Instrumentos Clinicos de Lab Oratorio

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Instituto Tecnológico de Mexicali

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Instituto Tecnológico de
Mexicali
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Instrumentos Clínicos de Laboratorio
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Aplicación de Instrumentación Biomédica
01/10/2008
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Luis Antonio Mendoza Gómez
Julio Cesar Camacho Figueroa
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Contenido
Espectrofotómetro..............................................................................................3
Componentes de un espectrofotómetro .........................................................3
Funcionamiento de un espectrofotómetro de reflectancia...............................4
Geometría óptica de un espectrofotómetro.....................................................5
Cromatografía .............................................................................................. ......8
Esquema de un cromatógrafo de gases .........................................................9
Fase móvil .................................................................................................... .11
Sistema de inyección ............................................................................... .....11
Tipos de columnas ........................................................................................12
Fase estacionaria. Soporte sólido .................................................................13
Detectores..................................................................................... ................15
Aplicaciones analíticas ................................................................................. .18
Electroforesis................................................................................. ...................20
Aplicación De La Electroforesis......................................................................21
Métodos electroforéticos zonales..................................................................22
Fuentes de error en la electroforesis.............................................................25
Hematología.....................................................................................................27
Diagnostico................................................................................................ ....28
Bibliografía.......................................................................................................29
[Escribir texto] Página 2

Espectrofotómetro
Un espectrofotómetro es un instrumento usado en la física óptica
que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre
valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de
radiaciones. También es utilizado en los laboratorios de química para la
cuantificación de sustancias y microorganismos.
Hay varios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción

atómica o espectrofotómetro de masa.
Figura 1. Espectrofotómetro
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz

monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es
absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos
funciones:
1. Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra
2. Indicar indirectamente que cantidad de la sustancia que nos interesa

está presente en la muestra
Componentes de un espectrofotómetro
Fuente de luz
La misma ilumina la muestra. Debe cumplir con las condiciones de

estabilidad, direccionabilidad, distribución de energía espectral continua y
larga vida. Las fuentes empleadas son lámpara de tungsteno y lámpara
de arco de xenón.

Monocromador
El monocromador aísla las radiaciones de longitud de onda deseada

que inciden o se reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz
monocromática. Está constituido por las rendijas de entrada y salida,
colimadores y el elemento de dispersión. El colimador se ubica entre la
rendija de entrada y salida Es un lente que lleva el haz de luz que entra
con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual separa
todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirije
hacia otra lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida.
Fotodetectores
En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16

fotodetectores para percibir la señal en forma simultánea en 16 longitudes
de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de medida, y
minimiza las partes móviles del equipo.
Funcionamiento de un espectrofotómetro de reflectancia
Los espectrofotómetros de reflectancia miden la cantidad

proporcional de luz reflejada por una superficie como una función de las
longitudes de onda para producir un espectro de reflectancia. El espectro
de reflectancia de una muestra se puede usar, junto con la función del
observador estándar CIE y la distribución relativa de energía espectral de
un iluminante para calcular los valores triestímulos CIE XYZ para esa
muestra bajo ese iluminante.
Figura 2. Funcionamiento de un espectrómetro de reflectancia
El funcionamiento de un espectrofotómetro consiste básicamente en

iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja

dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo más
usual es que los datos se recojan en 31 intérvalos de longitudes de onda
(los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm… 700 nm). Esto se consigue
haciendo pasar la luz a través de un dispositivo monocromático que
fracciona la luz en distintos intérvalos de longitudes de onda. El
instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia
en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparación con
una superficie de reflexión difusa perfecta.
La reflectancia de una muestra se expresa como una fracción entre 0 y 1,

o como un porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de que
los valores de reflectancia obtenidos son valores relativos y, para
muestras no fluorescentes, son independientes de la calidad y cantidad de
la luz usada para iluminar la muestra. Así, aunque los factores de
reflectancia se midan usando una fuente de luz concreta, es
perfectamente correcto calcular los valores colorimétricos para cualquier
iluminante conocido.
Geometría óptica de un espectrofotómetro
La geometría óptica del instrumento es importante. En algunos

instrumentos, se usa una esfera integradora que permite iluminar la
muestra de forma difusa, de forma igualada desde todos los ángulos,
mientras que la luz reflejada se recoje en un ángulo aproximádamente
perpendicular a la superficie de la muestra.

