Tema11 Cromatografia

QUMICA ANALTICA TEMA 11.
Mtodos Cromatogrficos
11.1. Introduccin 11.2. Clasificacin 11.3. Elucin en la columna cromatogrfica 11.4. Cromatogramas 11.5 Cromatografa de gases (CG) - Instrumentos -Gas portador -Sistema de inyeccin -Columnas: de relleno y capilares -Detectores: TCD, FID, ECD, CG-EM 11.6. Aplicaciones de la CG 11.7. Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) 11.8. Clasificacin: de adsorcin o CSL, inica, de exclusin molecular, de afinidad y de reparto 11.9. Instrumentos de la HPLC: - bombas - fase mvil - inyeccin - columnas - detectores: de ndice de refracin, de absorbancia UV, de fluorescencia, de ionizacin de llama y espectrometra de masas. 11.10. Aplicaciones de la HPLC
QUMICA ANALTICA TEMA 11. Mtodos Cromatogrficos

11.1. Introduccin La cromatografa fue descubierta en 1906 por el botnico ruso M. Tswett. Coloc un extracto de pigmentos vegetales en la parte superior de una columna de vidrio rellena de yeso pulverizado. Al agregar ter observ que de la mezcla original se separaban, en el interior de la columna, diversas bandas coloreadas, que descendan a diferentes velocidades.

11.1. Introduccin El fundamento de la cromatografa es la presencia de dos fases, dispuestas de manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema, la otra (fase mvil) se desplaza a lo largo de l. La clave de la separacin en cromatografa es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribucin). Los componentes ms afines a la fase estacionaria (los ms retenidos) avanzan ms lentamente que los ms afines a la fase mvil (los menos retenidos) que se mueven con ms rapidez. Figura 12.2. Columnas Es decir, las sustancias eluyen de la columna en usadas en Cromatografa orden inverso a sus coeficientes de distribucin con respecto a la fase estacionaria.
11.2. Clasificacin Los mtodos cromatogrficos se clasifican de acuerdo a los siguientes criterios: A la Geometra del sistema Al modo de separacin Al mecanismo de retencin Segn la naturaleza de la fase mvil
Figura 12.2. Columnas usadas en Cromatografa
QUMICA ANALTICA
11.2. Clasificacin
TEMA 11. Mtodos Cromatogrficos
Tabla 11.1. Tipos comunes de fases en las tcnicas de Separacin Tcnica Cromatografa Gaseosa (GC) Fase Mvil Gas (helio, nitrgeno, Hidrgeno) Fase estacionaria -Lquido adsorbido unido a una superficie slida (GLC) -Slido (GSC) -Lquido adsorbido unido a una superficie slida (LLC o particin) -Slido (LSC o adsorcin) -Resina de intercambio inico (IEC) -Lquido en intersticios de un slido polimrico (EC) -Lquido con un grupo especfico unido a una superficie slida (AC) Columna capilar rellena con la disolucin sometida a un alto voltaje que crea una migracin de las especies cargadas Slice modificada polmeros en columnas empaquetadas Capas de gel de slice recubiertas, xido de aluminio, celulosa o poliamidas
Cromatografa Liquida (HPLC)
Agua Liquida disolventes orgnicos tales como metanol, acetonitrilo, propanol, hexano.
Electroforesis Capilar (CE) Cromatografa de fluido Supercrtico (SFC) Cromatografa Plana (Cromatografa en Capa Delgada, TLC)
Un electrolito una disolucin tampn CO2 en estado supercr tico Mezclas de disolventes tales como hexano / acetona.

11.2. Clasificacin Tanto la cromatografa plana como la de columna se basan en el mismo tipo de equilibrio. Las fases mviles gaseosa y de fluidos supercrticos requieren el empleo de una columna. En superficies planas slo pueden utilizarse fases mviles lquidas. 11.3. Elucin en la columna cromatogrfica En la figura 11.2. puede verse cmo se separan por elucin, en una columna empaquetada, dos componentes, de una muestra, A y B.

