacional por el de "enzimas" aplicado por Khne, (1878) proveniente del griego "en zyme" = levadura y segn otros del trmino griego "zymes" = zumo. Esta ltima acepcin de la palabra "enzima" confirma la

inexactitud de la antigua clasificacin que se haba hecho entre "fermentos figurados o celulares" y "no figurados, solubles o enzimas". En efecto, fue Eduardo Buchner quien comprob mediante su experiencia (que le vali el Premio Nobel en 1907), que la fermentacin alcohlica lograda por el zumo de expresin de la levadura, se realizaba por la "zimasa 2" independiente de toda clula viva. Para exprimir el contenido celular de la levadura emple una prensa hidrulica (Schmidt-Hebbel, Pennacchiotti,1982).

Hitos en la evolucin del conocimiento de las enzimas

La historia de las enzimas est estrechamente conectada con el gran aumento del conocimiento en el campo de la qumica y de la tecnologa de alimentos; se seala que fue en estas dos disciplinas que la actividad catalizadora de las enzimas fue observada por primera vez (Pintauro, 1979). Entre las etapas que constituyen verdaderos hitos en la evolucin progresiva de la investigacin sobre las enzimas fueron, entre otras, sin duda, las siguientes: - Descripcin en 1526 de fenmenos relacionados con la fermentacin, por el famoso qumico Paracelso. - Observacin hecha en 1783 por el naturalista y fisilogo Lzaro Spallanzani, de que la carne era digerida por el jugo gstrico de los animales. - Descripcin de J.Liebig y F. Whler en 1837, de la emulsina de las almendras. - Aislamiento, a partir de races de vegetales, de una primera enzimaperoxidasa realizado por Planche, a comienzos del Siglo XIX. - Estudio de la invertasa en la miel, hecho por H.Erlenmeyer, en 1874. - Los estudios de Irvine en 1785 demuestran la accin hidroltica sobre el almidn y Kirchoff en el mismo ao describe las diastasas del trigo. - Elaboracin de un primer preparado enzimtico de origen microbiano, patentado por Takamine en Japn, en 1884. - Obtencin de una primera enzima en forma cristalina, la ureasa, a partir de la soja, en 1926, por Sumner. - Mejoramiento de las tcnicas de purificacin y caracterizacin de un centenar de enzimas, lo que condujo a una verdadera "ingeniera enzimtica", en los aos 30 siguientes. - Reconocimiento de la secuencia aminoacdica de una serie de enzimas importantes, en la dcada del 60. - Comprobacin de la estructura tridimensional de la lisozima, por anlisis de rayos X en 1965. - Sntesis qumica completa de una enzima con actividad de ribonucleasa, realizada por Merifield a fines de la decada del 60. Los estudios sobre las enzimas se han acelerado ltimamente, en tal forma que han permitido el mejoramiento de las tcnicas de purificacin, de obtencin y caracterizacin de ms de un centenar de ellas y se ha llegado a conocer el impacto de las biotecnologas enzimticas, las que estn adquiriendo un inters considerable, debido a la especificidad de su accin, la limitacin de sus riesgos de polucin y la posible economa de energa que a veces involucra su aplicacin (Schmidt-Hebbel H., Pennacchiotti 1.,1982). Es conocida la multitud de fenmenos de origen enzimtico que pueden incidir en los procesos tecnolgicos a que se someten los alimentos.

Como la destruccin de la clula no inhibe las enzimas, stas pueden continuar su accin ms all de la muerte por cosecha o destruccin del sistema biolgico de todo organismo vegetal o animal, que constituye el alimento. En esta actividad las enzimas pueden tener efectos desagradables sobre el olor, sabor, textura y valor nutritivo de los alimentos; la oxidacin enzimtica del cido ascrbico y de los carotenos es un ejemplo de esta ltima accin. Por otra parte, la actividad enzimtica puede tener efectos beneficiosos en los alimentos, de modo que se debe favorecer como sucede, por ejemplo, en su intervencin en el proceso de maduracin de las frutas, quesos y derivados crnicos (Schultz H.W., Anglemeir A.F.,1960).

3. APLICACIONES DE LAS ENZIMAS

Las enzimas pueden aplicarse en tecnologa de alimentos para diferentes fines: 3.1 Como indicadores del estado higinico y de conservacin de los alimentos. La presencia de algunas enzimas producidas por microorganismos indicara el estado higinico y de conservacin de los alimentos. Como ejemplo, la catalasa y reductasa en leche y jugos. Para la determinacin de la catalasa se usa un catalasmetro, que permite medir el volumen de oxgeno que se desprende al agregar a la leche o jugo una cantidad de agua oxigenada; el resultado se expresa en ml de %. La leche cruda normal desprende hasta 30 ml de , la pasteurizada hasta 6 ml de y la cocida no presenta desprendimiento de oxgeno. Las leches enfermas y sucias desprenden hasta 10 15 veces ms que una leche normal (Schmidt-Hebbel, 1981; Pintauro, 1979; King, 1978). 3.2 Como control de procesos tecnolgicos en alimentos Las enzimas fosfatasa y peroxidasa se usan para determinar si la temperatura aplicada fue la adecuada para su inactivacin. La fosfatasa puede determinarse, en base a la hidrlisis del disodiofenil-fosfato, en presencia de la enzima que libera fenol, el que se reconoce por el reactivo dibromoquinonclorimida, apareciendo color azul por la formacin de indofenol. Una leche bien pasteurizada debe permanecer incolora. En el proceso de escaldado o blanching, el test de peroxidasa es fundamental (Braverman,1980; Lund,1975). Las principales razones por la que se ha escogido esta enzima para este control son: - su presencia en cantidades considerables en todos los alimentos - su estabilidad al calor, siendo muy resistente a l - su actividad puede medirse fcilmente por mtodos simples y rpidos. Se reconoce la presencia de la peroxidasa usando como reactivo una solucin hidroalcohlica de guayacol y agua oxigenada, apareciendo un color naranja al existir la enzima en el alimento. El lmite trmico de esta enzima es de 75 a 82 C, siendo la temperatura de pasteurizacin de slo 71 C. De no inactivarse la enzima en forma adecuada, puede sufrir la regeneracin enzimtica durante el almacenamiento del alimento. La polifenoloxidasa es otra enzima importante que permite determinar si el proceso tecnolgico ha sido bien realizado. Esta enzima es la responsable del pardeamiento que sufren algunos alimentos y es inactivada por el calor y, entre otros compuestos qumicos, por el anhdrido sulfuroso. Si se desea detectar la presencia de esta enzima se aplica la prueba del catecol, apareciendo un color pardo, de estar ella presente (Schultz, 1960). 3.3 Las enzimas como reactivos de laboratorio