Figura 3. Geometría estándar de un espectrofotómetro de reflectancia
Otros instrumentos, por el contrario, iluminan la muestra desde un

ángulo determinado y recojen la luz reflejada desde otro ángulo. Un caso
típico es que la muestra se ilumine desde un ángulo de 45º con respecto a
la superficie y que la luz reflejada se mida desde un ángulo 0º. A esto se
le llama "geometría 45º/0º. Lo contrario es la geometría 0º/45º. Las
geometrías basadas en la esfera antes mencionadas se conocen como D/0
y 0/D. Es extremadamente difícil establecer la correspondencia de
medidas tomadas entre instrumentos cuya geometría óptica no sea
idéntica. Para la mayoría de las superficies, la reflectancia cambia según
los ángulos de iluminación y observación. Las cuatro geometrías
estándares establecidas por CIE son:
1. Iluminación difusa y toma de la luz en la normal (D/0).
2. Iluminación en la normal y toma de la luz difusa (0/D).
3. Iluminación a 45º y toma de la luz en la normal (45/0)
4. Iluminación en la normal y toma de la luz a 45º (0/45).
Los colorímetros miden los valores triestímulos de forma más directa

y funcionan usando tres filtros de amplio espectro. En consecuencia, los

colorímetros no pueden proporcionar datos de reflectancia espectral, pero
muchas veces son preferibles a los espectrofotómetros debido a su bajo
coste de fabricación y facilidad de transporte.

Cromatografía
En cromatografía de gases se incluyen todos los métodos

cromatográficos en los que la fase móvil es un gas (gas portador), siendo
la fase estacionaria un líquido (CGL) o un sólido (CGS). Se desarrolla en
una columna cerrada en la que se encuentra retenida la fase estacionaria
y por la que se hace pasar el gas portador, la técnica de separación es la
elución.
Iniciado el proceso cromatográfico los componentes de la mezcla se

distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil; la elución tiene lugar
forzando el paso de un gas inerte a través de la columna. La fase móvil no
interacciona con el analito y su única misión es la de transportar la
muestra.
La cromatografía gas-sólido tiene una fase estacionaria sólida en la

cual se produce la retención de los analitos debido a la adsorción física
sobre la superficie del sólido. Esta técnica ha tenido una aplicación
limitada debido a la tendencia de los picos de elución a formar colas y a la
retención semipermanente de gases activos sobre la fase estacionaria.
La cromatografia gas-líquido (objeto de estudio en este capítulo) se

basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase
estacionaria líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte
(soporte) o en las paredes interiores de la columna, si ésta es capilar.
La técnica ha sido ampliamente desarrollada en los últimos años en el
análisis de compuestos volátiles (punto de ebullición inferior a 400oC). La
limitación es debida a que las muestras se deben de introducir como gas
en cabeza de columna; cuando son líquidas sevolatilizan
instantáneamente en el bloque de inyección del cromatógrafo. Martin y
Synge, en 1941, definieron la técnica y en 1955 aparece en el mercado el
primer cromatógrafo.

Esquema de un cromatógrafo de gases
Las partes esenciales de un equipo cromatográfico son
• Fuente de gas portador (botella a presión)

• Sistema de regulación de caudales (válvula reguladora y
manómetro)
• Bloque termostatado de inyección de las muestras.
• Columna termostatada, conteniendo la fase estacionaria.
• Detector termostatado, con amplificador de señal y registro gráfico.
• Caudalímetro de precisión.

El gas portador es un gas inerte, generalmente helio, nitrógeno o
argón, de elevado grado de pureza. El caudal del mismo que pasa
por la columna, ha de ser conocido y controlado.
El bloque de inyección, para introducir los solutos en la corriente de

gas portador y vaporizar las muestras cuando éstas no son
gaseosas. Así, la temperatura del bloque ha de ser superior a la del
punto de ebullición del componente de la mezcla menos volátil.
Las columnas pueden ser con relleno, en las que la fase estacionaria
líquida está retenida sobre un sólido inerte (soporte) y capilares ó
semicapilares, en las que la fase estacionaria se fija sobre las
paredes interiores del capilar. La temperatura de la columna
depende de los puntos de ebullición de los componentes de la
mezcla.
El detector tiene por objeto medir la variación de alguna propiedad
física del gas portador originada por la elución de los compuestos.
La temperatura del detector ha de ser mayor o igual que la de
columna para evitar la condensación de algún compuesto eluido.
Registro gráficamente de la medición del detector.
La separación de los compuestos de una mezcla se realiza en las

