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ACTIVIDAD ENZIMTICA Curvas temporales de actividad enzimtica de LDH de msculo esqueltico de pollo

Resumen. Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que actan como catalizadores de reacciones qumicas de
importancia biolgica como el metabolismo, la principal funcin de estas es disminuir la energa de activacin para aumentar la velocidad de reaccin, que en condiciones normales tardaran mucho tiempo o incluso sera imposible llevarlas a cabo. En este experimento se medir la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa (aislada durante la prctica anterior) utilizando un mtodo espectrofotomtrico para determinar su actividad, grado de pureza y rendimiento. minutos. El procedimiento se repiti para el resto de las fracciones (F2, F3, F4, FPA, FPB y FPC).

INTRODUCCIN RESULTADOS MATERIAL Y MTODOS


A) Material biolgico Fracciones obtenidas en la prctica de purificacin de protenas (F1, F2, F3, F4, FPA, FPB y FPC). Desarrollo experimental Para cada una de las fracciones, se realiz una dilucin para la determinacin del ensayo (la dilucin hecha fue de 1:500). Posteriormente se identificaron 7 celdas para cada fraccin F1, F2, F3, F4, FPA, FPB y FPC y en cada celda se colocaron los reactivos descritos en la tabla 1. Tabla 1. Reactivos y cantidades agregadas en cada celda Reactivos Amortiguador de fosfatos Piruvato Agua destilada Cantidades (L) 600 36 291 Se midi la absorbancia de cada una de las fracciones con piruvato y NADH, los resultados de las lecturas obtenidos a cada 30 segundos de las fracciones F1, F2 y F3 se presentan en la tabla 2, las absorbancias de las fracciones F4, FPA, FPB Y FPC se observan en la tabla 3. Tabla 2. Registro de absorbancia de las fracciones 1,2 y 3 obtenidas.
Tiempo (min) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 Abs F1 1.283 1.262 1.242 1.233 1.228 1.215 1.196 1.188 1.101 1.096 1.052 1.013 0.986 0.956 0.925 Abs F2 1.267 1.258 1.236 1.225 1.218 1.209 1.190 1.166 1.137 1.101 1.045 1.022 0.956 0.893 0.895 Abs F3 1.288 1.250 1.219 1.192 1.149 1.114 1.079 1.045 1.014 0.978 0.947 0.913 0.880 0.848 0.818

Registro de absorbancias de las fracciones.

*Es importante aadir los reactivos en el orden correspondiente Se ajust el espectrofotmetro a 340nm, tomando como blanco agua destilada, una vez hecho esto se agreg 63 L de NADH a la celda correspondiente a la fraccin F1, se tap y agit por inversin, inmediatamente se ley en el espectrofotmetro para corroborar que la dilucin realizada inicialmente es adecuada para el seguimiento de la actividad de la enzima. Despus de realizar la lectura, en la misma celda se colocaron 25L de la enzima diluida, nuevamente y por inversin se agit la celda. Se registraron las absorbancias cada treinta segundos durante 7

*Las fracciones utilizadas estaban diluidas en 1:5 **Antes de las lecturas, a cada fraccin, se le hizo dilucin nuevamente (1:500)

Tabla 3. Registro de absorbancia de las fracciones 4, FPA, FPB, FPC obtenidas.


Tiempo Abs Abs Abs Abs

(min) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7

F4 1.286 1.28 1.279 1.276 1.275 1.269 1.271 1.27 1.27 1.257 1.266 1.265 1.265 1.264 1.264

FPA 1.257 1.265 1.257 1.26 1.257 1.254 1.254 1.253 1.254 1.254 1.254 1.253 1.256 1.253 1.23

FPB 1.39 1.394 1.374 1.371 1.37 1.366 1.365 1.363 1.362 1.36 1.359 1.359 1.357 1.356 1.355

FPC 1.359 1.349 1.334 1.327 1.323 1.318 1.316 1.311 1.308 1.305 1.304 1.302 1.299 1.298 1.296
0.9 0.8 1.3 1.4

Curva temporal de las fracciones


FPB F4

Absorbancia

1.2 1.1 1

FPA

F1 F2

F3
0 2 4 6

Tiempo (min) Grfica 1. Curva temporal de actividad enzimtica de las fracciones (F1, F2, F3, F4, FPA, FPB, FPC) C. Determinacin de la actividad total y especfica de la enzima y rendimiento de la purificacin. La actividad total de la enzima se obtiene con la pendiente de cada fraccin, para calcularla se utiliza la ecuacin 1.

*Las fracciones utilizadas estaban diluidas en 1:5 *Antes de las lecturas, a cada fraccin, se le hizo dilucin nuevamente (1:500)

En la tabla 2 y 3 se observ que la absorbancia de cada de una de las fracciones disminua, esto se debe a la desaparicin gradual de NADH que es transformado a NAD+ por la reaccin enzimtica.

Ecuacin 1: Actividad enzimtica total. B. Curvas temporales de actividad enzimtica para cada fraccin. Con las lecturas realizadas en el espectrofotmetro, se graficaron las absorbancias de cada fraccin contra el tiempo de registro (grficas 1). Y a partir de estas, se obtuvo la pendiente para realizar la determinacin de la actividad enzimtica. (Tabla 4). Tabla 4. Pendientes obtenidas del grfico Abs contra tiempo para cada fraccin.
Fraccin F1 F2 F3 F4 FPA FPB FPC Pendiente -0.0526 -0.0557 -0.0675 -0.0030 -0.0022 -0.0047 -0.0080 Tomando en cuenta la cantidad de enzima de la celda, as como el factor de dilucin (Ecuacin 2), se calcul la actividad enzimtica de las fracciones. (Tabla 6). Dnde: = coeficiente de extincin molar de NADH (6.22x103 M-1mL-1) m=pendiente de la recta (abs/min) y b= distancia de la celda (1 cm) Los resultados se presentan en la tabla5. Fraccin F1 F2 F3 F4 FPA FPB FPC Actividad enzimtica 8.4565x10-6 8.9549 x10-6 1.0852 x10-5 4.8231 x10-7 3.5369 x10-7 7.5562 x10-7 1.2861 x10-6

Tabla 5. Actividad total de la enzima en las fracciones.

Ecuacin 1: Actividad enzimtica total.

Dnde: Actividad total= actividad enzimtica


calculada anteriormente donde no se toma en cuenta el factor de dilucin y la cantidad aadida a la celda (tabla 5). FD= factor dilucin (1:500), Volumen de reaccin= 1 mL y Volumen aadido de enzima= 0.025 mL.

Fraccin F1 F2 F3 F4 FPA FPB FPC

Actividad enzimtica

0.1691 0.1790 0.2170 0.0096 0.0070 0.0151 0.0257

Tabla 6. Actividad total de la enzima en las fracciones (considerando cantidad de enzima en la celda y FD.