Mediante enzimas puras, se pueden determinar algunos componentes de los alimentos, a veces difciles de valorar por mtodos qumicos; como ejemplo se puede determinar la glucosa en la miel y de algunos cidos orgnicos como el cido lctico en vino. Para la determinacin de la glucosa en la miel se usa la enzima glucosa-oxidasa que es capaz de transformar la glucosa en cido glucnico y agua oxigenada. Al agregar un reactivo cromgeno como la o-dianisidina, el oxgeno desprendido reacciona con l, dando un color que es proporcional a la concentracin de glucosa en el producto. La glucosa-oxidasa va acompaada con la enzima catalasa, la que descompone el agua oxigenada que se va formando:

En el caso del vino la presencia de cido lctico se determina usando la enzima lactatodeshidrogenasa (LDH) que favorece el traslado de H+ del cido lctico a la nicotina mida-adeninadinucleotido (NAD) (Schmidt-Hebbel,1981):

Para la determinacin de alcohol existen buenos mtodos enzimticos, usando la alcoholdehidrogenasa, obtenida de levadura. El equilibrio de la reaccin que convierte el etanol en acetaldehido (NAD a NADH, ledo a 340 nm) se logra usando semicarbacida o hidracina para retener el acetaldehido. El NADH formado se mide por tcnicas colorimtricas determinaciones fluorimtricas (King,1978). Tabla N 2 CONTENIDO DE PEROXIDASA EN ALGUNOS ALIMENTOS Alimento RBANO NABO CAMOTE PAPA TRIGO CEBADA Contenido de peroxidasa 403 U/kg 110 U/kg 30 U/kg 36 U/kg 10 U/kg 9 U/kg

FUENTE: Underkofler, L.A., 1961. U = es el aumento de absorbancia de 0.001 por minuto bajo las condiciones especficas de ensayo a 25 C.

Captulo III PROTENAS DE ORIGEN ANIMAL

Las protenas representan un papel nutricional especial, tanto para la alimentacin humana como para los animales. Se ha demostrado que, adems de su funcin nutricional para cubrir necesidades energticas y de constitucin, las protenas desempean una funcin esencial en la apetencia del alimento, es decir, en sus caractersticas organolpticas.

Entre los alimentos que entregan protenas de alta calidad biolgica (es decir, aportan los aminocidos esenciales) se encuentran la leche, la carne, el pescado, el huevo (3,2, 20-23,15-20 y 13,5%, respectivamente). 1. PROTENAS DE LA CARNE La parte comestible mayoritariamente corresponde a los tejidos animales que forman los msculos y que contienen protenas de alto valor biolgico, de manera que tanto la carne de mamferos y de aves de corral, como el pescado aportan cantidades importantes de lisina, suficiente cantidad de triptofano y bajo porcentaje en metionina (Yfera, 1979; Bourgeois et al., 1982; American Meat Inst. Found,1960). En la carne se han descrito varias protenas, las que poseen diferentes funciones. Se las ha clasificado como miofibrilares, sarcoplasmticas y del estroma. 1.1 Protenas miofibrilares En este grupo se encuentran: a) Miosina: Se trata de una molcula asimtrica de doble cabeza y es la nica en el sentido de presentar una propiedad estructural como una enzimtica, correspondiendo a una ATPasa. Se presenta como dos cadenas polipeptdicas y su configuracin es helicoidal; con dos colas enrolladas entre s y en las dos cabezas terminales estara radicada la actividad ATPsica (Fig. 2). Figura 2 ESQUEMA DE UNA MOLCULA DE MIOSINA

La miosina contiene un alto porcentaje en cido glutmico y cido asprtico que son los responsables del aroma de la carne (Belitz et al., 1985; Cheftel et al., 1992).

b) Actina: Esta protena se encuentra bajo dos formas; una globular conocida como actina G y una fibrilar, correspondiendo a la actina F. En presencia de iones bivalentes (Ca y Mg) la actina G, que es un monmero, tiende a polimerizarse, formando agregados fibrilares. Otras protenas que pertenecen a este grupo son: la Tropomiosina (4.3%) y las Troponinas (4.3%) que regulan la contraccin muscular.

2. PROTENAS DE PESCADO Y MARISCOS

La carne de pescado contiene alrededor de un 15/, de protenas, dependiendo del ciclo evolutivo del pescado. Su alto valor biolgico se debe al tipo y relacin de los aminocidos, presentando una alta digestibilidad. Entre las protenas del pescado se encuentra la miosina, en cantidad ligeramente superior a la de carne de mamferos, 38 y 40%, respectivamente. No contiene elastina y presenta un bajo contenido de colgeno 2-4%. El 10 al 20% de las protenas musculares del pescado son albminas y el 70% son globulinas, miosina, actina y actomiosina (Yfera,1979). La estabilidad trmica de las protenas de pescado es menor que la de la carne de mamfero, producindose con ms facilidad la desnaturalizacin por urea y la hidrlisis por las enzimas tripsina y quimotripsina es mucho ms rpida. En el pescado se distinguen dos tejidos: uno claro y otro obscuro, que presentan diferente composicin qumica, como puede observarse en la Tabla N 3. Tabla N 3 COMPOSICIN QUMICA DE MUSCULATURA DE PESCADO Tipo Tejido claro Tejido obscuro *(N x 6.25) Tabla N 4 CONTENIDO DE PROTEINAS EN PESCADOS Y MARISCOS I. Pescados Albacora Bacalao de profundidad Carpa Cojinoba Congrio dorado Congrio colorado Congrio negro Corvina Jurel Humedad g/100 g 77.0 63.9 78.5 68.2 81.4 80.0 81.4 74.9 73.0 Protenas (Nx6.25) g/100 g 18.9 13.1 15.7 17.2 16.5 15.5 15.8 20.5 21.9 Agua 77.4 69.9 Protena* 20.4 17.5 Grasa 2.1 12.5 Ceniza 1.25 1.20