siguientes etapas,
1. Una vez elegida la columna y fase estacionaria, se ajustan las
temperaturas de la cámara de inyección, columna y detector,
así como el caudal de gas portador. Cuando la señal del
detector es constante (sin ruidos la línea base) se hace la
inyección de la muestra.
2. Las muestras se inyectan en cantidades inferiores a 1 μl

cuando son líquidas y sobre 1 ml si son gaseosas; se
introducen en la cámara de inyección, donde se vaporizan, y
son arrastradas hasta cabeza de columna.
3. Los componentes se fijan en una pequeña zona de la columna;

por equilibrios sucesivos entre fase móvil y estacionaria cada
componente se desplaza por la columna a velocidades
diferentes.
4. Finalmente, los solutos que salen de la columna, pasan al

detector y se obtiene el cromatograma.
Los parámetros que definen una separación cromatográfica gas-líquido

son, tipo de gas portador y caudal del mismo; columna y dimensiones de
la misma; fase estacionaria; tipo de detector; temperatura del bloque de
inyección, de la columna y del detector.

Fase móvil
Ha de ser un gas inerte, que no interaccione con la fase estacionaria

ni con el analito, como el helio, el argón, el nitrógeno y el hidrógeno. La
elección del gas portador se hace, frecuentemente, en función del
detector. El nitrógeno, helio y hidrógeno suele utilizarse con los detectores
de ionización de llama (FID). El argón con el detector de captura
electrónica (ECD). El helio e hidrógeno con el detector de conductividad
térmica (TCD), por su elevada conductividad; si bien el hidrógeno es un
fuerte reductor, lo que puede limitar su uso.
La velocidad de flujo se controla por medio de reguladores de

presión, manómetros y medidores de flujo. El rango de presiones varía
entre de 0,7 a 3,5 kg/cm2 por encima de la presión ambiental, lo que
proporciona una velocidad de flujo desde 25 a 50 ml/min en las columnas
de relleno y de 1 a 25 ml/min en las columnas capilares. El caudal de gas
portado se mide al final de la columna, mediante un medidor de pompas
de jabón.
Sistema de inyección
La eficacia de la columna obliga a que la muestra sea de un tamaño

adecuado y que se aplique instantáneamente; inyecciones lentas o
muestras de volumen excesivo producen ensanchamientos de las bandas
y disminuye la eficacia.
La muestra se introduce en el bloque de inyección con una

microjeringa a través de una membrana de caucho o silicona (septum),
figura 5.2. La cámara de inyección es de acero inoxidable o níquel con un
sistema de calefacción eléctrico y un aislamiento térmico que permita
mantener una temperatura constante, 50OC por encima del punto de
ebullición del analito.

En las columnas de relleno, la cantidad de muestra líquida máxima
es de 10 μl; en columnas capilares se utilizan muestras mucho más
pequeñas, del orden de 10-3 μl. El inyector para columnas capilares suele
disponer de un sistema de división de flujo (split/splitless) para que a la
columna solamente pase una pequeña fracción de la muestra,
desechando el resto. Las muestras gaseosas se inyectan mediante una
válvula automática y en mayor cantidad.
Los requisitos que debe cumplir un sistema de inyección son

producir bandas iniciales lo más estrechas posibles y no alterar la
composición de la mezcla que llega a la columna.
Tipos de columnas
Existen dos tipos de columnas, principalmente, de relleno y

capilares o semicapilares. Contiene la fase estacionaria y en ella tiene
lugar la separación cromatográfica.
Las columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable,

aluminio, vidrio y teflón; con un diámetro interior entre 2 y 4 mm y una
longitud entre 2 y 3 m. La eficacia está en torno a 1.000-2.000 (platos
teóricos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, máximo 10
componentes.
La columna está rellena de un material sólido (soporte), finamente

dividido y homogéneo; recubierto, por una capa de 0,05-1 μm de espesor,
de fase estacionaria líquida. Está configurada en forma helicoidal, con un
diámetro de unos 15 cm, para poder ser instalada en el horno
termostatizado.