11.3. Elucin en la columna cromatogrfica
Figura 11.2. Diagrama que muestra cmo se separan en una columna cromatogrfica dos componentes, A y B de una mezcla. Seal del detector en varios estados de la elucin

11.3. Elucin en la columna cromatogrfica El eluyente es el disolvente que se emplea para transportar los componentes de la mezcla a travs de la fase estacionaria. La separacin de los componentes se logra pasando una cantidad suficiente de fase mvil a travs de la columna para hacer que las bandas individuales salgan hacia el extremo al ser eluidas de la columna.

11.4. Cromatogramas Un cromatograma es un grfico de alguna funcin de la concentracin del analito frente al tiempo o al volumen de elucin, siendo til tanto para el anlisis cualitativo como cuantitativo. La posicin de los picos en el eje del tiempo se puede utilizar para identificar los componentes de la muestra y el rea bajo los picos proporciona una medida cuantitativa de la cantidad de cada especie.

11.4. Cromatogramas El tiempo de retencin, tr, de un componente es el tiempo necesario despus de la inyeccin de una mezcla en la columna hasta que ese componente llegue al detector. La fase mvil no retenida atraviesa la columna en el mnimo tiempo posible, tm. El tiempo de retencin ajustado de un soluto es el tiempo de ms que necesita un soluto para atravesar toda la columna, respecto al que emplea un disolvente no retenido, tr.

11.5. Cromatografa de gases Existen dos tipos de cromatografa de gases: la de gas-lquido (GLC) y la de gas-slido (GSC). La primera es la que tiene ms aplicaciones analticas y se le conoce como cromatografa de gases (GC). La cromatografa de gas-slido tiene menos aplicaciones debido a que muchas molculas reactivas o polares poseen tiempos de retencin muy largos y las colas de los picos de elucin no son aceptables. El fundamento de la cromatografa gas-lquido es la separacin del analito entre una fase gaseosa mvil (gas portador) y una fase lquida esttica adherida en la superficie de un relleno slido inerte o en las paredes de una columna capilar.

11.5. Cromatografa de gases Instrumentos En la figura 11.4. se muestra un diagrama esquemtico de un cromatgrafo de gases. La muestra de un lquido voltil o de un gas se inyecta a travs de un disco de goma en un portador caliente, en el que se evapora rpidamente. El vapor es arrastrado a travs de la columna por el gas portador (He, N2 o H2) y los analitos, despus de separados, llegan al detector, cuya respuesta aparece en la pantalla de un ordenador o un registrador. La columna debe estar suficientemente caliente a fin de que los analitos alcancen una presin de vapor suficiente para que se eluyan en un tiempo razonable. El detector se mantiene a temperatura ms alta que la columna, de forma que los analitos se encuentren en fase gaseosa.

11.5. Cromatografa de gases Instrumentos
Figura 11.4. Componentes bsicos de un cromatgrafo de gases

11.5. Cromatografa de gases Gas portador El gas portador viene comprimido en botellas a presin y es necesario disponer de reguladores de presin y manmetros para controlar la velocidad de flujo de gas. Las presiones que se alcanzan a la entrada de la columna van de 10 a 50 psi y proporciona un flujo de 25 a 50 mL/min. El gas portador cumple bsicamente dos propsitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector.

11.5. Cromatografa de gases Gas portador Un gas portador debe reunir ciertas condiciones: Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria) Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa Fcilmente disponible y puro Econmico Adecuado al detector a utilizar

11.5. Cromatografa de gases Sistema de inyeccin Las muestras lquidas se inyectan con microjeringas calibradas (figura 11.5) a travs de un diafragma o septo de caucho o de silicona que desemboca en una cavidad o puerta donde se calienta la muestra antes de pasar a la columna. La temperatura que se alcanza en esta cavidad es 50 C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra. Los volmenes de muestra oscilan entre dcimas de microlitro hasta 20 L.

11.5. Cromatografa de gases Sistema de inyeccin

11.5. Cromatografa de gases Columna Es el lugar donde ocurre la separacin. Se dice que es el corazn de un cromatgrafo. El xito o fracaso de una separacin depender no solo del relleno, tambin depende de los materiales de construccin de la columna misma. Los materiales con los cuales generalmente se pueden elaborar las columnas son: cobre, aluminio, acero inoxidable, vidrio tefln. El relleno puede ser un slido, un lquido recubriendo un slido.