Lenguado Merluza Mero Pejegallo Pejerrey Reineta Sardina espaola Sierra Trucha de cultivo II. Mariscos Cholgas Choritos Jaibas cocidas Langostinos congelados Camarn congelado Loco Macha Ostra Navajuela

78.0 80.6 65.1 76.9 76.1 75.4 68.4 65.6 73.1 81.1 82.9 70.0 73.6 72.6 71.1 71.6 77.5 78.5

18.9 17.3 12.2 21.3 16.4 19.3 17.1 22.1 19.6 14.2 10.0 17.4 23.0 23.7 21.7 15.1 10.9 14.2

FUENTE: Schmidt-Hebbel, Pennacchiotti et al., 1992.

3. PROTENAS DEL HUEVO

El huevo sirve de alimento al hombre desde tiempos remotos. Contiene valiosos nutrientes en forma concentrada y que son de fcil absorcin. El principal componente del huevo es el agua, correspondiendo a las 3/4 partes del peso total (71.6%). Las protenas del huevo tienen un valor biolgico de 100 y el patrn de referencia aminoacdica de FAO (12) la considera como protena ideal. Las protenas de la clara de huevo difieren de las propiedades de la yema, tanto en su funcin biolgica como en su composicin qumica. Mientras que la propiedad funcional ms importante de la clara es su capacidad de formar espuma, la importancia de la yema reside en su contribucin a 1a estabilizacin de emulsiones de grasa en agua (Mc Donnell L.R. et al.,1995). 3.1 Protenas de la clara de huevo a) Ovoalbmina: Corresponde al 54% del peso total del huevo; se trata de una glucoprotena y ha sido estudiada en forma profunda debido a su fcil separacin, presentando 4 grupos -SH y residuos fosfricos que son liberados por una fosfatasa. Es muy inestable al calor; de lquida e incolora, por accin del calor se transforma en una masa slida y blanca. Es una protena que contiene un alto porcentaje de metionina y lisina, lo que se considera muy importante por tratarse de dos aminocidos esenciales en que son deficientes la mayora de los vegetales.

b) Conalbmina: Corresponde al 13% del peso y es una protena que se caracteriza por presentar la capacidad de fijar el hierro de las bacterias. Sus propiedades antibacterianas se deben a lo sealado ya que al captar el hierro de ellas, ste no est disponible para el crecimiento bacteriano. c) Ovomucoide: Corresponde al 11% del peso y tiene la propiedad de inhibir la tripsina; por ello se la considera como una antienzima. Se trata de un mucoprotedo que contiene una alta concentracin de cido silico en forma normal. Los cidos silicos son derivados del cido neuramnico, el que resulta de la condensacin de la D-manosamina y el cido pirvico. Esta protena es resistente al calor, pero a 100 C pierde la propiedad de inhibir la tripsina. d) Ovomucina: Corresponde al 1.5% del peso, contiene un 2% de cido silico y presenta propiedades de hemoaglutinacin viril. e) Avidina: Es una glucoprotena y corresponde al 0.05%. Es una protena que ha merecido mucha atencin pues se trata de una antivitaminica, es antibiotina. Hay que recordar que la biotina tiene una accin protectora sobre un aminocido esencial, el triptofano, de modo que al complejarse como ella, el triptofano queda libre pudiendo sufrir modificaciones. f) Lisozima: Se trata de una protena muy pequea, eminentemente bsica (contiene arginina, histidina y lisina). Presenta una accin antibacteriana del tipo N-acetil-muramidasa (corresponde a una carbohidrasa), que acta sobre el muramil presente en la pared celular de las bacterias, provocando su lisis. Fue descrita por Fleming y se dice que sin lisozyma el huevo sera ms perecible de lo que es; es destruida por el calor. g) FIavoprotena: Esta protena fija, en parte, la riboflavina y es la responsable del color amarillo verdoso de la clara. h) Ovoinhibidor: Se encuentra en un 0.1%, y se la describe como la fraccin que es capaz de inhibir las proteasas de origen bacteriano y fungal. 3.2 Protenas de la yema de huevo La yema es una emulsin de grasa en agua. Est situada al centro del huevo, teniendo forma esfrica y un color que va del amarillo claro al naranja fuerte. Contiene alrededor de un 30% de agua y sus protenas se encuentran libres y combinadas. a) Entre las protenas libres se encuentra la fosvitina que contiene alrededor de un 10%, de fsforo y es soluble en agua. Tabla N 5 APLICACIONES BASADAS EN LAS PROPIEDADES FUNCIONALES DEL HUEVO Industria Galletera y pastelera Propiedades Aromticas Coagulantes Colorantes Emulsionantes Espesantes Ligantes Ligantes Anticristalizante Espesantes Aromticas

Embutidos y confitera

Flanes y cremas

Helados Mayonesas y salsas Pastas alimenticias

Coagulantes Colorantes Ligantes Emulsificantes Aromticas Colorantes Ligantes

FUENTE: Bourgeois, Le Roux, 1982. Tabla N 6 CONTENIDO DE PROTENAS EN ALGUNOS ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL Alimentos Leche de vaca (3%) grasa Leche semidescremada,1%, grasa Leche en polvo seca descremada Leche de cabra entera Huevo de gallina Clara, huevo Yema, huevo Huevo seco Ternera asada Pierna cordero asada Pierna cerdo asada Carne pollo asada (sin grasa) Salmn hervido Protenas* g% 3.3 3.3 36.2 3.6 12.1 9.4 16.1 45.2 30.6 28.8 29.7 27.2 25.7 Tabla** 3.2 40.1 4.0 13.5 10.8 16.5

* FUENTE: Robinson et al.,1971. ** Tabla Composicin Qumica Alimentos Peruanos, 1992. b) Las protenas combinadas corresponden a protenas unidas a lpidos; entre stas se encuentra la lipovitelina y la lipovitelinina, que han sido separadas por cromatografa y electroforesis; 17-18% y 12-13%, respectivamente.