Las columnas capilares tienen un diámetro interior inferior a 1 mm
(320-250 μm) y una longitud de 5 a 50 m. Suelen construirse con sílice
fundida que le dan gran resistencia física y flexibilidad. Alcanzan una
eficacia hasta de 4.000 (platos teóricos/m) y se usan para muestras
complejas. La fase estacionaria se depositada sobre las paredes interiores
del tubo capilar.
Otro tipo de columnas capilares son con soporte recubierto, en la

que la superficie interna del capilar está recubierta de una capa de
material de soporte (tierras de diatomeas) de 30 μm, lo que permiten una
mayor cantidad de fase estacionaria y por tanto de muestra.
Las columnas semicapilares tienen un diámetro interior de 530 μm

que admiten cantidades de muestra similares a las columnas de relleno, y
proporcionan mayor eficacia que éstas.
Una de las variables importantes en el desarrollo cromatogáfico,

como se indicó con anterioridad, es la temperatura de la columna;
temperatura óptima es función de los puntos de ebullición de los
componentes de la muestra y del grado de separación deseado.
En muestras de parecidos puntos de ebullición la temperatura

óptima es ligeramente superior al punto de ebullición medio de los
componentes de la muestra. En el caso de muestras complejas, en la que
los puntos de ebullición de los distintos componentes son muy diferentes,
se recomienda emplear una programación de temperatura, aumentando
ésta continuamente a medida que avanza la separación. El aumento de la
temperatura reduce los tiempos de retención.
Fase estacionaria. Soporte sólido
La fase estacionaria de una columna cromatográfica ha de reunir

una serie de requisitos como:
• Baja volatilidad, su punto de ebullición debe de ser por lo menos

100oC superior a la temperatura máxima de operación de la
columna.
• Estabilidad térmica.
• Inercia química.
• Los valores del factor de capacidad (k´) y del factor de selectividad
(α) de los analitos deben estar dentro de los intervalos aconsejados.
La separación en cromatografía gas-líquido se debe a los diferentes

coeficientes de reparto del analito entre la fase móvil y la fase
estacionaria y tiene que haber un cierto grado de solubilidad de los
compuestos con la fase estacionaria. Por ello, una característica muy
importante de la fase estacionaria es la polaridad. Siguiendo el principio

de "semejantes disuelven a semejantes" los solutos se retienen más en
las fases líquidas de polaridad parecida, lo que permiten obtener mejores
separaciones.
Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de

dialquilsiloxanos son poco polares, las compuestas por poliéster son muy
polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separación, los
alcoholes, ácidos y aminas son polares; los ésteres cetonas y aldehidos
tienen polaridas intermedia; y son de baja polaridad los hidrocarburos
saturados.
Otro factor a tener en cuenta son los límites de temperatura que

puede soportar la fase estacionaria, el límite inferior será el punto de
fusión o temperatura a la que la viscosidad de la fase líquida es muy
elevada, lo que haría disminuir la eficacia. El límite superior es la
temperatura a la que la presión de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg
(250oC inferior al punto de ebullición) por encima de esta temperatura se
produce arrastre de la fase líquida, lo que lleva consigo efectos en el
detector (ruido, suciedad), interferencias con los solutos y en suma,
deterioro de la columna.
En una fase líquida cualquiera, una serie homóloga se eluye según orden
creciente de número de átomos de carbono. Si la fase es no polar, los
solutos no polares eluyen según orden creciente de punto de ebullición.
En una fase polar se retendrán más los solutos polares que los no polares
a igualdad de puntos de ebullición.
Otro aspecto ha desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es

el soporte sólido empleado en las columnas de relleno; el objetivo es el de
proporcionar una superficie elevada donde depositar la fase líquida en
forma de película muy fina para proporcionar una mayor superficie de
contacto entre fase móvil y fase estacionaria.
Las características de los soportes sólidos son, una elevada

superficie específica (1m2/g); una superficie homogénea; estabilidad
térmica; geometría adecuada; baja dispersión de tamaño de las
partículas, entorno a 150-250 μm; dureza mecánica; inercia química y
naturaleza porosa.
Los soporte, más generalizados, son los de silíceo como las tierras
de diatomeas o sintéticos; de vidrio y de polifluorocarbonados (teflón). Los
soportes de diatomeas están constituidos por residuos de algas
unicelulares diatomáceas que se unen formando filamentos.
Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes,

pero parecida estructura. Tienen una superficie específica de 1 m2/g. El
constituyente mayoritario es de anhídrido silícico SiO2 (90%), tratado con
un fundente alcalino a 1.600oC se obtiene el producto comercial conocido
como Chromosorb W de superficie poco adsorbente por lo que es muy útil
para separar compuestos polares.

Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como
Chromosorb P, C-22 y Sterchomel, tiene mayor resistencia mecánica y
superficie específica que el anterior, pero es muy activo y no se puede
utilizar con compuestos polares.
Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes

interiores de sílice fundida, en las columnas capilares, provocan
adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultado
picos cromatográficos distorsionados.
Se ha demostrado que este fenómeno se debe a los grupos silanol

(-SiOH) que se forman en la superficie de los silicatos debido a la
humedad. El silanol tiene gran afinidas por las moléculas orgánicas
polares. Este proceso puede desactivarse por sililación con
dimetilclorosilano, Cl2Si (CH3)2, que elimina el H del silanol formando ClH.
Detectores
Un detector es todo dispositivo capaz de medir una propiedad física

del gas portador, la cual varía con la presencia de pequeñas cantidades
de analito; debe reunir una serie de características:
• Alta sensibilidad (relación entre la respuesta del detector y la

magnitud física de la muestra detectada)
• Buena estabilidad
• Respuesta continua y reproducible a los cambios de concentración
del compuesto
• Respuestas adecuadas al mayor número posible de muestras
• Tiempo de respuesta corto
• Reactividad nula.
Los detectores más comunes son:

a) Detectores de conductividad térmica, se basa en los cambios en la
conductividad térmica de la corriente de gas portador debido a la
presencia de moleculas del analito que abandona la columna.
Responde a la concentración del soluto en el gas portador y no es
destructivo.
El elemento principal es una "célula de conductividad térmica" que

consiste en un bloque de material buen conductor del calor, con una
cavidad a través de la cual fluye el gas portador. En su interior, se
coloca un hilo de platino, a temperatura 40ºC superior a la del
bloque. La pérdida de calor del elemento caliente depende de la
conductividad térmica del gas.

En el bloque se perforan dos cavidades, conteniendo cada una de
ellas un hilo de platino calentado; por una de ellas pasa gas
portador puro y por la otra el gas portador que sale por la columna,
para medir conductividades relativas.
Los elementos sensores están incorporados a un puente de

Wheatstone; cuando pasa solamente gas portador puro a través de
ambas células, el puente se equilibra a cero; cuando eluye un
componente, la conductividad térmica de la mezcla (gas portador-
analito) varía, por lo que cambia la temperatura del elemento
sensible de la correspondiente célula. Como consecuencia de esto,
hace lo mismo la resistencia del filamento y se desequilibra el
puente, produciendo una variación de potencial que se mide en un
milivoltímetro.
Un último requisito es que la conductividad térmica del gas portador

ha de ser elevada, caso del helio e hidrógeno que es de seis a diez
veces mayor que la mayoría de los compuestos orgánicos.
Otras consideraciones sobre el detector de conductividad térmica

son, la sencillez, el amplio rango lineal, respuesta a todo tipo de
compuestos, carácter no destructivo, y baja sensibilidad (10-8 g
soluto/ml) que impiden su utilización con columnas capilares, debido
al pequeño tamaño de las muestras.
b) Detector de ionización de llama, es uno de los más usados en

cromatografía de gases; el gas portador procedente de la columna
se mezcla con hidrógeno que sale por una tobera. En el extremo de
ésta, se aporta aire y forma una llama que quema e ioniza los
compuestos separados en la columna.
En la parte superior se encuentran dos electrodos entre los que se

establece una diferencia de potencial; el analito ionizado en la llama

y ocasiona un paso de corriente entre los electrodos que se registra,
figura 5.4. Los gases portadores que se utilizan son el helio,
nitrógeno e hidrógeno.
Este detector es insensible a grupos funcionales como carbonilo,

alcohol, halógenos y amina que originan en la llama pocos iones; lo
mismo ocurre con el He, Ar, Kr, Ne, Xe, O2, N2, CS2, H2S, SO2, NO,
N2O, NH3, CO, CO2, H2O, CH4, SiHCl3, SiF4. Por otra parte, posee
una elevada sensibilidad (10-13 g soluto/ml) y es destructivo.
c) Detectores de captura electrónica, se basa en la captura de los

electrones libres procedentes de la ionización del gas portador;
disminuyendo, por tanto, la intensidad de corriente de ionización.
Son muy sensibles (10-14 g soluto/ml) y no son destructivos.