11.5. Cromatografa de gases Columna Podemos clasificar las columnas segn el propsito del proceso cromatogrfico: Empaquetadas: Contienen un soporte slido fino recubierto de una fase estacionaria lquida no voltil, o el slido mismo es la fase estacionaria. Son de acero inoxidable, nquel o vidrio y tienen un dimetro de 3-6 mm y una longitud de 1-5 m. El soporte slido est constituido, frecuentemente, por tierra de diatomeas (esqueletos silceos de algas) que se silanizan para reducir los enlaces por puente de hidrgeno con compuestos polares. Capilares:
W.C.O.T. (Wall Coated Open Tubular = Columna tubular abierta de pared recubierta) S.C.O.T. (Support Coated Open Tubular = Columna tubular abierta recubierta de un soporte) P.L.O.T. (Porous Layer Open Tubular = Columna tubular abierta de capa porosa)

11.5. Cromatografa de gases Silanizacin de los rellenos de diatomeas

11.5. Cromatografa de gases
de 3 a 6 mm de 1 a 5 m
de 0,2 a 1 mm de 15 a 100 m

11.5. Cromatografa de gases Columna Capilares:
Seccin transversal de columnas de pared recubierta Columna cromatogrfica de slice fundida. El dimetro de rollo es de 0,2 m y la longitud entre 15 y 100 m

11.5. Cromatografa de gases Columna Capilares: Factores que Afectan la Eficiencia de una Columna Longitud de la Columna Dimetro de la Columna Tamao de las partculas del relleno Naturaleza de las fases Cantidad de fase estacionaria Temperatura de la columna Velocidad del gas portador Cantidad de muestra inyectada Material del cual est elaborada la columna Enrollado de la columna

11.5. Cromatografa de gases. Influencia de la temperatura
Isotrmico 150C
Gradiente de temperaturas
50C - 250C, a 8/min
La temperatura es un factor muy importante en la forma de los cromatogramas. En condiciones isotermas, las mezclas de sustancias de muy diferentes puntos de ebullicin presentan picos ensanchados para los componentes menos voltiles.

11.5. Cromatografa de gases Detectores Un detector es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluidas a la salida de la columna cromatogrfica. Podemos expresar que el detector son los "ojos" de un cromatgrafo. El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la naturaleza y magnitud de la propiedad fsica. En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta accin se traduce en una seal elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador grfico integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.

11.5. Cromatografa de gases Clasificacin de los detectores pueden ser clasificados: Detectores segn su grado de selectividad:
Universales. Responde a la mayora de los solutos que pasan por l. Especficos y Selectivos. Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con un mnimo de respuesta a otras.
Detectores destructivos y no destructivos. Detectores segn su modo de respuesta:

Dependientes del Flujo Msico. Producen una seal que es proporcional a la cantidad de soluto que pasa a travs de l en la unidad de tiempo pero es independiente del volumen de gas portador requerido para la elucin. Dependiente de la Concentracin. Dan una seal proporcional a la cantidad de soluto por unidad de volumen de gas portador que pasa a travs de l.
Detectores segn el proceso de deteccin: Ionizacin, pticoespectroscpico, Electroqumico, etc.

11.5. Cromatografa de gases Clasificacin de los detectores segn su grado de selectividad

11.5. Cromatografa de gases Caractersticas de los Detectores Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una seal elctrica medible. Rango Dinmico Lineal. Rango de masa concentracin de muestra sobre el cual el detector mantiene una sensibilidad constante con desviaciones inferiores al 5%. El significado prctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la concentracin para la cual el detector es fiable.

11.5. Cromatografa de gases Caractersticas de los Detectores Ruido. Se cuantifica por el promedio de la amplitud pico-pico de la seal. El significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinacin de la cantidad mnima detectable. Lmite de Deteccin. Est definido como la mnima cantidad de sustancia que puede producir una seal que sea el doble del nivel de ruido. Corriente de Fondo. Seal constante de salida generada por el proceso en el que un detector est operativo sin que alguna sustancia pasa a travs de l. Esta seal es muy importante, ya que permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.