4. PROTENAS DE LA LECHE
Las protenas de la leche han sido estudiadas ampliamente y se han producido muchos avances, especialmente durante las ltimas dcadas, en el sentido de tener una mejor comprensin de su compleja composicin. Las protenas de la leche son las que hace ms tiempo y en mayor cantidad consume el hombre. La leche de vaca es la mejor conocida y su produccin es la ms importante, porque se usa para reemplazar la leche humana y como alimento proteico esencial para los adultos (Cheftel et al., 1992). En una leche normal el contenido promedio de protena es de 30 a 35g por mil, lo que representa el 95% del nitrgeno total de la leche. En torno al 80% las protenas se encuentran bajo la forma de complejas molculas (macro), conteniendo una parte mineral (especialmente fosfato de calcio) que se conocen como micelas.

Las casenas estn presentes fundamentalmente en esta forma y contienen hasta un 8% de minerales. Las casenas son protenas cidas, por ser ricas en cido glutmico y asprtico. Se sabe, actualmente, que hay cuatro tipos de casenas, cada una con un cierto nmero de variantes genticas (2) y que la albmina y la globulina constituyen un grupo complejo de ellas conocidas como protenas del suero. Alrededor de un 80% de la protena de la leche es casena. Ninguna otra protena natural se parece a ella: un aspecto muy especial es la presencia de fsforo, correspondiendo a una fosfoprotena. La casena se presenta en 4 tipos llamados alfa, beta, gama y kappa casena, que representan, respectivamente, un 50, 30, 5 y un 15%. La kappa casena es la nica que sirve como coloide protector que preserva a las micelas de la agregacin; de no ser as, la leche presentara una consistencia parecida al requesn (Patton,1975). Otras protenas de la leche son la beta-lactoglobulina (0.4%) y la alfa-lactoalbmina que contiene una proporcin relativamente alta del aminocido cistena, que lleva un grupo -SH. Cuando se calienta la leche, estos grupos empiezan a desprenderse de la protena (temperatura 70 C), como slfuro de hidrgeno responsable del aroma caracterstico de la leche hervida. La beta-lactoglobulina tiene una gran importancia prctica en lo relacionado con las propiedades tecnolgicas de las protenas de la leche. Las protenas del suero de leche representan ms o menos un 20% de las protenas de la leche; tienen un inters especial por su elevado valor nutritivo y por ser un sub-producto barato de la fabricacin del queso (Braverman, 1980). Debido a la menor disponibilidad de leche en algunos pases latinoamericanos, se han realizado estudios tendientes a buscar sucedneos de ella. Un producto que se comercializa ya en Venezuela es "La Colina", en cuya formulacin se encuentra un 77% de aislado de soja y un 23% de suero de leche; adems lleva un porcentaje de grasa vegetal. La mezcla de las protenas presente en este producto es excelente y comparable a la de las protenas de la leche. La Colina es una excelente alternativa al consumo de leche ya que contiene la misma cantidad de protena y energa y stas son equivalentes en calidad y disponibilidad. Tabla N 7 COMPOSICIN PROXIMAL, VALOR ENERGTICO Y CONTENIDO DE COLESTEROL Y MICRONUTRIENTES EN LECHE ENTERA Y "LA COLINA" EN POLVO.

Protena Grasa Carbohidrato (por diferencia) Cenizas Humedad

"La Colina" en g/1008 26.97 25.10 38.49 6.99 2.46 en mg/1008 1.04 570.3 1.449.9

Leche en g/1008 26.53 26.09 38.43 5.47 3.48 en mg/1008 1.03 364.4 1.075.7

Vitamina A Sodio Potasio

Calcio Fsforo Hierro Zinc Colesterol Caloras (kcal/100g) FUENTE: Cioccia A. et al, 1994.

1.008.3 736.4 3.82 3.57 29.55 487.6

1.020.2 684.1 2.2 3.4 72.3 494.3

Captulo IV PROTENAS DE ORIGEN VEGETAL

Los dos grandes grupos de plantas de mayor importancia en la agricultura mundial pertenecen a la familia de las Gramneas (Cereales) y las Leguminosas de consumo humano. Las protenas de origen vegetal se ubican en dos clases: grupo menor y grupo mayor. En el grupo menor se encuentran los alimentos siguientes: Algas (Chlorella 10% protena, Luche y Cochayuyo) Levaduras (Trula utilis, Cndida lipoltica con un 42 a un 62%) Protenas monocelulares o bacterianas Residuos agrcolas, industriales Protenas de hojas En la familia de las nueces figuran: ------10.0%, protenas Avellana ------12.0 Pin --------4.5 Castaa --------3.7 Almendra ------18.0 Nuez En el grupo mayor se encuentran: Cereales Leguminosas Oleaginosas 1. PROTENAS DE LOS CEREALES Los granos de los cereales son una buena fuente de protena para la mayora de la poblacin mundial, siendo consumidos en cantidades relativamente grandes en las zonas sub-urbanas. Sus cultivos varan de acuerdo a las condiciones como clima, topografa, calidad del suelo, rgimen pluvial, disponibilidad de agua. As se tiene que el arroz se cultiva de preferencia en Asia; en el norte de Europa y Rusia predomina el cultivo del centeno; en Estados Unidos, Mxico y Centro Amrica predomina el maz, mientras que en Canad, Australia y Amrica Latina, el principal cultivo es del trigo (Aykroyd et al., 1970).