La célula de conductividad consta de un ánodo, un cátodo y una
fuente radiactiva de Ni63 que produce partículas ß. Entre el ánodo y
el cátodo se establece una diferencia de potencial suficiente para
recoger todos los electrones pero no los iones.
Se utiliza Argón-metano 95-5 como gas portador para evitar la

formación de iones metaestables. Cuando el Ar-CH4 se introduce en
la célula, sus moléculas se bombardean por las partículas ß y la
ionización del gas da origen a electrones libres. La atracción de
estos electrones al ánodo crea una corriente base.
Si una muestra susceptible de capturar electrones (hidrocarburos

clorados) se encuentra en la corriente de gas portador y entra en la
célula de captura electrónica reduce la corriente, produciéndose una
disminución en la señal de salida del detector, figura 5.5.
Su aplicación principal es para compuestos órganoclorados

(pesticidas, herbicidas) aunque también es válido para aromáticos
polinucleares, nitrocompuestos, anhídridos y compuestos de azufre,
así como el NO2 y SO2 procedente de chimeneas.
d) Acoplamiento de cromatografía de gases con otras técnicas

instrumentales, proporciona una herramienta muy potente en la
identificación de los componentes de una mezcla compleja; la
tendencia actual es utilizar como detectores selectivos, que
controlan continuamente el efluente de la columna, técnicas
instrumentales como Espectrometría de Masas y Espectroscopía
Infrarroja; todo ello ayudado de un ordenador para el
almacenamiento de los datos espectrales, y posterior presentación
como espectros y cromatogramas.
Aplicaciones analíticas
La aportación analítica de la cromatografia de gases al análisis

químico tiene dos vertientes, la primera es su capacidad en la separación
de compuestos (orgánicos, inorgánicos, bioquímicos, etc.). La segunda es
emplear los tiempos o volúmenes de retención para la identificación
cualitativa, mientras que el área de los picos proporciona información
cuantitativa.
Como parámetro cualitativo se encuentra el tiempo de retención

(tR) o el volumen de retención (VR); sin embargo, su dependencia de
variables tales como temperatura de la columna, velocidad de flujo y
composición de la fase estacionaria, le hace poco fiable. Pese a ello, si se
observan tiempos de retención muy parecidos para un patrón (sustancia
conocida) y una muestra problema cuando cambian las condiciones de

operación, las probabilidades de que ambas sean la misma sustancia
aumentan.
Otro parámetro cualitativo es la "retención relativa" que requiere un

patrón interno B que permite obtener un valor de α que sirve como índice
para identificar un compuesto A.
El parámetro que proporciona mayor fiabilidas es el "índice de

retención de Kovats" que se basa en una comparación entre la posición
del pico de un analito y los picos de dos o más parafinas normales. El
sistema de índices de retención de Kovats está basado en la elección de
series homólogas de parafinas normales como patrones de referencia
dando un valor del índice I=100n a cada parafina normal de n átomos de
carbono.
Para un compuesto que eluye entre las parafinas de (n) y (n+m)

átomos de carbono, el índice de retención de Kovats viene dado por la
expresión,
It es el índice de retención de Kovats del compuesto i
(t´R) es el tiempo de retención reducido del compuesto i y de las

parafinas de (n) y (n+m) átomos de carbono
El índice de retención de Kovats depende solamente de la fase

estacionaria y de la temperatura, por lo que es fácilmente reproducible de
unos instrumentos a otros. Es una constante para cada compuesto para
unas condiciones experimentales determinadas, permitiendo la
identificación cualitativa de compuestos. Este método es más laborioso
que el de las retenciones relativas, requiere disponer de una serie de
patrones de hidrocarburos saturados lineales y es una ayuda importante
para la selección de fases estacionarias líquidas.