11.5. Cromatografa de gases Detectores ms usados en Cromatografa de Gases
Detector de Conductividad Trmica (TCD). Mide la conductividad trmica del gas portador, ocasionada por la presencia de substancias eluidas. Detector de Ionizacin a la Llama (FID). Basado en la medida de las variaciones de la corriente de ionizacin en una llama oxgeno-hidrgeno debido a la presencia de substancias eluidas. Detector de Captura Electrnica (ECD). Basado en la electronegatividad de las substancias eluidas, y su habilidad para formar iones negativos por captura de electrones. Detector de Fotometra a la Llama (PDA). Basada en la medida de la intensidad de la emisin molecular de la fluorescencia de heterotomos en las molculas orgnicas. Detector de Espectrometra de Masas (MS). Su principio est basado en el bombardeo por electrones de las sustancias a ser analizadas, estas se fragmentan de acuerdo a leyes bien definidas de la naturaleza que es conocida como patrones de fragmentacin.

11.5. Cromatografa de gases Detector de Conductividad Trmica (TCD)
Se basa en los cambios de conductividad trmica del gas portador debido a la salida de los componentes de la muestra. Responde a la concentracin del soluto en el gas portador. No es destructivo. La conductividad trmica del gas portador ha de ser elevada (He y H2 tienen una conductividad trmica de 6 a 10 veces mayor que la mayora de los compuestos orgnicos.
-Sencillez -Amplio rango lineal -Respuesta a todo tipo de compuestos -No destructivo -Baja sensibilidad, que impide su empleo con columnas capilares, debido al pequeo tamao de las muestras.
Caractersticas

11.5. Cromatografa de gases
Detector de Conductividad Trmica (TCD)

11.5. Cromatografa de gases Detector de Conductividad Trmica (TCD). Aplicaciones:
Separacin cuantitativa de compuestos que no generan seal en otros detectores: Ejemplo: separacin de gases y carbohidratos: 1. N2 2. CH4 3. CO2 4. n-C2 5. NH3 6. n-C3 7. i-C4 8. n-C4
Por ser un detector no destructivo, puede ser usado en cromatografa preparativa o deteccin secuencial con otros detectores en tandem.

11.5. Cromatografa de gases Detector de Ionizacin de llama (FID)
Es uno de los ms empleados. Forma una llama que quema e ioniza los compuestos separados en la columna. Insensible a grupos funcionales como C=O, O-H y N-H, que originan en la llama pocos iones. Insensible a muchos compuestos gaseosos. Elevada sensibilidad (10-13 g soluto/min). Destructivo. Como prcticamente todas las sustancias analizables por CG son orgnicas, en la prctica se considera un detector UNIVERSAL.

11.5. Cromatografa de gases Detector de Ionizacin de llama (FID) PRINCIPIO Formacin de iones cuando un compuesto se quema en una
llama de hidrgeno y oxgeno.
El gas portador se mezcla con H2 y O2. Ninguno de estos compuestos forma iones en la llama, por lo que no se genera corriente elctrica
Cuando un compuesto orgnico eluye, l tambin se quema. Como en su combustin se forman iones, la llama pasa a conducir la corriente elctrica.

11.5. Cromatografa de gases Detector de Ionizacin de llama (FID)
Selectivo para sustancias que contienen uniones C-H en su estructura qumica. (Como prcticamente todas las sustancias analizables por CG son orgnicas, en la prctica se considera un detector UNIVERSAL)

11.5. Cromatografa de gases Detector de Captura Electrnica (ECD)
Se basa en la captura de los electrones libres procedentes de una fuente de radiacin - por parte de las especies electrfilas que salen eluidas en el gas portador, no electrfilo. Es el ms sensible (10-14 g soluto/mL) No son destructivos. Su aplicacin ms importante es para deteccin de compuestos organoclorados (pesticidas, herbicidas)

11.5. Cromatografa de gases Detector de Captura Electrnica (ECD) PRINCIPIO Supresin de un flujo de electrones lentos causada por la
absorcin de stos por especies electrfilas.
Un flujo de electrones lentos se establece entre un nodo (fuente radiactiva - emisora) y un ctodo
Al pasar una sustancia electroflica, algunos electrones son absorbidos, disminuyendo la corriente elctrica.