Los cereales que ocupan ms del 70/o de la tierra cultivable del globo, proporcionan el 52% de la energa directamente ingerida por el hombre: un 11% es aportado por productos de origen animal como: carne, huevo, leche; un 10% por papas y otros tubrculos, un 10%) por frutas y verduras, un 9% por grasas animales y aceites vegetales, 7% por azcar y un 1% por pescado (Lehninger,1985). Las protenas de los cereales se dividen de acuerdo a su solubilidad; as las albminas son solubles en agua; las prolaminas lo son en alcohol de 70 "C y las glutelinas son insolubles en agua, pero solubles en cido diluido. Las prolaminas se desdoblan en un aminocido, la prolina ms amonaco y reciben diferentes nombres de acuerdo al cereal de que se trate: as, la zena corresponde al maz la orzena corresponde al arroz la gliadina corresponde al trigo la avenina corresponde a la avena la hordena corresponde a la cebada La gliadina del trigo y la glutenina tambin del trigo producen en presencia de agua el gluten, sustancia capaz de formar una verdadera malla que retiene el gas que se produce durante la fermentacin. Ambas fracciones en su forma hidratada tienen efectos diferentes sobre las caractersticas reolgicas de la masa de panificacin: las prolaminas son responsables preferentemente de la viscosidad y las glutelinas de la elasticidad de la masa (Belitz; Grosch,1985). Por otra parte, a la albmina del trigo se la conoce como leucosina y a la globulina como edestina. 1.1 Protenas del maz El maz es una fuente pobre de protenas para un animal monogstrico (incluyendo animales como el cerdo y el pollo), as como para el hombre. Sus protenas no slo son bajas en contenido (10%) sino tambin en calidad. La ms importante deficiencia del maz, en lo que respecta a su valor nutritivo, es su bajo contenido de lisina, aminocido esencial que el hombre y otros animales no rumiantes no sintetizan y, por lo tanto, debe ser suministrado por los alimentos. Luego de rigurosos estudios, en 1964, se obtuvo una variedad de maz con alto contenido de lisina, representando una espectacular mejora como alimento con respecto al maz normal (de 2g se elev su contenido a 3.398%). Este maz se conoce como "opaco 2. Por otro lado se han realizado estudios logrndose un aumento en el contenido total de las protenas de maz que de un 10% subi a valores entre 12 y 15%. Tabla N 8 CONTENIDO DE PROTENA EN CEREALES Cereal Protena Trigo Centeno Cebada Avena Maz Mijo g/1008 en peso seco 12.2 11.6 10.9 11.3 10.2 10.3

Sorgo Arroz FUENTE: Cheftel et al., 1992

11.0 8.1

2. PROTENAS DEL AMARANTO

Entre varios recursos vegetales de Centro Amrica y Amrica del Sur, destaca el inters que se le ha estado dando al amaranto (Amaranthus spp.), cuyos productos ya eran conocidos y consumidos por las civilizaciones del pasado en la regin de Latinoamrica, principalmente por los aztecas, mayas y los incas. Su produccin y uso se han extendido a otras regiones del mundo, en particular en la India. Se trata de una semilla parecida a los cereales y es de alto rendimiento. Los amarantos tienen buenas aptitudes para su utilizacin como hortalizas de hojas, de acuerdo a su productividad de forraje. De los estudios qumicos se deduce que presentan un alto contenido en protenas, cenizas, fibra y adems un elevado porcentaje de factores anti-nutricionales tales como saponinas y cido oxlico. Estos resultados se han comparado con las hojas de espinaca y acelga, resultando similares las primeras e inferior el contenido de cido oxlico (Ciappini et al., 1997). La semilla de amaranto es de calidad nutricional muy superior a la de los cereales. Este recurso ofrece sus hojas como verduras, la semilla se usa como cereal y la planta entera como forraje (Bressani,1993; Martnez N., Aon C., 1996). La semilla contiene un promedio de 16.4% de protena, con, variabilidad entre 14-21% y es rica en los aminocidos esenciales, lisina y triptofano, siendo limitante la leucina. La cantidad de fibra cruda vara entre 7.1 y 16.4%; en tanto la fibra insoluble oscila entre 4.6 a 13.5% y la soluble entre 1.5 y 6.5%. Su composicin proximal se indica en la siguiente Tabla: Tabla N 9 COMPOSICIN PROXIMAL DE SEMILLA DE AMARANTO Humedad Protena Lpidos Cenizas Fibra cruda Hidratos de carbono 10.5 g/100g 16.4 7.7 3.5 4.2 57.7

El amaranto por su elevado contenido de lisina servira como base suplementaria de los cereales: contiene 365 mg/g N frente al Patrn de Referencia de FAO que indica 310 mg. En general, niveles de 25 a 30% de harina de semilla de amaranto agregados a 70-75% de harina de cereal, Tabla N 10 CONTENIDO DE AMINOCIDOS ESENCIALES Aminocidos Lisina Metionina Triptofano Cistina Amaranto Mg/gN 365 120 73 127 Patrn FAO/OMS 340 60 220

Treonina

236

250

mejoran la calidad del trigo, maz, avena y arroz (Bressani,1993) (Paredes Lpez O. et al.,1988). La composicin proximal de las hojas de amaranto se presenta en la Tabla N 11 comparada con las hojas de acelga y espinaca. Tabla N 11 COMPOSICIN QUMICA DE LAS HOJAS DE AMARANTO, ACELGA Y ESPINACA*

-Humedad Protena Grasa Fibra cruda Cenizas Carbohidratos Hierro (mg%) Act.Vit.A (mcg%) *g/1008

Amaranto 86.9 4.5 0.6 1.6 2.4 4.0 24.1 2.740

Acelga 91.2 2.6 0.4 0.9 1.6 3.3 6.6 1.114

Espinaca 91.8 2.6 0.4 0.8 1.8 2.6 3.4 1.184

3. PROTENAS DE COTILEDONES DE ALGARROBO

Las especies del gnero Prosopia crecen en las zonas semiridas del continente americano y sus frutos han servido de alimento a los habitantes de la regin y su madera como combustible. En cuanto al contenido de protena los diferentes investigadores indican valores que fluctan entre 29.4 y 31.2%, presentando la variedad cultivada en Chile entre un 33.1 a 33.9%. En cuanto a la composicin en aminocidos, se ha encontrado que algunas variedades son deficientes en aminocidos azufrados, en tanto que la variedad chilena lo es en isoleucina y treonina (Vsquez et al., 1991).