Electroforesis
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas
(proteínas o ácidos nucleicos) según la movilidad de estas en un campo
eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por
tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se
use. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa,
que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan con
sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de
una manera dependiente del peso molecular. Para la separación se usa un
gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al
poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se
moverán y deberán ir pasando por la malla, por la que las pequeñas se
moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más
y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.
Figura 4. Equipo de electroforesis
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza

una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas
según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su

importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E.
L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona,
nombre que se asigno a la separación de materiales en un campo
eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este termino se
limito originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas ,
se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a
sustancias de bajo peso molecular.
Fundamento

Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son
colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de
atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir
cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia
el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se
desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).
Figura 5. Separación de moléculas
El movimiento de las moléculas esta gobernado también por dos

fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará
este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las
moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento
browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado
difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la
temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no

migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas
son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a
moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el

movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas
resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar
un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular
que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el
movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración
electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento
del frente se vera reducido también.
Aplicación De La Electroforesis
• Fraccionamiento de las hemoglobinas

• Diferenciación de la hemoglobina fetal
• Diagnóstico de talasemias, anemias falciformes, etc
• Proteínas séricas
• Proteínas urinarias
• Lipoproteínas
• Ácidos nucleicos

• Enzimas
• Inmunoelectroforesis
• Etc.
Métodos electroforéticos zonales
Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes

campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se
aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte
sólido, que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en
general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de
las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen
los flujos de convección del solvente.
Figura 6. Métodos electroforéticos zonales
Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón,

poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este método
tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de
proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es
mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es
simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el
soporte y dos electrodos Los más utilizados son:
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la

acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte,
de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y
reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad
mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten
buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado.

Figura 7. Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Además tiene la ventaja de que variando la concentración de

polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del
poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido
a su neurotoxocidad.
Electroforesis en geles de gradientes
El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente

de concentración de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un
gradiente decreciente en el tamaño del poro, pueden tener ventajas sobre
los geles de concentraciones uniformes de acrilamida.
Figura 8. Electroforesis en geles de gradientes.
En un gel en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona

donde el tamaño de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el
limite del poro no se produce una migración apreciable aunque no se
detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que
resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones mas estrechas,
además de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden
resolver en un mismo gel comparado con los de una concentración fija.

Electroforesis en geles de agarosa
La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas,

como el agar-agar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones
(típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas
por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este
gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras
poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el
paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas
grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.
Electroforesis capilar
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las

técnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y
tecnología distinta que nos permiten obtener una serie de ventajas al
respecto, Esta separación de péptidos realizada sobre un capilar de silica
fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500
v/cm refrigerados por aire.
La corriente electroendosmótica (FEO) generada por los grupos

silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente
plana del frente del líquido que contrasta con el frente parabólico de la
cromatografía líquida de alta resolución.
Figura 9. Electroforesis capilar
La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que

generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez
y resistencia, tiene una ventaja a través de ella que permite el pasaje de
la luz UV de tal manera que la visualización es on-line. Con esta técnica
descripta es posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas
y sustancias no cargadas en forma simultánea.

Isoelectroenfoque
Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en

el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas
amfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que
existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La región del
ánodo es Ácida y la del cátodo es alcalina.
Figura 10. Isoelectroenfoque
Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas

que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango. Las
sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su
punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran hacia el
cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más bajos
que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migraran hacia el
ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH coincidirá
con su punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán. De
esta forma las moléculas amfotéricas se sitúan en estrechas bandas
donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.
Electroforesis bidimensional
La electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en

una mezcla según sus dos propiedades moleculares, una en cada
dimensión. El procedimiento más usado se basa en la separación en una
primera dimensión mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión
según peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.
Fuentes de error en la electroforesis
La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada

por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la
polimerización y la corrida del gel, velocidad de la polimerización, niveles
de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparación de
las muestras.