11.5. Cromatografa de gases Detector de Captura Electrnica (ECD). Aplicaciones: Es el detector de eleccin para anlisis de trazas de organohalogenados y similares
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
PESTICIDAS
Tetracloro-m-xileno A BHC Lindano Heptachlor Endosulfn Dialdrin Endrin DDD DDT Metoxychlor Decaclorobifenila

11.5. Cromatografa de gases - Espectrometra de masas (CG-EM) La asociacin CG-EM proporciona una herramienta muy til para la identificacin de mezclas complejas

11.5. Cromatografa de gases - Espectrometra de masas (CG-EM)
INTERFASE -Ha de tener un volumen muerto mnimo para evitar el ensanchamiento de las lneas. -Debe reducir drsticamente la presin, pues en el espectrmetro ha de ser inferior a 10-3 torr. CMARA DE IONIZACIN -Se emiten electrones en un filamento caliente y se aceleran hacia un nodo colector. -En su trayectoria chocan con las molculas del analito y las ionizan.
Analizador
interfase
Cmara de ionizacin
de masas
-Se produce el ion molecular e iones secundarios, consecuencias de fragmentaciones. M + e- M+ + 2 e- A+ + B+ + ANALIZADOR DE MASAS Se separan los iones generados segn su relacin carga/masa, en el seno de campos magnticos

11.5. Cromatografa de gases - Espectrometra de masas (CG-EM)
Esta es la seal que produce el pico 4 (benceno). La masa mayoritaria es el in molecular (78), aunque no siempre es el pico mayoritario. Existen bases de datos de espectros de masas de sustancias conocidas.

11.6. Aplicaciones de la cormatografa de gases La CG es una tcnica que se puede aplicar para separar especies que tienen una volatilidad apreciable y se mantienen estables a temperaturas superiores a 100 C. Se utiliza tanto en anlisis cualitativo como cuantitativo. Calibracin con patrones El mtodo del estndar interno

11.6. Aplicaciones de la cromatografa de gases Calibracin con patrones Mtodo del estndar interno

11.7. Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) Tambin llamada de alta eficacia o de alta presin. Utiliza una presin elevada para forzar el paso de disolvente por una columna que contiene partculas muy finas, consiguiendo as separaciones de gran resolucin. La fase mvil es un disolvente lquido que contiene a la muestra como mezcla de solutos. 11.8. Clasificacin La HPLC se puede clasificar segn la naturaleza de la fase estacionaria: Cromatografa de particin, reparto o cromatografa lquido-lquido Cromatografa de adsorcin o cromatografa lquido-slido Cromatografa inica o de intercambio inico Cromatografa de exclusin molecular Cromatografa de afinidad

Cromatografa de adsorcin o cromatografa lquido-slido Se basa en los fenmenos de adsorcin que ocurren al ponerse en contacto slidos activos con lquidos.
FASE ESTACIONARIA Gel de slice (SiO2xH2O). Centros activos: grupos silanol (Si-O-H), que interaccionan con grupos funcionales polares de los solutos. Al saturarse de molculas de agua hay que activarlo, calentando a 200C. Almina (Al2O3xH2O). Sitios activos cidos prximos a Al3+ y bsicos prximos a O2-. Tambin se desactiva con agua. FASE MVIL Los disolventes compiten con la muestra por los centros activos de la fase estacionaria. Serie Eluotrpica Lista de disolventes ordenados con respecto a su capacidad relativa para desplazar solutos de una fase estacionaria. Para gel de slice:
Agua > metanol > etanol > acetona > Ac. Etilo > CHCl3 > benceno > tolueno > CCl4 > ciclohexano > hexano
Es posible seleccionar un disolvente o una mezcla con el poder eluyente adecuado para una determinada separacin.