4. PROTENAS DE LEGUMINOSAS
Las leguminosas son sin duda las semillas que ms proveen de protenas al tercer mundo. Se caracterizan sus protenas por ser deficientes en metionina, pero ricas en lisina. Las semillas maduras y secas de la familia Fabacea se conocen como leguminosas, nombre derivado de legumbre (la vaina que las contiene), y se han usado en la alimentacin humana desde tiempos inmemoriales. Las arvejas y porotos semi-duros, an verdes, se les considera hortalizas (FAO, 1985; Whitaker J.R. et al., 1977). Las protenas corresponden a albminas, globulinas y glutelinas (fracciones separadas por Osborne) (Belitz-Grosch,1985) y se distribuyen en la forma siguiente: Tabla N 12 DISTRIBUCIN DE LAS PROTENAS % EN LEGUMINOSAS

Fracciones Albmina Globulina Glutelina

Soja 10 90 0

Man 15 70 10

Arveja 21 66 12

Poroto 4 67 29

Haba 20 60 15

El elevado contenido de globulina en las semillas indica que su funcin es, principalmente, fuente de protena de reserva, la que se moviliza durante el transcurso de la germinacin (Whyte, R.D., et al., 1955). No se ha encontrado en las protenas de las leguminosas propiedades funcionales de importancia comercial comparable a la capacidad de formar masa, de las prolaminas y de las glutelinas de los cereales. 4.1 Protenas de frejol, aluvia, chaucha o juda El frejol (poroto) contiene las protenas Vicina y Faseolina, ambas son globulinas. Adems, contiene una albmina conocida como Fasina, que corresponde a una hemoaglutinina. Las fitohemoaglutininas conocidas como Lectina, causan la aglomeracin de los glbulos rojos de la sangre y a veces de los leucocitos. Las lectinas de las plantas son generalmente glicoprotenas que contienen alrededor de un 5% de carbohidratos. Las leguminosas (alrededor de 600 especies) contienen lectinas entre el 2 y el 10% de la protena total (Robinson, 1991). 4.2 Protenas de haba, arveja, lenteja y garbanzo En estas leguminosas, se encuentran protenas del tipo de las globulinas.

4.3 Protenas del poroto de soja

La Glycina hispida corresponde a una oleaginosa que contiene un alto porcentaje de materia grasa. Luego de la extraccin del aceite queda una torta muy rica en protena; sta se la conoce con el nombre de glicinina, que es parecida a la casena de leche, pero se diferencia de ella por no contener fsforo. Tabla N 13 CONTENIDO DE PROTENAS EN LEGUMINOSAS Leguminosas Arveja seca Arveja, harina cruda Arveja, harina precocida Frejol crudo Frejol cocido Garbanzo crudo Garbanzo cocido Haba cruda Lenteja cruda Lenteja cocida Lenteja, harina cruda Protena (Nx6.25) g/100g 22.4 23.6 21.1 20.6 9.7 18.2 6.6 24.7 24.0 7.4 32.8

Altramuz Man Colza Soja Maravilla o girasol FUENTE: Robinson, 1992.

34.0 24.3 20.0 36.0 25.7

Actualmente, las fuentes no convencionales ms usadas a nivel mundial son las protenas de la soja, siendo Estados Unidos, Brasil y China los principales pases productores de ella. Tabla N 14 COMPOSICIN QUMICA DE LA HARINA DE SOJA Humedad Protenas (Nx6.25) Lpidos Cenizas Fibra cruda 7.5 g/100g 30.1 0.6 6.0 2.1

FUENTE: Yfera ,1979. Adems de la harina desgrasada de soja, se han desarrollado dos preparados proteicos: el concentrado proteico de soja (CPS) y las protenas aisladas de soja (PAS). La preparacin del concentrado de protena de soja se realiza a partir de la harina desgrasada, extrayendo los hidratos de carbono y otras sustancias solubles con alcohol acuoso; contiene 70% de protena en base seca y se encuentra en el comercio para su uso en productos crnicos. La preparacin de aislado de protenas de soja se basa en tratar la harina desgrasada de soja con una solucin salina y luego acidificando el extracto hasta pH 4.6 para coagular las protenas (Steven Joung, 1996). stas contienen 90% de protena en base seca. Estos aislados son productos altamente funcionales; al sustituir una produccin de protena de carne soluble, estabilizan emulsiones y contribuyen a asegurar el mantenimiento estructural en carnes cocidas terminadas (Young Steven,1996). Tabla N 15 COMPOSICIN DE PREPARADOS DE PROTEINA DE SOJA

Humedad Protenas (Nx6.25) Lpidos Fibra cruda Cenizas FUENTE: Yfera, 1979

CPS 2.6 - 8.0 70.0 - 72.6 0.32 - 2.0 2.9 - 5.0 3.0 - 5.8

PAS 3.9 - 7.0 90.0 - 97.7 0.2 - 1.2 0.01 - 0.2 2.5 - 1.5

Las protenas de la soja son ricas en aminocidos esenciales, siendo el contenido de lisina de gran importancia (55-56 mg/g de protena), ya que al mezclarlas con los cereales complementan la deficiencia de stos en lisina.

Otros productos de la soja son: Protenas fibriladas que se obtienen como polvos de forma fibrosa, masticables, de consistencia parecida a la carne y contienen alrededor de 50% de protenas. Se usan para elaborar productos de textura semejante a la carne, en embutidos, hamburguesas, etctera.