Hematología
La Hematología (de gr. hema=sangre, logo=estudio

hematología=estudio de la sangre αἷμα, -ατος-, "sangre" y -λογία,
"estudio") es la especialidad médica que se dedica al tratamiento de los
pacientes con enfermedades hematológicas, para ello se encarga del
estudio e investigación de la sangre y los órganos hematopoyéticos
(médula ósea, ganglios linfáticos, bazo, etc) tanto sanos como enfermos.
La hematología es la rama de la ciencia médica que se encarga del

estudio de los elementos formes de la sangre y sus precursores, así como
de los trastornos estructurales y bioquímicos de estos elementos, que
puedan conducir a una enfermedad.
La hematología es una ciencia que comprende el estudio de la

etiología, diagnóstico, tratamiento, pronóstico y prevención de las
enfermedades de la sangre y órganos hemolinfoproductores. Los médicos
especialistas en este dominio son llamados hematólogos.
Las enfermedades hematológicas afectan la producción de sangre y

sus componentes, como los glóbulos rojos, la hemoglobina, las proteínas
plasmáticas, el mecanismo de coagulación (hemostasia), etc.
La hematología comprende el estudio del paquete celular el perfil o

el estado sanguíneo, los cuales son:
• Recuento de eritrocitos (y valor hematocrito)

• Recuento de leucocitos
• Determinación de hemoglobina
• Velocidad de sedimentación globular (VSG)
• Fórmula leucocitaria (recuento diferencial de leucocitos)
Los hematopatólogos usualmente están certificados en patología

clínica y anatómica, y tienen años adicionales de preparación en
hematopatología. La hematopatología es el estudio de no sólo las
enfermedades de la sangre y la médula ósea, sino también de los órganos
y tejidos que usan las células de la sangre para realizar sus funciones
fisiológicas, como los nódulos linfáticos, el bazo, el timo y otros tejidos
linfáticos. Los hematopatólogos se concentran en el diagnóstico de las
condiciones de los tejidos hematopoyéticos y los tejidos ricos en linfocitos.
Los exámenes de hematología más comunes son:
Examen Usos

Conteo sanguíneo completo (su sigla en Para ayudar a
inglés es CBC), que incluye: diagnosticar la anemia,
Conteo de los glóbulos blancos (su sigla en ciertos cánceres de la
inglés es WBC). sangre, y para monitorizar
Conteo de los glóbulos rojos (su sigla en la pérdida de sangre e
inglés es RBC). infección.
Conteo de las plaquetas.
Conteo del volumen de los hematócritos de
los glóbulos rojos (su sigla en inglés es HCT).
La concentración de la hemoglobina (su sigla
en inglés es HB) - el pigmento que lleva
oxígeno en los glóbulos rojos.
Conteo sanguíneo diferencial.
Conteo de las plaquetas. Para diagnosticar, o

monitorizar el sangrado y
los trastornos de la
coagulación o ambos.
Tiempo de protrombina (su sigla en inglés es Para evaluar el sangrado y

PT). los trastornos de la
coagula
Urinálisis (análisis de orina), que incluye un Para diagnosticar las

examen del color, nivel del pH y de la infecciones del riñón y de
gravedad; el análisis químico para determinar la vejiga, y otras
la presencia de sangre, proteínas, glucosa y enfermedades.
otras sustancias; y un examen microscópico
de los glóbulos rojos y blancos, bacterias y
otras sustancias.
Diagnostico
Los hematólogos utilizan análisis de sangre para diagnosticar

distintos desórdenes. De particular importancia son los análisis que
proporcionan información sobre los componentes celulares de la sangre
de un paciente. El análisis más común, llamado recuento hemático
completo, indica el número de glóbulos rojos, glóbulos blancos y
plaquetas en una unidad dada de sangre. Los hematólogos también
examinan muestras de sangre al microscopio para identificar células
sanguíneas anormales y diagnosticar enfermedades de la sangre. Además
de analizar enfermedades sanguíneas, los médicos también pueden
diagnosticar otros tipos de desórdenes, como la hepatitis C, una
enfermedad crónica del hígado que se detecta en la sangre.

Bibliografía
• http://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofot%C3%B3metro
• http://www.frlp.utn.edu.ar/grupos/aepeq/equipos.pps
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ros/celular/electroforesis.html
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• http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/parametros
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• http://www.healthsystem.virginia.edu/uvahealth/adult_path_sp/hema
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• http://es.wikipedia.org/wiki/Hematolog%C3%ADa
• http://mx.encarta.msn.com/encyclopedia_961537537/Hematolog%C
3%ADa.html

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