Cromatografa de intercambio inico
Se basa en el equilibrio de distribucin de los iones de soluto (X) entre el disolvente y los sitios cargados de la fase estacionaria (R-A) R-A- M+ + X+(aq) R-A- X+ + M+ (aq) (intercambio catinico) R-A+ M- + X- (aq) R-A+ X- + M- (aq) (intercambio aninico) La fuerza con que se adhieren los iones de soluto (X) aumenta con la carga del in y disminuye con el tamao del ion hidratado. FASE ESTACIONARIA Materiales que pueden intercambiar iones. Naturales zeolitas. Sintticas resinas intercambiadoras copolmeros de estireno y vinilbenceno con centros intercambiadores de cationes (sulfonatos, carbosilatos,...) o de aniones (grupo amonio cuaternario, amina,...) FASE MVIL Disolucin acuosa. Variando la fuerza inica o el pH de la fase mvil cambia la fuerza de retencin de los iones de soluto por la fase estacionaria

Resinas intercambiadoras
estireno divinilbenceno
grupo sulfonato
grupo carboxilato
grupo amonio intercambiador de aniones
intercambiadores de cationes

(intercambio aninico)
Centros cargados de la fase estacionaria

(intercambio aninico)
GRADIENTE: aumentando la concentracin salina de la fase mvil los iones sta (Cl-) compiten cada vez ms favorablemente con la muestra por los sitios activos cargados de la fase estacionaria.

a) Intercambio aninico
b) Intercambio catinico

Cromatografa de exclusin molecular o de permeacin en gel para
separacin de protenas o macromolculas en funcin de su peso molecular. Las molculas pequeas penetran en los pequeos conductos que presentan las bolas de gel, donde la velocidad de flujo de solvente es menor. Las molculas grandes, incapaces de penetrar en los pequeos conductos de las bolas de gel, se mueven entre ellas, donde la velocidad del flujo del solvente es superior. Como consecuencia, las molculas de mayor peso molecular son eluidas antes ue las de menor peso molecular.

Cromatografa de exclusin molecular o de permeacin en gel

Cromatografa de afinidad

Cromatografa de afinidad
MATRIZ Partculas de tamao uniforme, porosas, inertes y estables. Activacin de la matriz Unin entre el ligando y la matriz, a travs de los grupos OH de sta.
NH -OH -OH
+ CNBr
+ H2N-protena
-O-C-NH-protena -OH
Con frecuencia, el ligando est situado demasiado cerca de la matriz, lo que dificulta su asociacin con la especie a retener se emplean brazos de extensin, que son cadenas de hidrocarburos situados entre la matriz y el ligando.
Casi todas las aplicaciones inciden en el campo de la bioqumica (interacciones enzima-coenzima, anticuerpo-antgeno, hormona-receptor)

Cromatografa de particin o reparto de fase enlazada (CLL)
-Se basa en el reparto de los solutos entre dos lquidos inmiscibles. -Una de las variantes ms importante de la cromatografa de reparto es aqulla en la que la fase estacionaria lquida est unida qumicamente a un soporte slido (fase enlazada). enlazada -La fase mvil es un lquido completamente inmiscible con la fase fija. SOPORTE gel de slice, tierra de diatomeas, celulosa,..., de 3-10 m Se han de evitar los fenmenos de adsorcin de la fase mvil al soporte slido. Las molculas de la fase estacionaria unidas al soporte forman una estructura microscpica similar a un cepillo, en donde las molculas de la muestra quedan retenidas con mayor o menor fuerza segn su afinidad relativa. CLL CLLen enfase fasenormal normal -Fase -Fasemvil mvil lquido lquidoapolar apolar -Fase -Faseestacionaria estacionaria lquido lquidopolar polar -Para -Paraseparacin separacinde decompuestos compuestos orgnicos. orgnicos. CLL CLLen enfase fasereversa reversa -Fase -Fasemvil mvil lquido lquidopolar polar -Fase -Faseestacionaria estacionaria lquido lquidoapolar. apolar. -Para -Paraseparacin separacinde decompuestos compuestos hidroflicos. hidroflicos.

Cromatografa de particin de fase enlazada (CLL)
Cromatografa LL en fase normal FASES MVILES Cloroformo, tetracloruro de carbono, etilter, hexano, etc. FASES FIJAS:
(molculas ligadas al soporte) Cromatografa LL en fase reversa FASES MVILES Disoluciones acuosas, acetonitrilo, metanol, con pH < 8 FASES FIJAS: (molculas ligadas al soporte)