5. PROTENAS DE HORTALIZAS, FRUTAS Y PRODUCTOS DERIVADOS

Bajo la denominacin de hortalizas se comprende aquella parte de los vegetales que al estado fresco, sin desecar al aire, crudos, cocidos, conservados o preparados de diferentes formas, sin extraccin de componentes esenciales, se usan directamente para el consumo humano, con excepcin de las frutas procedentes de los rboles frutales (Belitz-Grosch,1985). 5.1 Hortalizas Las hortalizas contienen como trmino medio 1-3% de compuestos nitrogenados, de los cuales el 35 al 80% son protenas y el resto corresponde a aminocidos, pptidos y otros compuestos. La fraccin proteica se compone en su mayor parte de enzimas que en la manipulacin y preparacin de ellas pueden jugar un rol positivo o negativo. As, por un lado participan en la formacin de los aromas tpicos y por otro son responsables de la produccin de aromas no deseados, alteracin tisular y modificaciones del color. Las hortalizas contienen enzimas correspondientes a todos los grupos principales de ellas como xido-reductasas, fenoloxidasas, peroxidasas: hidrolasas como las glicosidasas, esterases, proteasas: ligases como la glutamina-sintetitasa. 5.2 Frutas, frutos secos y productos derivados Las frutas contienen entre un 0.1 y 1.3% de compuestos nitrogenados. De ellos las protenas constituyen un 35-75%; los aminocidos se encuentran bien representados. La mayor parte de la fraccin proteica est constituida por enzimas, entre ellas: pectinoesterasas, celulasas, amilasas, lipasas, fosforilasas, etc. (Belitz, Grosch,1985). Los frutos secos presentan ms o menos 20% de componentes nitrogenados y un 50% de lpidos.

6. ALGAS
Las algas son otra fuente potencial de protenas, que en un principio podran ser una solucin para la alimentacin futura de la humanidad. Las algas fotosintticas fijan el y la energa solar y realizan la sntesis de materia orgnica a velocidades que son cientos de veces mayores que las de las protenas superiores. Se ha trabajado mucho en el desarrollo del alga unicelular Chlorella en cultivos lquidos, pero hasta el momento han fracasado pues los alimentos producidos son demasiado caros, poco apetitosos y de bajo valor nutritivo. Tabla N 16 COMPOSICIN QUIMICA DE ALGAS SECAS

Protenas Carbohidratos

Cultivadas en medio Autotrofo* 55-65 15-30 Heterotrofo** 40-15 45-50

Grasas Cenizas Fibra Humedad FUENTE: Yfera, 1979.

4-7 8-9 1-2 4-5

3-5 4-5 1.5-4 3-4

*Autotrofo: medio que contiene como nica fuente de carbono el **Hetertrofo: medio que lleva compuestos qumicos orgnicos (azcar, protenas).

Captulo V PROTENAS NO CONVENCIONALES

1. PROTENAS DE ORIGEN MICROBIANO Algunos microorganismos se desarrollan en hidrocarburos, los que al crecer, sintetizan protenas, ricas en aminocidos deficitarios en las protenas vegetales. La produccin de protenas a cargo de microorganismos a partir de compuestos hidrocarbonados no es, naturalmente, una idea nueva. Durante muchos aos la produccin de levadura para alimentos de uso animal, e incluso para humanos, ha sido una industria apreciable aunque pequea. La capacidad de produccin de levaduras sobre hidrocarburos es el doble que sobre los azcares; en condiciones favorables 1 kg de hidrocarburos produce 1 kg de levadura, mientras que 1 kg de azcar proporciona slo 1 /2 kg de levadura. Las protenas producidas mediante fermentacin de petrleo no difieren en algn aspecto esencial de las obtenidas por cualquier otro proceso natural, es decir, ganado, aves, Tabla N 17 CONTENIDO DE AMINOCIDOS DE LEVADURA SECA Aminocido Alanina Cistina Leucina Lisina Metionina Triptofano Fenilalanina Treonina Tirosina Valina FUENTE: Gutirrez, C.1993. pescado y vegetales. Son ricas en vitaminas del complejo B y presentan un bien equilibrado patrn aminoacdico. Contienen un alto porcentaje de lisina, que las convierte en un til complemento de los cereales pobres en este aminocido (Gutirrez, 1993). % 6.0 0.2 6.3 6.5 1.2 1.4 3.9 4.1 2.4 5.1

Estas protenas desarrolladas sobre petrleo, una vez secadas y purificadas, se presentan como polvo o escamas blanquecinas, inodoras y sin sabor pronunciado. Su primer uso ha sido como alimento para ganado (Frutton,1975).

2. DESECHOS INDUSTRIALES
En la elaboracin de concentrados de tomate se producen prdidas por concepto de semillas, cscara, tamizado de pulpa. En las semillas se ha sealado que contienen un alto porcentaje de lisina. En cuanto al contenido de protenas sta oscila entre un 20.8 y un 30%. 3. PROTENAS DEL SUERO DE LECHE El suero es un subproducto de la industria del queso. El suero retiene ms o menos el 55% de los nutrientes de la leche y contiene protenas solubles como la lactoalbmina y la lactoglobulina. En la actualidad el suero fresco es desgrasado, pasteurizado y posteriormente concentrado y secado. Se usa incorporado a helados, margarina, manjar, yogur y en alimentos infantiles. El mayor inters de la protena del suero se presenta en la elaboracin industrial de una serie de productos denominados concentrados proteicos de suero. Estos productos contienen hasta un 75% de protenas y un 3.5% de lactosa (Yez et al.,1983).

4. OKARA
Es un ingrediente alimenticio rico en protenas y fibras. Es el subproducto de la extraccin acuosa del grano de soja y sera una alternativa como fuente de estos dos componentes de nuestros alimentos. Por su alto contenido en lisina presenta propiedades para complementar con protenas de cereales y como fuente de fibra en la elaboracin de productos crnicos (Villarroel, M., Rossi, A. et al., 1997). Tabla N 18 COMPOSICION QUMICA DE OKARA

Protena* Fibra Calcio Potasio Sodio Zinc

g/100 g.s.s 38.07 39.8 376 mg 929.3 mg 141.1 mg 8.9 mg

*(42.1 mg de lisina disponible/g de protena)

Captulo VI PROTENAS TEXTURIZADAS Y PROTEINAS TOXICAS

PROTENAS TEXTURIZADAS Numerosas protenas vegetales poseen estructuras globulares y pese a su abundancia tienen una aplicacin limitada en la tecnologa alimentaria. En el curso de estudios para aumentar el campo de

aplicacin de las protenas vegetales se desarroll a partir de mediados de los aos cincuenta una serie de procesos para transformar las protenas globulares en protenas fibrilares. Mediante tcnicas adecuadas se obtuvieron productos resistentes a la coccin, con textura semejante a la carne que pueden utilizarse como material de relleno ("meat extender") o sustitutivos de la carne ("meat analog") o en general donde se desee una estructura desmenuzable en terrones. Fuentes de protenas para la obtencin de productos texturizados son por ejemplo: la soja, casena, gluten de trigo, semillas de algodn, cacahuate, ssamo, girasol, protenas de suero lcteo, plasma sanguneo, despojos de mataderos tales como pulmn, estmago. En el proceso de texturizacin se produce por ruptura de los enlaces intramoleculares el despliegue de las cadenas peptdicas estiradas, mediante creacin de enlaces intermoleculares (Belitz, Grosch,1985). PROTENAS TXICAS Durante el ao 1997 Inglaterra asombr al mundo al darse a conocer un mal que afectaba a las vacas produciendo la muerte de ellas. El neurlogo norteamericano Stanley B. Prusiner, a travs de sus estudios encontr que la demencia no era producida ni por bacterias, ni virus, sino por lo que l denomin "Priones" (proteinaceus infection particles) integrando as los trminos de "protena" e "infeccin". Se trata en efecto, de glico-proteidos, exentos de cidos nucleicos, ni ADR, ni ARN, carentes de informacin gentica. Los priones estn implicados en patologas que pueden afectar varias especies animales y al hombre y se caracterizan por provocar un profundo dao del tejido cerebral, despus de un largo perodo de incubacin. En bovinos se produce una descoordinacin total en sus movimientos, lo que ha originado el nombre de "vacas locas". La sigla BSE (Bovine SpongiformeEncephalopathy) proviene de su ltimo sntoma una degeneracin esponjosa del cerebro, comprobable por va microscpica del animal muerto (International Div. Newsletter, 1997; Merck Informa, 1997). En este contexto dos hechos motivaron la aparicin masiva de esta infeccin en Inglaterra; fabricantes prepararon forraje para vacunos de "especial valor nutritivo y rendimiento" por adicin fraudulenta de harina de cadveres de ovejas australianas, infectadas. La otra causa de la contaminacin se debi al hecho de querer ahorrar costos, rebajando la temperatura y la presin para la adecuada esterilizacin de este forraje, pues los priones son bastante resistentes al calor (Pldinger, 1996). Por estas investigaciones el Dr. Prusiner obtuvo el Premio Nobel de Medicina del ao 1997.

Captulo VII VALOR NUTRICIONAL DE LAS PROTENAS

Los niveles de protenas propuestos son aquellos considerados como necesarios para mantener la salud y las necesidades fisiolgicas de la mayor parte de los individuos de un grupo de poblacin (Robinson, 1991).

Tabla N 19 INGESTA PROTEICA DIARIA RECOMENDADA POR FAO/OMS/UNU (1985) Edad (aos) Lactantes y nios 0.25 - 0.5 0.75 -1.0 2-3 9 -10 Adolescentes (Varones) 10 -11 14 -15 17 -18 Adultos Nivel de seguridad (g prot/kg por da) 1.86 1.48 1.13 0.99

0.99 0.96 0.86 0.75

Durante la lactancia se recomienda una ingesta proteica diaria adicional de 16g. Sin embargo, las necesidades reales son de alfa aminocidos y por tanto la composicin en aminocidos de las protenas de la dieta es extremadamente importante. Las necesidades de aminocidos se indican en la Tabla N 20. Tabla N 20 NECESIDADES DE AMINOCIDOS SUGERIDAS POR LA FAO/OMS/UNU+ Aminocidos (mg/g de protena bruta) Necesidades requeridas Lactantes Preescolares Media (2-5 aos) (rango)++ 26 (18-36) 19 46 (41-53) 28 93 (83-107) 66 66 (53-76) 58 42 (29-60) 25 72 (68-118) 63 43 (40-5) 34 17 (16-17) 11 55 (44-77) 35 460 (408588) 434 (390552) 339 32 Edad escolar (10-12) 19 28 44 44 22 22 28 9 25 241 222 Adultos 16 13 19 16 17 19 9 5 13 127 111

Histidina Isoleucina Leucina Lisina Atetionina + cistina Fenilalanina + tirosina Treonina Triptfano Valina Total: Incluyendo la histidina Sin incluir la histidina

(+FAO/WHO/UNU, 1985). ++ Composicin de aminocidos de la leche de mujer. Para los adultos, los niveles seguros van de 0.75 g/kg; nios (10-12 aos) 0.99 g/kg; nios (2-5 aos) 1.10 g/kg (Se ha elegido este rango de edades porque coincide con el rango de edades de

las personas a partir de las cuales se han obtenido los datos. Las necesidades de aminocidos de los nios entre 1 y 2 aos pueden ser intermedias entre las de los lactantes y los preescolares). El consumo de protenas presenta ventajas y algunas desventajas. Entre las primeras se mencionan que son esenciales para la mayora de las funciones vitales del organismo, incluyendo el desarrollo y el mantenimiento de las clulas. Entre las desventajas se puede sealar que ingerir demasiadas protenas puede sobrecargar el hgado y los riones ocasionando la produccin de orina acdica, que puede provocar una prdida de calcio de los huesos, aumentando el riesgo de osteoporosis. Los nutricionistas recomiendan que se obtenga entre el 10 y el 15% de la energa a partir de las protenas, un 20 a un 25% de las grasas y un 55 a 60% de los hidratos de carbono. Si el consumo de grasas o de hidratos de carbono es insuficiente para satisfacer sus necesidades de energa, las protenas del organismo sern descompuestas para ser utilizadas como fuente de energa. El hombre comn o un adolescente de sexo masculino necesita ms o menos 55g de protenas al da, que pueden obtenerse de una racin por ejemplo de 220g de pollo magro o de 250g de trucha cocida al vapor. La mujer normal o joven adolescente requiere alrededor de 45g de protena al da, en tanto que un nio entre 7 y 10 aos unos 28g al da (Reader's Digest,1996).