Los rellenos con fases unidas qumicamente, cuando se utilizan en fase reversa se aproximan al sistema ideal y universal para la cromatografa de lquidos. Para investigar la separacin tipos de muestras desconocidos, stos son los rellenos que se investigan en primer lugar debido a su amplio intervalo de aplicabilidad y a la facilidad con que pueden cambiarse los tiempos de retencin variando las fases mviles. APLICACIONES EN TODOS LOS CAMPOS: Frmacos Bioqumica Alimentacin Indust. qumica Contaminantes Quimica forense Medicina Antibiticos, sedantes, esteroides, analgsicos Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aditivos, aflatoxinas Aromticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes Pesticidas, herbicidas, fenoles, ... Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orinas, estrgenos

FASE NORMAL FASE REVERSA

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos El sistema HPLC que se muestra en la figura 11.8 consta de un sistema de suministro de disolvente, una vlvula de inyeccin de muestra, una columna de alta presin, un detector y un ordenador para controlar el sistema y visualizar los resultados. Actualmente muchos sistemas incluyen adems un horno para controlar la temperatura de la columna.
inyector
Figura 11.8. Diagrama de los componentes de un equipo HPLC

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos: Bomba
La fase mvil es siempre un lquido que se impulsa a travs de la columna por medio de una bomba. Existen dos tipos: mecnicas y neumticas. Las principales estn provistas de un pistn o diafragma que impulsa al lquido a travs de la columna. En general, las bombas de pistn producen presiones ms altas. Las bombas neumticas operan inyectando un gas a presin al compartimiento que contiene la fase mvil, obligndola a penetrar en la columna con la misma presin del gas. El funcionamiento de la bomba es muy importante para lograr una buena separacin, ya que regula la velocidad de la fase mvil y mantiene el flujo constante. Velocidad y presin La eficiencia de la columna depende en parte de la velocidad de flujo. Las columnas comunes operan a velocidades de 10 a 60 mL por hora y bajo presiones de 30 a 400 atm.

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos: Bombas

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos: Bombas
Bomba de doble pistn para HPLC

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos. Fase mvil Es una de las variables que influyen ntimamente en la separacin. Las caractersticas con que debe contar una buena fase mvil son:
a) No alterar la columna y su naturaleza. b) Ser compatible con el detector. c) Disolver la muestra. d) Ser de baja viscosidad. e) Que permita recobrar la muestra en su forma simple. f) Ser pura (lquidos para cromatografa). No debe contener gases disueltos desgasificacin g) De adquisicin econmica. h) A veces conviene trabajar usando mezclas binarias o ternarias de disolventes, con gradiente de concentracin, en lugar de hacerlo a composicin constante de la fase mvil (isocrtico).

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos Introduccin de la muestra - Debe hacerse rpidamente y sin alterar el relleno de la columna. Se emplean dos mtodos: con eluente fluyendo y con flujo detenido. - La muestra debe filtrarse y/o centrifugarse antes de ser inyectada, para evitar la contaminacin de la fase estacionaria por partculas en suspensin. -En las columnas analticas se emplea una precolumna, que es una pequea seccin de tubo recambiable, rellena con el mismo material de la columna para proteger a sta de la contaminacin -El mtodo de inyeccin ms utilizado en HPLC son las vlvulas de inyeccin, con bucles de volumen conocido, con dos posiciones: llenado e inyeccin.

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos: Vlvulas de inyeccin
jeringuilla jeringuilla
al desecho Lazo de volumen de muestra fijo A la columna entrada disolvente A la columna
al desecho
entrada disolvente
Posicin de llenado
Posicin de inyeccin

Cromatografa Lquida de Alta Resolucin 11.9. Instrumentos: Columnas
-Son la parte ms importante del cromatgrafo. -Pueden dividirse en dos tipos: analticas y preparativas. -Las analticas se caracterizan por tener dimetros muy pequeos: entre 1 y 6 mm. -Las columnas pueden ser de vidrio o de algn material metlico. -No se deben emplear columnas de cobre cuando la fase mvil es de carcter cido. La longitud de la columna vara entre 0,15 y 6 m. Las columnas ms largas poseen mayor resolucin, pero provocan una rpida cada de presin y, por lo tanto, variaciones en la velocidad de flujo. -Las partculas del relleno tienen un tamao entre 3 y 10 n (40.000 60.000 platos tericos/metro) Columna de HPLC

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos Fase estacionaria La fase estacionaria ideal es aquella que proporciona la mejor resolucin de los componentes de la muestra en el menor tiempo. Debe aceptar la cantidad de muestra requerida, ser de fcil empaquetado, econmica y producir una cada de presin lenta. La cantidad de la muestra est directamente relacionada con la capacidad de la fase estacionaria. Temperatura En la cromatografa de lquidos se puede o no tener control sobre la temperatura de la columna y del detector. En columnas a alta presin, las temperaturas elevadas incrementan la velocidad y la resolucin.
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Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC)
11.9. Instrumentos Detectores Indican la presencia y miden la cantidad de los componentes que emergen de la columna. Se dividen en destructivos y no destructivos. Los no destructivos permiten usar la muestra en investigaciones posteriores. Entre stos estn los de luz ultravioleta y los de ndice de refraccin. Los detectores ms utilizados: -Detectores diferenciales Detector de ndice de refraccin
Absorbancia ultravioleta
-Detectores selectivos:
Fluorescencia Electroqumicos
-Detectores modificados para gases:
Espectrmetro de masas De ionizacin de llama
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Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC)
11.9. Instrumentos Detectores Un detector ideal debe reunir las siguientes caractersticas: a) Alta sensibilidad. b) Buena estabilidad (bajo nivel de ruido) y reproducibilidad. c) Respuesta lineal de un cierto rango. d) Pequeo tiempo de respuesta, independientemente de la velocidad del flujo e) Pequeo volumen muerto, para minimizar el ensanchamiento de las bandas cromatogrficas f) Insensible a cambios de presin y de temperatura g) Respuesta independiente de la composicin de la fase mvil h) No ser destructivo No todos los detectores cumplen todas las condiciones
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Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos Detector de ndice de refraccin.

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos Detectores de absorcin UV
La concentracin de la muestra es inversamente proporcional a la fraccin de luz transmitida a travs de la celda, de acuerdo con la ley de Beer. Se emplean principalmente lmparas de longitud de onda fija, como la de mercurio (254 nm) y la de fsforo (280 nm). Casi todas las sustancias orgnicas absorben en estas longitudes de onda. Una celda ordinaria tiene un camino ptico de 0,5 cm y slo 8 L de lquido
Salida del eluato
Figura 11.13. Camino ptico de una microcelda de un detector

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos
El detector UV (o visible-UV) de fotodiodos se utiliza con fines identificativos, ya que al eluir los componentes de la muestra se detecta su espectro de absorcin. (cada sustancia tiene un espectro de absorcin caracterstico)

Espectros de absorcin UV efluentes de una mezcla que contiene tres esteroides tomados a intervalos de 5 s, mediante un detector de fotodiodos.

Detectores de fluorescencia
-La fluorescencia se mide por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitacin. -Semejantes a los detectores de absorbancia. -Altamente sensitivos.

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos Detectores modificados para gases
De ionizacin de llama. Un alambre mvil transporta pequeas fracciones de

eluyente de la columna a un evaporador, donde el disolvente se volatiliza en el alambre. A continuacin, se transfiere a un horno piroIizador y los vapores emitidos son arrastrados a un detector de ionizacin de llama mediante una corriente de argn.
De espectrometra de masas. La interfase entre una tcnica en fase lquida

y una tcnica en fase gas a muy baja presin fue un problema con difcil solucin durante mucho tiempo. Actualmente hay diversas tcnicas para rconseguirlo, como la ionizacin por electrospray y otras tcnicas de secado.

Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC) 11.9. Instrumentos Registradores La forma de los picos que aparecen en el cromatograma vara de acuerdo con el detector empleado 11.10 Aplicaciones de la HPLC La cromatografa de lquidos es de gran aplicacin para el anlisis de aquellas sustancias de naturaleza orgnica poco voltiles. Se pueden analizar con esta tcnica azucares, aminocidos, vitaminas, frmacos, polmeros naturales o sintticos.....

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Cromatografa Liquida (HPLC)

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Figura 11.4. Componentes bsicos de un cromatgrafo de gases

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Detectores destructivos y no destructivos. Detectores segn su modo de respuesta:

Detectores segn el proceso de deteccin: Ionizacin, pticoespectroscpico, Electroqumico, etc.

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grupo amonio intercambiador de aniones

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Centros cargados de la fase estacionaria

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